VALIDAREA

METODELOR DE
ANALIZĂ

1
 Validarea unei metode analitice, conform
Farmacopeei Statelor Unite ale Americii 28, este procesul
prin care se stabilește prin studii de laborator, dacă acea
metodă îndeplinește condițiile pentru aplicațiile
analitice pentru care a fost pusă la punct.

Validarea este așadar, o etapă importantă în

determinarea reproductibilității și siguranţei metodei,
deoarece poate confirma dacă metoda este potrivită
pentru a fi utilizată pentru un anumit sistem.

2
 În laboratoarele de analiză, validarea are la bază
standarde, cum ar fi:
•Bunele practici de producţie (Good Manufacturing Practices -
GMP)
•Bunele practici de laborator (Good Laboratory Practices - GLP)
•Bunele practici clinice (Good Clinical Practices - GCP) etc.
Alte reguli pentru validare sunt stabilite de:
•Organizația Internațională a Standardelor (ISO) în seriile 9000
și 17025
•Normele Europene (EN 45001)
•Farmacopeea Statelor Unite ale Americii (United States
Pharmacopoeia - USP)
•Agenția Alimentelor și Medicamentului (Food and Drug
Administration - FDA)
•Agenția pentru Protecția Mediului (Environmental Protection
Agency - EPA).
3
 Este important de precizat că la ora actuală nu există un
consens în ceea ce priveşte diferitele documente de
reglementare internaţională (ISO, ICH, Afnor, Sanco, FDA, ANM,
Conferinţa de la Washington) pentru definirea criteriilor care
trebuie testate în faza de validare.
De exemplu criteriul de liniaritate este prezentat diferit
de la un document la altul, în cazul în care acesta apare printre
criterii.
Acelaşi lucru se întâmplă pentru exactitatea mediei care
poate fi confundată cu exactitatea în unele documente.
Ca o paranteză, în limba română confuzia este foarte
uşoară, datorită faptului că pentru termenii din limba engleză şi
franceză (trueness/justesse şi accuracy/exactitude) există un
singur cuvânt românesc - exactitate.
De aceea s-a propus pentru trueness echivalentul
exactitatea mediei pentru că se referă la exactitatea dintre
media mai multor măsurători şi o valoare convenţională
adevărată. 4
Criterii de validare după Farmacopeea Europeană

Determinarea Determinarea
Teste pentru
principiului activ impurităţilor sau Teste farmaco-
Criterii limitele de
sau a produşilor produşilor de tehnice
impurităţi
finiţi degradare
Fidelitatea Da Da
Da Nu
(precizia)
Exactitatea Da Da
Nu Nu
(acurateţea)
Limita de Da Da
Nu Nu
detecţie
Limita de Da Da
Nu Nu
cuantificare
Da Da Da Da
Specificitatea
Intervalul de Da Da Da Da
validitate
Da Da Da
Liniaritatea Nu
Da Da Da Da
Robusteţea
5
 Criterii de validare după Comunitatea Economică
Europeană (CEE)
METODA CRITERII DE VALIDARE

Identificarea/ detecţia − specificitatea

− specificitatea
Determinarea conţinutului de
− limita de detecţie
impurităţi
− limita de cuantificare
− specificitatea
− fidelitatea
− repetabilitatea
Determinarea conţinutului
− reproductibilitatea
(concentraţiei) sau a activităţii
− exactitatea
substanţei active
− liniaritatea
− intervalul de liniaritate
− sensibilitatea

6
 Normele IUPAC menționează că validarea poate fi:

•Validare într-un singur laborator – atunci când se

verifică viabilitatea metodei înaintea unui studiu în
colaborare (între mai multe laboratoare) și asigură faptul
că metoda pusă la punct este utilizată corect.

•Validare completă – caracteristicile metodei au fost

verificate de multiple laboratoare, în colaborare.

7
 SPECIFICITATEA / SELECTIVITATEA
În limbajul comun, termenii de specificitate şi
selectivitate sunt deseori interschimbabili.
O metodă este specifică dacă este adecvată pentru un
singur analit, în timp ce o metodă este selectivă dacă poate fi
utilizată pentru mai mulţi analiţi care pot fi însă diferenţiaţi
sau, cu alte cuvinte, reprezintă capacitatea unei metode de a
cuantifica cu acurateţe şi specific analitul sau analiţii în
prezenţa altor compuşi.
Selectivitatea implică capacitatea de a separa analitul de
produşii de degradare, metaboliţi (în cazul medicamentelor)
şi alţi compuşi prezenţi în probă.
În cazul medicamentelor, USP 28, defineşte
specificitatea ca fiind capacitatea de a analiza analitul în
prezenţa altor componenţi cum ar fi impurităţi, produşi de
degradare şi matricea. 8
 IUPAC şi AOAC (Asociația Stiințifică Dedicată
Excelenței în Metode Analitice) utilizează termenul de
selectivitate mai mult decât cel de specificitate pentru
metodele care sunt complet selective, pe când USP, ICH
(Conferința Internațională De Armonizare A Cerințelor
Tehnice Pentru Înregistrarea Produselor Farmaceutice
de Uz Uman) şi FDA folosesc termenul specificitate.

9
 În tehnicile cromatografice, selectivitatea metodei
poate fi dovedită printr-o bună separare între analit şi
alte componente (cum ar fi excipienţi, impurităţi,
produşi de degradare şi metaboliţii).
Rezoluţia de separare a analitului trebuie să fie de
1,5-2 ori mai mare decât a celorlalte componente.
Pentru a împiedica coeluţia altor substanţe,
trebuie să fie cercetată puritatea peak-ului analitului.
De exemplu, pentru a determina puritatea peak-
ului se apelează la spectrul UV-VIS .

10
 Spectrul UV-VIS al analitului poate fi înregistrat la
mijlocul peak-ului sau pe pantele peak-ului.

11
 Pentru punerea la punct a unei metode de analiză
într-un laborator de analiză al medicamentului,
selectivitatea poate fi cercetată foarte simplu prin
injectarea sau spotarea de etaloane sau martori
(blank).
Sistemul cromatografic studiat va trebui să
realizeze separarea analitului, iar puritatea şi
identificarea peak-ului analitului se va realiza prin
comparare cu peak-ul etalonului.

12
 Peak-ul cromatografic poate fi considerat pur dacă
factorul de separare calculat la lungimi de undă diferite este
constant.
Compararea semnalelor la diferite lungimi de undă
poate fi utilizată pentru demonstrarea purităţii peak-urilor.
S-a propus utilizarea lăţimii peak-ului măsurată la mijlocul
înălţimii, precum şi simetria peak-ului.
Chiar dacă peak-urile analitului şi a etalonului sunt
identice, proba poate conţine o impuritate cu spectru
similar analitului.
Cele mai selective metode de analiză aplicate la probe
biologice sunt cele combinate:
 LC–UV;
 LC–MS;
 GC–MS;
 GC–FTIR. 13
 LINIARITATEA
Liniaritatea reprezintă capacitatea metodei de a
produce rezultate direct sau indirect proporţionale cu
concentraţia analitului din probă pe un anumit interval
de concentraţii.
De obicei, liniaritatea este reprezentată printr-o
curbă de regresie liniară a valorii măsurate ca o funcţie a
creşterii concentraţiei analitului
Pe de altă parte, liniaritatea rezultatelor unei
proceduri de analiză reprezintă capacitatea acesteia de a
obţine rezultate direct proporţionale cu concentraţia
analitului din probă.
Criteriul de liniaritate se aplică pentru rezultatele
obţinute, adică pentru relaţia dintre concentraţia
calculată experimental pe baza funcţiei de răspuns şi cea
introdusă (calculată teoretic). 14
 Liniaritatea funcţiei de răspuns poate fi evaluată
vizual de pe diagrama ce reprezintă modificarea
semnalului funcţie de conţinutul sau concentraţia
analitului.
Dacă există o relaţie liniară, testul trebuie să fie
evaluat prin metode statistice, de exemplu prin calculul
dreptei de regresie folosind metoda celor mai mici
pătrate.
În anumite cazuri, pentru a obţine liniaritatea
între răspuns şi concentraţia probei, datele
experimentale trebuie supuse unei transformări
matematice înainte de analiza lor prin regresie.

15
 În urma analizei de regresie se vor calcula
parametri cum sunt: coeficientul de corelaţie (r),
coeficientul de regresie (r2), interceptul cu ordonata,
panta şi deviaţia standard a dreptei de regresie,
suma reziduală a pătratelor etc.
De asemenea, se va reprezenta grafic
dependenţa semnalului de concentraţia analitului
din probă.
Intervalul de linearitate ce trebuie cercetat
depinde de scopul metodei analitice şi se consideră
în general ±20% faţă de concentraţia ţintă, dar poate
ajunge până la 150% din concentraţia ţintă.

16
 Pentru teste de puritate, intervalul în care
metoda trebuie să fie liniară cuprinde limita de
cuantificare şi 30% peste concentraţia ţintă.
Testele de stabilitate au un interval de 0–2% faţă
de concentraţia ţintă, iar cele de dizolvare ±20% faţă
de concentraţia ţintă
Pentru evaluarea liniarităţii sunt necesar minim
5 valori ale concentraţiei pentru cel puţin trei serii
de soluţii de substanţe standard de diferite
concentraţii (de regulă concentraţia de interes ± 20
până la 50% pentru valorile extreme de
concentraţie).
Pentru metodele TLC, curba de calibrare trebuie
obținută pentru fiecare placă ce va conține
etaloanele și probele necunoscute.
17
 Metoda statistică cea mai utilizată pentru a găsi cea
mai bună corelare între curba de calibrare şi date
precum şi tipul de curbă de calibrare care oferă cea mai
bună corelare, este regresia liniară sau metoda celor mai
mici pătrate.
Pentru a compara două curbe de calibrare este
necesară măsurarea celei mai bune corelări a etalonului
la linie, în care scop se utilizează parametrii coeficientul
de corelaţie şi eroarea standard a regresiei.
Coeficientul de corelaţie, este o măsură a asocierii
liniare dintre două variabile, cu alte cuvinte a gradului în
care reprezentarea bivariată sub forma unei diagrame de
împrăştiere se apropie de o dreaptă.

18
 Coeficientul de corelaţie ia valori intre -1 şi +1
inclusiv, cu semnificaţia de asociere pozitivă /
negativă după semnul coeficientului şi de lipsa de
asociere pentru rxy = 0.
O valoare de +1 indică o relaţie liniară perfectă
între semnalul analitic şi concentraţie cu semnalul
în creştere, iar o valoare -1 indică o relaţie liniară
perfectă cu semnalul analitic în scădere.
Coeficientul de corelaţie nu indică liniaritatea
dacă nu are o valoare ce depăşeşte r = 0,999.
Pentru valori mai mici trebuie calculaţi şi alţi
parametri, ca de exemplu testul ANOVA pentru
regresie.
Cea mai comună metodă de calibrare constă în
prepararea unor soluţii standard de concentraţie
cunoscută, ce acoperă domeniul de concentraţie în
care se află proba de analizat. 19
 EXACTITATEA MEDIEI
(BIAS = EROARE SISTEMATICĂ)

Exactitatea mediei unei proceduri analitice

exprimă îngustimea acordului între valoarea medie
obţinută dintr-o serie de măsurători şi o valoare care
este acceptată fie ca valoare convenţional adevărată,
fie ca valoarea acceptată (de exemplu, standard
internaţional, standard al farmacopeei).

20
 PRECIZIA
Precizia exprimă îngustimea acordului (gradul
de dispersie, coeficientul de variaţie) dintre o serie de
măsurători care provine din mai multe serii ale
aceleiaşi probe omogene (rezultate independente) în
condiţii identice de lucru.
Precizia oferă date asupra erorilor
întâmplătoare şi nu are nici o legătură cu valoarea
adevărată. Deoarece toate măsurătorile conţin erori
întâmplătoare, rezultatul unei singure măsurători nu
poate fi acceptat ca valoare adevărată.
Pentru a prezice domeniul în care se găseşte
valoarea adevărată este necesară o estimare a acestei
erori, acest lucru făcându-se prin repetarea
măsurătorii de mai multe ori.
Din acest proces se obţin doi parametri
importanţi şi anume valoarea medie şi variabilitatea
măsurătorilor.
21
 Cea mai utilizată modalitate de măsură a valorii
medii este media aritmetică, calculată utilizând formula:
n

_ ∑x i
x= i =1

(suma valorilor măsurătorilor raportată la numărul

total de măsurători).

Deoarece erorile întâmplătoare sunt distribuite

normal, modul comun de măsură a variabilităţii
(preciziei) este deviaţia (abaterea) standard (σ).
Valoarea deviaţiei (abaterii) standard se calculează
utilizând relația:
2
n
 
_

∑  x i− x

σ= i =1

n
22
 Dacă setul de date este limitat, valoarea medie
este adesea aproximată ca valoare adevărată, fiind
necesară estimarea abaterii standard. În acest caz,
valoarea abaterii standard, notată cu SD, se calculează
cu formula:
2
n
 _

∑  x i − x

SD = i =1

n −1

Odată ce numărul de valori din setul de date

creşte, valoarea SD se va apropia de valoarea σ.
23
 Un alt termen comun utilizat pentru a măsura
variabilitatea este coeficientul de variaţie (CV) sau
deviaţia standard relativă (RSD), care se exprimă ca
procent, conform formulei de mai jos:
SD SD
RSD = % RSD = ⋅100
_
x
sau _
x

Criteriul acceptat pentru valoarea abaterii

standard relative (RSD) în studiul preciziei metodei
este RSD ≤ 2% (n ≥ 6).
Precizia este importantă în mod particular atunci
când în analiză este implicată şi o etapă de pregătire a
probei.
24
 Variabilitatea poate afecta exactitatea.
Se cunoaşte faptul că reproductibilitatea unei
analize descreşte disproporţional cu scăderea
concentraţiei.
Incertitudinea în analiza urmelor creşte
exponenţial comparativ cu componenţii majori şi
minori.
De la acest fapt pot apărea abateri în situaţiile în
care există etape de pregătire a probei.
Pe de altă parte, modul de pregătire a probei
rămâne un proces riguros care influenţează
majoritatea variabilităţilor.

25
 Precizia caracterizează gradul de concordanţă a
rezultatelor analitice între ele, la aplicarea repetată a
metodei de analiză pe aceeaşi probă omogenă sau
eşantion pregătit pentru analiză în condiţii identice.
Precizia arată cât de aproape se află valorile
măsurate una faţă de alta pentru un număr de
măsurători în aceleaşi condiţii.
Normele elaborate de ICH (International
Conference of Harmonization) definesc precizia ca
fiind formată din 3 componente: repetabilitatea,
precizia intermediară şi reproductibilitatea.

26
 Repetabilitatea: rezultatele independente sunt
obţinute folosind aceeaşi procedură, pe probe
identice, în acelaşi laborator, de către acelaşi
operator, utilizând acelaşi echipament şi într-un
interval scurt de timp.
Repetabilitatea analizei (precizia intra – probă)
se studiază utilizând un minim de 9 determinări
acoperind domeniul specific de concentraţie (de
exemplu 3 determinări la 3 valori ale concentraţiei),
sau un minim de 6 determinări la o valoare de 100%
din concentraţia soluţiei ce urmează a fi testate.

27
 Precizia intermediară: rezultatele independente
sunt obţinute folosind aceeaşi procedură, pe probe
identice, în acelaşi laborator, de către diverşi
operatori, folosind echipamente diferite şi într-un
interval de timp dat.

Reproductibilitatea: rezultatele independente

sunt obţinute folosind aceeaşi procedură, pe probe
identice, în laboratoare diferite, de către diverşi
operatori şi folosind echipamente diferite.

28
 ACURATEŢEA (EXACTITATEA)
Normele elaborate definesc acurateţea
(exactitatea) ca o caracteristică a apropierii
rezultatelor analitice de valoarea adevărată.
Exactitatea este o măsură a deviaţiei valorii
medii găsită prin analiză, faţă de valoarea adevărată.
Acurateţea se evaluează prin aplicarea metodei
de analiză studiată, la probe cu concentraţii
cunoscute.
La efectuarea acestor analize probele se
analizează faţă de soluţii etalon corespunzătoare sau
faţă de martori, pentru a se înlătura astfel efectul
interferenţelor.
29
 O altă variantă este constituită de compararea
rezultatelor obţinute prin metoda nouă cu cele
obţinute printr-o metodă deja cunoscută, despre care
se ştie că prezintă acurateţe.
Pentru substanţe medicamentoase, testul de
acurateţe se efectuează frecvent prin adăugarea unei
cantităţi cunoscute din analit, prin cântărire sau prin
măsurarea unui volum de soluţie (analit dizolvat în
solvent), la soluţia placebo, astfel încât să se obţină
concentraţii cu valori în domeniul de detecţie al
analitului.
Pentru forme farmaceutice cum sunt
comprimatele, supozitoarele, cremele etc., acest fapt
poate însemna evaluarea potenţialelor interacţiuni
ale substanţei active cu excipienţii în soluţie.
30
 Acest test evaluează specificitatea metodei în
prezenţa excipienţilor în condiţiile utilizate pentru
analiza acelui compus activ.
Se recomandă ca studiile de exactitate pentru
substanţe active sau diverse produse să se
efectueze la nivele de 80%, 100% şi 120% (un
interval de 80 – 120% sau chiar 75 – 125% din
concentraţia reală).
Aceste soluţii se utilizează pentru studiile de
acurateţe numite “amestecuri sintetice” sau
“preparate realizate în laborator”.
În cazul metodei de analiză prin adaos de
standard, concentraţia dispersată este în intervalul
50 – 150% din valoarea de interes şi se realizează
prin dispersarea concentraţiilor cunoscute de
analit în probe biologice (ser, plasmă etc.).
31
 La fiecare nivel de concentraţie studiat se
evaluează probe replicate.
Valoarea deviaţiei standard relative (RSD) a
rezultatelor obţinute în urma calculului pe aceste
probe replicate vor furniza variaţia analizei sau
precizia metodei.
Valoarea medie reprezentată ca procent indică
exactitatea metodei.
Pentru evaluarea acurateţii se calculează
regăsirea în procente, calcule ce se fac pe baza
rezultatelor experimentale obţinute.
Intervalul în care se acceptă rezultatele testului
de regăsire este cuprins între 98 şi 102% sau 95 şi
105%. 32
 Pentru probele biologice, regăsirea poate fi ± 20%
din concentraţia reală.
În cazul determinării unui analit aflat în urme,
criteriile de acceptare sunt cuprinse între 80 – 120%,
pentru mai mult de 100 ppb şi 60 – 100%, sub 100 ppb
146.
Pentru impurităţi, criteriile acceptate sunt ± 20%,
pentru o concentraţie a impurităţilor ≤ 0,5% şi de ±
10% pentru o concentraţie de impurităţi ≥ 0,5% 146.
Pentru a elimina posibilele erori ce pot apare pe
parcursul determinărilor, se va calcula media
valorilor obţinute.

33
Valorile acceptate în studiul acurateţii şi preciziei pentru
diferite concentraţii de analit

Concentraţia unităţi regăsirea precizia

analitului(%) medie (RSD %)

34
 LIMITA DE DETECŢIE

Limita de detecţie (LD) reprezintă cantitatea

minimă dintr-un anumit component ce se poate pune
în evidenţă, faţă de o probă martor, cu o anumită
limită de încredere (în general 1%).
În metodele cromatografice estimarea LD se
efectuează pe baza evaluării raportului semnal/
zgomot de fond (linie de bază).
Pentru estimarea limitei de detecţie, în
general se consideră acceptabil un raport semnal /
zgomot de 3/1 sau 2/1.

35
 Estimarea LD se mai poate face şi pe baza deviaţiei
standard şi a pantei dreptei de regresie şi se realizează utilizând
formula: 3 ⋅σ
LD =
P
unde σ reprezintă deviaţia standard a dreptei de regresie, iar P
reprezintă panta dreptei de regresie.
Pentru estimarea deviaţiei standard a dreptei de regresie se pot
utiliza mai multe metode:
 pe baza deviaţiei standard a probelor martor se măsoară
magnitudinea semnalului de fond pentru un număr mare de probe
martor şi se calculează deviaţia standard a valorilor obţinute;
 pe baza curbei de calibrare trebuie să se construiască şi să se
studieze o curbă de calibrare specifică folosind probe ce conţin
analitul într-un domeniu de concentraţie apropiat de limita de
detecţie.
36
 LIMITA DE CUANTIFICARE (LQ)

Limita de cuantificare (LQ) reprezintă cantitatea

minimă dintr-un anumit component identificat ce se poate
cuantifica cu certitudine.
Estimarea LQ pe baza evaluării raportului
semnal /zgomot se realizează prin compararea
semnalelor măsurate pentru probe cu o concentraţie
scăzută şi cunoscută a analitului şi probe martor
urmată de stabilirea concentraţiei minime la care
analitul poate fi cuantificat cu fidelitate.
Pentru estimarea limitei de cuantificare, în
general se consideră acceptabil un raport semnal /
zgomot de 10/1.
37
 Valoarea estimată trebuie să fie validată prin analize
independente a unui număr adecvat de probe la care se
cunoaşte faptul că sunt preparate astfel încât sa conţină
concentraţii aproape de limita de cuantificare.

În general, limita de cuantificare (LQ) se calculează

prin multiplicarea cu 3 a limitei de detecţie (LD):
LQ = 3 x LD

38
 ROBUSTEŢEA ŞI STABILITATEA METODEI

Robusteţea unei metode analitice se defineşte prin

măsurarea capacităţii metodei de a rămâne neafectată de variaţii
mici, deliberate, ale unor parametri. De aceea, parametrul oferă o
indicaţie a reabilitării metodei pe parcursul utilizării.
Dacă măsurătorile sunt susceptibile de variaţii în ceea ce
priveşte condiţiile analitice, aceste condiţii trebuie să fie controlate
sau trebuie luate anumite măsuri de precauţie.
O consecinţă a robusteţei este aceea că se stabilesc o serie de
parametri de sistem pentru a ne asigura că validitatea procedeului
analitic se menţine ori de câte ori se utilizează.
Stabilitatea unei metode analitice reprezintă gradul de
reproductibilitate a rezultatelor obţinute pe aceeaşi probă, în
condiţii diferite, cum sunt: laboratoare diferite, analişti diferiţi,
aparatură diferită, diferite loturi de reactivi, zile diferite de lucru
etc. 39
 În studiul robusteţii metodelor cromatografice pe
strat subţire trebuie studiată influenţa pe care o
manifestă următorii factori:
 temperatura;
 umiditatea;
 metoda de aplicare a spoturilor;
 forma şi mărimea spoturilor;
 compoziţia fazei mobile;
 pH-ul;
 tipul de strat subţire utilizat;
 volumul de probă aplicat;
 forma bacului;
 condiţiile de uscare a placilor.

40
 Pentru metodele HPLC trebuie studiată influenţa
următorilor factori asupra robusteţii metodei:

 viteza de curgere a fazei mobile;

 temperatura în coloană;
 tipul de coloană cromatografică;
 volumul injectat;
 compoziţia faze mobile;
 pH;
 lungimea de undă de detecţie.

41
 Pentru studii pe lichide biologice, trebuie cercetată
stabilitatea analitului în mediul biologic.
Trebuie cercetată o eventuală degradare în perioada
dintre recoltarea probei și analiză.
Instabilitatea analitului poate fi provocată de diverși
factori, precum: interacțiuni cu recipientul, aerul,
descompunerea termică, evaporarea componenților volatili sau
fotoliză.
Pentru a limita degradarea pot fi efectuate unele
prelucrări ale probei precum răcirea sau chiar congelarea
probei, păstrarea în loc ferit de lumină, adăugarea unor agenți
stabilizanți, ajustarea pH-ului, derivatizarea, utilizarea
inhibitorilor enzimatici.

42
 Validarea metodelor analitice trebuie efectuată de
către toate laboratoarele de analiză și urmăreşte testarea
parametrilor principali ai validării pentru a asigura
acurateţea, precizia, specificitatea, reproductibilitatea şi
robusteţea metodei pentru intervalul de concentraţie în
care poate fi studiat analitul.

43