Actividad antimicrobiana del aceite esencial de Cannabis sativa sobre

Fusobacterium nucleatum. Estudio in vitro

INVESTIGADORES

PAOLA BERNATE CASTRO

KATHERINE NIÑO SALINAS

ERIKA PATRICIA PINEDA MATEUS

JUAN CAMILO TORRES OLARTE

UNIVERSIDAD COOPERATIVA DE COLOMBIA

FACULTAD DE ODONTOLOGÍA

BOGOTÁ D.C.

2019
1
Actividad antimicrobiana del aceite esencial de Cannabis sativa sobre
Fusobacterium nucleatum. Estudio in vitro

INVESTIGADORES

PAOLA BERNATE CASTRO

KATHERINE NIÑO SALINAS

ERIKA PATRICIA PINEDA MATEUS

JUAN CAMILO TORRES OLARTE

Asesor

ALVEIRO TUPAZ ERIRA

DMD, MsC en Bioquímica, Universidad Nacional de Colombia.

PhD (c) ciencias Biológicas, Pontificia Universidad Javeriana.

UNIVERSIDAD COOPERATIVA DE COLOMBIA

FACULTAD DE ODONTOLOGÍA

BOGOTÁ D.C.

2019

2
Actividad antimicrobiana del aceite esencial de Cannabis sativa sobre
Fusobacterium nucleatum. Estudio in vitro

INVESTIGADORES

PAOLA BERNATE CASTRO

KATHERINE NIÑO SALINAS

ERIKA PATRICIA PINEDA MATEUS

JUAN CAMILO TORRES OLARTE

Trabajo de Grado presentado para optar el título de Odontólogo

Asesor

ALVEIRO TUPAZ ERIRA

DMD, MsC en Bioquímica, Universidad Nacional de Colombia.

PhD (c) ciencias Biológicas, Pontificia Universidad Javeriana.

UNIVERSIDAD COOPERATIVA DE COLOMBIA

FACULTAD DE ODONTOLOGÍA

BOGOTÁ D.C.

2019
3
El trabajo de Grado Actividad antimicrobiana del aceite esencial de Cannabis
sativa sobre Fusobacterium nucleatum. Estudio in vitro, elaborado por PAOLA
BERNATE CASTRO, KATHERINE NIÑO SALINAS, ERIKA PATRICIA PINEDA
MATEUS, JUAN CAMILO TORRES OLARTE, ha sido aprobado como requisito
parcial para optar el título de Odontólogo.

_________________________

Decana

________________________

Coordinador de Investigación

________________________

Asesor

Bogotá, D.C, mayo de 2019

4
DEDICATORIA

A nuestros padres, quienes siempre nos han brindado su apoyo y cariño, por ser
una guía constante para alcanzar nuestras metas, ya que con su enseñanza
logramos ser seres humanos íntegros. Infinitas gracias por creer en lo que somos y
en nuestro potencial.

5
AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen a:

Yeisson Espinosa Villamizar., por su acompañamiento durante el proceso en este

proyecto, por su tiempo, comprensión, apoyo y sobre todo paciencia.

Alveiro Erira, por acogernos y guiarnos para finalizar de manera exitosa esta
investigación.

6
 TABLA DE CONTENIDO

GLOSARIO.............................................................................................................. 8
INTRODUCCIÓN .................................................................................................... 9
1 CONTEXTO DE LA INVESTIGACIÓN............................................................ 10
1.1 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA DE INVESTIGACIÓN. .................. 10
1.2 MARCO TEÓRICO................................................................................... 12
1.3 MARCO REFERENCIAL .......................................................................... 15
1.4 JUSTIFICACIÓN ...................................................................................... 16
1.5 OBJETIVOS ............................................................................................. 17
1.5.1 OBJETIVO GENERAL ....................................................................... 17
1.5.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................. 18
2 MÉTODO ........................................................................................................ 18
2.1 TIPO DE ESTUDIO .................................................................................. 18
2.2 POBLACIÓN ...............................................Error! Bookmark not defined.
2.3 CRITERIOS DE INCLUSIÓN ................................................................... 18
2.4 CRITERIOS DE EXCLUSIÓN .................................................................. 18
2.5 MUESTRA................................................................................................ 18
2.6 OPERACIONALIZACIÓN DE VARIABLES .............................................. 18
2.7 HIPÓTESIS .............................................................................................. 19
2.8 PROCEDIMIENTO ................................................................................... 19
2.9 RECOLECCIÓN Y ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE LA INFORMACIÓN. ... 21
2.10 ASPECTOS ÉTICOS ............................................................................... 21
3 RESULTADOS ............................................................................................... 21
4 DISCUSIÓN .................................................................................................... 22
5 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES .................................................. 24
REFERENCIAS

ANEXOS

Anexo 1. Protocolo cultivo bacteriano

7
GLOSARIO

 Alopático: sistema por el cual los profesionales de la atención de la salud,

tratan los síntomas y las enfermedades por medio de medicamentos,
radiación o cirugía. (1)
 Antisépticos: sustancia o medicamento que se emplea para destruir los
gérmenes que infectan un organismo vivo o para evitar su existencia.(2)
 Biofilm: comunidad microbiana de células adheridas a una superficie en la
que las células se mantienen unidas gracias a una matriz extracelular(3)
 ENSAB: Estudio Nacional de Salud Bucal(4)
 Homeopático: Método curativo que se fundamenta en la aplicación de
sustancias naturales.(5)
 OMS: Organización Mundial de la Salud(6)
 UFC: Unidad Formadora de Colonias

8
INTRODUCCIÓN

La enfermedad periodontal es una patología que afecta los tejidos del periodonto,
produciendo la perdida de inserción de estos, movilidad dental, sangrado gingival e
inflamación. En Colombia se ha evidenciado gran prevalencia, por esto se ha hecho
necesario estudiar diferentes alternativas de tratamiento novedosas que a su vez
disminuyan los efectos secundarios que los métodos convencionales producen. El
Objetivo de este proyecto fue Determinar la actividad antimicrobiana del aceite
esencial de cannabis sativa sobre Fusobacterium nucleatum

Se realizó un estudio experimental In Vitro, en donde se examinó a Fusobacterium

nucleatum, determinando la actividad antimicrobiana que el aceite esencial de
Cannabis sativa presentó sobre este, en diferentes concentraciones
20,40,60,80,100%. Se realizó la activación de la cepa que se encontraba
conservada a -20°C en suspensión de leche descremada, se procedió a
descongelarla tomando un volumen de 100 µl, y fueron inoculadas en agar sangre
suplementado utilizando la técnica de siembra masiva, luego se incubaron a 37°C
por cinco días en condiciones de anaerobiosis, posteriormente se tomó una UFC y
se realizó un pase de siembra por técnica de rejilla, en agar Wilkins Chalgren
suplementado con hemina y menadiona, se incubaron a 37°C por cinco días en
condiciones de anaerobiosis. Se depositó el inoculo y se incubó por 24 horas,
pasadas estas se midió el halo de inhibición en cada una de las concentraciones,
obteniendo como resultado que, Cannabis sativa sí presenta actividad
antimicrobiana sobre Fusobacterium nucleatum y que su efecto fue similar al
presentado con la clorhexidina.

9
1 CONTEXTO DE LA INVESTIGACIÓN

1.1 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA DE INVESTIGACIÓN.

Las enfermedades periodontales son alteraciones patológicas de etiología

multifactorial en donde se encuentran implicados la bio película y algunas
enfermedades sistémicas que alteran los tejidos del periodonto (encía, ligamento
periodontal, cemento radicular y hueso inicialmente se presenta como gingivitis, con
signos característicos como la inflamación y el sangrado gingival, el no realizar el
tratamiento a tiempo genera periodontitis, donde aparte de las dos manifestaciones
ya mencionadas, provoca pérdida de inserción de la encía y hueso(7) esto podría
ocasionar pérdida dental. Entre los microorganismos patógenos propios de la
enfermedad se encuentran: Actinomices actinomycetemcomitans, Porphyromonas
gingivalis, Bacteroides forsythus, Veillonella paraula, Streptococcus sanguis,
Prevotella intermedia, Fusubacterium nucleatum(8).

Según la Organización Mundial de la Salud (OMS), las enfermedades periodontales

afectan de un 15% a 20% adultos entre los 35 a 44 años a nivel mundial (6), los
resultados del ENSAB IV en Colombia destacan que en la mayor parte de la
población (61.8%) se evidenció periodontitis en sus diferentes grados de severidad,
siendo más frecuente la periodontitis moderada (43.46%), seguida por la
periodontitis avanzada (10.62%), y muy poca población se clasifico como sin
periodontitis (38,20%), con lo cual se crea una urgente necesidad de intervenir en
esta problemática (4).

La periodontitis como ya se mencionó es de etiología multifactorial, en la cual

interactúan los microorganismos y el huésped. Los microorganismos actúan como
los iniciadores del proceso infeccioso, la susceptibilidad del huésped frente a esta
enfermedad va estar determinada por factores de riesgo de tipo ambiental, sistémico
y genético; la presencia de dos o más factores de riesgo en una persona aumentan
la probabilidad de sufrir algún tipo de enfermedad periodontal (9).

10
Siguiendo esto, el estilo de vida ha sido catalogado como un factor de riesgo que
puede llegar a ser modificado, en este podemos encontrar el tabaquismo,
alcoholismo, falta de ejercicio, mala alimentación, entre otros; El tabaquismo es el
más significativo de estos, ya que se ha encontrado que dependiendo de su dosis
se presenta la severidad de la enfermedad y que a su vez puede llegar a alterar la
cicatrización de los tejidos bucales(10). Como factores sistémicos se puede
encontrar la diabetes mellitus mal controlada, esta es una enfermedad caracterizada
por la presencia de inflamación sistémica, en donde la periodontitis y candidiasis
oral son sus manifestaciones bucales más prevalentes(9).

Los microorganismos también hacen parte de los factores de riesgo para desarrollar
la enfermedad periodontal y, han sido clasificados en complejos, Socransky
mediante un estudio de placa sub-gingival, agrupó los microorganismos por colores
dependiendo su función y momento de aparición durante la enfermedad, en total
salieron 6 complejos: el complejo amarillo está constituido por los colonizadores
pioneros, en su gran mayoría Streptococos. El complejo azul está formado por
microorganismos de co-agregación, haciendo parte de ellos las especies del género
Actinomyces. El complejo purpura está compuesto por microorganismos
colonizadores secundarios como Veionella párvula. En el complejo verde se
encuentran anaerobios que hacen parte de la placa madura como Aggregatibacter
actinomycetemcomitans. El complejo naranja se compone de Fusubacterium
nucleatum este es un microorganismo gram-negativo catalogado como puente entre
las comunidades pioneras y los microorganismos característicos de la enfermedad
periodontal. Por último está el complejo rojo, al cual pertenecen los
microorganismos propios de la enfermedad periodontal como Porphyromonas
gingivalis (11).

Como alternativas para el tratamiento de esta enfermedad existen diferentes

terapias como la instrumentación mecánica o con ultrasonido (12) y la utilización de
co-adyudantes tipo antisépticos y en algunos casos antibióticos (13) para la
disminución de la placa bacteriana y la inflamación, lo que lleva en un corto plazo a
lograr detener la pérdida de inserción del periodonto (12,13).

11
El antiséptico de elección ha sido por mucho tiempo la Clorhexidina al 0.2% debido
al amplio espectro que posee frente a estos microorganismos. Sin embargo, se
deben tener en cuenta los efectos colaterales de esta: coloración parda de los
dientes o de algunos materiales de restauración, erosión de la mucosa bucal y del
dorso de la lengua (14), perturbación del gusto (15,16), tumefacción unilateral o
bilateral de la parótida, aumento de la formación de cálculos supra-gingivales (este
efecto puede deberse a la precipitación de proteínas de la saliva sobre la superficie
dental), sabor amargo (16). Desde hace tiempo se ha evidenciado el uso
indiscriminado de antimicrobianos, lo que ha creado una resistencia de los
microorganismos. Debido a esto, los agentes antimicrobianos naturales han
captado la atención y proponen una nueva alternativa como co-ayudante.

Uno de estos grupos de agentes antimicrobianos naturales que se ha utilizado

durante siglos en naturopatía es el botánico derivado de aceites esenciales, debido
a que han sido reconocidos por sus propiedades antiinflamatorias, antimicrobianas
y antioxidantes (17).

1.2 MARCO TEÓRICO

Las enfermedades periodontales crónicas se definen como enfermedad inflamatoria

del periodonto (tejido que rodea los dientes) (18),son alteraciones patológicas de
etiología multifactorial en donde están implicada placa bacteriana, microorganismos
patógenos y enfermedades sistémicas que alteran los tejidos del periodonto (18–
20) .y son un problema de salud pública a nivel mundial y especialmente en los
países en vía de desarrollo, ya que según la OMS afectan a un 15%-20% de los
adultos de edad media 35-44 años(6).

En 2009 se realizó un estudio en Estados unidos en el cual se evaluó la condición

periodontal de 3.743 personas mayores de 30 años. Sus resultados arrojaron que
el 47% de la población padecía periodontitis en algún grado de severidad con
tendencia al aumento en periodontitis moderada acorde al incremento de edad(21).

12
Un segundo estudio realizado en 1997 en Alemania en el que se evaluaron 4.310
personas mayores de 20 años, de las cuales 50.9% de los adultos presentó
periodontitis entre moderada y severa. Igual presentando la edad como un factor
predisponente al potenciamiento de su severidad(22).

El último estudio realizado en Colombia a cerca de la salud buco dental de sus

habitantes ENSAB IV tiene resultados preocupantes en materia de prevalencia de
la periodontitis, puesto que, arroja un 61.8% de personas que padecen esta
enfermedad en sus diferentes grados de severidad, siendo más asidua la
periodontitis moderada(4).

Teniendo en cuenta los estudios anteriores si se realiza una comparación Colombia

tiene el mayor porcentaje de población con periodontitis entre moderada y severa
presentando un 54.8%, seguido de Alemania con un 50.9%, Estados Unidos con un
47% y por ultimo Australia con 22.9%.

Dentro de los factores de riesgo de la enfermedad periodontal entendiéndose factor

de riesgo como cualquier característica del individuo que incremente la posibilidad
del individuo de padecer la enfermedad se encuentran: estilo de vida (cigarrillo),
sistémicos (diabetes Mellitus, enfermedad cardiovascular, neumonía, embarazo,
enfermedad pulmonar obstructiva crónica e isquemia cerebro-vascular),
microbianos(Porphyromonas gingivalis, Aggregatibacter actinomycetemcomitans,
Bacteroides forsythus, Fusobacterium nucleatum), psicológicos (Depresión),
genéticos, familiares y sociodemográficos.

Asimismo, se detecta en estudios realizados en ratas a Actinomyces viscosus como

posible agente causal de la periodontitis. Luego de 1980 se define que la etiología
de la enfermedad periodontal como multifactorial. Es decir, en ellas intervienen los
microorganismos y un hospedero susceptible, siendo los microorganismos factores
etiológicos esenciales es decir son el factor etológico directo que causa esta
enfermedad(9). Específicamente se debe a la proliferación de la placa dental
formada por un número de especies bacterianas ubicadas en el surco gingival,
estos microorganismos son anaerobios en un 90%, se distribuyen en:
13
Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Bacteroides forsythus, Fusobacterium
nucleatum vincentii ss, Peptomicros estreptococo, P. gingivalis, Prevotella
intermedia, Streptococcus intermedius, Rectus Campylobacter espiroquetas(9,18).

La Biopelícula (formada después de varios días de una deficiente higiene oral), da

como resultado un desplazamiento de microorganismos anaerobios gram negativos
a órganos móviles(23) como es el caso de los de Fusobacterium nucleatum

Género Fusobacterium: bacilos largos, inmóviles, anaerobia, de las especies

aisladas de este género se ha diferenciado a Fusobacterium nucleatum como la
única potencialmente patógena y se asocia a la enfermedad periodontal ya que es
el puente entre los microorganismos pioneros y los propios de la enfermedad(24).

Dentro de los tratamientos instaurados para la enfermedad periodontal ha sido por

excelencia la instrumentación mecánica, que se basa en realizar un raspaje y
alisado radicular, ya sea utilizando instrumental manual, sónico, ultrasónico. Se ha
evidenciado en diferentes estudios clínicos la respuesta que se tiene de estos
tratamientos frente a la periodontitis crónica, lo que la hace sin duda el tratamiento
a elección para cualquier enfermedad periodontal(25), junto con esta se utilizan
coadyuvantes que ayudan a la disminución de microorganismos, se han escogido
los antibióticos y antisépticos como la clorhexidina (2,26)

Pero a través del tiempo los microorganismos se han adaptado y han creado una
resistencia bacteriana a los antibióticos(27) estos han sido reconocidos desde que
se introdujeron los primeros usos clínicos. El microorganismo en cuestión tiene la
capacidad de destruir el antibiótico o de crecer en su presencia (27). Debido a esto
se ha optado por utilizar diferentes extractos naturales como co-ayudantes dentro
de los cuales encontramos diversas plantas y frutos con actividad
antimicrobiana(28).

Cannabis sativa es una planta que existe desde tiempos inmemoriales, y a la cual
se le han retribuido numerosos beneficios para el tratamiento de diferentes
enfermedades(17,28).Es una especie herbácea de

14
la familia Cannabaceae, originaria de las cordilleras del Himalaya, Asia. Se ha
utilizado durante miles de años como planta medicinal con registros escritos que
datan de 2737 a. C. Se ha utilizado en el tratamiento de pacientes con
enfermedades crónicas debilitantes tales como VIH / SIDA, dolor crónico no
oncológico, epilepsia(29), múltiple la esclerosis lateral amiotrófica y la esclerosis de
la gestión de síntomas tales como dolor, náuseas, falta de sueño, ansiedad y estrés.
Cannabis sativa es compleja en su composición química; contiene más de 525
productos químicos conocidos. La clase más conocida y más específica de cannabis
constituyentes es los cannabinoides terpenophenolic C21, con delta-9-
tetrahidrocannabinol (THC) es el más constituyente psicológicamente
activo(17,28,29). Por lo cual su utilización debe hacerse de manera propicia sin
embargo se comprobó que tiene presente terpenoides normales con lo cual se
informa que es usado como cualquier otro aceite esencial del mercado(17,28).

1.3 MARCO REFERENCIAL

Cannabis sativa es una planta conocida en todo el mundo bajo diferentes subtipos
y derivados, es de origen oriental y el primer cultivo realizado data de hace 5000
años y desde entonces ha sido utilizada como materia prima para diferentes
productos entre ellos fibras para material textil y aceites esenciales para uso
medicinal(30).

Comúnmente los canabioides son relacionados con solo una partícula en especial
THC que se encarga de activar el sistema nervioso central sin embargo para las
personas del común son desconocidos los efectos de los cannabinoides no
alucinógenos o cannabinoides no clásicos. Los cannabinoides clásicos son
relacionados estructuralmente con el tetrahidrocannabinol, los cannabinoides no
clásicos como Los aminoalquilindoles, los eicosanoides relacionados con los endo-
cannabinoides, 1,5-diarilpirazoles, quinolinas y aril- Sulfonamidasl y compuestos
adicionales, son aquellos poco estudiados y los que poseen propiedades diferentes
a alucinaciones.

Los aceites esenciales, especialmente las de las variedades legales de Cannabis

sativa, han recibido muy poca relevancia por parte de los investigadores en el
15
mundo, a pesar de la importancia y potencial que pueda tener en la tecnología
médica específicamente en el campo de la fito-medicina, la disciplina de estudio de
los derivados farmacéuticos derivados de plantas. Por ejemplo, las propiedades
antimicrobianas de los aceites de Cannabis sativa, pueden utilizarse contra
patógenos nosocomiales, de deterioro y de origen alimentario en específico de
origen bacteriano (31)

Dentro del empirismo de la medicina alopática y la experticia de la fito-medicina en

conjunto, desarrollaron aceites esenciales de sus semillas que tenían hasta un 95%
de pureza en cuanto moléculas presentes (32). Estudios comprobaron que estos
aceites esenciales de cannabis sativa tuvieron efecto minimo inhibitorio en algunas
bacterias gram (+) como Enterococcus hirae, Enterococcus faecium y S. salivarius,
bacil- lus subtilis, Staphylococcus aureus y gram (-) como Escherichia coli ,
Pseudomonas aeruginosa en los cuales mostró una actividad inhibitoria mayor (32).
En otro estudio se señaló que en plantas sembradas en los países nórdicos la
molécula de THC desciende y otras elevan su crecimiento dando una mejor
actividad antimicrobiana (33) esto afirmando la teoría de que las moléculas no
alucinógenas poseen propiedades medicinales no solo analgésicas si no también
antibacterianas. Otro estudio demostró que la actividad antimicrobiana del aceite
esencial de Cannabis sativa va más allá de bacterias gram y tiene presencia
inhibitoria también en hongos (34) teniendo en cuenta la resistencia que han creado
muchas de las bacterias debido a la utilización y el abuso de medicamentos
antibióticos(35) hacen del efecto del aceite esencial del cannabis sativa una
alternativa para tratar enfermedades causadas por estos microorganismos.

1.4 JUSTIFICACIÓN

El aceite esencial de Cannabis Sativa ha presentado actividad antimicrobiana en la

mayoría de cepas gram-positivas y algunas gram-negativas, como se presenta en
los estudios de Hossein Sarmadyan (33). Otros investigadores han encontrado que
los compuestos bioactivos le dan la capacidad de inhibir irreversiblemente y causar
la muerte celular bacteriana, sin llegar a producir efectos secundarios como los
antisépticos comunes (18,19).

16
Los estudios demuestran que utilizando co-ayudantes de tipo natural
específicamente aceites esenciales, se logra una reducción de la carga bacteriana,
ya que presentan actividad antimicrobiana(2). Annona muricata ha mostrado
actividad contra Streptococcus mutans, Streptococcus mitis, Porphyromonas
gingivalis y Candida albicans, por otro lado, Robinia pseudoacacia presentó
actividad frente a Porphyromonas gingivalis (36).El aceite de timol (extraído de la
planta de tomillo), ha sido conocido por su amplio espectro antimicrobiano, posee
múltiples propiedades biológicas tales como la actividad antiinflamatoria,
antioxidante, hepato protectora y antitumoral (20). El mecanismo detrás de esta
actividad antibacteriana incluye permeabilización y despolarización de la membrana
citoplasmática, reduciendo el gradiente de pH a través de la membrana
citoplasmática. Esta reducción en el gradiente de pH también afecta negativamente
a la fuerza motriz del protón que conduce al agotamiento del ATP intracelular
causando la muerte celular. La enfermedad Periodontal es una alteración de los
tejidos de soporte de origen inflamatorio causada por la formación y persistencia
de una biopelícula bacteriana (11,12) donde se da una pérdida de inserción de los
tejidos del periodonto, debido a que la enfermedad periodontal es la sexta
enfermedad con más prevalencia a nivel mundial(18), surge la necesidad de seguir
indagando acerca de la actividad antimicrobiana de productos naturales como el
aceite esencial de cannabis sativa y la respuesta de microorganismos patógenos
como Fusobacterium nucleatum, ya que es el puente entre los microorganismos
pioneros de la enfermedad periodontal y así poder dar una nueva alternativa en el
tratamiento de estas enfermedades.

1.5 OBJETIVOS

1.5.1 OBJETIVO GENERAL

Determinar la actividad antimicrobiana del aceite esencial de Cannabis sativa sobre
Fusobacterium nucleatum.

17
1.5.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Establecer la concentración mínima inhibitoria del aceite esencial de Cannabis
Sativa sobre Fusobacterium nucleatum.

Comparar la actividad antimicrobiana del aceite esencial de Cannabis Sativa versus

la clorhexidina al 0.2 % sobre Fusobacterium nucleatum.

2 MÉTODO

2.1 TIPO DE ESTUDIO

Estudio Experimental In Vitro

2.2 CRITERIOS DE INCLUSIÓN

Cepas viables.

2.3 CRITERIOS DE EXCLUSIÓN

Crecimiento atípico.

2.4 MUESTRA

Fusobacterium nucleatum.

2.5 OPERACIONALIZACIÓN DE VARIABLES

VARIABLE DEFINICIÓN OPERACIONALI ESCALA RECOLECCIÓN

ZACIÓN DE Y REGISTRO
MEDICIÓN

18
 Actividad Eliminación de 1.Presente Cuantitativa Halo de
antimicrobiana microorganismos discreta Inhibición(mm)
o inhibición de su 2.Ausente
crecimiento Excel resultados
mediante una Cannabis Sativa.
sustancia

Concentración Concentración 1.20% Cuantitativa Halo de

mínima más baja de un ordinal Inhibición(mm)
inhibitoria antimicrobiano 2.40%
que se necesita Excel resultados
3.60% Cannabis Sativa.
para inhibir el
crecimiento de un 4.80%
microorganismo
5.100%

2.6 HIPÓTESIS

NULA: El aceite esencial de cannabis sativa NO tiene actividad antimicrobiana sobre

Fusobacterium nucleatum.

ALTERNA: El aceite esencial de Cannabis sativa Sí tiene actividad antimicrobiana

sobre Fusobacterium nucleatum.

2.7 PROCEDIMIENTO

Fase 1: selección bacteriana y del aceite esencial.

-Selección de la cepa bacteriana: Fusobacterium nucleatum

-Selección del aceite. Aceite Esencial de Cannabis sativa

Fase 2: Preparación de la solución de trabajo y dilución en diferentes

concentraciones

Se realizó una solución de trabajo con el extracto puro de Cannabis sativa, ya que
por sus características viscosas y resinosas fue imposible tomar las cantidades

19
necesarias con la pipeta para realizar las diferentes diluciones con exactitud. Para
esto se realizó una dilución del extracto en agua destilada y tween 1:1:1, obteniendo
un volumen final de 300 µl; posteriormente, se procedió a realizar las diluciones de
trabajo al 20,40, 60, 80 y 100% en agua destilada.

Concentración Solución de trabajo Agua destilada Volumen final

20% 20 µl 80 µl 100 µl
40% 40 µl 60 µl 100 µl
60% 60 µl 40 µl 100 µl
80% 80 µl 20 µl 100 µl
100% 100 µl 0 µl 100 µl

Fase 3: Activación bacteriana.

La cepa se encontraba conservada a -20°C en suspensión de leche descremada,

se procedió a descongelarla tomando un volumen de 100 µl, y fueron inoculadas en
agar sangre suplementado con hemina y menadiona, utilizando la técnica de
siembra masiva. Luego se incubaron a 37°C por cinco días en condiciones de
anaerobiosis, posteriormente se tomó una UFC y se realizó un pase de siembra por
técnica de rejilla, en agar Wilkins Chalgren suplementado con hemina y menadiona,
se incubaron a 37°C por cinco días en condiciones de anaerobiosis.

Se tomaron 3-5 UFC de una caja previamente sembrada, con asa bacteriológica
para ser solubilizadas en caldo tioglicolato, y así alcanzar una concentración
MacFarland 1 (3x108 células/mililitro).

Se depositó el inoculo y se sembró sobre las superficies de agar Wilkins Chalgren

suplementado con hemina y menadiona, seguido a esto se realizaron pozos sobre
la superficie del agar con un sacabocados estéril de 6mm de diámetro y en cada
uno de ellos se depositaron 20 µl de las diluciones del extracto puro de Cannabis
sativa al 20,40,60,80,100% respectivamente, Clorhexidina al 0,2% (control positivo)
y agua con Tween 20 (control negativo), cada uno de estos ensayos se realizaron
por triplicado, y se procedió a incubar por 24 horas a 37°C, posteriormente se
midieron los halos de inhibición.

20
2.8 RECOLECCIÓN Y ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE LA INFORMACIÓN.

Los datos obtenidos fueron registrados en la base de datos realizada en Excel

llamada resultados Cannabis Sativa. Los análisis fueron realizados por medidas de
tendencia central, medidas de dispersión y T de Student.

2.9 ASPECTOS ÉTICOS

Según la resolución número 8430 de 1993 (octubre 4), artículo 63 aquellas

instituciones investigadoras en las que se realice investigación con
microorganismos patógenos o material biológico que puedan contenerlos deberán
contar con instalaciones y equipo de laboratorio adecuado a las normas estipuladas,
donde se garantice la correcta manipulación de estos microorganismos.

Para la evaluación de riesgo el artículo 67 evalúa las normas técnicas y

correspondientes que clasifican a los microorganismos. Grupo de riesgo l,
microorganismos que representan escaso riego para el individuo y la comunidad.

Los residuos generados por la manipulación de los materiales utilizados en el

laboratorio de microbiología durante el manejo de las cepas bacterianas serán
desechados de acuerdo a los protocolos de manejo de residuos de la universidad
descritos en el Decreto 2676 de 2000 “Por el cual se reglamenta la gestión integral
de los residuos hospitalarios y similares”.

3 RESULTADOS

Concentración mínima inhibitoria del aceite esencial de Cannabis sativa sobre

Fusobacterium nucleatum
Al realizar las pruebas antimicrobianas para determinar la concentración mínima
inhibitoria, se evidenció que al diluir el aceite esencial de Cannabis sativa en Tween
20 y agua, las propiedades antimicrobianas disminuían, por lo cual no fue posible
determinar la concentración mínima, sin embargo, se pudo determinar una actividad
inhibitoria al 100% del aceite esencial sobre Fusobacterium nucleatum con un halo
inhibitorio de 4,2mm ± 0,85 SD.

21
Figura 1. Actividad antimicrobiana del Aceite esencial de Cannabis sativa
sobre Fusobacterium nucleatum
6
0.65
0.85
5
Halo de inhibición (mm)

1
0 0 0 0 0
0
20% 40% 60% 80% 100% clorhexidina agua+tween
Concentración

Efecto del Aceite esencial de Cannabis sativa vs clorhexidina al 0,2% sobre

Fusobacterium nucleatum

Teniendo en cuenta que el aceite esencial de cannabis sativa no mostró efecto

inhibitorio en concentraciones del 20%, 40%, 60%, y 80% no fue posible realizar
una comparación con la clorhexidina; sin embargo, como la concentración del 100%
del aceite esencial de cannabis fue la única que mostró un efecto inhibitorio sobre
fusobacterium nucleatum se realizó la comparación con clorhexidina al 0,2 % y se
observó que el aceite esencial generó un halo de inhibición de 4,2mm ± 0,85 SD,
mientras que la clorhexidina generó un halo de inhibición de 4,6mm ± 0,65 SD. Las
diferencias no fueron estadísticamente significativas con un valor p=0.50

4 DISCUSIÓN

Según los resultados obtenidos, se puede evidenciar que cannabis sativa tiene
efecto antimicrobiano sobre Fusobacterium nucleatum, y que este efecto es similar

22
al de la clorhexidina al 0.2%; aunque no se encontraron estudios similares donde
se determine el efecto antimicrobiano de cannabis sativa sobre Fusobacterium
nucleatum, sí se encontraron estudios del efecto antimicrobiano sobre cepas gram
positivas y gram negativas por lo cual se realizaron algunas comparaciones entre
los estudios.

Ali Esra et al en el 2012 (37) evaluaron la actividad antimicrobiana de Cannabis

sativa como aceite esencial y en dilución en éter de petróleo y metanol, cada uno
de estos sobre cepas gram positivas (Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus),
gram negativas (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa) y hongos(Aspergillus
niger y Candida albicans.). Sus resultados se pueden comprar con los de este
estudio ya que el aceite esencial presentó actividad moderada sobre las cepas gram
negativas (15mm en halo de inhibición).

Hossein Sarmadyan et al en el 2014(31) determinaron el efecto del extracto hidro-

alcoholico de cannabis sativa en infecciones nosocomiales, lograron determinar que
el extracto de cannabis sativa tuvo efecto sobre las cepas gram positivas como
Staphylococcus aureus, mientras que sobre cepas gram negativas (Pseudomonas)
no mostraron efecto antimicrobiano por lo cual se evidenció cierta resistencia.

Otro estudio realizado por Lorenzo Nissen et al en el 2010(30) caracterizaron y

evaluaron la actividad antimicrobiana de aceites esenciales de variedades
industriales de cáñamo (Cannabis sativa), sobre microorganismos gram
positivos(streptococcus salivarius subsp. , Thermophilus, Enterococcus y
Clostridium spp ), gram negativas(Pseudomonas savastonoi, Pectobacterium
carotovorum subsp. Carotovorum) y levaduras (Torulospora delbrueckii,
Saccharomyces cerevisiae) tomando tres variedades de cáñamo: carmagnola,
fibranova y futura, aunque todas obtuvieron efecto sobre cepas gram positivas, solo
futura mostró tener efecto antimicrobiano sobre cepas gram negativas.

23
5 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

El aceite esencial de Cannabis Sativa si presenta actividad antimicrobiana sobre

Fusobacterium nucleatum al 100%

La actividad antimicrobiana de Cannabis sativa al 100% es similar al de la

clorhexidina al 0,2%.

La mezcla de tween 20 y agua como diluyente inhibe las propiedades

antimicrobianas de cannabis sativa sobre Fusobacterium nucleatum.

24
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m

29
ANEXO 1. PROTOCOLO DE CULTIVO BACTERIANO

Medidas generales de seguridad en el laboratorio.

- Locativas:
- Desinfección de paredes y equipos. (antisépticos).
- Canecas de basura con bolsa roja y verde.
- Guardianes.
- Personales.
- Guates de látex.
- Gorro.
- Tapabocas.
- Bata desechable.
- Gafas de protección.

Materiales de cultivo:

- Cepa bacteriana (fusobacterium nucleatum).

- Aceite de Cannabis Sativa.
- Jarra de anaerobiosis.
- Sobres de anaerobiosis
- Cajas petry
- Asa de jenly
- Agar sangre
- Agar Wilkins Chalgren
- Hemina y menadiona
- Incubadora.
- Alcohol
- Mecheros

1. Preparación del agar: En una balanza analítica se procedió a pesar 60gr de

agar base, se depositó el contenido en un Erlenmeyer y se disolvió en 500ml de
agua destilada, se agitó hasta obtener una solución homogénea sin grumos,

30
 posteriormente se tapó y se llevó al autoclave y esterilizarlo a 120ºC por 1 hora
y se dejaron enfriar los materiales.
2. Adición de la sangre: con una jeringa desechable se agregó directamente a la
mezcla por uno de sus costados, se tuvo en cuenta que no tuviera coágulos ni
estuviera hemolisada, se agitó suavemente y se agregó 5%.
3. Dispensar el medio: Se procedió a rotular las cajas en la tapa y se sirvieron
aproximadamente 20ml en cada una de las cajas petri y se esperó a que se
solidificaran.
4. Preparación de cultivo:

a) En la mesa de trabajo se procedió a poner varios mecheros encendidos,

luego se descongeló la cepa la cual se encontraba a -20ºc en suspensión
de leche descremada, con una micropipeta, se tomó 100 µl y se dispensó
en el agar con un asa por todo el medio de cultivo, en técnica de siembra
masiva.
b) En una jarra de anaerobiosis, se procedió a depositar las cajas petri,
introduciendo un sobre de anaerobiosis, se selló la jarra rápidamente para
llevarla a la incubadora a 37ºc por cinco días.
c) Se tomaron 1 UFC y se realizó un pase de siembra por técnica de rejilla
en agar sangre con hemina y menadiona, se incubaron a 37°C por cinco
días en condiciones de anaerobiosis.
d) Se tomaron 3-5 UFC de una caja petri previamente sembrada, tomando
un asa bacteriológica para ser solubilizadas en caldo tioglicolato y así
alcanzar una concentración MacFarland 1 (3x108 células/mililitro).

5. Dispersión del aceite en el medio: Se depositó el inoculo y se sembró sobre

las superficies de agar Wilkins chalgren suplementado con hemina y menadiona,
seguido a esto, se realizaron pozos sobre la superficie del agar con un
sacabocados estéril de 6mm de diámetro y en cada uno de ellos se depositaron
20µl de las diluciones de Cannabis sativa al 20,40,60,80,100%respectivamente,
Clorhexidina al 0,2% (control positivo) y agua con Tween 20 (control negativo),

31
 cada uno de estos ensayos se realizaron por triplicado. y se procedió a incubar
por 24 horas a 37°C, posteriormente se midieron los halos de inhibición.

PROTOCOLO DE COLORACIÓN GRAM

MATERIALES

a. Cristal violeta.
b. Lugol de Gram.
c. Alcohol-acetona.
d. Safranina o Fucsina de Gram
e. Cultivos bacterianos.

PROCEDIMIENTO

1. Se preparó un extendido fino de una colonia bacteriana y se dejó secar al

aire.
2. Se fijó el material al portaobjeto de modo que no fuera arrastrado durante el
proceso de tinción, pasando el portaobjeto 4 veces sobre la llama del
mechero.
3. Se colocó el preparado sobre un soporte de tinción y se cubrió la superficie
con solución cristal-violeta durante 1 minuto.
4. Se lavó bien con agua destilada.
5. Se cubrió el preparado con solución de yodo (Lugol de Gram) durante un
minuto.
6. Se lavó nuevamente con agua destilada.
7. Se sostuvo el portaobjeto y se bañó la superficie con el decolorante (alcohol
cetona), hasta no arrastrar más colorante violeta (esto requiere
habitualmente unos 10 segundos más o menos).
8. Se lavó nuevamente con agua corriente y colocar el portaobjeto sobre el
soporte, cubrir con safranina o el contra-colorante a utilizar durante un
minuto.

32
9. Se lavó nuevamente con agua destilada y se procedió a examinar el
preparado al microscopio, las bacterias Gram positivas se observaron de
color violeta y las Gram negativas de color rojo o rosadas.

33