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FACULTAD DE ODONTOLOGÍA
TEMA:
ii
CRITERIOS DE EXCLUSIÓN .................................................................................... 9
OPERACIONALIZACIÓN DE LAS VARIABLES ................................................. 10
MANEJO Y MÉTODOS DE RECOLECCIÓN DE DATOS .................................... 10
ANÁLISIS ESTADÍSTICO ....................................................................................... 12
ASPECTOS BIOÉTICOS .............................................................................................. 13
Beneficios potenciales del estudio .............................................................................. 13
Confidencialidad ......................................................................................................... 13
Riesgos potenciales del estudio .................................................................................. 13
ASPECTOS METODOLÓGICOS ................................................................................. 13
ASPECTOS JURÍDICOS ............................................................................................... 13
RESULTADO ESPERADOS ........................................................................................ 14
BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................................ 15
ORGANIZACIÓN Y PLANIFICACIÓN DE LA INVESTIGACIÓN ......................... 17
PRESUPUESTO ......................................................................................................... 17
CRONOGRAMA........................................................................................................ 18
iii
INTRODUCCIÓN
1
MARCO TEÓRICO
1. ENFERMEDAD PERIODONTAL
1.1.1. DEFINICIÓN
La enfermedad periodontal en una patología inflamatoria de origen microbiano que
afecta a los tejidos que rodean al diente.
1.1.2. ETIOPATOGENIA
La periodontitis crónica es una de las patologías más comunes en la cavidad bucal
que presenta una etiología bacteriana. Entre los microorganismos más agresivos de
la lesión constan P. gingivalis, Aggregatibacter Actinomycetemcomitans, Tannerella
forsythia, Prevotela Intermedia, Treponema denticola. Siendo la P. gingivalis la
más agresiva. (8)
2
terapéutica, ya que es mucho más difícil afectar a la placa y a la gingivitis cuando esta
ya está establecida. (7)
2.1. CLORHEXIDINA
El antiséptico más estudiado y eficiente para inhibir la placa y prevenir las
periodontopatías es la clorhexidina. (7) Es un antiséptico derivado de una biguadina,
con carga positiva, catiónica a pH fisiológico y amplio espectro de actividad
antimicrobiana. (10)
Un estudio determinó que el uso de clorhexidina 2 veces al día en ausencia de cepillado
inhibe la formación de placa dental. (7)
3. FITOTERAPIA
“Se define a la Fitoterapia como la ciencia que estudia la utilización de los
productos de origen vegetal con una finalidad terapéutica, ya sea para prevenir,
atenuar o curar un estado patológico.”(11)
Según muchas investigaciones etnobotánicas, la medicina a base diferentes tipos de
plantas es muy común en comunidades indígenas, que llevan estos conocimientos de
generación en generación (1, 2).
Se dice que diferentes tipos de plantas tienen un poder curativo, y el principal objetivo
de la investigación etnobotánica es registrar los usos que los indígenas le dan a los
diferentes recursos vegetales.
El 80% de la población mundial depende de la medicina tradicional para las necesidades
de atención primaria de salud. (1)
Las propiedades terapéuticas de las plantas medicinales son atribuidas a la presencia de
sustancias activas que tienen cada planta como alcaloides, flavonoides, glucósidos,
vitaminas, taninos y cumarines. Para el descubrimiento de fármacos modernos, algunas
plantas utilizadas en la medicina tradicional han sido ampliamente estudiadas para
aplicarlos en la medicina tradicional.
3
La familia Rubieacea tiene un gran roll en la innovación de fármacos y uso en los
tratamientos de enfermedades crónicas e infecciosas en la medicina convencional,
siendo muchas las utilizadas. (1)
4. HAMELIA PATENS
Es una planta de rápido crecimiento, de hojas perennes. La altura de la Hamelia patens
es de 1,80 a 3,65 metros y puede dispersarse de 1,50 a 2,44 metros. Las hojas pueden
ser bastante variadas y onduladas y los márgenes son ondulados. Hamelia patens puede
crecer en todo tipo de suelo como húmedo, ácido, alcalino, arena, marga y arcilla. Las
flores surgen periódicamente a lo largo del año pero con menos espontaneidad en época
de frío.
Esta planta se prolifera a partir de semillas. Las frutas son comestibles y de forma oval,
la fruta madura es parecida a las bayas y el color varía desde verde, a rojo y finalmente
a púrpura o color negruzco. (1)
4
4.1. COMPONENTES QUÍMICOS
Las plantas de Hamelia patens son ricas en componentes bioquímicos como son
alcaloides indólicos, isopteropodina, ácido rosmarínico terpenos, esteroles, flavonoides
y efedrina (1, 3, 4, 14, 15); teniendo todos actividades biológicas sobre los seres vivos
como la actividad antinflamatoria e inmuno-estimulante de los alcaloides indólicos (16),
como los flavonoides que tienen propiedades antifúngicas y bactericidas, etc. (17)
5
4.4. ACTIVIDAD ANTIINFLAMATORIA
En el estudio realizado por Sosa et al. (2002) realizado en ratones, demuestra actividad
antiinflamatoria frente a varios extractos de las hojas de H. patens.
Se han aislado compuestos triterpénicos y esteroideos, flavonoides y alcaloides de sus
hojas, estos compuestos podrían estar implicados en la actividad antiinflamatoria. (20)
6
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
Un coadyuvante en el control de la placa bacteriana, responsable patologías
periodontales, son los agentes químicos; y uno de los más usados es la clorhexidina por
sus propiedades antimicrobianas, pero este tiene efectos adversos que afectan al
paciente y limitan su uso. (7, 9)
La Hamelia patens es una planta que se ha utilizado empíricamente para la
higienización bucal en los indígenas de la Amazonía ecuatoriana y control de
infecciones e inflamación de heridas en otras culturas (1, 5, 14, 20, 21, 25), pero al no
existir estudios acerca de la actividad antimicrobiana esta planta sobre los patógenos
bucales nos hace cuestionarnos:
¿Existirá efecto inhibitorio del extracto acuoso de Hamelia patens sobre cepas de
Porphyromonas gingivalis?
OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL
Determinar si existe un efecto inhibitorio del extracto acuoso de Hamelia patens
(Rubiaceae) frente a cepas de Porphyromonas gingivalis ATCC® 33277™ mediante un
diseño experimental in vitro.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Determinar si existe efecto inhibitorio del extracto acuoso de Hamelia patens
frente a la Porphyromonas gingivalis ATCC® 33277™.
Determinar el efecto inhibitorio de la clorhexidina al 0.12% frente a la
Porphyromonas gingivalis ATCC® 33277™.
Comparar los halos de inhibición de los discos impregnados del extracto acuoso
de Hamelia patens frente a los discos impregnados con clorhexidina al 0.12%.
HIPÓTESIS
HA1. El extracto acuoso de Hamelia patens tendrá efecto inhibitorio frente a la
Porphyromonas gingivalis.
H01. El extracto acuoso de Hamelia patens no tendrá efecto inhibitorio frente a la
Porphyromonas gingivalis.
HA2. El efecto inhibitorio del extracto acuoso de Hamelia patens será mayor al de la
clorhexidina al 0.12% frente a la Porphyromonas gingivalis
H02. El efecto inhibitorio del extracto acuoso de Hamelia patens será menor al de la
clorhexidina al 0.12% frente a la Porphyromonas gingivalis
7
CONCEPTUALIZACIÓN DE LAS VARIABLES
JUSTIFICACIÓN
La gingivitis y la periodontitis son patologías bacterianas que necesitan un correcto
control de la placa bacteriana, además son problemas de salud pública que afecta a la
gran mayoría de la población ecuatoriana siendo una de las primeras causas de
morbilidad en odontología a nivel mundial.
El control químico de estas patologías se lo realiza en su mayoría con clorhexidina al
0.12%, pero debido a sus efectos adversos su uso es limitado. Por lo que se debería
buscar terapias alternativas a este agente.
El presente estudio tiene como finalidad determinar si existe un efecto inhibitorio de la
Hamelia patens (Rubiaceae) frente a cepas de Porphyromonas gingivalis ATCC®
33277™ mediante un diseño experimental in vitro, para así poder utilizar el extracto de
esta planta como una terapia alternativa a la clorhexidina y evitar así sus efectos
adversos.
8
MATERIALES Y MÉTODOS
TIPO DE ESTUDIO
Experimental in vitro
POBLACIÓN DE ESTUDIO
Cepas bacterianas de Porphyromonas gingivalis, que es un bacilo corto o cocobacilo,
anaerobio estricto, gram negativo, que mide 0.5 – 0.8 µm x 1 – 3.5 µm. Es considerado
un colonizador secundario que se contagia a partir de individuos infectados
principalmente por medio de la saliva. Y es el microorganismo más agresivo en
periodontopatías.
CRITERIOS DE INCLUSIÓN
Cajas Petri con Agar Mueller-Hinton inoculadas con Porphyromonas gingivalis
ATCC® 33277™.
CRITERIOS DE EXCLUSIÓN
Cajas Petri con Agar Mueller-Hinton inoculadas con Porphyromonas gingivalis
ATCC® 33277™ que hayan sido contaminadas o que hayan sufrido alteraciones
durante el proceso.
9
OPERACIONALIZACIÓN DE LAS VARIABLES
Efecto Medición del halo que se Dependiente Cuantitativa Resistente < 8mm 1
inhibitorio frente forma alrededor del Continua S. límite 9-14mm 2
a la disco impregnado con el Sensible ≥ 20mm 3
Porphyromonas agente activo con
referencia al Gold
gingivalis estándar. Dato que se
obtiene mediante un
calibrador pie de rey
ESTANDARIZACIÓN
Previo al estudio el estudiante a cargo será capacitado en normas de bioseguridad para
para así evitar posibles accidentes dentro del laboratorio por parte de la Dra. Rachide
Acosta del laboratorio de Microbiología de la Facultad de Ciencias Químicas de la
Universidad Central del Ecuador y ya que ella será la encargada de la realización de los
cultivos y pruebas in vitro, no es necesaria una estandarización para determinar la
concordancia inter o intraobservador ya que el estudiante se limitará solamente a la
recolección de los datos.
10
Se realizará el pedido de la cepa en MEDIBAC, distribuidor de material de laboratorio,
donde el plazo es de 30 días para la entrega.
El almacenamiento de la cepa comprada se lo hará en el laboratorio de microbiología de
la facultad de Ciencias Químicas hasta realizar la activación de la cepa.
Para la activación de la cepa primero se elegirá el medio de aislamiento primario (Agar
chocolate), luego se seguirá los pasos que indica el fabricante en su página web en el
Agar Mueller Hinton en una cámara de flujo laminar. Se colocará en una jarra de
anaerobiosis y se la mantendrá en la incubadora a 37°C por 48 horas para el control
posterior donde se verificará que no existió algún tipo de contaminación en el
procedimiento de activación de la cepa, para esto se realizará una tinción Gram.
Para la congelación de la cepa se preparará en un tubo de criogenización, cuya
preparación consiste en 300µg de agar de infusión cerebro corazón y 600µg de glicerol
con las normas correspondientes. Se llevará las cepas a los tubos de criogenización en
una cámara de flujo laminar con un asa tomándolas del agar chocolate y se llevará a
criogenización en na congeladora a -80°C.
De la cepa inicial con la que se trabajará, se realizará un pase con la Formula de
MacFarland. Se lo realizará en la cámara de flujo laminar, se necesitará 10ml de Cloruro
de Sodio y la cepa. Con un asa llevaremos una cantidad de la bacteria hacia el tubo de
Cloruro de Sodio, se lo mezcla bien en el vórtex y se mide la concentración del tubo que
debe llegar a 1.5 𝑋 108 𝑝𝑜𝑟 𝑚𝑙 8 células. Una vez hecho esto con un hisopo remojado en
el tubo de Fórmula de MacFarland se llevará al Medio de Mueller Hinton, aquí no se
utilizará la técnica de estriación, se pinta con el hisopo el medio.
Las hojas de Hamelia patens, del que se obtendrá el extracto acuoso, se recolectarán en
su forma natural en la Provincia de Pastaza, cantón Pastaza, con la ayuda de una
persona de nacionalidad Shuar, obteniendo 20 gramos de hojas pesados en una balanza
digital que se trasladarán a la ciudad de Quito, Provincia de Pichincha, a la Facultad de
ciencias químicas de la Universidad Central del ecuador en un envase hermético, donde
se realizará la descontaminación de la planta mediante un lavado con agua que deber
estar entre 10 y 40°C, preferiblemente a 28°C y se procederá a la etapa de secado que
será preferiblemente al sol.
Una vez que se ha descontaminado minuciosamente, se triturarán las hojas mediante
una máquina de trituración. La planta triturada se someterá a un tratamiento de
radiación láser durante 3 a 10 minutos. Posteriormente la materia se suspenderá en agua
de modo que exista de 10 mg de materia tratada por 30 ml de agua y se dejará reposar
entre 7 a 15 días. Por último se llevará a cabo la separación de la fase líquida y la fase
sólida mediante decantación, el extracto de hojas esterilizado será añadido a un medio
de Agar Sabourand Dextrosa/Agar Czape Dox para obtener las deferentes
concentraciones (20%, 30%, 50%). (19, 30)
Una vez hecho los medios de Mueller Hinton, se procederá a colocar los discos en
blanco embebidos en clorhexidina al 0.12%, el extracto acuoso de Hamelia patens al
11
50, 75 y 100% embebida en los discos en blanco, y discos en blanco embebidos con
suero fisiológico. Para cada uno se utilizará 8 medios de Mueller Hinton, se esperará
24h para ver los resultados.
La medición se llevará a cabo mediante la medición de los halos obtenidos de los
cultivos de Porphyromonas gingivalis ATCC® 33277™ con el calibrador pie de rey y
serán comparados con el cuadro de los datos obtenidos en el BD BBL Sensi-Disc
Antimicobial Suceptibibility Test Disc que nos indica si es sensible o resistente.
El manejo de desechos se realizará de acuerdo a las normas establecidas en cada
laboratorio.
ANÁLISIS ESTADÍSTICO
La información obtenida se analizara mediante estadística descriptiva, junto con la
ayuda de un especialista en Estadística y el programa de EXCEL y SPSS versión 17.0
Tomando en cuenta tanto las variables dependientes e independientes se definirá que:
Si el presente estudio necesita pruebas Paramétricas, se utilizaran:
- x2
- La Prueba t de student.
- ANOVA.
En el caso de que se necesite pruebas No Paramétricas, se utilizaran:
- Prueba U de Mann-Whitney.
- Prueba de Kruskall-Wallis.
Tomando en cuenta las pruebas que se vayan a realizar sean estas Paramétricas o No
paramétricas, los resultados serán representados mediante la ayuda de:
Tablas de Frecuencia Relativas
Tablas de Frecuencia Absolutas
Tabla de Frecuencia Acumulada
Gráficos Estadísticos con histogramas
Gráficos Estadísticos de Sectores
Calculo de Medidas de Tendencias Central, si el caso lo amerita.
Todas las Tablas, Histogramas, Cálculos, entre otros. Serán analizados y discutidos
junto con el tutor, previo al informe final.
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ASPECTOS BIOÉTICOS
El estudio será realizado en el laboratorio de Microbiología de Facultad de Ciencias
Químicas, en el que se utilizará solamente cepas bacterianas sin poner en compromiso a
algún ser vivo.
Beneficios potenciales del estudio
El presente estudio pretende identificar si existe un efecto antimicrobiano del extracto
frente a la Poprhyromonas gingivalis para poder utilizarlo como terapia alternativa a la
clorhexidina (que es limitada por sus efectos adversos), en el tratamiento de patologías
periodontales como la periodontitis crónica. Además que incitará a otros investigadores
a realizar estudios sobre otras cepas bacterianas predominantes en la cavidad bucal y así
ampliar su uso en favor de las ciencias odontológicas.
Confidencialidad
No aplica
Riesgos potenciales del estudio
El operador no correrá ningún riesgo de contaminación, ya que se trabajará bajo las
normas de bioseguridad que se determinen en el laboratorio de Microbiología de la
Facultad de Ciencias Químicas de la UCE, ingresando obligatoriamente al laboratorio
con bata, mascarilla y gorra; y utilizando guantes y gafas al momento del manejo de las
muestras.
ASPECTOS METODOLÓGICOS
El presente estudio tiene como finalidad determinar si existe un efecto inhibitorio de la
Hamelia patens (Rubiaceae) frente a cepas de Porphyromonas gingivalis ATCC®
33277™ mediante un diseño experimental in vitro, para así poder utilizar el extracto de
esta planta como una terapia alternativa a la clorhexidina y evitar así sus efectos
adversos. El tamaño de muestra será de 24 cajas Petri inoculadas de Porphyromonas
gingivalis ATCC® 33277™ en Agar Mueller-Hinton siendo un tamaño adecuado para
poder producir resultado fiables. (28, 29)
Los resultados podrán ser extrapolados a otros estudios ya que se llevará un protocolo
estricto en el manejo de los datos obtenidos y toda cepa que haya sido contaminada o
que haya sufrido alteraciones durante el proceso serán excluidas del estudio.
Los procedimientos estadísticos para el análisis de los datos serán determinados al
obtener todos los valores correspondientes al estudio, mediante un experto para así
evitar sesgos.
ASPECTOS JURÍDICOS
No aplica
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RESULTADO ESPERADOS
El extracto acuoso de Hamelia patens inhibirá el crecimiento de Porphyromonas
gingivalis ATCC® 33277™, produciendo un halo de inhibición.
El halo de inhibición producido por el extracto acuoso de la Hamelia patens será mayor
al de la clorhexidina al 0.12%
14
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16
ORGANIZACIÓN Y PLANIFICACIÓN DE LA INVESTIGACIÓN
PRESUPUESTO
El estudio será financiado en su totalidad por el estudiante Pablo Tenorio Peñafiel
Insumo Valor
Cepa de Porphyromonas gingivalis ATCC® 33277™ $216.44
Discos en blanco $4.50
Clorhexidina al 0.12% (Encident) $5.84
Costo por uso de laboratorio $200.00
Agar sangre $60.00
Guantes $20.00
Asas de inoculación $3.36
Impresiones $40.00
Copias $20.00
Esferos y Marcadores $10.00
Cuadernillo de Laboratorio $9.00
TOTAL $589,14
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CRONOGRAMA
X
Obtención del extracto acuoso de la planta
X
Activación de la cepa
X
Replicación de la cepa
X
Criogenización de la cepa
X X
Realización del antibiograma
X X
Medición del halo de antibiograma.
X X
Recopilación de datos
X
Tabulación de datos
X
Realización del informe final.
X
Defensa de la Tesis
18