Anticorpos Monoclonais

• Aplicações:
- Diagnóstico
- Terapêuticas

• Anti-CD4 – um anticorpo com potencial

terapêutico muito versátil
Joana Duarte
 Anticorpos Monoclonais
Grande especificidade de ligação:
Excelente ferramenta de diagnóstico
• Elisas
• Imunofluorescência
• Citometria de fluxo

Grande potencial terapêutico

• Anticorpos contra moléculas patogénicas
(Citocinas inflamatórias, marcadores tumorais...)
• Anti-TNF na artrite Reumatóide
• Anti-CD20 no tratamento de linfomas B.
Técnica de produção de Anticorpos Monoclonais:
 Anticorpos monoclonais

Fases de Produção de anticorpos monoclonais:

• Imunização

• Rastreio – selecção de linfócitos B produtores dos anticorpos

(plasmócitos)

• Preparação das células do mieloma (células tumorais do tipo B)

• Fusão das células do mieloma com os plasmócitos do ratinho

• Rastreio dos clones obtidos

• Clonagem das linhas de hibridomas

 Anticorpos monoclonais

Hibridomas = Mieloma + células linfóides do ratinho

• As células de mieloma não devem produzir anticorpos para evitar que posteriormente cada
hibridoma produza mais do que um tipo de Ig
• Diluição em meio selectivo (as células de mieloma que não fundem não resistem e morrem)
 Aplicações dos Anticorpos monoclonais
Diagnóstico :
Utilização dos anticorpos marcados em técnicas de imunologia

• ELISAS – marcação enzimática

(detecção de anticorpos anti-HIV,
detecção de infecções virais)

• Microscopia de Fluorescência – marcação com fluorocromos

(Detecção de autoanticorpos, detecção de antigénios em
tecidos)
Aplicações dos Anticorpos monoclonais Diagnóstico

• Citometria de Fluxo
marcação com fluorocromos
(Análise multiparamétrica e rápida de antigénios à
superfície celular ou citoplasmáticos)

As células marcadas com

anticorpos monoclonais em
suspensão atravessam o
citómetro num fluxo fluído
contínuo.
 Citometria de fluxo

• O feixe de luz detecta as células, identificando a

forma e cor das mesmas:

-Dispersão da luz (forma)

-Intensidade de Fluorescência
(marcadores especificos)

• Os sinais são transmitidos ao

computador que permite a análise
estatística dos mesmos
• Os dot plots permitem analisar a
expressão de duas marcações (2 cores
de fluorocromos diferentes) nas células
presentes na amostra
 Citometria de fluxo

Exercício: Vamos determinar a % de células T CD4 produtoras de IFNg

Análise de dados: Gating
O Potencial da Citometria de Fluxo
VÍDEO
 Aplicações dos Anticorpos monoclonais
Potencial Terapêutico:
Os anticorpos monoclonais podem ser usados para diferentes fins
terapêuticos:

• Inibição

• Estimulação

• Bloqueio

• Depleção/Eliminação das células alvo por apoptose

Aplicações dos anticorpos monoclonais Potencial Terapêutico

ex: Anticorpos depletantes que utilizados em tumores com o objetivo de eliminar

as células tumorais
Aplicações dos anticorpos monoclonais Potencial Terapêutico

• O anti-CD3 está em clinical trials na diabetes

Alvo: células T
Doença autoimune – inibição das células T intervenientes na
apresentação dos auto-antigénios e na activação do SI.

• O anti-CD4 já foi utilizado na prevenção de rejeição a tranplantes

Alvo: células Thelper
Inibição da activação do sistema imunitário no sentido de prevenir a
rejeição de um novo tecido

• O anti-TNF é muito utilizado em artrite reumatóide

Alvo: Citocina pro-inflamatória
Bloqueio da acção inflamatória da citocina e consequente prevenção
da progressão rápida da doença.

• O anti-CD20 é utilizado no combate a linfomas B

Alvo: células B
Depleção de células (Tumorais e não tumorais)
Células T:
Um alvo comum nas terapêuticas com anticorpos monoclonais.

Porquê?
 T cells

APC
CD4 CD8
60-70% of PB 30-40% of PB

- Helper cells (B and CD8) - Cytotoxic

- Modulate cellular and humoral responses - Kill intracellular pathogens
Cytokine Production Contact-dependent
Effector functions (different subsets) Perforin and Granzymes release
Development of cell memory IFN-γ producers
As células CD4 “Helpers”medeiam a resposta imunitária
adaptativa

Células B

Células CD8
Citotóxicas:
-Ativação
- Diferenciação
As células CD4 dividem-se em diferentes grupos com
funções distintas
Produção de
Anticorpos nos
Centros germinais

Parasitas
extracelulares
Alergias

IFNγ+IL-12 Patogénios intracelulares

Autoimunidade

Bactérias
Fungos
Autoimunidade

Homeostase
Tolerância
Regulação
As células CD4 quando reagem contra os antigénios
errados podem tornar-se patogénicas
Th2
Th17

Th1 CD4+
T cells

Reconhecem proteínas Provocam doenças autoimunes

nossas como invasoras
Reconhecem proteinas
alimentares ou do ambiente que provocam respostas crónicas
nos rodeia (ácaros, medicamentos como as alergias
etc) como prejudiciais

Aumentam a resposta inflamatória!

 As células Reguladoras são conhecidas por
controlar as respostas inflamatórias do sistema
imunitário, estabelecendo um equilíbrio!

Células CD4 Células

Helpers Reguladoras

...na ausência deste equilíbrio a doença terá tendência a progredir

 Reacções Alérgicas Doenças Autoimunes

Allergy Autoimmunity
O Potencial dos anticorpos monoclonais:
O exemplo do anti-CD4 como terapêutica em doenças autoimunes e
alérgicas
O anti-CD4 bloqueia o receptor CD4 das células Thelper
Ox40
Ox40L
CD4
MHC
T cell TCR
APC

CD40
CD40L

• Impede a apresentação eficiente do antigénio

• As células não são activadas contra o antigénio em questão
• Inibe a resposta imune que seria desencadeada pelo antigénio
• impede que as células Thelper(CD4) ajudem na progressão da resposta

Será que o anti-CD4 é eficiente na Prevenção e tratamento de

doenças autoimunes e alérgicas?
ESCLEROSE MÚLTIPLA:
• Afeta mais de um milhão de pessoas em todo o mundo
• Provocada por disfunções imunes, background genético/fatores
ambientais
• Consequências:

- Inflamação,
- Dismielinação
- atrofia do SNC
- Afeta as Funções
motoras e mentais
IMUNOPATOGÉNESE
 Modelo Experimental de Esclerose Múltipla

• Modelo animal de esclerose multilpa - EAE

• Partilha muitas características com a EM

Indução da doença:
- Imunização com antigénios derivados de mielina
- Grupo de animais tratados com anti-CD4

MOG - myelin oligodendrocyte glycoprotein

PLP - proteolipid protein
MBP - myelin basic protein
O anti-CD4 previne o desenvolvimento de Esclerose Múltipla
naive sick anti-CD4

CNS total CD4 T cells

Previne a infiltração de Linfócitos

Sick no SNC
anti-CD4
• Para verificar se o anti-CD4 era igualmente eficiente no
tratamento da doença...
• Imunizámos com anti-CD4 após manifestação dos
primeiros sintomas

O Anti-CD4 trata a doença já estabelecida

• Fomos analisar a produção de citocinas pró-inflamatórias como
IL-17 e IFN para verificar se o anti-CD4 previne a resposta
inflamatória
IL-17 IFN-γ

Th17 Th1

O Anti-CD4 inibe a produção de IFN e IL-17

• Será que a proporção de células reguladoras é superior nos
animais tratados?
• Fomos verificar o nº de células reguladoras (expressão de
Foxp3) nos controlos comparativamente com os tratados

Polyclonal Tregs Antigen-specific Tregs

O Anti-CD4 permite a expansão das células reguladoras

específicas para o antigénio
 Para um melhor controlo das condições, fomos observar o que acontecia em
cultura celular:
- citocinas inflamatórias versus células reguladoras, na presença e ausência de
anti-CD4

Cell
culture

Cultura de células Thelper

+ Antigénio MBP
+/- anti-CD4
Tregs Th17

• Inibição da produção de IL-17

• Promove a expressão de
marcadores de regulação e
anti-inflamatórios
O anticorpo monoclonal anti-CD4:

• Previne o desenvolvimento e trata a doença quando já

estabelecida;

• Inibe a Produção de citocinas pro-inflamatórias

• Promove a expansão das células

reguladoras e do ambiente anti-
inflamatório

• Ajuda a reestabelecer o equilíbrio

imunitário

Publicado em:
Duarte J, (2012)“T cell apoptosis and induction of foxp3+ regulatory T cells underlie the
therapeutic efficacy of CD4 blockade in experimental autoimmune encephalomyelitis”. J
Immunol..
 O Anti-CD4 é igualmente eficiente na Artrite Reumatóide e na
Prevenção de Alergias

O anti-CD4 na
Artrite
Reumatóide:

Duarte J, Agua-Doce A, Oliveira VG, Fonseca JE, Graca L. “Modulation of IL-17 and Foxp3
expression in the prevention of autoimmune arthritis in mice.”, PLoS One. 2010 May 10;5(5).

O anti-CD4 na
Resposta
Anafilática:

Duarte J, Caridade M and Graca L (2011) “CD4-blockade can induce protection from peanut-
induced anaphylaxis”. Front. Immun. 2:56.
 Hipótese

IFN-γ
TGF-β
TGF-β

Tregs
IL-6

Células CD4 Células

Helpers Reguladoras
Anti-CD4