Actividad antimicrobiana del aceite esencial de Cannabis sativa sobre

Fusobacterium nucleatum. Estudio in vitro

INVESTIGADORES

Paola Bernate Castro. Estudiante de Odontología. Universidad Cooperativa de

Colombia, Sede Bogotá.erika.bernate@campusucc.edu.co

Katherine Niño Salinas. Estudiante de Odontología. Universidad Cooperativa de

Colombia, Sede Bogotá. katherine.ninos@campusucc.edu.co

Erika Patricia Pineda Mateus. Estudiante de Odontología. Universidad

Cooperativa de Colombia, Sede Bogotá. erika.pinedam@campusucc.edu.co

Juan Camilo Torres Olarte. Estudiante de Odontología. Universidad Cooperativa

de Colombia,. Sede Bogotá. juan.torreso@campusucc.edu.co

ASESOR CIENTÍFICO

ALVEIRO ERIRA. Docente Universidad Cooperativa de Colombia, Facultad de

Odontología, Sede Bogotá

1
Contenido

1 RESUMEN..................................................................................................... 4

2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ........................................................... 5

2.1 JUSTIFICACION ..................................................................................... 8

2.2 MARCO TEÓRICO ............................................................................... 10

2.3 MARCO DE REFERENCIA ................................................................... 13

2.4 Pregunta de investigación ..................................................................... 16

3 OBJETIVOS ................................................................................................ 16

3.1 Objetivo general .................................................................................... 16

3.2 Objetivos específicos ............................................................................ 16

4 MATERIALES Y MÉTODO .......................................................................... 17

4.1 Tipo de estudio ..................................................................................... 17

4.2 Población .................................................Error! Bookmark not defined.

4.3 Criterios de inclusión ............................................................................. 17

4.4 Criterios de exclusión ............................................................................ 17

4.5 Muestra ................................................................................................. 17

4.6 Variables ............................................................................................... 17

4.7 HIPÓTESIS ..............................................Error! Bookmark not defined.

4.8 PROCEDIMIENTO ................................................................................ 18

4.9 Aspectos Éticos .................................................................................... 19

2
 4.10 Análisis .............................................................................................. 20

5 RESULTADOS ESPERADOS ..................................................................... 20

6 PRESUPUESTO ......................................................................................... 21

6.1 Presupuesto global de la propuesta por fuentes de financiación .......... 21

7 CRONOGRAMA .......................................................................................... 22

8 BIBLIOGRAFÍA............................................................................................ 23

3
1 RESUMEN

Las enfermedades periodontales han sido a lo largo del tiempo un tema de interés
tanto en la práctica odontológica como en la vida cotidiana a nivel mundial, esta, ha
sido descrita como una patología multifactorial porque en esta pueden estar
asociados factores sistémicos, locales y microorganismo, entre los que podemos
encontrar: Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia y Fusubacterium
nucleatum, sus manifestaciones se dan desde la inflamación a nivel del
periodonto(encía) hasta la destrucción de todos los tejidos periodontales y de
soporte del diente, que en muchos casos puedes llegar a provocar la pérdida dental.
Se han planteado diferentes tipos de tratamientos para detener la enfermedad y con
esta a los microorganismos, los más utilizados son el raspaje y alisado radicular
que se puede realizar con el uso de curetas o un cavitron y de la mano de estas
técnicas manuales y locales se ha dado el uso de co-adyudantes como los
antimicrobianos, su uso indiscriminado y en largos periodos de tiempo puede llegar
a acaparar muchos efectos secundarios como: coloración parda en los dientes,
erosión de la mucosa bucal, entre otros, y han llegado a causar la resistencia de
muchos microorganismos frente a todo tipo de antibióticos, lo que hace que su uso
ya no sea tan efectivo. Es por este motivo que los aceites esenciales han generado
impacto en la comunidad, ya que estos presentan actividad antimicrobiana frente a
diversos microorganismos el Aceite Esencial de Cannabis Sativa podría ser una
alternativa de tratamiento en enfermedades periodontales, se ha identificado esta
planta en el sector farmacéutico de manera muy amplia, ya que sus metabolitos
muestran potentes bio-actividades en la salud. Se ha identificado el cannabidiol
como un componente del aceite de cáñamo eficaz contra bacterias Gram positivas
y levaduras. El objetivo general de este estudio es Determinar la actividad
antimicrobiana del aceite esencial de cannabis sativa sobre Fusobacterium
nucleatum.

La metodología utilizada se inicia con la selección de la cepa bacteriana en la fase

1: selección bacteriana y del aceite esencial. Luego se procederá a realizar las
diluciónes en diferentes concentraciones: se procederá a realizar las diluciones de
4
trabajo al 20,40, 60, 80 y 100% en agua destilada. Se procederá a activar la bacteria,
esta estará conservada a -20°C en suspensión de leche descremada, se procederá
a descongelarla tomando un volumen de 100 µl, y seran inoculadas en agar sangre
suplementado con hemina y menadiona, utilizando la técnica de siembra masiva.
Luego se incubarán a 37°C por cinco días en condiciones de anaerobiosis,
posteriormente se tomará una UFC y se realizara un pase de siembra por técnica
de rejilla, en agar Wilkins Chalgren suplementado con hemina y menadiona, se
incubaron a 37°C por cinco días en condiciones de anaerobiosis. Se tomarán 3-5
UFC de una caja previamente sembrada, con asa bacteriológica para ser
solubilizadas en caldo tioglicolato, y así alcanzar una concentración MacFarland 1
(3x108 células/mililitro).Se depositaran 20 µl de las diluciones del extracto puro de
Cannabis sativa al 20,40,60,80,100% respectivamente, Clorhexidina al 0,2%
(control positivo) y agua con Tween 20 (control negativo), cada uno de estos
ensayos se realizaran por triplicado, y se procedió a incubar por 24 horas a 37°C,
posteriormente se midiran los halos de inhibición.

Se espera la generación de nuevo conocimiento frente a la actividad antibactreriana

del Aceite Esencial de Cannabis Sativa siendo este un nuevo co-adyudante en el
tratamiento de la enfermedad Periodontal.

2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

Las enfermedades periodontales son alteraciones patológicas de etiología

multifactorial en donde están implicadas la placa bacteriana, los microorganismos
patógenos y las enfermedades sistémicas que alteran los tejidos del periodonto
(encía, ligamento periodontal, cemento radicular y hueso)1-2. Dando lugar
inicialmente a la gingivitis, presentando como su primera manifestación la
inflamación y el sangrado gingival, siguiendo el transcurso de la enfermedad pasa
a ser mucho más grave convirtiéndose en periodontitis, donde aparte de las dos
manifestaciones ya mencionados se empieza a provocar la pérdida de inserción de
la encía al hueso3 y con esta en casos más severos la perdida de la pieza dental.

5
Entre los microorganismos patógenos propios de la enfermedad se encuentran:
Actinomices actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Bacteroides
forsythus, Veillonella paraula, Streptococcus sanguis, Prevotella intermedia,
Fusubacterium nucleatum 4.

Según la Organización Mundial de la Salud, las enfermedades periodontales

afectan de un 15% a 20% adultos entre los 35 a 44 años a nivel mundial5, los
resultados del ENSAB IV en Colombia destacan que en la mayor parte de la
población (61.8%) se evidenció periodontitis en sus diferentes grados de severidad,
siendo la más frecuente la periodontitis moderada (43.46%), seguida por la
periodontitis avanzada (10.62%), y muy poca población se clasifico como sin
periodontitis (38,20%), Con lo cual se crea una urgente necesidad de detener esta
problemática6.

La etiología de la periodontitis como ya se menciono es multifactorial, en ella

interactúan los microorganismos y el huésped, los microorganismos actúan como
los iniciadores del proceso infeccioso, la susceptibilidad del huésped frente a esta
enfermedad va estar afectada por diferentes factores de riesgo de tipo ambiental,
sistémico, genético y de estilo de vida; la presencia de dos o más factores de riesgo
en una persona aumentan la probabilidad que esta sufra de algún tipo de
enfermedad periodontal7.

El estilo de vida ha sido catalogado como factor de riesgo que puede llegar a ser
modificado, en este podemos encontrar el tabaquismo, alcoholismo, falta de
ejercicio, mala alimentación; el tabaquismo es el más significativo de estos, se ha
encontrado que dependiendo de su dosis se presenta la severidad de la enfermedad
y que a su vez puede llegar a alterar la cicatrización de los tejidos dentales 8. Como
factores sistémicos se puede encontrar la diabetes mellitus mal contralada, esta es
una enfermedad caracterizada por la presencia de inflación sistémica, en donde la
periodontitis y candidiasis oral son sus manifestaciones bucales de más
prevalencia7.

6
Los microorganismos también hacen parte de los factores de riesgo para desarrollar
la enfermedad periodontal, estos han sido clasificados en la enfermedad periodontal
por complejos, estos los determino socransky mediante un estudio de placa
subgingival, son clasificados por colores dependiendo su función y momento de
aparición durante la enfermedad periodontal, en total son 6 complejos: el amarillo
está constituido por los colonizadores pioneros, en su gran mayoría streptococos,
el complejo azul esta formado por microorganismos de co- agregación, haciendo
parte de ellos las especies del genero Actinomyces, el complejo purpura está
compuesto por microorganismos colonizadores secundarios como Veionella
párvula, en el complejo verde se encuentran anaerobios que hacen parte de la placa
madura como Aggregatibacter actinomycetemcomitans, y en los últimos dos
complejos encontramos los microorganismos frente a los que queremos trabajar, en
el complejo naranja encontramos: Prevotella intermedia y Fusubacterium
nucleatum estos son microorganismos gram-negativos catalogados como puentes
entre las comunidades pioneras y los microorganismos característicos de la
enfermedad periodontal, y por último se encuentra el complejo rojo en donde están
los microorganismos propios de la enfermedad periodontal, en donde se encuentra
Porphyromonas gingivalis9.

Como alternativas para el tratamiento de estas enfermedades se encuentran

evidenciadas diferentes terapias como lo son la instrumentación mecánica o con
ultrasonido10 la utilización de co-adyudantes tipo antisépticos y en algunos casos
antibióticos11 donde se presenciará la disminución de la placa bacteriana y la
inflamación lo que lleva en un corto plazo a lograr detener la pérdida de inserción
del periodonto al hueso alveolar10-11.

El antiséptico a elección ha sido por mucho tiempo la clorhexidina al 0.2% debido al

amplio espectro que posee frente a estos microorganismos. Sin embargo, se deben
tener en cuenta los efectos colaterales de esta4 como: coloración parda de los
dientes o de algunos materiales de restauración, erosión de la mucosa bucal y del
dorso de la lengua12, perturbación del gusto13-14, tumefacción unilateral o bilateral
de la parótida, aumento de la formación de cálculos supragingivales (este efecto

7
puede deberse a la precipitación de proteínas de la saliva sobre la superficie dental),
sabor amargo que es difícil de enmascarar por completo14.

Desde hace tiempo se ha visto el uso indiscriminado de antimicrobianos, lo que

lleva la aparición de bacterias multirresistentes. Debido a estas razones, los agentes
antimicrobianos naturales han captado la atención y proponen una nueva
alternativa. Uno de estos grupos de agentes antimicrobianos naturales que se ha
utilizado durante siglos en naturopatía es el botánico derivado de aceites esenciales.
La mención más temprana del aceite esencial usado para los propósitos
terapéuticos está en el papiro de Ebers, donde se han enumerado más de 800
remedios y tratamientos. Desde entonces, los aceites esenciales han sido
reconocidos por sus propiedades antiinflamatorias, antimicrobianas y
antioxidantes15. Dentro de los tratamientos que se han documentado se encuentra
el aceite de timol (extraído de la planta de tomillo) ha sido conocido por su amplio
espectro de actividad antimicrobiana, posee múltiples propiedades biológicas tales
como las actividades antiinflamatoria, antioxidante, hepatoprotectora y
antitumoral16. El mecanismo detrás de esta actividad antibacteriana incluye
permeabilización y despolarización de la membrana citoplasmática, reduciendo el
gradiente de pH a través de la membrana citoplasmática. Esta reducción en el
gradiente de pH también afecta negativamente a la fuerza motriz del protón que
conduce al agotamiento del ATP intracelular que conduce posteriormente a la
muerte celular17.

2.1 JUSTIFICACION

Las enfermedades Periodontales, son enfermedades inflamatorias causadas por la

formación y persistencia de biofilm (placa bacteriana) y está asociada a diferentes
factores de riesgo como enfermedades sistémicas y el tabaquismo7-8. La gingivitis
es la primera manifestación de estas, sus signos son la inflamación y el sangrado
gingival, es una enfermedad reversible, ya que con una correcta técnica de cepillado
y el mantenimiento de esta se puede eliminar esta enfermedad. La periodontitis se
da como resultado de la progresión de la enfermedad, en donde se va a dar una

8
pérdida de inserción de los tejidos del periodonto18, la periodontitis se ha encontrado
que es la sexta enfermedad con más prevalencia en la humanidad 19.

La prevención de estas enfermedades está basada en la concientización del

paciente para que logre mantener una higiene oral en donde no se dé la formación
de biofilm que logre iniciar la enfermedad; su tratamiento se han desarrollado
técnicas manuales, quirúrgicas y no quirúrgicas10, el uso de la cirugía o no depende
de la gravedad de la enfermedad y de la perdida de inserción que presente el
paciente; se realiza un raspaje y alisado radicular para poder retirar la placa
bacteriana blanda y calcificada y se hace uso de co-adyudantes11 buscando que los
tejidos periodontales se puedan regenerar y que la enfermedad se detenga.

Este estudio se centra en conocer las propiedades antimicrobianas del aceite

esencial de Cannabis sativa como alternativa de tratamiento en enfermedades
periodontales20, que en un principio (1735) fue descrita por el botánico Carl linneo21.
Cannabis Sativa .es una importante especie herbácea originaria de Asia central
debido a sus aplicaciones multiuso: es una rica fuente de fibras de celulosa y
leñosas. Igualmente el interés de esta planta en el sector farmacéutico es muy
amplia, ya que sus metabolitos muestran potentes bioactividades en la salud
humana22. Se ha identificado el cannabidiol como un componente del aceite de
cáñamo eficaz contra bacterias Gram positivas y levaduras. Los quimiotipos de C.
Sativa cultivados en latitudes septentrionales reportan tener una proporción más
alta de cannabidiol a tetrahidrocannabinol, lo que resulta en una mayor actividad
antimicrobiana23.

En previos estudios se ha identificado que molecularmente cannabis sativa cuenta

con cinco cannabinoides principales (cannabidiol, cannabicromeno, cannabigerol,
Δ9-tetrahidrocannabinol y cannabinol mostraron una potente actividad contra una
variedad de cepas de Staphylococcus aureus resistentes a la meticilina. Se obtuvo
evidencia de que el pre-cannabidiol (1a) es un potente antibiótico de plantas, e
investigaciones más recientes han demostrado, en diversos grados, la actividad
antibacteriana de los cannabinoides no picotrópicos cannabicromeno (CBC, 2),

9
cannabigerol (CBG, 3b ) y el cannabidiol (1b) , así como para el agente psicotrópico
Δ9-tetrahidrocannabinol (THC, 4b) . Estas observaciones y la inactividad de varios
constituyentes no cainoides de C. sativa como agetes antibacterianos sugieren que
los cannabinoides y sus precursores son los agentes antibacterianos más probables
presentes en los preparados de Cannabis sativa31.

2.2 MARCO TEÓRICO

Las enfermedades periodontales crónicas se definen como enfermedad inflamatoria

del periodonto (tejido que rodea los dientes)24.son alteraciones patológicas de
etiología multifactorial en donde están implicada placa bacteriana, microorganismos
patógenos y enfermedades sistémicas que alteran los tejidos del periodonto1,2,24 .y
son un problema de salud pública a nivel mundial y especialmente en los países en
vía de desarrollo25,según la OMS al afectan a un 15%-20% de los adultos de edad
media 35-44 años5.

En 2009-2010 se realizó un estudio en Estados unidos en el cual se evaluó la

condición periodontal de 3.743 personas mayores de 30 años. Sus resultados
arrojaron que el 47% de la población padecía periodontitis en algún grado de
severidad con tendencia al aumento en periodontitis moderada acorde al
incremento de edad26.

Un segundo estudio realizado de 1997-2001 en Alemania en el cual se evaluaron

4.310 personas mayores de 20 años en el cual 50.9% de los adultos presentaron
periodontitis entre moderada y severa. Igual presentando un factor la edad como un
factor predisponente al potenciamiento de su severidad27

Para concluir un estudio realizado en Australia en el cual se evaluaron 5.505

personas mayores de 15 años. Sus resultados arrojaron a un 22.9 % de personas
con signos de periodontitis moderada y severa28.

Los resultados del ENSAB IV en Colombia destacan que en la mayor parte de la

población (61.8%) se evidenció periodontitis en sus diferentes grados de severidad,
siendo la más frecuente la periodontitis moderada (43.46%), seguida por la

10
periodontitis avanzada (10.62%), y muy poca población se clasifico como sin
periodontitis (38,20%)5.

Teniendo en cuenta los estudios anteriores si se realiza una comparación Colombia

tiene el mayor porcentaje de población con periodontitis entre moderada y severa
presentando un 54%.8 seguido de Alemania con un 50.9%, Estados Unidos con un
47% y por ultimo Australia con 22.9%.

Dentro de los factores de riesgo de la enfermedad periodontal entendiéndose factor

de riesgo como cualquier característica del individuo que incremente la posibilidad
del individuo de padecer la enfermedad se encuentran: estilo de vida (cigarrillo),
sistémicos (diabetes Mellitus, la enfermedad cardiovascular, la neumonía, los
resultados adversos del embarazo, la enfermedad pulmonar obstructiva crónica y la
isquemia cerebro-vascular) microbianos(Porphyromonas gingivalis,
A,actinomycetemcomitans , Bacteroides forsythus, Fusobacterium nucleatum)
psicológicos (Depresión) , genéticos, familiares, sociodemográficos y relacionados
con los dientes (malformaciones)29.

La etiología de las enfermedades gingivales comienza ser investigada en 1960

donde fue descrita por primera vez una espiroqueta como la causa de la gingivitis
ulcero necrosante al mismo tiempo que se detecta en estudios realizados en ratas
a Actinomyces viscosus como posible agente causal de la periodontitis. Luego de
1980 se define que la etiología de la enfermedad periodontal como multifactorial. Es
decir, En ellas intervienen los microorganismos y un hospedero susceptible, siendo
los microorganismos factores etiológicos esenciales es decir son el factor etológico
directo que causa esta enfermedad30 Específicamente se debe a la proliferación de
la placa dental formada por un número de especies bacterianas ubicadas en el surco
gingival, estos microorganismos son anaerobios en un 90%, se distribuyen en:
A,actinomycetemcomitans , Bacteroides forsythus, Fusobacterium nucleatum
vincentii ss, Peptomicros estreptococo, P. gingivalis, Prevotella intermedia,
Streptococcus intermedius, Rectus Campylobacter espiroquetas24,25,30.

11
La placa (formada después de varios días de mala higiene oral higiene oral), da
como resultado un desplazamiento de anaerobios gram negativos a órganos
móviles32.

Genero Porphyromonas: se caracterizan por ser bacilos inmóviles, anaerobios,

Gram-negativos. Actualmente solo se han podido aislar 3 de las 12 especies
reconocidas, P. endodontalis y P. asaccharolytica, P. gingivalis, esta ultima
asociada al progreso de la periodontitis crónica33.

Genero Fusobacterium: bacilos largos, inmóviles, anaerobia, de las especies

aisladas de este género se ha diferenciado a fusobacterium nucleatum como la
única potencialmente patógena y se asocia a la enfermedad periodontal 34.

Género Prevotella: son bacilos Gram-negativos anaerobios. De las 3 especies

implicadas en la periodontitis P. Intermedia se ha destacado por su capacidad de
degradar inmunoglobulinas y toxicidad sobre los fibroblastos35.

Dentro de los tratamientos instaurados para la enfermedad periodontal ha sido por

excelencia la instrumentación mecánica, que se basa en realizar un raspaje y
alisado radicular, ya sea utilizando instrumental manual, sónico, ultrasónico. Se ha
evidenciado en diferentes estudio clínicos la respuesta que se tiene de estos
tratamientos frente a la periodontitis crónica, lo que la hace sin duda el tratamiento
a elección para cualquier enfermedad periodontal32 , junto con esta se utilizan
coadyuvantes que ayudan a la disminución de microorganismos, se han escogido
los antibióticos36 y antisépticos como la clorhexidina. Pero a través del tiempo los
microorganismos se han adaptado y han creado una resistencia bacteriana a los
antibióticos37 estos han sido reconocidos desde que se introdujeron los primeros
usos clínicos .La resistencia bacteriana a los antibióticos se debe Insensibilidad de
bacterias a las acciones antimicrobianas de Dado antibiótico. El microorganismo en
cuestión tiene la capacidad de destruir el antibiótico o de crecer en su presencia 38.
Debido a esto también se ha optado por utilizar diferentes extractos naturales como
co-ayudantes dentro de los cuales encontramos diversas plantas y frutos con
actividad antimicrobiana39.

12
Cannabis sativa es una planta que existe desde tiempos inmemoriales, y a la cual
se le han retribuido numerosos beneficios para el tratamiento de diferentes
enfermedades40,41.

Es una especie herbácea de la familia Cannabaceae, originaria de las cordilleras

del Himalaya, Asia. Se ha utilizado durante miles de años como
planta medicinal con registros escritos que datan de 2737 a. C. Se ha utilizado en
el tratamiento de pacientes con enfermedades crónicas debilitantes tales como VIH
/ SIDA, dolor crónico no oncológico, epilepsia 42, múltiple la esclerosis lateral
amiotrófica y la esclerosis de la gestión de síntomas tales como dolor, náuseas, falta
de sueño, ansiedad y estrés. Cannabis sativa es compleja en su composición
química; contiene más de 525 productos químicos conocidos. La clase más
conocida y más específica de cannabis constituyentes es los cannabinoides
terpenophenolic C21, con delta-9-tetrahidrocannabinol (THC) es el más
constituyente psicológicamente activo40,41,42. Por lo cual su utilización debe hacerse
de manera propicia sin embargo se comprobó que tiene presente terpenoides
normales con lo cual se informa que es usado como cualquier otro aceite esencial
del mercado40,41.

2.3 MARCO DE REFERENCIA

La enfermedad periodontal es un proceso infeccioso de la encía y las estructuras

adyacentes, producido por diversos microorganismos que colonizan el área
subgingival. Esta enfermedad, a diferencia de la gingivitis, se caracteriza por una
pérdida estructural de hueso alveolar, cemento, y ligamento, producida por
determinados factores de riesgo. A su vez histológicamente podemos observar la
formación de bolsas periodontales a causa de la perdida de fibras colagenas y el
sistema inmune actuando en contra del huésped43.

Dentro de los microorganismos asociados encontramos A,actinomycetemcomitans

, Bacteroides forsythus, Fusobacterium nucleatum vincentii ss, Peptomicros
estreptococo, P. gingivalis, Prevotella intermedia, Streptococcus intermedius,
Rectus Campylobacter espiroquetas37 estos descubiertos, reconocidos y aislados

13
en las últimas décadas como potenciales para el desarrollo de la enfermedad
periodontal en sus diferentes grados 24,30,43.

El tratamiento de la enfermedad periodontal según las diferentes escuelas de

periodoncia varia en quirúrgico y no quirúrgico dependiendo su severidad ambos
acompañados de antisépticos como co-ayudantes que actúan sobre la placa
primaria evitadon la adhesión y colonización de otras bacterias, los cuales deben
cumplir con aspectos como seguridad, especificidad, eficacia. Dentro de los cuales
encontramos los antibióticos, los antisépticos bisguanidicos y fenoles y aceites
esenciales44,45.

Los fenoles y aceites esenciales

Se ha demostrado a través de diferentes estudios que los extractos de naturales de

plantas y frutos poseen efectos antimicrobianos en diferentes grados de
concentración entre los frutos naturales investigados se encontraron: naranja que
mostro actividad contra tres patógenos orales46, guanábana mostró actividad en
patógenos como Streptococcus mutans, Streptococcus mitis,Porphyromonas
gingivalis y Candida albicans 48,Robinia pseudoacacia una planta que mostro
actividad contra P. gingivalis49, Terminalia laxiflora, Acacia totrtilis, Ambrosia
marítima, Argemone mexicana, C. hartmannianum, Terminalia browni son una serie
de plantas investigadas en la región sudanesa que demostraron tener actividad
antibiótica49.

Los extractos de las semillas de Cannabis Sativa poseen actividad antibacteriana

contra la mayoría de las cepas Gram-positivas y Gram-negativas40, para este
proceso es importante tener en cuenta la composición de las plantas medicinales
como el cannabis sativa que en su composición tiene alcaloides, estas son
sustancias orgánicas naturales que se encuentran predominantemente en las
plantas. Las principales ventajas del uso de alcaloides derivados de plantas como
medicamentos es que son relativamente más seguros que las alternativas
sintéticas, ofrecen grandes beneficios terapéuticos y el tratamiento es más
asequible. En anteriores estudios se demuestra la eficacia de los alcaloides
extraídos de Cannabis Sativa frente a bacterias gram positivas. Con esta micro-flora

14
hallada en la cavidad bucal en la cual su principal actividad de microorganismos
son estreptococos y estafilococos, tales como S. mutans, S.sorbrinus, y S.sanguis,
tiene un significativo porcentaje de inhibición, ahora bien el tratamiento puede ser
aún más eficaz con combinaciones de antibióticos para tratar las infecciones41, otra
de sus propiedades es el cáñamo la semilla de cáñamo es una rica fuente de
nutrición, que contiene 25% -35% de lípido, 20% -25% de proteína, 20% -30% de
carbohidrato, 10% -15% de fibra insoluble y una amplia gama de minerales el aceite
de semilla de cáñamo contiene mayor nivel de ácidos grasos poliinsaturados (70%
-80%)50.La mayoría de los aminoácidos esenciales contenidos en la proteína del
cáñamo son suficientes y tiene un sinfín de beneficios entre esos se evidencia que
fue utilizado por los médicos árabes como anestésico en operaciones quirúrgicas
por influencia de la India. Nissen et al estudiaron la actividad antimicrobiana del
aceite esencial de las semillas de cáñamo y encontró que el aceite esencial inhibía
efectivamente el crecimiento de los fitopatógenos51. Además, varios otros
compuestos bioactivos han sido reportados de Cannabis incluyen terpenos,
azúcares, esteroides, flavonoides, compuestos nitrogenados y fenoles no
canabinoides uno de sus más relevantes componentes son los terpenoides
oxigenados y algunos hidrocarburos que se encuentran en los aceites esenciales
representan la mayor parte de su actividad antimicrobiana. Estos terpenoides se
difunden dentro de la membrana celular, dañándola irreversiblemente y causando
la muerte celular bacteriana. Siendo de naturaleza lipofílica, causando expansión
de la membrana, aumenta su fluidez e inactiva las enzimas incrustadas dentro de la
membrana.

El aceite de las semillas de Cannabis sativa ejerció una marcada actividad

antibacteriana (21-28 mm) contra Bacillus subtilis y Staphylococcus aureus,
actividad moderada (15 mm) contra Escherichia coli y alta actividad (16 mm) contra
Pseudomonas aeruginosa e inactivo frente a los dos hongos Probado Este resultado
es similar al reportado por Novak et al. Quien descubrió que el aceite extraído de
C.sativa tenía actividad antimicrobiana y esto podría deberse a la presencia de
sesquiterpenos oa la presencia de cannabidiol). El extracto de éter de petróleo de
toda la planta mostró una actividad antibacteriana pronunciada (23-28 mm) contra

15
ambos organismos Gram positivos, alta actividad (16 mm) contra Escherichia coli e
inactivo contra Pseudomonas aeruginosa y ambos hongos. El extracto de metanol
de la planta entera mostró también una actividad antibacteriana pronunciada (29
mm) contra Bacillus subtilis, baja actividad (12 mm) contra Staphylococcus aureus
y alta actividad (16 - 18 mm) contra ambos organismos Gram negativos, inactivo
contra Aspergillus niger y bajo Actividad (13 mm) contra Candida albicans 52.

2.4 Pregunta de investigación

¿Cuál es la actividad antimicrobiana del aceite esencial de Cannabis sativa, sobre

las bacterias periontopatogenas, Phorphyromona gingivalis, Fusobacterium
nucleatum, Prevotella intermedia?

3 OBJETIVOS

3.1 Objetivo general

Determinar la actividad antimicrobiana del aceite esencial de cannabis sativa sobre

Phorphyromona gingivalis, Fusobacterium nucleatum, Prevotella intermedia, en
cultivo individual y co- cultivo.

3.2 Objetivos específicos

Identificar la concentración mínima inhibitoria y concentración mínima bactericida

del aceite esencial de cannabis sativa sobre Phorphyromona gingivalis,
Fusobacterium nucleatum, Prevotella intermedia, en cultivo individual.

Establecer la concentración mínima inhibitoria y la concentración mínima

bactericida del aceite esencial de cannabis sativa sobre Phorphyromona gingivalis,
Fusobacterium nucleatum, Prevotella intermedia en co-cultivos.

Comparar la actividad antimicrobiana del aceite esencial de cannabis sativa versus

la clorhexidina al 0.2 % sobre Phorphyromona gingivalis, Fusobacterium nucleatum,
Prevotella intermedia.

16
4 MATERIALES Y MÉTODO

4.1 Tipo de estudio

Estudio Experimental In Vitro

4.2 Criterios de inclusión

Cepas viables

4.3 Criterios de exclusión

Crecimiento atípico

4.4 Muestra

Fusobacterium nucleatum.

4.5 Variables

VARIABLE DEFINICIÓN OPERACIONA ESCALA RECOLECCIÓ

LIZACIÓN DE N Y REGISTRO
MEDICIÓN
Actividad Eliminación de 1.Presente Cuantitati Halo de
antimicrobiana microorganismos va discreta Inhibición(mm)
2.Ausente
o inhibición de su Excel
crecimiento resultados
mediante una Cannabis Sativa.
sustancia

Concentraci Concentración 1.20% Cuantitati Halo de

ón mínima más baja de un va ordinal Inhibición(mm)
2.40%
inhibitoria antimicrobiano Excel
que se necesita 3.60%
resultados
para inhibir el 4.80% Cannabis Sativa.
crecimiento de un
microorganismo 5.100%

17
4.6 Hipótesis

NULA: El aceite esencial de cannabis sativa NO tiene actividad antimicrobiana sobre

Fusobacterium nucleatum.

ALTERNA: El aceite esencial de Cannabis sativa Sí tiene actividad antimicrobiana

sobre Fusobacterium nucleatum.

4.7 PROCEDIMIENTO

1: selección bacteriana y del aceite esencial.

-Selección de la cepa bacteriana: Fusobacterium nucleatum

-Selección del aceite. Aceite Esencial de Cannabis sativa

Fase 2: dilución en diferentes concentraciones: se procederá a realizar las

diluciones de trabajo al 20,40, 60, 80 y 100% en agua destilada.

Agua
Concentración AE Cannabis sativa Volumen final
destilada

20% 20 µl 80 µl 100 µl

40% 40 µl 60 µl 100 µl

60% 60 µl 40 µl 100 µl

80% 80 µl 20 µl 100 µl

100% 100 µl 0 µl 100 µl

Fase 3: Activación bacteriana.

18
La cepa estará conservada a -20°C en suspensión de leche descremada, se
procederá a descongelarla tomando un volumen de 100 µl, y seran inoculadas en
agar sangre suplementado con hemina y menadiona, utilizando la técnica de
siembra masiva. Luego se incubarán a 37°C por cinco días en condiciones de
anaerobiosis, posteriormente se tomará una UFC y se realizara un pase de siembra
por técnica de rejilla, en agar Wilkins Chalgren suplementado con hemina y
menadiona, se incubaron a 37°C por cinco días en condiciones de anaerobiosis.

Se tomarán 3-5 UFC de una caja previamente sembrada, con asa bacteriológica
para ser solubilizadas en caldo tioglicolato, y así alcanzar una concentración
MacFarland 1 (3x108 células/mililitro).

Se depositará el inoculo y se sembrará las superficies de agar Wilkins Chalgren

suplementado con hemina y menadiona, seguido a esto se realizaran pozos sobre
la superficie del agar con un sacabocados estéril de 6mm de diámetro y en cada
uno de ellos se depositaran 20 µl de las diluciones del extracto puro de Cannabis
sativa al 20,40,60,80,100% respectivamente, Clorhexidina al 0,2% (control positivo)
y agua con Tween 20 (control negativo), cada uno de estos ensayos se realizaran
por triplicado, y se procedió a incubar por 24 horas a 37°C, posteriormente se
midiran los halos de inhibición.

4.8 Aspectos Éticos

Según la resolución número 8430 de 1993 (octubre 4) de la república de Colombia

y el ministerio de salud, en la cual se establecen las normas científicas, técnicas y
administrativas para la investigación en salud.

Se estipula en el artículo 63 que aquellas instituciones investigadoras en las que se

realice investigación con microorganismos patógenos o material biológico que
puedan contenerlos deberán contar con instalaciones y equipo de laboratorio
adecuado a las normas estipuladas, donde se garantice la correcta manipulación de
estos microorganismos. En los laboratorios de la Universidad Cooperativa de

19
Colombia se hallan oportunas y adecuadas estas instalaciones por lo que garantiza
el manejo apropiado de patógenos.

Para la evaluación de riesgo el artículo 67 evaluar las normas técnicas y

correspondientes que clasifican a los microorganismos. Por lo tanto el grupo
correspondiente de cepas bacterianas a manipular es, grupo de riesgo l,
microorganismos que representan escaso riego para el individuo y la comunidad.

4.9 Análisis

OBJETIVO ESPECÍFICO VARIABLES ANÁLISIS

Establecer la concentración Concentración mínima Promedio,

mínima inhibitoria del aceite esencial
inhibitoria. Desviación
de Cannabis Sativa sobre
estándar y t-
Fusobacterium nucleatum.
student.

Comparar la actividad antimicrobiana Promedio,Desvi

del aceite esencial de Cannabis
ación estándar y
Sativa versus la clorhexidina al 0.2 %
t-student.
sobre Fusobacterium nucleatum

5 RESULTADOS ESPERADOS

Generación del conocimiento

Generar un impacto científico, desarrollando nuevo conocimiento de la actividad

antibacteriana del aceite esencial del cannabis sativa como co-adyuvante del
tratamiento de la enfermedad periodontal para inhibir o eliminar las bacteria
periodontopatogena fusobacterium nucleatum, Generar un impacto académico,

20
pues los resultados de la investigación se difundirán a través de una clase magistral
en la facultad.

Apropiación social/pública del conocimiento

Generar un impacto académico, los resultados de la investigación se difundirán a

través de una clase magistral en la facultad de la Universidad Cooperativa de
Colombia sede Bogotá y en la comunidad científica se realizara la disertación de
los resultados en un congreso.

6 PRESUPUESTO

6.1 Presupuesto global de la propuesta por fuentes de financiación

PRESUPUESTO GLOBAL (Miles de pesos)

Financiación

RUBROS Otras
Costo Costo Investigadore
UCC fuente
Unitario total s
s

Incubadora 10.000 10.000 0 10.000 0

Balanza analítica 5.000 5.000 5.000

Refrigerador 2.000 2.000 2.000

Autoclave 2.000 2.000 2.000

Agar Sangre 800.000 800.000 800.000

2.500.00 2.500.00
Cepa bacteriana 2.500.000
0 0

Sobre anaerobiosis 200.000 600.000 600.000

Caldo de tioglicolato 600.000 600.000 600.000

21
 Puntas micropipeta 100.000 200.000 200.000

Micropipetas 3.000 3.000 3.000

Sangre de cordero 200.000 400.000 400.000

Erlenmeyer 1.000 1.000 1.000

300.00
Material bibliográfico 300.000 300.000
0

Publicaciones y
0 0 0 0 0
patentes

Administración 0 0 0 0 0
4’723.00 5’423.00 323.00
TOTAL 5’100.000 0
0 0 0
7 CRONOGRAMA

Semestre
Sexto Séptimo Octavo Noveno Decimo
Actividad Mes Mes Mes Mes Mes Mes Mes Mes Mes Mes
3 6 3 6 3 6 3 6 3 6
Planteamiento
X X
de la pregunta

Revisión
X X X
Bibliográfica

Protocolo de
X
investigación

Presentación a
comité de
X
investigación y
bioética

Compra de
insumos,
X
selección de
cepas

22
Estandarizar
criterios y X
prueba piloto

Ensayos
X X
experimentales
Análisis de
X X
resultados

Escritura del
documento
final y
X X
organización
de
presentación

Socialización
x x
de resultados

Discusión y
x x
conclusiones

Artículo final x x

Presentación x x

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