UNIVERSIDADE FEDERAL DE VIÇOSA

CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E TECNOLÓGICAS

DEPARTAMENTO DE FÍSICA

Implantação da técnica de Pinça Magnética no Laboratório de Física

Biológica da UFV

BOLSISTA: Rayane Maria de Oliveira

ORIENTADOR: Márcio Santos Rocha

Relatório Final, referente ao período de

julho/2018 a julho/2019, apresentado à
Universidade Federal de Viçosa, como parte
das exigências do Programa Institucional de
Bolsas de Iniciação Científica.

VIÇOSA
MINAS GERAIS – BRASIL
JULHO DE 2018/2019
 UNIVERSIDADE FEDERAL DE VIÇOSA

CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E TECNOLÓGICAS

DEPARTAMENTO DE FÍSICA

RESUMO

Nas últimas décadas várias técnicas de espectroscopia foram desenvolvidas para a

medição de propriedades mecânicas de moléculas únicas. Uma dessas técnicas é o da
Pinça Magnética, que exerce força e/ou torque sobre uma ou sobre um grupo de
moléculas. No experimento clássico, uma ponta da molécula é presa a uma lamínula e a
outra ponta é presa a uma microesfera paramagnética, e com o auxílio de imãs ou fios
transportando correntes podemos manipular a microesfera e obter informações da
molécula. O campo magnético gerado pelo imã exerce uma força sobre a microesfera
que pode aumentar ou diminuir movendo-se o imã para perto ou longe da
lamínula/amostra, essa força pode ser de aproximadamente 10fN até 100Pn
dependendo da configuração do imã. Nos experimentos mais comuns de pinça
magnética, a microesfera é iluminada por uma luz que fica localizada acima dos imãs,
produzindo imagens de difração. Comparando essas imagens de difração com a imagem
de difração de uma microesfera de referência, que fica presa na lamínula, podemos
descobrir a distância que a molécula foi estirada. Além disso, como a microesfera está
em uma solução, ela possui movimento Browniano, que depende da força aplicada
sobre ela pelos ímãs. Por meio destas informações, podemos construir um gráfico de
força por extensão das moléculas, extraindo propriedades da mesma.

Palavras-Chave: Pinças magnéticas, DNA, Ímãs permanentes.

___________________________ _________________________________
Márcio Santos Rocha Rayane Maria de Oliveira
(Orientador) (Bolsista)
1 INTRODUÇÃO 6

1 Introdução
A micromanipulação de moléculas únicas é uma importante técnica experimental que vem ga-
nhando destaque devido às variadas aplicações, em especial em Física da Matéria Mole e em Física
Biológica. Com o uso dessa técnica de espectroscopia de força de moléculas únicas é possível anali-
sar, por exemplo, as variações nas propriedades mecânicas de um polímero, o que permite avaliar as
mudanças estruturais durante uma interação deste polímero com outra molécula [1]. Em 1969 Ashkin
e colaboradores desenvolveram o método de pinçamento óptico nos Estados Unidos, onde utilizaram
laser fortemente focalizado para o aprisionamento de partículas, que ajudou em estudos de sistemas
biológicos na escala de micrômetros [2].
Além do método de pinça óptica existem vários outros, como a Microscopia de Força atômica
(AFM) que usa a combinação dos princípios do microscópio de varredura por tunelamento e do per-
filômetro da ponta [3]. Neste trabalho a técnica de espectroscopia que estudamos é o de pinçamento
magnético. As Pinças Magnéticas, são instrumentos que utilizam um campo magnético externo para
aplicar força em uma microesfera paramagnética que está ligada a uma das extremidades de uma
molécula, no nosso caso o DNA, enquanto a outra ponta do biopolímero está fixa em uma lamínula
sob o estágio do microscópio. Este campo pode ser gerado por diferentes configurações, sejam elas:
imãs permanentes ou fios transportando correntes, desde que sejam posicionados de forma correta,
otimizando o gradiente de campo magnético na região da amostra. Com esse aparato conseguimos
obter a curva de força por extensão, que permite determinar as propriedades mecânicas do complexo
formado entre a molécula de DNA e um ligante qualquer, onde a força aplicada sobre a microesfera
amarrada ao DNA, pode ser deduzida monitorando o movimento Browniano da microesfera em torno
da sua posição de equilíbrio. Utilizando a expansão de Taylor e o teorema da equipartição, derivamos
uma expressão para a força aplicada em termos da extensão do DNA e da variação do movimento
Browniano da microesfera. [4].
Assim, neste trabalho iniciamos explicando a ideia básica de uma pinça magnética e depois as
técnicas, imagem de difração e contraste de imagem, para obter a extensão da molécula de DNA em
função da força magnética aplicada sobre a microesfera paramagnética. Utilizando o método de Wong
e Halvorsen calibramos a pinça para adquirir a curva característica da força magnética pela extensão
da molécula de DNA de forma precisa.
2 OBJETIVOS 7

2 Objetivos
Este trabalho tem como objetivo principal estabelecer um padrão de calibração para a Pinça Mag-
nética baseado na imagem de difração da luz emitido pela microesfera magnética, para então obtermos
as propriedades mecânicas básicas da molécula de DNA, que são o comprimento de contorno e com-
primento de persistência. Primeiramente calibramos a pinça através da comparação da imagem de
difração da microesfera de referência, aquela que fica "presa"na lamínula, com uma microesfera que
possui uma molécula de DNA ligada a ela. Em seguida, damos início a utilização do método que uti-
liza o contraste da imagem para obter a extensão da molécula do DNA, que nos forneceu resultados
mais precisos na determinação da posição da microesfera e da força aplicada .
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 8

3 Revisão bibliográfica

3.1 A molécula de DNA

Em 1953, o biólogo James D.Watson e o físico Francis Crick desvendaram a estrutura tridimen-
sional do Ácido Desoxirribonucleico (DNA), que foi uma grande revolução genética e lhe rederam o
Prêmio Nobel de Medicina de 1962. Eles utilizaram a análise dos padrões de difração de raios-x ob-
tidos por Rosalind Franklin e E. Goslin em amostras de fibras de DNA e as "regras de Chargaff"que
formalizavam as quantidades das bases nitrogenadas elaborado por Erwin Chargaff em 1951, para
deduzirem que o DNA contém a informação descrita em um código genético. Desde então as pes-
quisas na área de genética se intensificaram, alcançando vários resultados no campo da ciência e da
tecnologia moderna [5].

3.1.1 A estrutura da molécula de DNA

James D. Watson e Francis Crick descobriram que o DNA é formados por uma série linear de
estruturas básicas que chamamos de nucleotídios, de modo a formar longas cadeias polinucleotídicas,
e a sequência específica de nucleotídios constitui a linguagem de código genético. Cada nucleotídeo
é formado por um grupo fosfato (PO− 4 ), um açúcar do tipo pentose, a desoxirribose, e uma base
nitrogenada. Os açucares e fosfatos são idênticos em cada nucleotídio, porém as bases nitrogenadas
é o que diferem eles. Existem quatro tipos de bases nitrogenadas, são elas: adenina (A), timina (T),
guanina (G), e citosina (C).
As moléculas de DNA são constituídas por duas cadeias polinucleotídicas enroladas uma sobre a
outra, lembrando uma comprida escada helicoidal; as bases nitrogenadas permanecem ligadas a uma
base na cadeia oposta por meio de ligações de hidrogênio, constituindo os "degraus"da escada, como
mostrado na Figura 1.
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 9

Figura 1: Representação plana, mostrando as duas cadeias polinucleotídicas unidas por meio de suas
bases nitrogenadas [5].

As cadeias polinucleotídicas sempre se ligam aos pares: a adenina (A) em uma fita sempre pareia
com a timina (T) na outra fita, e a guanina (G) com a citosina (C). No nucleotídio as bases nitrogenadas
se ligam ao carbono 1’ da pentose através de uma ligação glicosídica, enquanto o grupo fosfato se
liga ao carbono 5’, também da pentose, por uma ligação fosfoéster, como ilustrado na Figura 2 para a
adenina e a citosina.

Figura 2: Ligações para formação de nucleotídeos (a) Adenina e (b) Citosina

3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 10

Observe na Figura 3 que as bases nitrogenadas possuem estruturas químicas e tamanhos diferen-
tes. As purinas, que são a adenina e a guanina, são semelhantes em sua estrutura química possuindo
dois anéis aromáticos, enquanto a timina e a citosina, que são conhecidas como pirimidinas, possuem
apenas um anel.

Figura 3: Estrutura química das bases nitrogenadas [6].

Para formar as cadeias, os nucleotídeos se ligam através de pontes fosfodiéster estabelecidas entre
o grupo fosfato e um grupo hidroxila do nucleotídeo adjacente, Figura 4. No entanto, caso o carbono
5’ da pentose do primeiro nucleotídeo esteja voltado para cima, todos os demais nucleotídeos da
cadeia estarão na mesma posição, determinando o crescimento da cadeia na direção 5’ para 3’.

Figura 4: Ligações de pontes fosfodiéster [7].

3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 11

Assim, para a formação da dupla-hélice as cadeias correm em sentidos opostos, ou seja , partindo
de uma das extremidades dessa cadeia, observa-se que uma cresce no sentido do carbono 3’ para o
carbono 5’ e, a outra, no sentido do carbono 5’ para o carbono 3’, formando a molécula de DNA
representada na Figura 5 [8].

Figura 5: Representação da molécula de DNA [9]

3.1.2 O DNA do Bacteriófago λ

Em nossos experimentos utilizamos DNA encontrado em bacteriófago λ . Ele é um vírus que

infecta a bactéria E. Coli, possuindo aproximadamente 48.500 pares de base, que resulta em compri-
mento médio ponta a ponta de 16 µm, sendo ideal pra experimentos de estiramentos [9].
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 12

3.2 Princípio de funcionamento das pinças magnéticas

A montagem principal de uma pinça magnética clássica é mostrada na Figura 6, que consiste
basicamente de um microscópio, de uma câmera CMOS, de um computador, e o fundamental, imãs.

Figura 6: Montagem experimental de uma pinça magnética clássica [4]

Com esta montagem conseguimos estirar a molécula de DNA, que tem uma das pontas presa na
superfície da lamínula e outra presa na microesfera magnética por meio de ligações não-covalentes
que resistem forças na ordem de 100 pN (piconewtons). O campo magnético gerado pelos imãs pode
exercer força de 10 fN (femtonewtons) até 100 pN na microesfera, que podemos calcular através da
expressão [10]:

→ 1→ → →
F= ∇ (m . B) (1)
2
→ →
onde m é o momento magnético induzido da microesfera pelo campo magnético externo, B . Esta
força é devido ao momento de dipolo dos imãs e existirá desde que o campo magnético dos mesmos
seja não-uniforme [10]. Observe também que podemos aplicar uma ampla gama de forças sobre a
microesfera, movendo os imãs para cima ou para baixo, a medida que o gradiente local do campo
magnético é diminuído ou aumentado.
Além de estudarmos o estiramento da molécula de DNA, a pinça magnética tem a grande vanta-
gem de poder estudar a rigidez e o grau de superenrolamento do DNA através da rotação do campo
magnético externo, ou seja, da rotação dos imãs [10]. Só podemos fazer isto porque o torque aplicado
pelo DNA na microesfera é insignificante comparado com o imposto pelo campo magnético externo.
No entanto o uso da Equação 1 pode ser limitado, devido à complexidade na configuração do
→
campo magnético, B , a variabilidade no tamanho da microesfera e na densidade de magnetização.
Portanto, utilizamos o movimento Browniano como método alternativo para obter uma expressão
para a força. Esses movimentos são gravados por com uma câmera CMOS (complementary metal-
oxide-semiconductor) e é observado que a variação da posição da microesfera no plano xy (sistema de
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 13

coordenadas ilustrado na Figura 7) é inversamente proporcional com a força aplicada, ou seja, quanto
maior for a força aplicada na microesfera magnética, menor vai ser o movimento da microesfera em
torno de uma posição de equilíbrio.

Figura 7: Representação esquemática da microesfera amarrada a molécula de DNA e uma microesfera

de referência.
→
Na pinça magnética, a força magnética, Fmag , é aplicada sobre a molécula de DNA na direção z,
e assim, surge uma força de restauração exercida pelo DNA, que fornece a energia potencial total do
sistema,

E p = EDNA + Emag = A(l) − Fmag .z (2)

onde A(l) é a energia mecânica armazenada no DNA que depende da sua extensão, l. Quando a
→
microesfera está em equilíbrio, ou seja, a posição da microesfera é (x, y, z) = (0, 0, l) =r0 , todas as
derivadas parciais devem ser igual a zero e podemos escrever:

∂ E p ∂ A(l) ∂ A(l)
= − Fmag = − Fmag = 0 (3)
∂z ∂z ∂l
a partir desta condição de primeira ordem, temos,

∂ A(l)
Fmag = (4)
∂l
O movimento Browniano força a microesfera constantemente a sair desse estado de equilíbrio,
que cria movimentos na direção do campo magnético, que vamos considerar como a direção do eixo
x, e também perpendicular a direção do campo magnético, que consideramos ser a direção y. Como
mostrado na Figura 8-A, na direção x, a microesfera com DNA possui a mesma direção das linhas
campo magnético (linhas pretas), consequentemente, a magnetização força a microesfera a manter o
alinhamento com o campo. Já na direção y, como mostra a Figura 8-B, os movimentos da microesfera
é predominantemente perpendicular as linhas de campo (círculos pretos), sendo capaz de girar a
microesfera livremente, fazendo com que na extensão, l, seja adicionada uma quantidade igual ao
raio da esfera,R, para esta direção.
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 14

Figura 8: A: Orientação da microesfera com a direção x, B: e com a direção y [11].

Fazendo uma expansão de Taylor em torno da posição de equilíbrio, temos:

→ → 1 1 1
E p ( r ) ≈ E p (r0 ) + kx ∂ x2 + ky ∂ y2 + kz ∂ z2 (5)
2 2 2

E então,
→ → 1 Fmag 1 Fmag 1 ∂ Fmag
E p ( r ) ≈ E p (r0 ) + ( )∂ x2 + ( )∂ y2 + ( )∂ z2 (6)
2 l 2 l +R 2 ∂l
onde kx , ky e kz são as constantes de rigidez em x, y e z respectivamente. Como já vimos, na direção z,
os movimentos da microesfera dependerá da força restauradora, causada pela molécula de DNA, que
pode ser calculado a partir de modelos de elasticidade de polímeros. No caso da molécula de DNA,
usamos o modelo Worm-Like Chain (WLC) para uma aproximação da constante kz [12].
Portanto, as três constantes da pinça magnética são:

Fmag
kx = (7)
l

Fmag
ky = (8)
l +R
"  #
l −3

∂ Fmag KB T
kz = = 2+ 1− (9)
∂l 2PL L

onde P é o comprimento de persistência e L é o comprimento de contorno do DNA amarrado, kB é a

constante de Boltzmann e T é a temperatura absoluta. Sabendo que a energia potencial na posição de
equilíbrio é zero, podemos aproximar a contribuição do deslocamento na direção do campo magnético
a energia potencial média pela expressão,

1
< E p >= kx < ∂ x2 > (10)
2
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 15

onde < ∂ x2 > é a variância do movimento da microesfera na direção x em torno da posição de

equilíbrio:
var∂ x ≡< ∂ x2 > − < ∂ x >2 =< ∂ x2 > (11)

a energia deste grau de liberdade é 12 KB T , usando o teorema da equipartição. Reorganizando os

termos obtemos uma expressão simples para a força aplicada sobre a molécula de DNA:

KB T l
Fmag = (12)
< ∂ x2 >

Assim, medindo a extensão do DNA, l, e a variância do movimento da microesfera paramagnética

< ∂ x2 >, obtemos a força aplicada através da Equação 12.
4 MATERIAIS E MÉTODOS 16

4 Materiais e Métodos

4.1 Montagem Experimental

O microscópio óptico invertido Nikon foi utilizado nos experimentos juntamente com uma obje-
tiva de imersão à óleo, com ótica corrigida no infinito, modelo CFI Plan Apochromatic, com aumento
de 100x e abertura numérica (NA) de 1.4, e junto ao microscópio temos um deslocador, para a movi-
mentação do ímã.

4.2 Preparação das amostras

O nosso porta - amostra consiste de uma lamínula, onde é colado em seu centro, com parafina, um
anel de borracha do tipo O-ring. As amostras consistem de uma solução aquosa de PBS (Phosphate
Buffer Saline) e de NaCl = 150mM, além das microesferas superparamagnéticas com um diâmetro de
2,8 µm e do DNA. Assim, com a pinça magnética realizamos os estiramentos da molécula de DNA,
que possui uma de suas pontas aderida na lamínula do porta – amostra e a outra ponta na microesfera
magnética.

4.2.1 Construção do porta-amostras

O porta-amostra consiste de uma lamínula (Corning) com uma espessura de aproximadamente

0,150 mm, um anel de borracha do tipo O-ring com um diâmetro de 0,7 cm, e uma outra lamínula
menor que serve como uma tampa. Utilizamos parafina derretida em um aquecedor para colar o
O-ring na lamínula, e a lamínula menor é apenas colocada por cima do O-ring.

4.2.2 Preparação da solução de DNA com as microesferas

Em um eppendorf adicionamos 7 µL de λ -DNA biotinilado nas duas pontas, para que as mesmas
possam ser fortemente ligadas a substratos recobertos com a proteína estreptavidina, diluído em PBS
(Phosphate Buffer Saline) para obter uma concentração final estimada de 5mM de pares de base. E
também colocamos 93 µL da solução da microesfera magnética M280 homogeneizada e deixamos no
banho térmico a 37 ◦ C por uma hora. Enquanto isso tratamos o porta-amostra, como descrito abaixo.
Depois que o O-ring foi colado na lamínula, adicionamos 20 µL de BSA biotinilada (Sigma-
Aldrich cat. A8549) diluída em tampão com magnésio a 1,9 mg/mL e deixamos na luz de UV por 20
minutos, retiramos o BSA-biot e lavamos com 30 µL de Tampão A (solução contendo sais monova-
lentes e magnésio bivalente), depois colocamos 20 µL de Estreptadivina (Sigma-Aldrich cat. S4762)
diluída em tampão PBS 7.4 com concentração entre 0,1 a 0,25 mg/mL e deixamos mais 20 minutos
na luz de UV. Após os 20 minutos, retiramos o excesso da solução STP-PBS e lavamos a superfície
com PBS 7.4, retiramos o excesso de PBS e levamos a lamínula para o microscópio. Esperamos a
lamínula secar por 15 minutos com a luz do microscópio ligada e depositamos a solução λ -DNA de-
pois que observamos a formação característica de cristais de estreptavidina na superfície da lamínula.
Esperamos mais 30 minutos para podermos iniciar o experimento.
4 MATERIAIS E MÉTODOS 17

4.2.3 Procedimento Experimental

Após colocarmos o porta-amostra com a solução de λ -DNA no microscópio, passamos a procura

de um DNA ideal. Nesse processo encontramos algumas configurações possíveis, como mostrado
na Figura 9. Nós encontramos microesferas completamente livres, elas se movimentam por toda a
solução, microesferas grudadas na lamínula, ou seja, que não possuem o movimento Browniano, mi-
croesferas presas a um ou mais DNA que se encontram livres ou grudadas umas às outras, também
encontramos moléculas de DNA livres em solução ou presas ao funda da lamínula. E por fim, encon-
tramos a configuração: microesfera + DNA + lamínula, que é a do nosso interesse, onde as pontas da
molécula de DNA estão grudadas na microesfera e na lamínula respectivamente.

Figura 9: Possíveis configurações em uma amostra para o experimento de pinça magnética [13].

Para encontrar esta configuração, aproximamos e afastamos um imã da amostra com a ajuda de
um deslocador, e observamos a imagem de difração gerada pela microesfera no computador. Quando
aproximamos o imã, se a microesfera permanecer vibrando em torno de uma posição fixa e a imagem
de difração dela mudar, podemos supor que existe uma molécula de DNA grudada nela. Para garantir
esta hipótese afastamos o imã da amostra, se a imagem de difração da microesfera voltar como era no
início, ou seja com o imã afastado, garantimos que existe uma molécula de DNA grudada na lamínula
e na microesfera. Se ao aproximarmos o imã a imagem de difração da microesfera não mudar, ou se
ela se mover para longe da posição inicial dela, garantimos que não é a configuração desejada para
realização do experimento. Há também o caso onde existe pouca variação da imagem de difração
para algumas microesferas; também não utilizamos essa configuração, pois sabemos que a extensão
do DNA é pequena. O próximo passo é obter a extensão da molécula de DNA para obter a força
magnética sobre a microesfera magnética, para isso utilizamos os métodos experimentais descritos na
próxima seção.
4 MATERIAIS E MÉTODOS 18

4.3 Métodos experimentais

4.3.1 Imagem de difração

Neste método a microesfera é iluminada por uma luz (LED) colocada acima dos imãs, e a interfe-
rência desta luz com a luz espalhada pela microesfera produz imagem de anéis de difração concêntri-
cos no plano focal da objetiva. O método de Gosse e Croquete nos permite obter a extensão do DNA.
Utilizando a imagem de difração, eles observaram que quando o plano focal da objetiva era deslocado
com precisão, a imagem dos anéis de difração da microesfera grudada na lamínula mudava, como
na Figura 10 A-D [10]. Observe que no plano focal, Figura 10-A, o centro da microesfera é preto,
e quando deslocamos a objetiva para baixo, que seria a mesma coisa de aproximar um imã de uma
microesfera que possui a molécula de DNA grudada nela, o centro da microesfera torna-se branco,
Figura 10: B-D. Desta forma, Gosse e Croquete criaram um perfil de calibração, mostrada na Figura
10-E, para cada posição do eixo z, eles gravaram um perfil radial da microesfera que estava grudada
na lamínula em relação a objetiva do microscópio [14].

Figura 10: A-D: Imagem do padrão de difração da microesfera, e o perfil de calibração [4]

Em seguida, para o posicionamento vertical, o perfil radial da microesfera era comparado em

tempo real a este conjunto de referência. Isto nos permite determinar a extensão do DNA, relacio-
nando a imagem de difração da microesfera de referência que está localizada (presa) na lamínula com
a distância percorrida pela microesfera amarrada ao DNA, como representado na Figura 8.
4 MATERIAIS E MÉTODOS 19

Com esse método e com a utilização de programas computacionais, como o ImageJ que calcula a
posição do centro de massa da microesfera fornecendo a sua posição e o KaleidaGraph para construir
o gráfico, conseguimos calcular a força aplicada pelos imãs e a extensão vertical média da molécula
de DNA. Infelizmente este método não nos fornece um resultado preciso da extensão do DNA e
consequentemente da força magnética, por isso foi desenvolvido um outro método para obter um
melhor resultado.

4.3.2 Contraste de imagem

Neste método relacionamos os níveis de cinza (N) das filmagens com a intensidade de luz (I) na
amostra da microsfera magnética, já que são lineares como demonstrado na referência [15] e com o
software ImageJ analisamos estes dados. Sabendo a expressão do contraste da imagem, dada pela
Equação 13,

I(x, y) − I0
C(x, y) = (13)
I0
em que C(x,y) é o contraste da imagem, I(x,y) é a intensidade da imagem na posição (x,y), I0 é o
background da imagem fora da microesfera [16]. Podemos escrevê-la em função dos níveis de cinza
(N) da seguinte forma:
N −b
N = b + aI ⇔ I = . (14)
a
Então,
I(x, y) − I0 N − N0 N0
C(x, y) = = ( ) (15)
I0 N0 N0 − b
onde N0 é o nível de cinza médio da imagem, e b é obtido através do ajuste linear da relação entre N
e I.
Desta forma, comparando o valor do contraste da imagem de difração da microesfera de calibração
com o valor que obtemos para o contraste da imagem da microesfera que possui um DNA aderido a
ela, obtemos a extensão da molécula de DNA, l, em alturas diferentes.
Para isto, foi criado um macro no ImageJ que calcula o contraste da imagem para várias alturas
diferentes, tanto da microesfera aderida a uma molécula de DNA, quanto para a microesfera de ca-
libração, e com a utilização do programa Mathcad determinamos a altura da microesfera magnética
durante o experimento.
5 RESULTADOS E CONCLUSÕES 20

5 Resultados e Conclusões
Para os nossos experimentos fizemos testes com várias configurações de ímãs, e o que nos for-
neceu uma força aplicada sobre a microesfera maior foi de dois ímãs quadrados permanentes de
neodímio (5 x 5 x 5 mm), espaçados de uma distância de 4 mm um do outro, e com o momento
magnético invertido de um em relação ao outro.
Adaptando a ideia do método de Gosse e Croquete, obtivemos um resultado satisfatório para
a método de Imagem de difração, levantando a curva de força por extensão de uma molécula de
DNA. Com o deslocador do microscópio fomos estirando a molécula de DNA, fazendo filmagens de
240 segundos e deslocando o deslocador de aproximadamente 10 µm para cada vídeo gravado, este
tempo foi necessários para obter dados mais confiáveis, garantindo que os histogramas dos dados
ajustavam-se a uma gaussiana. Então, comparando estas filmagens com as filmagens que foram feitas
da microesfera que estava presa na lamínula tínhamos uma noção do quanto a molécula de DNA foi
estirada, como mostra a Figura 11:

Figura 11: Lado direito: imagem da calibração, quando a microesfera estava presa na lamínula; Lado
esquerdo: microesfera grudada com a molécula de DNA.

Sabendo da extensão da molécula de DNA, l, e da flutuação da microesfera, < δ x2 >, através da

Equação 12 obtemos o gráfico de força por extensão do DNA, como mostrado na Figura 12. E tiramos
5 RESULTADOS E CONCLUSÕES 21

as variáveis de interesse, que eram o comprimento de persistência, P, e o comprimento de contorno, L,

através do ajuste feito utilizando o modelo Worm-Like Chain (WLC) que descreve o comportamento
semi-flexível de polímeros [12].

Figura 12: Curva de força por extensão da molécula de DNA, utilizando a técnica de imagem de
difração, onde o comprimento de contorno é L = (19, 4 ± 4)µm e de persistência é P = (34 ± 1)nm.

 
KB T z 1 1
F= + − (16)
P L 4(1 − Lz )2 4
A Equação 14 é o ajuste do modelo WLC para a molécula de DNA,onde z é a extensão da molécula
na direção do eixo z. Obtivemos com sucesso a curva característica da força por extensão do DNA,
como mostra a Figura 12.
5 RESULTADOS E CONCLUSÕES 22

No entanto, determinamos a extensão da molécula de DNA, l, visualmente, adicionando ao ex-

perimento um erro humano. Para corrigir isto, estamos criando um novo método de análise, através
do contraste da imagem. Através da Equação 15 e com o auxilio do software ImageJ comparamos
o valor da contraste da imagem da microesfera de calibração com o valor da microesfera que possui
um DNA aderido. Assim, utilizando o software MathCad estes dados foram comparados obtendo-se
a extensão da molécula de DNA com mais precisão. A curva de força por extensão para este método
segue na figura abaixo.

Figura 13: Curva de força por extensão da molécula de DNA pelo método de Contraste de Imagem,
onde o comprimento de contorno é L = (51 ± 23)µm e de persistência é P = (16.4 ± 3)nm.
5 RESULTADOS E CONCLUSÕES 23

Porém, o cálculo da variância da posição da microesfera para a determinação da força aplicada

tem que ser da posição instantânea da microesfera, X. No entanto, a câmera utilizada registra a ima-
gem da microesfera por um intervalo de tempo finito para adquirir sinal suficiente. Ou seja, a imagem
adquirida é uma média da posição verdadeira, Xm , tomada durante um intervalo de tempo, que chama-
mos de tempo de integração da câmera W. Assim, como a Equação 12, não vale para a posição média
da microesfera, Xm , e sim da posição instantânea, introduzimos um erro na medida da variância dado
por

var(Xm ) ≤ var(X) (17)

Este erro superestima a força magnética aplicada, pois a var(Xm ) é menor que var(X), mas pode-
mos corrigi-lo utilizando a função de correção S(α) criada por Wong e Halvorsen [17], que nos diz
que a variância instantânea é dada por

var(Xm )
var(X) = (18)
S(α)
em que S(α) é dada por

2 2
S(α) = − 2 (1 − exp(−α)) (19)
α α
sendo que α é a razão entre o tempo de integração da câmera,W, e a escala de tempo característico,
τ da microesfera em uma armadilha harmônica (α = Wτ ), que é o tempo que caracteriza a taxa de
variação da força que representa as interações da microesfera com a solução (líquido). Aplicando
esta correção nos dados da Figura 13, obtemos a curva de força por extensão para a variância correta
da Equação 12, mostrado na Figura 14.
5 RESULTADOS E CONCLUSÕES 24

Figura 14: Quadrados vermelhos: medida da variância sem correção. Triângulos verdes: correção da
variância usando a função de correção criada por Wong e Halvorsen.

Comparando os resultados da Figura 14 com os da Figura 12, que utiliza o método de imagem de
difração, vemos que a curva para o método de contraste de imagem parece com uma curva caracte-
rística de força por extensão para a molécula de DNA. Porém, mais testes e ajustes devem ser feitos
para obter mais dados com precisão, para garantirmos que este método funciona.
Aumentando a força aplicada sobre a microesfera, maior é o erro da variância obtida em um
intervalo de tempo de integração da câmera finito, W. Segundo a referência [18], quanto maior o
tempo de integração da câmera, maior será o erro do calculo da variância, e para a análise destes
dados o tempo de integração foi W = 8500µs, sendo consideravelmente alto.
6 CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS 25

6 Conclusões e Perspectivas
Neste trabalho, mostramos dois métodos para obtenção da curva de força por extensão da molécula
de DNA, porém ajustes ainda devem ser feitos, como achar uma configuração de ímãs que gera uma
força magnética maior sobre a microesfera e achar uma taxa de captura de imagens para obter mais
dados em um intervalo de tempo menor. Além de aperfeiçoar estes métodos, nosso próximo passo será
também aplicar torque a molécula de DNA com ajuda do motor Brushed Motor Controller- KDC101
da ThorLabs para estudar quantidades como rigidez torcional e o grau de superenrolamento de DNA.
REFERÊNCIAS 26

Referências
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