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Métodos Espectroscópicos para análisis

de Fármacos

Prof. Maritza F. Díaz Gómez


Escuela de Química y Farmacia
E-mail: maritza.diaz@unab.cl

Prof. M.Diaz
Espectroscopia

• Estudio de las interacciones de la radiación


electromagnética con átomos y moléculas

Interacciones

Absorción Emisión

Dependiendo de la longitud de onda de la radiación absorbida o emitida, los


métodos espectroscópicos se clasifican en:

Espectroscopia Espectroscopia
Espectroscopia
Ultra Violeta IR
Visible
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RADIACION ELECTROMAGNETICA
Es una combinación de campos eléctricos y magnéticos
oscilantes, que se propagan a través del espacio transportando
energía por medio de ondas.

La radiación solar es el conjunto de radiaciones


electromagnéticas emitidas por el Sol.
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LONGITUD DE ONDA λ AMPLITUD FRECUENCIA ν

RELACION ENTRE λ y ν

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CARACTERISTICAS DE LA LUZ
TIENE UNA NATURALEZA DUAL
• Como onda
LA LUZ • Como una corriente de partículas o paquetes de
energía (fotones)

Es la partícula portadora de todas las formas


EL FOTON de radiación electromagnética, incluyendo los rayos
gamma, los rayos x, la luz ultravioleta, la luz visible,
la luz infrarroja, las microondas y las ondas de radio. El
fotón tiene una masa invariable cero
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CARACTERISTICAS DE LA LUZ

Albert Einstein desarrolló en 1905 la teoría de que la luz


estaba compuesta de unas partículas denominadas fotones,
cuya energía era inversamente proporcional a la longitud de
onda de la luz

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Espectro electromagnético

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METODOS ESPECTROSCOPICOS
Se basan en la medición de la radiación electromagnética emitida o
absorbida por los analitos
Se clasifican de acuerdo con la región del espectro electromagnético que se utiliza.
Estas incluyen los rayos X, rayos ultravioleta, infrarrojo, microondas y radiofrecuencias
METODOS DE Se basan en la disminución de la potencia o atenuación de un haz de
ABSORCION radiación EM como consecuencia de su interacción con el analito.

METODOS DE Utilizan la radiación emitida cuando un analito es excitado por


EMISION cierta cantidad de energía térmica, eléctrica o radiante.

METODOS DE Se basan en la radiación emitida por el analito, solo que en este


FLUORESCENCIA caso la radiación emitida se genera por exposición de la muestra a
un haz de radiación electromagnética originada en una lámpara.
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Históricamente, los primeros métodos
espectroscópicos se restringían al uso Métodos ópticos
de la radiación visible

Sin embargo, debido a que los instrumentos empleados en estos métodos


tienen alguna similitud, esta terminología se ha empleado a los métodos
que utilizan la radiación UV o IR a pesar que ojo humano no percibe ningún
tipo de irradiación

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https://es.wikipedia.org/wiki/Espectro_visible#/media/File:Electromagnetic_spectrum-es.svg
COLORES
Las longitudes de onda mas largas que las del rojo se
les conoce como infrarrojas y las mas cortas que el
violeta, ultravioletas.

Ultravioleta Luz visible Infrarrojo

102 -104 ~ 104 104-107

UV Violeta Azul Verde Amarillo Naranja Rojo IR


4000 A Espectro Visible 7500 A

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COLORES

ESPECTRO VISIBLE DEL ESPECTRO ELECTROMAGNETICO

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COLORES COMPLEMENTARIOS DEL ESPECTRO VISIBLE

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Aplicaciones de la Espectroscopia de absorción
UV-Visible

Análisis Cualitativo: Estudiando la localización de los


máximos de energía de un espectro, se pueden identificar y
diferenciar unos elementos de otros

Análisis Cuantitativo: La intensidad de absorción de cada


elemento, a su λ característica, es mayor cuanto mayor sea su
concentración

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ANALISIS CUALITATIVO

Si hacemos un barrido espectral y


representamos gráficamente la intensidad
de absorción de radiación en función de la
Huella Dactilar
λ de la radiación

Los espectros de absorción de


cada elemento son únicos,
presentan máximos de energía
(picos), a λ característica y con
distinta intensidad

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ANALISIS CUANTITATIVO PROCESO DE ABSORCION

Cuando un rayo de luz monocromática con una intensidad I0


pasa a través de una solución, parte de la luz es absorbida
resultando que la luz emergente I es menor que I0
Luz incidente (I0) Luz absorbida Luz emergente (I)

a a = absortividad

I0
I
c = concentración.
(número de partículas por cm3)

b Longitud del medio absorbente o ancho de


la celda Prof. M.Diaz
PROCESO DE ABSORCION

a es una constante de proporcionalidad


ABSORTIVIDAD que comprende las características
(a) químicas de cada compuesto, o molécula
y su magnitud depende de las unidades
utilizadas para b y c.

Cuando se expresa la concentración en moles por litro y la trayectoria a través


de la celda en centímetros, la absortividad se denomina absortividad molar y
se representa con el símbolo e .
En consecuencia cuando b se expresa en centímetros y c en moles por litro.
A = ebc
Donde A representa la absorbancia del compuesto
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Las leyes de Lambert y Beer

Ley de
Lambert
• Los fundamentos de la
interrelación de la luz que
se absorbe y la que se
transmite

Ley de
Beer
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Ley de Lambert
Cuando un rayo de luz
Ley de monocromática (I0) pasa a través de
Lambert un medio absorbente, su intensidad
disminuye exponencialmente (I) a
medida que la longitud del medio
absorbente aumenta

I = I0e-ab

I0 I I0 I
I0 I

1 cm. 2 cm. 3 cm.

Ancho de la celda Prof. M.Diaz


Ley de Beer
Cuando un rayo de luz
monocromática pasa a través de
Ley de Beer
un medio absorbente, su
intensidad disminuye
exponencialmente a medida que la
concentración del medio
absorbente aumenta

I = I0e-ac

I I
I0 I I0 I0

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La ley
Ley de Lambert + Ley de Beer = de
Lo que significa que combinando ambas leyes se crea la Ley
de Beer-Lambert donde la fracción de luz incidente que es Lambert -
absorbida por una solución es proporcional a la Beer
concentración de soluto y al espesor de la sustancia
atravesada por la luz. La relación entre la luz incidente
(I0) y la reflejada (I) dará una idea de la cantidad de
radiación que ha sido absorbida por la muestra.

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La ley de Lambert -Beer
I = I0e-abc
Si despejamos: I/I0 = e-abc
Al cociente de las intensidades se denomina Transmitancia
T = I/I0 = e-abc
Sacando logaritmos:
Loge I/I0 = abc
Convirtiendo a log10: Log10 I/I0 = 2.303 abc
Log10 I/I0 = abc
Absorbancia = Log10 I/I0 = abc

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La ley de Lambert -Beer

Es la relación entre la intensidad de luz


Transmitancia transmitida por una muestra problema
(T) (I) con la intensidad de luz incidente
sobre la muestra (Io):

T = I / I0
Se expresa como % T

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La ley de Lambert -Beer

Es directamente proporcional a la longitud del


recorrido b a través de la solución y la
Absorbancia concentración c del color absorbente.
Estas relaciones se dan como:

A = a·b·c
A menudo b es dada en términos de cm.
c en gramos por litro,
la absortividad tiene unidades de l·g–1·cm–1.

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La ley de Lambert -Beer

¿Qué relación
De acuerdo a las características de la
guardan la
sustancia analizada, la luz que no se
transmitancia y
absorbe atraviesa la solución
la absorbancia? LUZ
A
B Luz transmitida
S
O

I0 R
B
I
I
D
A
T = I/I0
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La ley de Lambert -Beer
Por lo tanto la absorbancia es reciproca de la transmitancia

% Transmitancia contra concentración


Absorbancia contra concentración (pendiente con signo negativo y
(comportamiento lineal) comportamiento exponencial)

Absorbancia % Transmitancia

Concentración

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La ley de Lambert -Beer
Absorbancia
(A)

De lo anterior se desprende que la Absorbancia (A) o luz


que es absorbida por la muestra es igual al logaritmo en
base diez del recíproco de la transmitancia (T) o bien al -
log10 de la transmitancia, en el que el disolvente puro o
(“blanco”) es el material de referencia; esto es:

A =– log10 T
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La ley de Lambert -Beer
La representación gráfica correspondiente a absorbancia y
transmitancia en un gradiente de concentraciones es la
siguiente:

Concentr
ación

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La ley de Lambert -Beer

Obtención de TRANSMITANCIA utilizando valores de Absorbancia

Con base en la relación: T = 10-abc


y considerando que T se menciona en porcentaje (%)
%T = 10-abc x 100.
Aplicando logaritmos a la expresión anterior
log10 %T = -abc log 10 10 + log10 100
Invirtiendo términos
log %T = log10 100 -abc log 10 10 = 2 – abc * 1
log10 %T = 2 – abc
Como abc = Absorbancia = A
log10 %T = 2 – A.
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La ley de Lambert -Beer

log10 %T = 2 – A

Ejemplo:
Una absorbancia de 0.6 ¿a que equivale en % T?
Log10 % T = 2 – 0.6 = 1.4
Log10 % T = 1.4
%T = antilog101.4
% T = 25

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La ley de Lambert -Beer

Obtención de absorbancia a partir de un


valor de % de transmitancia

RECORDANDO: A = log10 1/T


Ejemplo de cálculo
%T = 30
T = 0.30
Sustituyendo (1/T) 1/0.30 = 3.33
Log10 3.33 = 0.523 de absorbancia

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Ejercicio 1. Una disolución de concentración C
tiene una transmitancia del 80%. Determinar el
porcentaje de transmitancia de una disolución
de la misma sustancia de concentración 3C
Ejercicio 2. Una disolución tiene una transmitancia de
0.10 a una cierta λ,
a) determinar su absorbancia
b) si su concentración es de 0.020 g / l, su masa
molecular de 100 y su transmitancia fue medida en
celdas de 1.0 cm, determinar su absortividad y su
absortividad molar. Prof. M.Diaz
Limitaciones de La ley
de Lambert -Beer
• Solo describe bien el comportamiento de disoluciones diluidas (< 10
μmolar).

• Desviaciones químicas: moléculas estables en disolución y sin


partículas en suspensión.
No se cumple cuando el analito se asocia, disocia o reacciona con el
disolvente para dar lugar a un producto que presenta un espectro de
absorción diferente.

• Desviaciones instrumentales: Solo se cumple con radiaciones


monocromáticas (está formada por una sola λ correspondiente a un
solo color). Prof. M.Diaz
Importancia de la Ley de Lambert Beer

En química analítica resulta muy interesante la


medida de la cantidad de luz absorbida por una
sustancia a una determinada λ, puesto que a
través de la aplicación de la ley de Lambert
Beer podemos relacionar dicha absorción de
radiación con su concentración

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CUANTIFICACION DE SUSTANCIAS POR
ESPECTROFOTOMETRIA

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CUANTIFICACION DE SUSTANCIAS POR
ESPECTROFOTOMETRIA

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Métodos de cuantificación

• Curva de calibración con estándares


externos

• Método de adición estándar:


- a volumen final constante
- a volumen variable

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Curva de calibración con estándares externos

Los estándares de calibración deben aproximarse en lo


posible a la composición general de las muestras

Patrones

Blanco Muestra

C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8


A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8 AXProf. M.Diaz
A0
CURVA DE CALIBRACION
Valores X Valores Y
Pendiente
Intercepto Concentración
Absortividad
0 0.01
A 0,7
2 0.1
0,6
4 0.2 A = 0,0066 +0,0490*C
0,5
6 0.3
0,4
8 0.405
0,3
10 0.5 y = 0,049x + 0,0066
R² = 0,9996
0,2
12 0.59
0,1
Muestra 0.34
0
0 2 4 6 8 10 12 14

C = 0,340- 0,0066/0,0490 = 6,80 mg/L C

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INSTRUMENTACION

ESPECTROFOTOMETRO

 Instrumento empleado para medir la absorbancia que utiliza


un selector monocromático para seleccionar la longitud de
onda.

 Puede usarse en la región UV, Vis e IR.

 Pueden ser de un solo haz o de doble haz.

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INSTRUMENTACION

ESPECTROFOTOMETRO

1
2 3 4

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ESPECTROFOTOMETRO

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INSTRUMENTACION
1. Fuente Radiación
Intensidad continua, estable e intensa en el rango de
longitud de onda que cubre

160-375 nm
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INSTRUMENTACION

2. Selector de longitudes de onda λ


Separa la banda de longitud de onda deseada del resto del espectro y la
dispersa al compartimiento de la muestra.
•Longitud de onda de máxima transmisión
•Ancho de banda efectivo

Monocromadores

•Monocromadores de
prismas

ESPECTROFOTOMETROS
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INSTRUMENTACION
3. CUBETAS

Compartimiento donde se coloca la muestra

CARACTERISTICAS

•Absorción mínima a la longitud de onda de trabajo


•Colocar con caras transparentes perpendiculares a la dirección del haz incidente

UV Visible

Cuarzo Plásticas Vidrio


< 380 nm 380- 780 nm 380- 780 nm

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INSTRUMENTACION
4. DETECTORES

Su función es convertir la respuesta del instrumento en una


señal medible

CARACTERISTICAS
1. Deben responder a un amplio rango de longitudes de onda
2. Deben dar respuestas rápidas.
3. Deben ser sensibles a bajos niveles de irradiación
4. Deben producir señal eléctrica fácilmente amplificable
5. La señal debe ser proporcional a la potencia radiante

Fototubos Fotomultiplicadores Fotodiodos

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Principios básicos de la Espectroscopia UV

Según su energía, la
radiación
electromagnética
puede interaccionar
con la materia de
diferentes formas:

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Como se aplica y se utiliza la Espectroscopia UV-Visible

La absorción de radiación UV-Visible se basa en las


transiciones electrónicas entre niveles energéticos de
los átomos de la muestra:

Los electrones (e-) más externos (los de valencia)


pueden saltar a otro orbital vacío de mayor nivel
energético si se aplica la E adecuada.

Absorción de un fotón cuya E coincida exactamente con la diferencia


entre el estado fundamental (E1) y el estado excitado (E2)
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Como se aplica y se utiliza la Espectroscopia UV-Visible
Especies absorbentes Cromóforos
La absorción de radiación UV-vis por una especie atómica o molecular M se
puede considerar como un proceso en dos etapas:

1.- Excitación M + hv → M*
Electrónica

•El producto de la reacción entre M y el fotón hv es una especie excitada


electrónicamente simbolizada por M*.

2. Relajación en especial la
conversión de esa energía M* → M+ calor
de excitación en calor Prof. M.Diaz
Relajación Molecular

El tiempo de vida medio de un


átomo excitado por absorción de
radiación es breve (10-8 a 10-9 s) . La Procesos de
energía radiante absorbida se disipa relajación
cuando el electrón vuelve a su orbita
fundamental
La energía radiante es la
transmitida en forma de
radiación electromagnética No radiantes: E0
• Emisión de Calor
E1 Radiantes:
Estado Excitado • Reacción fotoquímica Estado Fundamental
• Radiación Fluorescente Prof. M.Diaz
Relajación Molecular

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Tipos de transiciones moleculares

Las moléculas experimentan tres tipos de transiciones


cuando absorben radiación ultravioleta (UV), visible (VIS) o
infrarroja (IR):

Transición Transición Transición


Electrónica Rotacional Vibracional

Movimiento de los La rotación de la Las vibraciones de los


electrones en la molécula molécula como un todo átomos

La Energía Total asociada a un orbital


E = E electrónica + E vibracional + E rotacional
de una molécula está dada por:
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Transiciones moleculares

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Teoría de absorción molecular
La absorción de radiación ultravioleta o visible resulta, generalmente, de la excitación de
los electrones de enlace; como consecuencia, los picos de absorción pueden
correlacionarse con los tipos de enlaces de las especies objeto de estudio

Especie Es aquella que sus electrones más exteriores o electrones


absorbente de enlace sean elevados a niveles de energía más altos al
incidir sobre ella la radiación electromagnética

Clasificación de especies absorbentes de interés en UV visible:

Electrones Electrones
σ, π y n dyf Electrones
de transferencia
• Comp. Orgánicos • Lantánidos de carga
• Aniones inorgánicos • Actínicos Prof. M.Diaz
Especies absorbentes que contienen electrones σ, π y n

Iones y moléculas orgánicas Aniones inorgánicos

Todos los compuestos orgánicos Enlaces tipo σ


absorben REM
Los electrones compartidos en enlaces simples (C-C o C-H) están unidos tan
fuertemente, que la absorción ocurre sólo en la región UV de vacio (l < 180 nm).
En esta región también absorben los componentes de la atmósfera, por lo cual ésta no
es una región útil para hacer mediciones.

Las dificultades experimentales La mayoría de los estudios de


asociadas con el ultravioleta de compuestos orgánicos se llevan
vacío son muy importantes a cabo a λ >185 nm.
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Tipos de electrones absorbentes

Los electrones que contribuyen a la absorción


en una molécula orgánica son:

Enlazantes No Enlazantes n

Electrones externos no
Electrones compartidos que
compartidos, no participan en
participan directamente en la
ningún enlace y están en gran
formación de enlaces entre átomos,
parte localizados alrededor de
asociándose con más de uno de ellos
átomos como oxigeno, halógenos,
azufre y nitrógeno Prof. M.Diaz
Transiciones de Electrones

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Especies absorbentes que contienen electrones σ, π y n

•  a la que absorbe una molécula depende de la fuerza con que retiene


a sus distintos e-.

Enlaces sencillos C-C o C-H:  de la región del UV de vacío (<180 nm)


Enlaces dobles o triples:  de la región del UV
Compuestos orgánicos que contienen S, Br y I: absorben en la región
UV

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Especies absorbentes que contienen electrones σ, π y n

Grupo Grupo atómico presente en una molécula que lleva asociada una
Cromóforo banda de absorción electrónica ejemplos C = O, C = C, N = N…..

 La absorción de radiación visible y ultravioleta de longitud de onda más larga


están no obstante restringida a un número limitado de grupos funcionales
(cromóforos) que contienen electrones de valencia con energías de excitación
relativamente bajas.

Los electrones que participan en enlaces dobles y triples no están unidos tan
fuertemente, y por lo tanto, pueden ser excitados más fácilmente por la
radiación. Presentan picos de absorción en la región UV ( > 180 nm).
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ESPECTROFOTOMETRIA UV Y VISIBLE

CROMOFORO

AUXOCROMO

TERMINOS EFECTO BATOCROMICO


ESPECTRALES
EFECTO HIPSOCROMICO
EFECTO HIPERCROMICO
EFECTO HIPOCROMICO
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Transiciones electrónicas

Banda de absorción σ→σ*.

Banda de absorción σ→σ*. Poseen una energía asociada muy elevada, y


origina bandas de absorción en el UV de vacío. Por ellos no tienen interés
práctico y no se le dedica atención en análisis Prof. M.Diaz
Transiciones electrónicas n→σ*

Banda de absorción n→σ*. Los compuestos saturados que


contienen pares de electrones no compartidos (electrones no
enlazantes). Estas transiciones requieren menos energía que
las del tipo σ→σ*y originan absorciones entre 150 y 250 nm.

n orbitales no enlazantes presentes en


compuestos con heteroatomos de O, S y
halógenos.

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Transiciones electrónicas n→π* y π→π*

Banda de Los picos se desplazan a longitudes de ondas más


absorción largas (desplazamiento batocrómico, hacia el rojo)
π→π*

Los efectos de este tipo más intenso


Banda de
(desplazamiento hacia el azul de 30 nm o más) se
absorción
observan con disolventes polares próticos, por la
n→π*
formación de puentes de hidrógenos

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Análisis Cualitativo

EFECTO DEL DISOLVENTE

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Como se aplica y se utiliza la Espectroscopia UV-Visible

La magnitud de las absortividades molares ξ


Empíricamente, en espectrometría
de absorción molecular ε desde cero hasta 105.
ultravioleta y visible se observan

•Para un pico particular, la magnitud de ε depende de la sección transversal de captura de


las especies y de la probabilidad de que tenga lugar una transición al absorber energía.
Se ha demostrado que la relación entre ε y estas variables es
ε = 8,7 x 10-19 P A
Siendo:
P la probabilidad de que se produzca la transición y
A el área de la sección transversal de la molécula en centímetros
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Como se aplica y se utiliza la Espectroscopia UV-Visible

Para transiciones permitidas según la mecánica cuántica

Bandas de absorción
ξ = 104-105 Y P= 0,1-1
intensas

Para transiciones prohibidas según la mecánica cuántica

Bandas de absorción de ξ = < 103 Y P= < 0,01


baja intensidad

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Cromóforos simples carbonilos y derivados

La presencia de un átomo de oxigeno con sus pares electrónicos libres hace


posible la existencia de transiciones nπ* y nσ*.
Los aldehídos y cetonas saturadas presentan 3 bandas de absorción en la
región UV

Banda λmax nm Intensidad

ππ* 150-160 Elevada


nσ* 170-190 Media

nπ* 260-300 Débil (ϵmax<100)

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Cromóforos simples carbonilos y derivados

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Absorción por compuestos orgánicos con grupos cromóforos

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Efecto de la conjugación de los cromóforos

En la teoría de los orbitales moleculares, se considera que los


electrones π están deslocalizados por conjugación.
El efecto de esta deslocalización es el descenso del nivel de energía
del orbital π*, dotándole de menos carácter antienlazante.
Como consecuencia, los máximos de absorción se desplazan hacia
longitudes de onda mas largas (menor energía y mayor λ).
Desplazamiento Batocrómico o hacia el rojo.

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Efecto de la conjugación de los cromóforos

 El 1,3-butadieno, CH2=CHCH=CH2, tiene una banda de


absorción intensa que se desplaza 20 nm hacia longitudes de
onda mas largas si se compara con el pico correspondiente a
un dieno no conjugado

 Cuando los dobles enlaces conjugados son tres, el efecto


batocrómico es aún mayor

 La conjugación de cromóforos tiene un profundo efecto


sobre las propiedades espectrales.
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λmax = 185 nm λmax = 217 nm λmax = 188 nm λmax = 217 nm

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ABSORCION DE SISTEMAS AROMATICOS

• Los espectros UV de los hidrocarburos aromáticos se caracterizan por tres


grupos de bandas cuyo origen son las transiciones π→π*.
• Por ejemplo, el benceno presenta un pico de absorción intenso a 184 nm
(εmax= 60.000), una banda débil, llamada banda E2 a 204 nm (εmax=
7.900) y un pico aun mas débil, denominado banda B, a 256 nm (εmax=
200). Las bandas de las longitudes de onda largas del espectro del vapor
de benceno, y de muchos otros compuestos aromáticos contienen una
serie de picos agudos que se deben a la superposición de las transiciones
vibracionales sobre las transiciones electrónicas básicas.
• Los disolventes tienden a reducir (o eliminar) esta estructura fina como lo
hacen ciertos tipos de sustitución.

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ABSORCION DE SISTEMAS AROMATICOS

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Bibliografía consultada para la clase

1.Silverstein RM., Bassler GC., Morrill TC. Identificación


Espectrométrica de Compuestos Orgánicos. Ed. Diana
México, 1ra Ed. Enero 1980.
2.Skoog DA; Holler FJ, Nieman TA. Principios de análisis
instrumental, 2008, Cengage, Ed
3.Olsen ED, Métodos ópticos de análisis. 1986, Reverté Ed.

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