ESPECTROFOTOMETRÍA

Eiber Burbano*; Estefanía Osorio, Jorge Andrés Mora.

Universidad Santiago de Cali, Facultad de Ciencias Básicas, Programa de Química, Laboratorio de
Bioquímica
Febrero 25 de 2015, *eiberburbano@gmail.com

RESUMEN

La espectrofotometría es el método de análisis óptico más usado en las investigaciones biológicas.

El espectrofotómetro es un instrumento que permite comparar la radiación absorbida o transmitida
por una solución que contiene una cantidad desconocida de soluto, y una que contiene una
cantidad conocida de la misma sustancia; durante la práctica se efectuó espectros de absorción de
la luz visible de sustancias coloridas donde se determinó la longitud de onda en su absorbancia
máxima, encontrándose en el azul de bromotimol en medio acido (430 nm) y una mezcla de azul
bromotimol y rojo Congo (610 nm); además se aplicó y se utilizó la ley de Beer-Lambert,
encontrando una relación lineal entre la Absorbancia y concentración por medio de la regresión
lineal y finalmente se aprendió y reforzó el manejo del espectrofotómetro. La concentración halada
para la solución problema fue de 7,486 mg/L.

Palabras claves: Espectrofotómetro, ley de Beer-Lambert, Absorbancia, longitud de onda,

concentración.

específicas, que se caracterizan por su

INTRODUCCIÓN
El espectrofotómetro es el instrumento más
versátil del laboratorio puede utilizarse para
diferentes determinaciones analíticas. La
espectrofotometría UV-visible es una técnica
analítica que se fundamenta en la absorción
de estas radiaciones por parte de las
moléculas. Por ello el espectrofotómetro está
constituido por un foco de radiación visible o
ultravioleta, que emite una radiación que
atraviesa un selector, que permite escoger
una radiación de una longitud de onda (λ)
concreta. La radiación seleccionada incide
sobre la muestra contenida en una cubeta
transparente. Una parte de la radiación es
absorbida, mientras que el resto es
transmitido y se mide en un detector. Cada
molécula en función de su configuración
electrónica puede absorber unas radiaciones
longitud de onda. Las moléculas en solución
pueden absorber radiaciones de la zona
ultravioleta (λ=195-325nm) o de la luz visible
(λ=325-800nm).
Si cada molécula de un analito absorbe una
radiación característica, la medida de toda la
radiación absorbida nos permite medir la
cantidad de moléculas, es decir, la
concentración. La absorbancia (A), que se
calcula a partir de la medida experimental de
la radiación incidente y de la transmitida, y la
concentración se hallan relacionadas por la
ley de Beer-Lambert: A=axbxC, donde b es el
camino óptico (espesor de la cubeta) y a es
la absortividad específica, que es
característica para cada analito, pero
depende de la longitud de onda de la
radiación absorbida y de las características
de la solución (matriz) que contiene al
analito. Para el análisis cuantitativo se
construye normalmente una recta de
calibrado con patrones, procurando que la matriz sea igual o muy similar a la de la
muestra, y la absorbancia de la muestra se
interpola en esta recta de calibrado con el fin
de obtener la concentración (Guasch Torres
Josep, 2006).

El objetivo de la práctica es familiarizarse con

el uso y aplicación del espectrofotómetro,
efectuando el espectro de absorción de luz
visible de algunas sustancias determinando
la longitud de onda de máxima absorción de
cada una, comprobando la relación entre
absorbancia y la concentración (Ley de Beer-
Lambert) y aplicando dicha ley para la
determinación de la concentración de una
sustancia.

MATERIALES Y MÉTODOS

Para llevar a cabo la presente práctica esta

se realizó basándose en la guía del
laboratorio de Bioquímica General:
Espectrofotometría, con las siguientes
modificaciones: Gráfica 1. Azul de Bromotimol pH Ácido.

Se hallaron las medidas de Tabla 2. Datos experimentales

Absorbancia y concentración pero no Absorbancia diferentes longitudes de
se halló el % de transmitancia. Onda – Mezcla Azul Bromotimol y Rojo

A cada grupo se le designo una Congo, pH 7,5.
sustancia diferente, se trabajó con el
azul de bromotimol en medio ácido y
con la mezcla Azul Bromotimol y
Rojo Congo.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Parte 1

A continuación se presenta las tablas

correspondiente a los valores de absorbancia
de cada sustancia, en relación con diferentes
longitudes de onda (ƛ) y su respecta gráfica.

Tabla 1. Datos experimentales

Absorbancia diferentes longitudes de
Onda – Azul de Bromotimol a pH Ácido.
Gráfica 2. Mezcla Azul de Bromotimol y
Rojo Congo, pH 7,5.
Parte 2.
En seguida es presentada la tabla
correspondiente a las concentraciones
iníciales de cada sustancia.
Tabla No.3 Concentraciones y volumen de
agua inicial usado para cada una de las
soluciones preparadas.
Mediante el cálculo de la concentración de
cada uno de los tubos que fue igual para
cada sustancia, se procedió a realizar una
gráfica de absorbancia Vs Concentración
para establecer de una solución problema su
concentración.
Tabla N°5 Datos Experimentales
Absorbancia – Curva de Calibración Azul
de Bromotimol pH Ácido.

Para hallar la concentración final de cada uno

de los tubos según la tabla No. 3 se procedió
a utilizar la ecuación No.1

C1x V1= C2 x V2
Ecuación No.1

Al despejar se obtuvo la ecuación No. 2

C1 x V1= C2
V2 Ecuación No.2

En la siguiente tabla se muestran las

concentraciones de cada uno de los tubos,
obtenidas por medio de la ecuación N°2

Tabla N°4 Concentración de cada uno de Gráfica 3. Comportamiento gráfico Ley

los tubos. Beer-Lambert.

El tubo problema contiene una concentración
7,486 mg/L.
El espectro electromagnético, representa las
regiones visible y no visibles más importantes
de la distribución energética, al considerar la
luz (fotón) de máxima Absorbancia que
absorben las sustancias, donde cada fotón
tiene una energía , que está dada por
(E=hcv/ λ), donde h corresponde a la
constante de planck y v corresponde al
número de ondas, donde se observa que la
energía es inversamente proporcional a la
longitud de onda y directamente proporcional
al número de onda, por lo tanto en el caso
del azul de bromotimol en medio acido,
mostró una longitud de onda muy pequeña
430 nm y una Absorbancia de color Violeta.
El pH, la polaridad del solvente o moléculas
vecinas y la orientación de los cromóforos “es
la parte o conjunto de átomos de una
molécula responsable de su color”, son
factores que originan variaciones en los
valores, en el caso del pH son debidas al
efecto de éste sobre la ionización del
compuesto. Aún así la existencia de iones
inorgánicos en disolución acuosa absorbe
suficiente energía radiante en la región del
visible, lo que permite su determinación
espectrofotométrica directa, incluso en muy
bajas concentraciones, en la mezcla de azul
de bromotimol pH 7.5 más Rojo Congo la
Absorbancia de una solución a una longitud
de onda dada es la suma de las Absorbancia
de cada una de las especies en la solución a
esta longitud de onda, es decir la
Absorbancia es aditiva en esta mezcla se
encontró una longitud de onda de (610 nm)
que era de color Amarillo (Harris, 1992).
Por otro lado, en la segunda parte de la
práctica se comprobó la ley de Beer-Lambert,
utilizando nuevamente el espectrofotómetro;
pero esta vez se utilizó el máximo de
absorbancia obtenido en el espectro de
absorción de un analito, que mostrará la
longitud de onda que proporciona la mayor
sensibilidad posible, y por tanto será la que
se utilizará en el análisis espectrofotométrico
de dicho analito (Wade, 2004).
Hay que tener en cuenta que las sustancias
utilizadas (analito), se encuentran en la
región visible; se puede apreciar el color
visible de una solución y corresponde a las
longitudes de onda de luz que transmite, no
que absorbe. El color que absorbe es el
complementario del color que transmite. Por
tanto, para realizar mediciones de absorción
es necesario utilizar la longitud de onda en la
que absorbe luz la solución coloreada. La
fuente de radiación visible suele ser una
lámpara de tungsteno y no proporciona
suficiente energía por debajo de 320 nm.
(Díaz Nieves Abril, et al. 2004)
Por su parte, La ley de Beer-Lambert
establece que la absorbancia de una solución
es directamente proporcional a su
concentración a mayor número de moléculas
mayor interacción de la luz con ellas; también
depende de la distancia que recorre la luz por
la solución a igual concentración, cuanto
mayor distancia recorre la luz por la muestra
más moléculas se encontrará.
Durante la práctica se analizó la variación de
la absorción con respecto a la concentración
de una sustancia como el azul de
bromotimol. En el caso del azul de
bromotimol, se trabajó a un pH de 7.5 y a un
pH ácido (otro Grupo) y se observó que a
pesar de que en algunas concentraciones
eran muy similares sus absorbancias, la
longitud de onda trabajada para cada uno de
ellos era distinta; por lo que no se pudo decir
que en el azul de bromotimol exista un punto
isobéstico.
Mediante medidas espectrofotométricas se
determinan las concentraciones de la forma
asociada y de la disociada de una sustancia
sobre la base de que: ambas formas
obedecen la ley de Lambert-Beer y que las
concentraciones de las mismas son
determinables, ya sea porque absorben a
diferentes longitudes de onda o bien porque
se cumple la condición de aditividad
(Duymovich Claudio, 2005).
Para realizar correctamente la medición de
las sustancias mencionadas anteriormente,
se midió en contra de un blanco que contiene
todas las sustancias usadas en la prueba,
excepto el compuesto que se quiere medir.
El blanco se colocó primero en el instrumento
y se ajustó luego la extinción a cero (100%
de transmitancia) antes de tomar las lecturas
para la muestra, lo cual se realizó
efectivamente en la práctica (Plummer,
1981).
Para llevar a cabo la etapa de calibración, se
representó la absorbancia de las muestras de
concentración conocida a la longitud de onda
de máxima absorbancia, frente a la
concentración de dichas muestras. De esta
manera se obtiene la curva de calibración.
Esto fue entonces lo obtenido al graficar la
concentración vs. Absorbancia, en la cual se
observó que la segunda aumentaba a
medida que aumentaba la primera, la cual
posee un comportamiento lineal (regida por
la ley de Beer) (Plummer, 1981).
Mostrando que la absorbancia está
relacionada linealmente con la concentración
de las especies absorbentes y con la longitud
de la trayectoria de la radiación. La relación
lineal entre la absorbancia y la longitud de la
trayectoria de la radiación a una
concentración fija, es una generalización
para la que hay pocas excepciones.
(Anónimo)
Para el cálculo de la relación lineal
fotométrica se realizó un estudio de regresión
lineal de la recta hallada: Y = a + b X, Donde
b es la pendiente de la recta y a la ordenada
al origen. La pendiente b representa la
linealidad fotométrica. La recta ideal sería Y =
X por lo cual la pendiente ideal es 1,00 que
indica que el instrumento responde
linealmente en el rango de absorbancias
estudiadas. Por el método de mínimos
cuadrados se calculó a y b, fue utilizado el
programa Excel.
Determinado el espectro de absorción de esa
sustancia al graficar de la absorbancia de la
sustancia en función de la longitud de onda.
Al determinar las longitudes de onda de los
picos de absorción, estos pueden
correlacionarse con los tipos de enlace en
una determinada molécula, y son valiosos
para determinar los grupos funcionales
dentro de la molécula. La absorción UV-Vis
no es, sin embargo, una prueba específica
para ningún compuesto determinado. La
naturaleza del disolvente, el pH de la
solución, la temperatura, la concentración de
electrolitos, y la presencia de sustancias
interferentes pueden influir en los espectros
de absorción de los compuestos, así como
las variaciones en la anchura de la hendidura
(ancho de banda efectivo) en el
espectrofotómetro. (Anónimo, 2007)
Por medio de esta práctica se logró aprender
el uso correcto y manejo del
espectrofotómetro de absorción UV-visible
utilizándose sustancias que presentan color y
que por medio de la espectrofotometría se
puede observar su región de absorbancia en
determinada longitud de onda; también
determinó la longitud de onda de máxima
absorbancia de cada sustancia, efectuando
además espectros de absorción de luz visible
y corroborando la relación lineal entre
absorbancia y concentración, según la ley de
Beer-Lambert.
CONCLUSIONES
La densidad de la absorción de una
transición, a cualquier longitud de onda, está
determinada por la probabilidad de que
ocurra la transición y el tamaño de la
molécula absorbente (Pérez, 1983). Para las
sustancias: azul de bromotimol a pH neutro
(Otro Grupo de trabajo) y azul de bromotimol
en medio ácido, la absorción máxima de una
sustancia corresponde a la transición más
probable en la región de absorción (Pérez,
1983), traducido a los valores máximos de
longitud de onda registrados, 610nm y
430nm respectivamente.
Para la disociación del azul de bromotimol
con otras sustancias existe una variación de
la absorbancia del compuesto o mezcla
formada, con ello la forma absorbente
permuta en relación a la concentración total
de la forma disuelta (Pérez, 1983).
El azul de bromotimol es usado para
determinar la naturaleza ácida o básica de un
material sobre un rango, y ese rango es
identificado con el cambio de un color
indicador. (Stamell, 2001) Este indicador,
molecularmente, existe como un par
conjugado tanto de ácido como de base
(débiles o conjugados), que por medio de
inconversiones estructurales otorga el
cambio de la coloración con un cambio de
pH; si es ácido, el indicador acepta protones
del medio y la sustancia obtiene un color
amarillo, de lo contrario si es base, se dona
un protón al medio y el color indicador es el
azul (Stamell, 2001).
El pico de absorción para el azul de
bromotimol en medio ácido se registró
alrededor de los 430nm, por lo tanto, el color
azul es el que presenta mayor absorción
aunque el color transmitido es el amarillo.
Esto se da como consecuencia de que el
color de mayor transmitancia corresponde al
color que es complemento al tono que
presenta menor absorbancia (Harris, 2007).
En una mezcla, es decir un sistema con más
de un componente de radiación, la
absorbancia total está dada por sus
componentes. Si entre ellos no hay
interacción y la presencia de uno no afecta
las propiedades del otro, la absorción de luz
es la suma de absorbancias de todas las
especies que hay en la disolución. Es decir,
la absorción de luz es aditiva y será la suma
de las absorbancias individuales que tendría
cada sustancia si estuvieran en soluciones
separadas (Harris,2007).
En la mezcla de 1 ml de azul de bromotimol
y 1 ml de rojo congo se observan dos picos,
el primero en 490 nm y el segundo en 610
nm los cuales corresponden a los picos de
máxima absorbancia de cada componente de
la mezcla. Este fenómeno solo ocurre ya que
no hay cambios en las propiedades físicas y
químicas de cada, permitiendo así que no
exista cambio en la absorbancia. La suma de
estos dos picos interviene en la coloración
final de la mezcla pues la región visible del
espectro será la suma de los colores
correspondientes al resto de las longitudes
de onda de los dos picos de las sustancias,
en este caso gris (Harris, 2007).
Comprobación Ley Beer-Lambert: Las
medidas que se hicieron en la práctica se
tomaron desde un punto de referencia el cual
fue la longitud de onda donde se presentaba
el mayor pico, es decir la absorbancia
máxima, aquí es donde ocurre una mayor
sensibilidad. La absorbancia es casi
constante con longitud de onda a una
absorción máxima, con lo cual puede
esperarse un buen cumplimiento de la ley
(Skoog, 2008).Cuando se observan los datos
de la Gráfica 3, puede interpretarse que la
absorción se comporta de manera lineal con
respecto a la concentración y tienen a ser
una línea recta. La relación entre la absorción
de luz por una solución diluida o por un gas y
la concentración de la fase absorbente viene
dada por la ley de Beer-Lambert. Primero
que todo, cada cuanto de luz que penetra en
la solución tiene igual oportunidad de ser
absorbido. Esto implica que la luz es
monocromática. Cada molécula de la
sustancia que absorbe tiene igual
oportunidad de absorber y de interceptar un
cuanto de luz (Walton & Reyes, 1983). La
atenuación de la radiación a medida que este
pasa a través de un medio absorbente se
puede describir cuantitativamente mediante
dos términos distintos, relacionados entre sí,
la transmitancia y la absorbancia.
Ya teniendo en cuenta todos estos datos, se
comprobó que la ley se presenta en esta
sustancia, pues se observa que la longitud de
onda permanece en un crecimiento lineal
positivo constante, la lectura de salida de
absorbancia, a medida que hay una más
molécula será mayor en la solución, será
mayor la absorbancia, la relación es
directamente proporcional, por lo tanto, si la
concentración de la solución aumenta,
también lo hará la absorbancia (Bonner,
2011).
BIBLIOGRAFIA

Anónimo, “Determinación
Espectrofotométrica de pKa”. Licenciatura en
Química, Química Analítica III Universidad
Nacional de La Plata.

Anónimo. 2007. “Práctico de bioquímica y

biofísica”. Biología celular.

Díaz Nieves Abril, Bárcena Ruiz J. Antonio,

Fernández Reyes Emilio, Galván Cejudo
Aurora, Jorrín Novo Jesús, Peinado Peinado
José, Meléndez-Valdés Fermín Toribio,
Túnez Fiñana Isaac. 2004.

Duymovich Claudio, Acheme Rosana, Sesini

Sandra, Mazziotta Daniel. 2005.
“Espectrofotómetros y Fotocolorímetros Acta
Bioquímica Clínica Latinoamericana”

Guasch Torres Josep. Reflexiones Sobre

el Análisis Enológico (II): El Laboratorio
Enológico (1ª) "Enólogos" nº 41 (mayo-junio
2006).

Harris, D. 1992. “Análisis Químico

Cuantitativo”, Editorial Iberoamericana.
Estados Unidos Pp.495-499

Plummer, D.T. 1981. Bioquímica práctica.

Editorial McGrawHill Latinoamericana.
Traducido de la segunda edición. Bogotá-
Colombia.

Wade, L. G., 2004. Química orgánica, 5

edición, Prentice hall, Madrid,