Manual BCI 2019

Facultad de Medicina
Carrera de Bioquímica Clínica
Manual de Laboratorio
Bacteriología Clínica I
Código asignatura: 15664
I Semestre 2019
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Docente: José Eduardo Villacís

Horario de atención al estudiante: previa cita de lunes a viernes
Oficina: Laboratorio de Investigación Bioquímica Clínica
Correo Electrónico: jevillacis@puce.edu.ec
DESCRIPCIÓN DEL CURSO

Curso teórico-práctico en el que se estudian las enfermedades infecciosas bacterianas humanas
desde la perspectiva del reconocimiento de agentes patógenos en muestras clínicas
diferenciándolas de la microbiota normal. Se estudian los principales géneros bacterianos que son
patógenos en humanos, dando un enfoque en la identificación microbiológica, interacción con el
organismo y sus principales factores de virulencia. El curso se complementa con laboratorios
enfocados en la aplicación de distintos métodos fenotípicos y genotípicos para la identificación
de los distintos patógenos bacterianos en humanos
OBJETIVO GENERAL:
Capacitar al estudiante para que obtenga la información necesaria y útil de cómo diagnosticar y
tratar a un paciente que presente una infección bacteriana, con un manejo apropiado de muestras
clínicas humanas
RESULTADO(S) DE APRENDIZAJE DE LA CARRERA AL / A LOS QUE LA

ASIGNATURA APORTA
✓ Ejecutar las técnicas y procedimientos de laboratorio para el análisis de muestras
biológicas con calidad.
✓ Validar procedimientos de laboratorio asegurando la calidad técnica y diagnóstica del
análisis.
✓ Aplicar normas de seguridad y funcionamiento de un laboratorio clínico–microbiológico
y de biología molecular para la manipulación de diferentes muestras biológicas e
instrumental de laboratorio de acuerdo a la normativa vigente.
✓ Aplica los fundamentos científico-técnicos y administrativos para implementar, colaborar
y mantener un sistema de calidad en el laboratorio.
✓ Participar activamente en los equipos multidisciplinarios mediante sus conocimientos del
trabajo de laboratorio para ayudar en la toma de decisiones y definición de estrategias
orientadas a la atención primaria evidenciando la capacidad de trabajo en equipo
✓ Participar en la toma de decisiones para la adquisición de equipos de última generación
de acuerdo a las necesidades del laboratorio
RESULTADOS DE APRENDIZAJE DE LA ASIGNATURA

✓ Diferenciar los distintos tipos de patógenos bacterianos causantes de enfermedad en
humanos, sus factores de virulencia y su ubicación anatómica
✓ Aplicar las técnicas microbiológicas para el diagnóstico de las enfermedades infecciosas
de etiología bacteriana, respetando las normas de bioseguridad.
✓ Interpretar correctamente los resultados de las pruebas de laboratorio para el diagnóstico
de enfermedades infecciosas de etiología bacteriana.
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✓ Valorar la información de los resultados de las pruebas diagnósticas por el laboratorio, la

información clínica y epidemiológica para determinar el agente causal de las
enfermedades infecciosas y su impacto en la salud pública.
NORMAS DEL LABORATORIO:

➢ Entrar al laboratorio en forma ordenada, dejar las mochilas, libros u otros objetos
personales en los canceles asignados
➢ El uso de mandil, batas y guantes de látex o nitrilo para trabajar en el laboratorio de
bacteriología de uso obligatorio y personal.
➢ Colocarse la bata de laboratorio en todo momento, debe permanecer completamente
cerrada y esta no podrá salir del laboratorio
➢ Lavarse las manos con agua y jabón antes de realizar las actividades programadas, antes
de salir del laboratorio y siempre después de manejar materiales que se sabe o se sospecha
que son contaminantes.
➢ Limpiar y desinfectar las superficies de trabajo, antes de comenzar y al finalizar cada
práctica de laboratorio.
➢ Llevar un calzado apropiado, preferiblemente cerrado y de suela antideslizante en las
áreas de laboratorio.
➢ Recoger el cabello largo.
➢ No comer, no beber ni llevar objetos personales, prohibido aplicarse cosméticos ni
ponerse o quitarse lentes de contacto en ningún área del laboratorio.
➢ Mantener el área de trabajo ordenada, libre de libros, cuadernos u objetos personales,
exceptuando aquellos equipos y materiales necesarios para la realización del trabajo
práctico
➢ Mantener los equipos en orden, microscopio limpio el lente posterior su utilización con
el cable recogido y estuche.
➢ Colocar los materiales contaminados en los recipientes dispuestos para tal fin.
➢ Reportar inmediatamente cualquier accidente al profesor (derrame de material
contaminado, heridas, quemaduras, etc.), ninguno puede ser catalogado como menor.
➢ Por bioseguridad queda prohibido el uso de celulares durante la práctica,
➢ Si tiene alguna duda, diríjase al profesor.
MEDIDAS EN CASO DE EMERGENCIA

➢ Derrame de material biológico sobre el cuerpo: Remover la ropa inmediatamente. Lavar
vigorosamente el área expuesta con agua y jabón por un minuto. Reportar el incidente al
profesor. Buscar atención médica si es necesario.
➢ Salpicaduras en los ojos con materiales biopeligrosos: Lavar inmediatamente el globo
ocular e interior de la superficie del párpado con abundante agua durante 15 minutos
aproximadamente. Abrir el ojo para asegurar efectivamente el lavado, comenzando por
los párpados. Reportar el incidente al profesor. Buscar atención médica inmediatamente.
➢ Cortaduras menores y heridas por pinchazo: Lavar vigorosamente la herida con agua y
jabón por varios minutos. Aplicar un antiséptico adecuado Reportar el incidente al
profesor. Buscar atención médica inmediatamente.
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➢ En el caso de derrames: Reportar el incidente al profesor. Colocarse guantes y cubrir con

papel absorbente el área del derrame. Verter un desinfectante y dejar actuar 15 minutos.
Retirar el material absorbente junto al material roto y colocarlos en los recipientes para
residuos contaminados o bolsa de desechos. Lavarse las manos con abundante agua y
jabón.
➢ Centro Médico Universitario 2991660 Extensión 1660
PRÁCTICAS DE LABORATORIO:
➢ Las prácticas de laboratorio están descritas en el Manual de Laboratorio de Bacteriología
Clínica I en donde el estudiante debe leer con anticipación la práctica programada. Se
recomienda reforzar los conocimientos con el texto base o información disponible.
➢ Los informes y/o reportes de laboratorio se elaborarán por grupo de trabajo y serán
calificados según formato y criterios expuestos.
➢ La inasistencia injustificada a laboratorio no podrá ser recuperada.
➢ La justificación por inasistencia a una práctica debe realizarse previa a la falta, y con
condición de recuperación de la práctica. Una falta injustificada al laboratorio representa
la pérdida de la materia.
➢ Todos los informes o reportes de laboratorio deben ser entregados en versión digital
(documento en formato pdf) en la plataforma Moodle curso Bacteriología Clínica I (L),
6º nivel y entregados en versión impresa bajo solicitud del profesor.
➢ En caso de existir problemas con la plataforma, comunicar al profesor lo antes posible.
➢ No se aceptarán informes extemporáneos a la fecha de entrega ni en físico ni digital.
➢ Se tomarán pruebas orales o escritas de la práctica de laboratorio a realizar y de la anterior
5 minutos previo inicio del laboratorio
➢ Los exámenes parciales serán teóricos y/o prácticos que cubrirán las prácticas anteriores
con temas teóricos, procedimientos, análisis de resultados, informes, deberes y consultas.
MATERIALES PARA LABORATORIO:

Cada estudiante para ingresar a la práctica requiere de: batas de laboratorio (no saldrán del
laboratorio), un marcador punta fina, guantes de látex o nitrilo, gafas o lentes protectores,
cuaderno de trabajo y esfero.
EVALUACIÓN
La nota de la clase de laboratorio corresponde al 40% de la nota de teoría. Para pasar la materia
se debe obtener un puntaje mínimo que se determina al final de cada semestre.
Informes de laboratorio 1
Pruebas 1
Participación en clase 1
Examen parcial I, II, III 9
Examen final 8
TOTAL 20 puntos
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CONTENIDOS DEL CURSO
BACTERIOLOGÍA CLÍNICA 1 LABORATORIO
Fecha Semana Práctica
18-22 feb 1 Laboratorio 1: Introducción al laboratorio y normas de bioseguridad
25-1 marzo 2 Laboratorio 2: Medios de cultivo, aislamiento e identificación de bacterias
4-8 marzo 3 Vacación
11-15 mar 4 Laboratorio 3: Identificación de cocos Gram positivos. Staphylococcus
18-22 mar 5 Laboratorio 4: Identificación de cocos Gram positivos. Streptococcus, Enterococcus
25-29 mar 6 Examen Parcial 1
1-5 abril 7 Laboratorio 5: Baciloscopia
8-12 abril 8
15-19 abril 9
22-26 abril 10
29-3 mayo 11 Laboratorio 6: Identificación de bacilos Gram negativos (Enterobacterales)
6-10 mayo 12 Examen Parcial 2
13-17 mayo 13 Laboratorio 7: Identificación de bacilos Gram negativos no fermentadores
20-24 mayo 14
27-31 mayo 15
3-7 junio 16 Examen Parcial 3
10-14 junio 17 Examen Final
Estructura para la presentación del informe de laboratorio

La presentación del informe será tipo artículo, deberá entregarse impreso, hoja A4, a doble cara
y no debe exceder las 4 páginas.
Tema: Título de la práctica

Introducción: Se escribe en la introducción información breve, pero concisa del estado del arte
(Marco Teórico) del tema desarrollado (debe incluir las referencias bibliográficas actualizada,
relevante, de libros, artículos científicos, etc.). mínimo 2. Máximo 3 párrafos.
Redacción en modo impersonal.
Materiales y Métodos: En esta sección se hace la descripción breve de los métodos o
procedimientos utilizados. Use la tercera persona para hacer todas las descripciones, en tiempo
pasado (evite usar la primera persona del singular o del plural).
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Resultados: En esta sección se presentan los datos más relevantes en forma de tablas o gráficos
con sus respectivos nombres, la información que esté en estos, no debe repetirse en el texto. Estos
deben estar procesados o convertidos en las variables que son objeto de estudio.
Discusión o Análisis de resultados: En la discusión de resultados se analizan estos y se comparan
con lo reportado en la literatura. Es en esta sección en donde se muestra su capacidad de análisis,
de crítica y los aspectos que constituyen la originalidad de su trabajo. La discusión de resultados
es la parte de más peso y mayor importancia en el informe. Un aspecto importante de la discusión
es explicar las causas que originan los fenómenos observados. Estas causas se pueden inferir a
partir de los datos o de resultados de otras investigaciones que refuercen las afirmaciones hechas
en la discusión. También es conveniente, e indispensable, hacer una comparación con los
resultados obtenidos por otros autores y debe procurarse explicar el porqué de las diferencias o
similitudes encontradas con los trabajos previos. Indicar posibles fuentes de error que podrían
explicar la obtención de resultados incorrectos. (Debe incluir mínimo 3 referencias
bibliográficas). Redacción en modo impersonal.
Conclusiones: Lo que debe aparecer en una conclusión son las ideas originales que se originan
del trabajo o la declaración de que los resultados están en acuerdo (o en desacuerdo) con la
hipótesis de trabajo, establecida en la introducción. En las conclusiones no se colocan los
resultados.
Referencias bibliográficas: Las referencias bibliográficas deberán ir en formato APA 6ta edición.
Deben incluirse citas bibliográficas confiables como libros ya sea impresos o electrónicos junto
con artículos científicos.
Escala de calificación del informe Puntaje

Introducción 2
Materiales y métodos 1
Resultados 2
Discusión y conclusiones 4
Referencias bibliográficas 1
TOTAL 10
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Práctica 1
Seguridad en el laboratorio de Bacteriología Clínica
Objetivos de la práctica
a) Dar a conocer al estudiante de medidas de bioseguridad necesarias para evitar accidentes
de laboratorio:
b) Aplicar normas de bioseguridad para trabajar de manera adecuada en un laboratorio de
bacteriología.
Incendios
Localizar los extintores. Debido a que en un laboratorio de Bacteriología los riesgos de incendio
son variados, se requieren extinguidores. Localizar los gráficos de evacuación y señalización de
salidas de emergencia. Se participará de simulacros generales cuando las autoridades pertinentes
lo soliciten.
Problemas eléctricos
Para prevenir problemas eléctricos verificar que todo el cableado del laboratorio y de sus equipos
se encuentren en buenas condiciones. En caso de un hallazgo de un cable en mal estado,
comunicar al instructor y no conectarlo.
Almacenamiento de compuestos químicos

Es necesario confeccionar planillas con los compuestos almacenados, clasificados según su grupo
de riesgo (cancerígenos, mutágenos, teratógenos, corrosivos, venenosos, inflamables, oxidantes).
Se deben establecer precauciones de almacenamiento (por ejemplo, colocar las botellas de ácidos
concentrados en los estantes inferiores, para evitar que, en caso de accidente, se vuelquen sobre
el operador). También se deben explicitar los procedimientos a aplicar en casos de derrames y
establecer reglas de manipulación (por ejemplo, uso de protección frente a determinados
compuestos).
Bioseguridad
Como premisas fundamentales de la bioseguridad se debe:
(1) Considerar a todas las muestras que ingresen al laboratorio como de alto riesgo de
contaminación para el operador.
(2) Informar inmediatamente en caso de accidente o exposición que ocurra. Los cuidados médicos
deberán efectuarse inmediatamente.
(3) Informar al personal del laboratorio de las reglas para trabajar con agentes patógenos y los
riesgos que implica el no cumplimiento de las mismas.
(4) Inmunización apropiada cuando esté disponible.
Prácticas microbiológicas estándar

➢ El acceso a los laboratorios deberá restringirse de acuerdo a los trabajos que en ellos se
estén realizando. De todos modos, éste estará limitado al personal del laboratorio en áreas
de trabajo. No está permitido el ingreso de niños ni de mujeres embarazadas ajenas al
laboratorio, ni de individuos inmunocomprometidos.
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➢ Deben utilizarse guantes para manipular materiales que contengan microorganismos

viables o sustancias tóxicas o corrosivas. No reutilizar los guantes una vez que se hayan
quitado.
➢ Se debe proveer de ropas protectoras de laboratorio (uniforme antifluido, mandiles
mascarillas, guantes, gatas protectoras, entre otras), las que se recambiarán de acuerdo a
lo estipulado en cada caso. Los mandiles o batas que se han utilizado en el manejo de
materiales clínicos humanos o microorganismos aislados, no se podrán retirar del área de
trabajo. Cuando estén sucios, deben ser enviados en condiciones adecuadas a quien
realice la tarea del lavado de estas prendas.
➢ No utilizar zapatos abiertos
➢ Luego de manipular materiales contaminados, las personas deberán quitarse los guantes
e inmediatamente deberán realizar un correcto lavado de manos de acuerdo a guías
nacionales e internacionales. Lo mismo deberán hacer antes de retirarse del laboratorio.
➢ No está permitido comer, beber, fumar, manipular lentes de contacto, maquillarse o
almacenar alimentos para uso humano en áreas de trabajo.
➢ No morderse las uñas ni introducir cualquier objeto a la boca.
➢ Está prohibido pipetear con la boca. Se utilizarán dispositivos mecánicos.
➢ Los objetos cortantes (por ejemplo, cubreobjetos o portaobjetos) o punzantes (por
ejemplo, agujas) deberán descartarse en los recipientes instalados en cada mesón de
trabajo para tal fin. Cuando el recipiente esté ocupado en las 3/4 partes de su volumen,
deberá ser retirado para ser descontaminado.
➢ Todos los procedimientos se deberán efectuar minimizando la creación de aerosoles o
salpicaduras.
➢ Las mesadas en las que se pipeteen soluciones o suspensiones deberán contar con las
micropipetas adecuadas.
➢ Todos los mesones deberán tener alcohol de 70° (renovación semanal), y solución de
hipoclorito de sodio al 5% (renovación diaria) para descontaminar las áreas de trabajo.
➢ En todos los sectores deberá haber bolsas de determinado color (por ejemplo, negras)
para el descarte de residuos comunes, recipientes con la etiqueta de riesgo biológico y
bolsas de otro color (por ejemplo, rojas) para descontaminar y descartar material
contaminado y bolsas de otro color (por ejemplo, transparentes) de 150 micrones de
espesor para descontaminar y reciclar.
➢ Las superficies de trabajo se deberán descontaminar al menos una vez al día o luego de
algún derrame visible.
➢ Todo material a reusar o descartar, debe ser previamente descontaminado. No efectuar la
limpieza del mismo en el laboratorio.
➢ Todos los cultivos, stocks o materiales clínicos a desecharse deberán ser
descontaminados previamente. Para ello deberán colocarse en bolsas de mayor espesor
(transparentes), si se trata de recipientes reciclables, o bolsas rojas, si se trata de
elementos descartables. Las bolsas se transportarán a los descontaminadores (autoclaves)
y se procesarán de acuerdo a los procedimientos adecuados (125ºC durante media hora)
o se entregarán al personal encargado de los residuos patológicos.
➢ Todos los procedimientos técnicos deberán realizarse tratando de minimizar la
producción de aerosoles.
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Equipos de Seguridad (Barreras Primarias).

Los equipos de seguridad incluyen gabinetes de seguridad biológica (BSCs), recipientes cerrados,
y otros controles de ingeniería destinados a eliminar o minimizar las exposiciones a materiales
biológicos peligrosos. El gabinete de seguridad biológica (BSC) es el dispositivo principal
utilizado para proporcionar contención de salpicaduras o aerosoles infecciosos generados por
diversos procedimientos microbiológicos. Los gabinetes de seguridad biológica Clase I y Clase
II de frente abierto son barreras primarias que ofrecen niveles significativos de protección del
personal de laboratorio y del medio ambiente cuando se los utiliza en combinación con buenas
técnicas microbiológicas.
El gabinete de seguridad biológica Clase II también brinda protección contra la contaminación
externa de los materiales (por ejemplo, cultivos celulares, stocks microbiológicos) que se
manipulan dentro del gabinete. Un ejemplo de otra barrera primaria es la cubeta centrífuga de
seguridad, un recipiente cerrado destinado a prevenir la liberación de aerosoles durante el
centrifugado.
Para minimizar este riesgo, se deben utilizar controles de contención tales como BSCs o cubetas
centrífugas cuando deban manipularse agentes infecciosos que puedan transmitirse a través de la
exposición a aerosol. Los equipos de seguridad pueden también incluir elementos de protección
personal, tales como guantes, ambos, delantales, cobertores de zapatos, botas, respiradores,
máscaras faciales, anteojos de seguridad o antiparras.
Diseño de Instalaciones (Barreras Secundarias)

El diseño y la construcción de la instalación contribuyen a la protección de quienes trabajan en el
laboratorio, proporcionan una barrera para proteger a las personas que se encuentran fuera del
laboratorio, y protegen a las personas o animales de la comunidad de agentes infecciosos que
pueden ser liberados accidentalmente del laboratorio. La gerencia del laboratorio es responsable
de la provisión de instalaciones que guarden relación con la función del laboratorio y el nivel de
bioseguridad recomendado para los agentes que se manipulan.
La barrera o barreras recomendadas dependerán del riesgo de transmisión de los agentes
específicos. Por ejemplo, los riesgos de exposición de la mayor parte del trabajo en instalaciones
del nivel de Bioseguridad 1 y 2 serán el contacto directo con los agentes o exposiciones a
contactos inadvertidos a través de medio ambientes de trabajo contaminados. Las barreras
secundarias en estos laboratorios pueden incluir la separación del área de trabajo del laboratorio
del acceso al público, la disponibilidad de un sistema de descontaminación (por ejemplo,
autoclave) e instalaciones para el lavado de las manos.
Cuando el riesgo de infección por exposición a un aerosol infeccioso está presente, quizás sea
necesario implementar un mayor nivel de contención y barreras secundarias múltiples para evitar
que los agentes infecciosos se escapen hacia el medio ambiente. Dichas características de diseño
incluyen sistemas de ventilación especializados para asegurar el flujo de aire direccional, sistemas
de tratamiento de aire para descontaminar o eliminar agentes del aire de escape, zonas de acceso
controladas, esclusas de aire en las puertas de acceso al laboratorio o edificios o módulos
separados para aislar al laboratorio.
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Niveles de bioseguridad
Referencias:
1. OMS. Manual de bioseguridad en el laboratorio. (4ta ed.) 2012.
2. Richmond JY, Mc Kinney RW. Bioseguridad en laboratorios de Microbiología y
Biomedicina. CDCNIH, 4ta ed., Atlanta, GA, EE.UU., 2004.
3. U.S. Department of Labor, Occupational Safety and Health Administration. 1991.
Occupational Exposure to Bloodborne Pathogens, Final Rule. Fed. Register 56:64175-
64182.
4. U.S. Department of Labor, Occupational Safety and Health Administration. 1991. (2)
Richmond, J.Y. 1994. "HIV Biosafety: Guidelines and Regulations." In (G.
Schochetman, J. R. George, Eds.), AIDS Testing, Edition 2 (pp. 346-360). Springer-
Verlag New York, Inc.
5. National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS). 1997. Protection of
laboratory workers from instrument biohazards and infectious disease transmitted by
blood, body fluids, and tissue. Approved guideline. Dec. 1977, NCCLS Doc. M29-A
(ISBN1-56238339-6.
Esta práctica NO TIENE INFORME.
Deber 1: Grupal
Indicar 2 microrganismos bacteriano BSLIII, sus riesgos de laboratorio y precauciones
recomendadas para su manejo.
Acceder al siguiente link: https://my.matterport.com/show/?m=Mn6qitX5BwX
Enumerar los equipos que se encuentran en el BSLIII)
Adjuntar 1 ficha técnica de un reactivo de uso frecuente en el laboratorio de bacteriología clínica,
explicar su modo de uso y como descartarlo (Grupo de laboratorio)
Entregar el documento en formato pdf en la plataforma Moodle
Fecha límite: G1 lunes, G2 martes y G3 miércoles 13:00
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Práctica 2
Medios de cultivo, aislamiento e identificación de bacterias
1. Reconocer los diferentes medios de cultivo existentes para el crecimiento de
microorganismos aplicado a la parte clínica
2. Conocer el fundamento de uso de los diferentes medios de cultivo.
3. Inocular medios de cultivo, líquidos o sólidos para conseguir un correcto aislamiento.
Introducción
El cultivo de un microorganismo se basa en el conocimiento de sus necesidades nutritivas y
físicas. En el laboratorio podemos preparar o seleccionar medios adecuados a las necesidades de
crecimiento de una bacteria. Un medio puede ser de consistencia líquida, en este caso se denomina
caldo, o sólida, si se agrega agar al caldo. El agar es un polisacárido, extraído de algas, que
funciona como sustancia solidificante e inerte, ya que no actúa como elemento nutritivo frente a
la gran mayoría de las bacterias. Se comercializa en forma de polvo o gránulos finos y se puede
agregar a cualquier caldo en concentración de aproximadamente 15 a 20 gramos por litro, de
acuerdo a la calidad y grado de hidratación. El agar le confiere al medio una consistencia sólida,
o si se agrega en menor cantidad se pueden preparar medios semisólidos. Muchos de los adelantos
de la Microbiología se debieron al uso del agar, que ha permitido aislar y diferenciar bacterias,
proceso que no es posible en medios líquidos.
Clasificación de acuerdo a la finalidad

Medios no selectivos
Tienen por finalidad obtener el desarrollo de la mayor parte de los microorganismos. Son
ejemplos el agar tripticasa de soja adicionada de 5 % de sangre de oveja y el agar chocolate.
No existen medios universales. Las bacterias varían enormemente en cuanto a sus requerimientos
nutricionales, por lo que ningún medio es capaz de promover el crecimiento de todas las bacterias
que existen en la naturaleza.
Medios enriquecidos
Contienen un medio basal de apoyo al crecimiento, al cual se le agregan suplementos, como
vitaminas, hemina, suero bovino, etc. y están dirigidos a recuperar bacterias exigentes en
requerimientos nutritivos. Por ejemplo, un medio para cultivar gérmenes anaerobios consiste agar
tripteína de soja (medio basal) con agregado de hemina, vitamina K y sangre lisada de caballo
(suplementos nutritivos).
Medios selectivos
Tienen como objeto seleccionar determinado tipo de bacterias y eliminar otras acompañantes en
materiales clínicos donde se encuentran mezcladas. Se logra generalmente agregando a un medio
básico, colorantes como el cristal violeta o antibióticos para inhibir el desarrollo de algunos
grupos de microorganismos en forma selectiva. Ej. Agar Manitol Salado para seleccionar
Staphylococcus, agar SS para seleccionar Salmonella y Shigella, medio de Skirrow (con
antibióticos) para Campylobacter, entre otros.
Medios diferenciales
Permiten distinguir la presencia de distintos microorganismos en el cultivo y dan una orientación
rápida sobre algunos géneros y especies. Un ejemplo es el medio EMB, que contiene entre sus
componentes, lactosa como fuente de carbono y dos colorantes, eosina y azul de metileno. Las
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bacterias que no atacan la lactosa dan colonias transparentes y las que producen acidez a partir de
la lactosa dan colonias rojas, rosadas u oscuras. La especie Escherichia coli produce colonias
oscuras y de brillo metálico a diferencia de otras enterobacterias como Enterobacter spp. o
Klebsiella spp., cuyas colonias son rosadas. Este medio además de diferencial, es semiselectivo,
ya que los colorantes no permiten el crecimiento de las bacterias Gram positivas o hacen que su
desarrollo se vea inhibido.
Medios cromogénicos
Son medios de cultivo que incluyen en su composición compuestos cromógenos incoloros o
débilmente coloreados que son sustratos de enzimas específicas. Cuando estas enzimas degradan
el sustrato cromogénico, éste se transforma en una molécula coloreada. Estos medios de cultivo,
permiten así la identificación presuntiva de algunos patógenos frecuentes en un solo paso. Ej.
recuperación de patógenos específicos: estreptococos del grupo B, estafilococos resistentes a
meticilina, enterococos resistentes a vancomicina, etc.
Medios de transporte
Cuando se deben investigar microorganismos que pierden fácilmente viabilidad fuera de su
hábitat y por alguna circunstancia no se los puede cultivar inmediatamente, se recurre a los medios
de transporte, que se caracterizan por no poseer nutrientes, pero sí condiciones de humedad,
isotonicidad, pH y presencia de algunos reductores como cisteína o tioglicolato de sodio. Son
ejemplos el medio de Stuart, el medio de Cary y Blair y el de Amies carbón, que contiene carbón
activado.
Sistemas de identificación
Hay sistemas miniaturizados manuales (Api, cristal) y automatizados (ej Vitek, Micro Scan,
Phoenix, Sensititre) que, a través de una combinación de pruebas, proveen un bionúmero que
confrontado en una base de datos nos da la identificación más probable.
También hay en el mercado discos y tabletas con sustratos que con la utilización de un inóculo
bacteriano denso pueden detectar reacciones enzimáticas sin que exista desarrollo de la bacteria.
Recientemente, se ha aplicado la espectrometría de masas a la identificación de patógenos
bacterianos. El método, llamado MALDI-TOF MS se basa en la diferente velocidad que
adquieren partículas cargadas en una cámara de ionización. MALDI-TOF MS son las iniciales de
Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry.
Control de calidad de los medios de cultivo

En general, se utilizan medios deshidratados, que se reconstituyen en el laboratorio, o medios ya
preparados, listos para usar. En todos los casos deben ser conservados y procesados de acuerdo a
las especificaciones del fabricante, teniendo siempre en cuenta la fecha de vencimiento y las
condiciones de conservación y observando antes de usarlo las características físicas del mismo.
Si se trata de medios en polvo verificar su hidratación, consistencia y/o color.
Control de esterilidad
Al menos un 5% de las unidades de medios distribuidos en placas de Petri debe ser incubado a
35ºC durante 24 horas. A los medios que contienen sangre conviene incubarlos 24 horas más a
temperatura ambiente, para controlar el desarrollo de bacterias psicrófilas como Pseudomonas
fluorescens o Pseudomonas putida.
Cuando se detecte más de un 10% de placas contaminadas, debe desecharse todo el lote.
Control de pH
Deberá controlarse que el medio preparado tenga el mismo pH que se especifica en la literatura o
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en las recomendaciones del fabricante. Se debe rehidratar con agua de pH controlado y efectuarse
una medida inicial previa a la esterilización.
La medición final se realiza a una de las placas preparadas después su esterilización y
solidificación.
Apariencia y color
Se debe observar que las características del medio preparado respondan a su composición. La
presencia de algún precipitado, a menos que el medio contenga algún componente insoluble,
indica algún problema en la técnica de preparación, en la calidad del agua utilizada o en la calidad
del medio comercial. Si el precipitado desaparece cuando el medio se coloca a la temperatura de
incubación, se considera que es satisfactorio. Si el color no es el esperado, se debe controlar el
pH, cuyo valor debe caer dentro de0,2 unidades de lo especificado en la fórmula. Este control se
realiza para cada lote de placas compradas o cada vez que se prepara el medio.
Control de crecimiento
El control se realiza en una de las placas preparadas y se utilizan cepas bacterianas de especies
que sean exigentes para el desarrollo o que muestren características particulares en el medio.
El lote se considera apto para su empleo cuando se obtiene un desarrollo confluente de esa cepa.
Estabilidad y condiciones de conservación

Las placas preparadas deben ser almacenadas entre 2 y 8º C en bolsas selladas.
Los frascos con medios que no vayan a ser utilizados en el momento deberán guardarse en un
lugar seco al resguardo de la luz solar.
Antes de su utilización se debe controlar que los medios de cultivo no presenten evidencia de
descoloración, deshidratación, rotura del agar, volumen insuficiente, evidencias macroscópicas
de crecimiento bacteriano o micótico u otros signos de deterioro. Se sugiere descartar los medios
que presenten algunas de estas características.
Técnica de estriamiento en medios de cultivo.

Toda manipulación de muestras o cultivos bacterianos que implique la apertura de recipientes
expone su contenido a la contaminación desde el exterior por microorganismos externos o
esporas: estos se encuentran en el aire, polvo, superficies, piel, cabellos o ropa del manipulador,
y cualquier objeto o instrumento no estéril que entre en contacto o se acerque a los recipientes.
Para minimizar las posibilidades de contaminación ambiental todos los procesos deben realizarse
en condiciones de trabajo aséptico: En condiciones ideales, se debe trabajar en cabinas de flujo
laminar, que son cámaras en las cuales el aire que circula en su interior está prácticamente
desprovisto de microorganismos gracias a procesos de filtración y tratamiento con UV. En el
mesón de laboratorio, la asepsia se consigue extremando las medidas de limpieza y desinfección
en el área de trabajo, donde sólo se encontrará el material necesario, y utilizando en todo momento
el mechero de gas encendido. La llama debe ser azul transparente para que su poder de
calentamiento sea máximo y la combustión perfecta: debe regularse adecuadamente la entrada de
aire con la rosca del mechero. La llama nunca deberá estar de color amarillo o anaranjado, La
llama del mechero se usa para flamear algunos de los instrumentos que se utilizarán en las los
cultivos bacterianos (asas de siembra) y también se usa para flamear las bocas de todos los
recipientes siempre al abrirlos o al cerrarlos. La llama del mechero crea una zona de seguridad a
su alrededor en la que las posibilidades de contaminación se minimizan y en la que se debe
trabajar siempre sin alejar de ella los recipientes e instrumentos: todos los tubos y cajas petri se
abrirán de modo que queden con la cara hacia la llama del mechero. Todos los instrumentos que
se usen para llevar a cabo pases de muestras, medios de cultivo estéril o cultivos microbianos han
de estar previamente esterilizados: Las asas metálicas se esterilizarán en el momento de
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utilizarlas, flameándolas hasta que todo el alambre este simultáneamente al rojo vivo, y
dejándolas enfriar luego unos segundos, cerca de la llama del mechero, antes de recoger con ellas
el inóculo. Después de su uso las asas metálicas se vuelven a flamear antes de dejarlas en la mesa.
Técnicas para realizar inoculaciones o siembras bacterianas

El profesor realizará una demostración de cada una de las técnicas antes de cada procedimiento
Tipos de inoculación: 1.- Líquido a líquido (tubo a tubo)
2.- Líquido a sólido: (tubo a medio de cultivo)
3.- Sólido a líquido: (medio de cultivo a tubo o caja)
4.- Sólido a sólido: (medio de cultivo a medio de cultivo)
Materiales
➢ Mechero Bunsen
➢ Microscopio óptico
➢ Incubadora 370 C
➢ Refrigeradora
➢ Asa de punta circular
➢ Etanol 70%
➢ Fósforos
➢ Solución salina estéril 0,9%
➢ Hisopos
➢ Marcador punta fina
➢ Bata de laboratorio y guantes
➢ Colorantes cristal violeta, yodo Gram, alcohol-cetona y safranina
➢ Cultivos bacterianos de:
• Staphylococcus aureus (A)
• Staphylococcus epidermitidis (B)
• Escherichia coli (C)
• Klebsiella pneumoniae (D)
➢ Medios de cultivo:
• Agar Mac Conkey
• Agar Sangre Humana
• Agar Manitol Salado
• Agar Eosin Metilen Blue
Procedimiento
Inoculación de líquido a sólido: (Tubo A, B, C, D a medio de cultivo)
1.- Comprueba que tienes a tu alcance, cerca de la llama del mechero, un tubo con suspensión
bacteriana en su gradilla y una placa Petri de ABS con medio de cultivo sólido (sin líquido en la
superficie, que debe de estar seca), así como un asa microbiológica.
2.- Toma el asa y flaméala a la llama hasta que todo el alambre esté al rojo vivo. Deja que se
enfríe, manteniéndola en el área de seguridad, durante unos 10 segundos.
3.- Con la otra mano, toma el tubo del que vas a extraer el inóculo y destápalo utilizando para ello
el dedo meñique de la mano que sostiene el asa. Mantén el tapón todo el tiempo sujeto de ese
modo: no lo dejes en mesón, se contaminaría.
4.- Manteniendo el tubo ligeramente inclinado y con la boca dirigida a la llama, flamea
brevemente la misma (2 pases por la llama girando la boca) e inmediatamente introduce el asa y
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sumérgela en el líquido, de modo que al sacarla lleves una película de líquido en el asa. Cuida de
no tocar las paredes a la salida para que no se derrame.
5.- Vuelve a flamear ligeramente la boca del tubo y ponle de nuevo el tapón que mantenías sujeto
en el meñique de la otra mano. Deja el tubo en su gradilla.
6. Toma una placa de medio de cultivo sólido y ábrela en las proximidades de la llama, dejando
la tapa en la bancada y manteniendo la placa abierta de cara a la llama del mechero.
7.- Con el asa cargada con el inóculo, desliza esta sobre un sector de la superficie del agar,
dibujando estrías rectas, apretadas y extensas como se indica en la figura siguiente.
8.- Cierra la placa y esteriliza el asa totalmente.
Déjala enfriar. 9.- Gira la placa 90º desde la posición en que la dejaste, ábrela y, con el ASA
ESTÉRIL (sin volver a tomar inóculo), dibuja un nuevo grupo de estrías que se crucen con las
primeras, de modo que arrastres unas cuantas células de la que han quedado depositadas en la
zona 1, hasta la zona 2
10.- Cierra la placa, esteriliza de nuevo el asa y déjala enfriar.
11.- Gira de nuevo la placa 90º, ábrela y realiza un tercer grupo de estrías con el asa estéril,
siguiendo la pauta de la figura en la zona 3.
12.- Cierra la placa, esteriliza el asa antes de dejarla y lleva la placa a incubación con la tapa hacia
arriba y en las condiciones requeridas.
Inoculación de sólido a sólido: (medio de cultivo a medio de cultivo)

1.- Toma con el asa redonda estéril una pequeña cantidad de inóculo de un tubo o placa igual que
se indica en el procedimiento anterior.
2.- Con el asa cargada con el inóculo, desliza esta sobre un sector de la superficie del agar,
dibujando estrías rectas, apretadas y extensas como se indica en la figura.
3.- Cierra la placa y esteriliza el asa totalmente. Déjala enfriar.
4.- Gira la placa 90º desde la posición en que la dejaste, ábrela y, con el ASA ESTÉRIL (sin topar
el inóculo), dibuja un nuevo grupo de estrías que se crucen con las primeras, de modo que arrastres
unas cuantas células de la que han quedado depositadas en la zona 1, hasta la zona 2.
5.- Cierra la placa, esteriliza de nuevo el asa y déjala enfriar.
6.- Gira de nuevo la placa 90º, ábrela y realiza un tercer grupo de estrías con el asa estéril,
siguiendo la pauta de la figura en la zona 3.
7.- Cierra la placa, esteriliza el asa antes de dejarla y lleva la placa a incubación con la tapa hacia
arriba y en las condiciones requeridas. De este modo, arrastrarás unas pocas células de la zona 2
a la zona 3; estas serán tan escasas que probablemente quedarán lejos unas de otras durante el
movimiento final del asa, y, cuando crezcan y se desarrolle una colonia, estará lo suficientemente
aislada.
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Inoculación de Sólido a líquido: (medio de cultivo a tubo o caja)

1.- Prepara en tu mesón una placa con colonias de alguna cepa microbiana.
2.- Toma el asa redonda, esterilízala a la llama y deja que se enfríe. Una vez fría, destapa el tubo
o la placa con el cultivo microbiano siguiendo las indicaciones de los procedimientos previos,
toca con el asa el cultivo del tubo, o una colonia aislada si se trata de una placa, de modo que el
asa recoja una pequeña porción del inóculo. Cierra la caja Petri asépticamente.
3.- Toma el tubo de medio líquido, destápalo en condiciones asépticas e introduce el asa cargada
con el inóculo hasta la parte media del tubo y disolver el inoculo en las paredes del tubo con la
ayuda del medio líquido.
4.- Saca el asa y cierra el tubo tras flamear la boca del mismo. Colócalo en la gradilla.
5.- Esteriliza totalmente el asa antes de dejarla en su lugar.
Inoculación de Líquido a líquido (tubo A + tubo B + tubo C + tubo D)

1.- Comprueba que tienes la llama del mechero correctamente encendido, un asa metálica redonda
y un tubo correctamente tapado en una gradilla al alcance de la mano.
2.- Toma el asa y flaméala a la llama hasta que todo el alambre esté al rojo vivo. Deja que se
enfríe, manteniéndola en el área de seguridad, durante unos 10 segundos.
3.- Con la otra mano, toma el tubo del que vas a extraer el inóculo y destápalo utilizando para ello
el dedo meñique de la mano que sostiene el asa. Mantén el tapón todo el tiempo sujeto de ese
modo: no lo dejes en mesón, se contaminaría.
4.- Manteniendo el tubo ligeramente inclinado y con la boca dirigida a la llama, flamea
brevemente la misma (2 pases por la llama girando la boca) e inmediatamente introduce el asa
redonda y sumérgela en el líquido, de modo que al sacarla lleves una película de líquido en el asa.
Cuida de no tocar las paredes a la salida para que no se derrame.
5.- Vuelve a flamear ligeramente la boca del tubo y ponle de nuevo el tapón que mantenías sujeto
en el meñique de la otra mano. Deja el tubo en su gradilla.
6.- Toma el segundo tubo (el que vas a inocular) y ábrelo siguiendo el mismo procedimiento que
con el primero: una vez abierto y flameada la abertura, introduce el asa cargada, sumérgela en el
líquido, agítala un poco y sácala escurriéndola contra la pared interior del tubo. Flamea la boca
del mismo y tápalo con su tapón, que debes estar sujetando con el meñique de la otra mano.
7.- Por último, flamea el asa hasta que se ponga al rojo antes de depositarla en su lugar (o proceder
a una nueva inoculación).
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Resultados:
Indicar que cultivos tuvieron crecimiento en los diferentes medios de cultivo
Microoganismo ABS A. MaConkey Manitol EMB
Staphylococcus Ej.
aureus (A) Crecimiento
Staphylococcus
epidermitidis (B)
Escherichia
coli (C)
Klebsiella
pneumoniae (D)
Tipo de medio de
cultivo
Deber 2: Grupal
Responder las siguientes preguntas:
¿Cuál es la razón por qué se usan diferentes medios de cultivo para sembrar muestras clínicas?
¿En qué medios sembraría muestras de LCR, sangre, Esputo inducido y Heridas?
¿Explicar por qué en el mismo medio no crecieron las cuatro especies bacterianas?
Indicar en una tabla 5 medios de cultivo no selectivos, 5 medios selectivos, 5 medios diferenciales,
y 5 cromogénicos.
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Práctica 3
Identificación de bacterias cocos Gram positivos (Staphylococcus)
1. Conocer el fundamento de uso de las diferentes pruebas de laboratorio para identificación
de Staphylococcus spp.
2. Diferenciar las diferentes especies de Staphylococcus de importancia clínica.
3. Establecer algoritmos diagnósticos para identificación de género y especie
Introducción
Históricamente, los géneros Staphylococcus y Micrococcus fueron colocados junto con los
géneros Stomatococcus y Planococcus. en la familia Micrococcaceae, sin embargo, la
filogenética molecular y los análisis taxonómicos revelaron que los Staphylococcus y los
“Micrococcus” no están estrechamente relacionados. Los Staphylococcus pertenecen al cluster
Bacillus-Lactobacillus-Streptococcus, que consiste en bacterias Gram positivas con ADN en bajo
contenido G + C. Los Staphylococcus se caracterizan por ser células esféricas no formadoras de
esporas de 0,5 a 1,5 μm de diámetro, no móviles, que aparecen como cocos simples, en pares,
como tétradas, o como cadenas cortas, formando grupos irregulares como un racimo de uvas y
suelen ser catalasa positivos, mientras que en algunos casos se han reportado cepas catalasa
negativos. Estos crecen en presencia de NaCl 10% entre 18 ° C y 40 ° C y su metabolismo es
respiratorio y fermentativo.
Los microorganismos del género Staphylococcus, tienen la capacidad de producir diversas

infecciones, entre ellas: bacteriemia, endocarditis, infecciones de piel y partes blandas,
infecciones osteoarticulares, neumonías, e infecciones de vías urinarias. En agente más
importante de este género constituye S. aureus pero también se encuentran otras especies como
S. epidermidis, S. saprophyticus, S. lugdunensis que producen procesos infecciosos.
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Tabla 1. Pruebas que diferencian especies de Staphylococcus
Especie Clumping Free PYR Ureasa DNAsa Manitol

Factor coagulase
S. aureus POS POS NEG V POS POS

S. intermedius V POS POS POS POS V
S. pseudointermedius NEG POS POS POS POS POS
S. delphini NEG POS NEG POS NEG POS

S. schleiferi sub. POS NEG POS NEG POS NEG
Schleiferi
S. schleiferi sub. NEG POS V POS POS V

coagulans
PRUEBA DE CATALASA
La catalasa es una enzima (hemoproteína) que se encuentra en la mayoría de las bacterias aerobias
y anaerobias facultativas. Esta enzima cataliza la rotura del agua oxigenada, liberando oxígeno
libre. Esta prueba se la utiliza para diferenciar los géneros microbianos:
Staphylococcus (+), Micrococcus (+) de Streptococcus (-)
Bacillus (+) Listeria monocytogenes (+) Corynebacterium (+)
El agua oxigenada y el anión superóxido son productos terminales o intermedios de la

degradación aeróbica de los azúcares. Las catalasas se encargan de eliminar estos intermediarios
que son tóxicos para la bacteria.
2H2O2 2H2O + O2
PROCEDIMIENTO:
Colocar una gota de H2O2 al 3% en una placa portaobjetos libre de grasa
Suspender la colonia que ha crecido en agar nutritivo o no selectivo
Una producción inmediata de burbujas indica una reacción positiva.
Si la prueba se hace sobre medios que contienen sangre verificar posibles falsos positivos ya que
los eritrocitos también poseen la enzima catalasa, por lo que hay que tomar en cuenta que la
producción de burbujas se produzca a partir de las colonias y no del medio de cultivo.
Control de calidad: Enterococcus faecalis ATCC 29212 (negativa)
Staphylococcus aureus ATCC 25923 (positiva)
PRUEBA DE COAGULASA
Esta prueba nos permite la identificación y diferenciación de Staphylococcus coagulasa positiva
de Staphylococcus coagulasa negativa
Existen dos tipos de coagulasa:
Coagulasa libre: Es una enzima termoestable extracelular, que actúa mediante la activación del
factor CRF, formándose un complejo coagulasa-CRF, el cual reacciona con el fibrinógeno
produciéndose un coágulo de fibrina (test en tubo).
Coagulasa ligada: Está unida a la pared celular bacteriana que actúa sobre el fibrinógeno
provocando la formación de coágulos al contacto con el plasma. (test en placa).
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Para realizar esta prueba es recomendable el uso de plasma de conejo, la prueba se visualiza a las
4 horas, si existe presencia de coágulo, la prueba se considera positiva y si es negativa, se debe
espera 18 horas más, para confirmar su resultado. S. aureus no es la única especie coagulasa
positiva de este género. Esta actualización evita tener conceptos errados que lleve a
identificaciones incorrectas que pueden tener un alto impacto terapéutico.
PROCEDIMIENTO:
Prueba en Placa (coagulasa ligada)
Sobre un portaobjetos limpio colocar una gota de agua destilada o solución salina 0.8% estériles.
Con el asa estéril tomar 5 colonias de la bacteria en cultivo puro a examinar, depositarlas en la
gota de agua destilada o solución salina 0.8% y emulsificarlas hasta que se forme una suspensión
homogénea.
Añadir una gota de plasma de conejo a la suspensión anterior y mezclar por 10 segundos.
Las bacterias coagulasa (+) forman grumos visibles en 20 segundos
Se considera un resultado (-) si no aparecen grumos dentro de 4 minutos
Todo resultado negativo debe chequearse con la prueba en tubo.
Prueba en tubo (coagulasa libre)
En un tubo de 5mL estéril colocar 0.5 ml de plasma de conejo
Con el asa estéril tomar 5 colonias de la bacteria en cultivo puro a examinar y depositarlas en el
tubo con plasma.
Incubar el tubo en un baño María a 37°C.
Realizar la lectura a las 4 horas visualizando la formación de un coágulo que indicaría un resultado
positivo. Si no se observa el coágulo volver a incubar hasta 18 horas y chequear
PRUEBA MANITOL SALADO:

Es un medio selectivo y diferencial que se usa para el aislamiento selectivo de Staphylococcus sp.
por su alta concentración de cloruro sódico 7.5%, y es diferencial por que permite la
diferenciación de especies que metabolizan el carbohidrato manitol mediante la acidificación del
medio, el cual provoca un cambio del medio de rojo a amarillo por su indicador rojo fenol,
PRUEBA DE NOVOBIOCINA
La novobiocina es un antibiótico que actúa a nivel de las cadenas de ADN, impidiendo el super
enrrollamiento, por inhibición de una topoisomerasa, la girasa de ADN. Este antibiótico sirve
para diferenciar S. saprophyticus de otros Staphylococcus sp.
Esta prueba se basa en la resistencia intrínseca de S. saprophyticus a la novobiocina para
diferenciarlo de otras especies de Staphylococcus. Esta resistencia está asociada a la mutación en
GyrB. Esta prueba se realiza con un disco de 5ug de novobiocina.
PROCEDIMIENTO:
Sembrar las colonias sospechosas de S. saprophyticus en estrías muy juntas y sobre la superficie
de Agar Mueller Hinton o Agar base de sangre con una suspensión 0.5 Macfarland
Poner en el centro de la siembra un disco de 5ug novobiocina
Incubar aeróbicamente a 37°C por 24 horas
Se considera resistente si no aparece zona de inhibición alrededor del disco de novobiocina.
Control de calidad: Staphylococcus saprophyticus (resistente)
Staphylococcus aureus ATCC 25923 (sensible)
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Resistencias intrínsecas
Tomado de: CLSI M100ED29
Caso Clínico
Paciente masculino de 29 años de edad, acude al servicio de urgencias presentando escalofríos,
fiebre y dolor en la pierna derecha de 72 h de evolución. Refiere ampollas dolorosas y fluctuantes
de propagación progresiva en la pierna afectada. Al estudio físico se observan lesiones de aspecto
necrótico en la pierna. Se considera un diagnóstico clínico de osteomielitis.
El diagnóstico microbiológico se realiza mediante aspiración dirigida por tomografía
computarizada. En la tinción de Gram del aspirado de la herida, se observan cocos Gram positivos
agrupados en racimos. En agar sangre, se desarrollan colonias B hemolíticas:
Se requiere continuar con la identificación de colonias sospechosas e indicar su género y especie
Microrganismo Características Coloración Coagulasa Coagulasa

Catalasa Manitol MecA
macroscópicas Gram Tubo Placa
Colonia 1
Colonia 2
Colonia 3
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Microrganismo
Género y Especie
Colonia 1
Colonia 2
Colonia 3
Antibiograma Colonia 1
Esta práctica TIENE INFORME. Grupal

Explicar el proceso de como el microorganismo llego al hueso e interpretar sus resultados del
laboratorio incluido el antibiograma como un reporte de caso
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Práctica 4
Identificación de bacterias cocos Gram positivos (Streptococcus y Enterococcus)
de Streptococcus y Enterococcus spp.
2. Diferenciar las diferentes especies de Streptococcus y Enterococcus de importancia
clínica.
Introducción
El género Streptococcus comprende actualmente más de 100 especies reconocidas, un
número que se puede esperar aumente por los avances de tecnologías de última
generación. Los Streptococcus son Firmicutes del orden Lactobacillales y pertenecen a
la familia Streptococcaceae.
La designación de especies de Streptococcus se basa sobre la reacción de hemólisis, el
tamaño de la colonia y la presencia de antígenos de Lancefield que tiene varias
limitaciones pero que aún tiene un valor en la microbióloga clínica y su diagnóstico
presuntivo.
Las especies bacterianas pertenecientes al género Streptococcus son cocos Gram

positivos catalasa negativos de menos de 2 μm que tienden a crecer en cadenas en medio
líquido. La mayoría de las especies del género Streptococcus tiene un bajo contenido de
G + C en el ADN. Los Streptococcus son anaerobios facultativos. Debido a la falta de
compuestos hemo, estas bacterias son incapaces de tener metabolismo respiratorio.
Algunas especies como S. viridans y S. pneumoniae requieren niveles de CO2 al 5% para
un crecimiento adecuado, a 37°C
Características fenotípicas
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Los miembros del género Enterococcus son cocos Gram positivos, catalasa negativos que se
producen individualmente o están dispuestos en parejas o como cadenas cortas. Las morfologia a
veces son cocobacilares. Después del crecimiento en agar sangre durante 24 h, las colonias suelen
estar entre 1 y 2 mm de diámetro. Algunos aislamientos de E. faecalis puede ser beta-hemolítico
en agar que contiene sangre de conejo, caballo o sangre humana pero no hemolítica en agar que
contiene sangre de ovejas. Todas las demás especies suelen ser alfa-hemolíticas o no hemolíticas.
Los enterococos son anaerobios facultativos con un metabolismo que resulta en la producción de
ácido láctico como el principal producto final de la fermentación de la glucosa.
Estos microorganismos suelen ser capaces de crecer a temperaturas que van desde 10 a 45 ° C
con un crecimiento óptimo a 35ºC. La mayoría de las especies crecen en caldo que contiene 6,5%
de NaCl, e hidrolizan la esculina en presencia de sales biliares.
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Características fenotípicas
Resistencias intrínsecas
Tomado de: CLSI M100ED29
PRUEBA DE BACITRACINA
La bacitracina es una droga que interfiere con la síntesis del peptidoglicano teniendo un efecto
bactericida en la bacteria. Esta prueba se usa para la Identificación de Streptococcus Beta
hemolítico Grupo A (S. pyogenes) que es sensible a concentraciones de 0.04 unidades de
bacitracina mientras los demás estreptococos betahemolíticos no lo son.
PROCEDIMIENTO:
Con un asa estéril sembrar las colonias sospechosas de Streptococcus beta hemolítico Grupo A
sobre la superficie de un agar sangre fresco de cordero.
Colocar en el centro de la siembra disco de bacitracina 0.04 unidades
Incubar 24 horas a 37°C
Cualquier zona de inhibición se considera positiva, es decir sensible a la bacitracina.
Control de calidad: Streptococcus pyogenes ATCC (sensible)
Streptococcus agalactiae ATCC 12386 (resistente)
PRUEBA PYR
La presencia de la enzima pirrolidonil aminopeptidasa a menudo se prueba para distinguir S.
pyogenes de otros Streptococcus betahemolíticos. La hidrólisis de L-pirrolidonil-betanaftilamida
por la enzima b-naftilamida evidencia un color rojo con la adición de reactivo de cinamaldehído.
PROCEDIMIENTO (Prueba con discos)
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Rehidratar el disco con agua destilada. Aplicar sobre un inóculo denso del microorganismo, con
asa y tomado de colonias en cultivo puro de medio sólido durante no más de 24 horas. Incubar a
temperatura ambiente de 5 a 15 minutos.
Agregar una gota del reactivo revelador (p-dimetilaminocinamaldehído). Esperar un minuto.
Prueba positiva: color rojo.
Prueba negativa: color amarillo pálido o incoloro.
Control de calidad: Enterococcus faecalis ATCC 29212 (positiva)
Streptococcus agalactiae ATCC 12386 (negativa)
PRUEBA DE CAMP
En esta prueba se detecta el fenómeno lítico de los eritrocitos de cordero que ocurre por acción
de la toxina extracelular del Streptococcus beta hemolítico grupo B y la toxina beta del S. aureus
Estriar cepa de S. aureus en el centro de una caja bipetri de agar sangre de cordero, en línea
horizontal recta
Las colonias sospechosas de Streptococcus beta hemolítico grupo B se estrían en línea vertical
recta, en ángulo recto a la estría del S. aureus teniendo cuidado de no topar la estría del S. aureus
Incubar 18 - 24 horas a 37°C en atmósferas de CO2 (5%) o aeróbicamente.
Un resultado positivo se distingue una zona clara de beta hemólisis en forma de "punta de flecha",
entre las estriaciones de las cepas
Un resultado negativo no se distingue ninguna "punta de flecha"
Control de calidad: Streptococcus pyogenes ATCC (negativo)
Streptococcus agalactiae ATCC 12386 (positiva)
PRUEBA DE HIDRÓLISIS DEL HIPURATO DE SODIO

El Streptococcus beta hemolítico grupo B tiene una enzima la hipuricasa hidrolasa, que tiene la
capacidad de hidrolizar el hipurato de sodio con la formación de benzoato de sodio y glicina.
La presencia de glicina (compuesto alfa amino) se detecta al añadir ninhidrina que es un oxidante
que deamina los grupos alfa aminos con liberación de NH3 y CO2.
PROCEDIMIENTO:
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Realizar un inóculo denso de colonias sospechosas de Streptococcus grupo B a 0,5 ml al medio

de hipurato de sodio
Incuba a 37°C durante una hora
Agregar dos gotas del revelador (ninhidrina al 3,5% en butanol-acetona 1:1), se vuelve a poner
en estufa durante 15 minutos exactos y se efectúa la lectura final:
Prueba negativa: solución incolora
Prueba positiva: solución color púrpura, por ser la glicina un aminoácido que reacciona con el
reactivo de ninhidrina.
Control de calidad: Streptococcus pyogenes (negativa)
Streptococcus agalactiae (positiva)
PRUEBA DE HIDRÓLISIS DE BILIS ESCULINA

La esculina es un glucósido (acetal) que por acción de una enzima del Streptococcus grupo D, y
Listeria monocytogenes se descompone en esculetina y glucosa. La esculetina reacciona con sales
de hierro presentes en el medio de cultivo para formar un precipitado negro o café oscuro. Citrato
férrico (0.05%) se incorpora al medio de cultivo de bilis esculina como el indicador de la hidrólisis
de la esculina y la formación de esculetina.
PROCEDIMIENTO:
Estriar las colonias sospechosas de Streptococcus grupo D o Listeria monocytogenes en el fondo
y superficie del medio de Bilis Esculina Agar.
Incubar aeróbicamente por 18 - 24 horas a 37°C.
Positivo: Precipitado negro, cambio de color de amarillo a negro
Negativo: Ningún cambio de color
PRUEBA DE TOLERANCIA DE CLORURO DE SODIO AL 6.5%

Los Enterococcus son resistentes a cambios físicos y químicos; así pueden crecer a 10°C, como
también a 45°C, en altas concentraciones de ClNa e inclusive en MacConkey.
PROCEDIMIENTO:
Sembrar las colonias sospechosas de Enterococcus en un caldo con 6.5% de ClNa
Incubar por 18 - 24 horas a 37°C aeróbicamente
Resultados:
Positivo: Crecimiento (medio turbio)
Negativo: No crecimiento
PRUEBA DE OPTOQUINA
Esta prueba permite diferenciar Streptococcus pneumoniae (sensible) de otras especies de
Streptococcus alfa hemolíticos (resistentes).
La optoquina (Clorhidrato de etilhidrocupreina), un derivado del alcaloide hidroquinona, en
concentraciones de 5 mcg inhibe el crecimiento del Streptococcus pneumoniae
PROCEDIMIENTO:
Estriar las colonias sospechosas de S. pneumoniae sobre la superficie de un agar sangre de
cordero; la siembra se debe realizar de tal manera que se obtenga un crecimiento denso.
Colocar en el centro de la siembra un disco de optoquina de 5mcg
Incubar 18 - 24 horas a 37°C y en atmósferas con CO2 (5%)
Sensible: Si existe una zona de inhibición por lo menos de 14 mm de diámetro
Resistente: No hay zona de inhibición
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Control de calidad: Streptococcus viridans (resistente)

Streptococcus pneumoniae (sensible)
Se requiere identificar los siguientes asilamientos de muestras clínicas:
Tipo de muestra Orina Herida Sangre Traqueal
Pruebas de laboratorio Caso 1 Caso 2 Caso 3 Caso 4
Características
macroscópicas
(Hemólisis)
Gram
Catalasa
Bacitracina
CAMP
PYR
Bilis
Hipurato de Sodio
NaCl 6,5%
Optoquina
Otras:
Otras:
Otras:
Otras:
Género
Especie
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Caso Clínico
Niño de 9 años de edad, sin antecedentes de importancia, una semana previa al ingreso
hospitalario aparecen lesiones pruriginosas en tronco y miembros; 48 h antes de su ingreso
presenta tumefacción de cara interna de muslo derecho con rubor y calor local. En las horas
siguientes la tumefacción aumenta de tamaño y se agrega fiebre (38 °C). El cirujano drena el
absceso del muslo que contiene abundante material purulento, la muestra es analizada por
microscopia y por cultivo bacteriológico. Al microscopio se observaron cocos grampositivos en
cadenas, en el cultivo desarrollo de colonias hemolíticas en agar sangre y sin desarrollo en agar
sal y manitol.

Deber 3: Grupal
Responder las siguientes preguntas:
1. Que pruebas de laboratorio realizaría de manera secuencial para identificar género y

especie
2. Explicar cómo se genera la fiebre
3. Explicar el mecanismo por el cual se genera el material purulento del absceso
4. Explicar cuál es la estructura molecular de la proteína M y su importancia en la
patogénesis
5. ¿Cuáles son los fármacos de primera elección para combatir este tipo de infecciones?

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Práctica 5
Identificación de Mycobacterium tubeculosis por medio de baciloscopía
➢ Describir y demostrar la forma correcta y segura de toma y transporte la muestra
de esputo
➢ Establecer algoritmos diagnósticos para identificación de Mycobacterium
tuberculosis por baciloscopia
Introducción
En la actualidad la tuberculosis es considerada una de las enfermedades más importantes

en el mundo como problema de salud pública, agravada por la epidemia de VIH y por el
aumento de la resistencia. Según estimaciones disponibles por la Organización Mundial
de la Salud (OMS), alrededor de un tercio de la población mundial tiene latencia
Tuberculosis, correspondiente a aproximadamente 2.4 mil millones personas. La
tuberculosis es una enfermedad crónica, infecciosa y curable, causada por el
Mycobacterium tuberculosis en el 95% de los casos y su transmisión se produce de
persona a persona por vía aérea.
M. tuberculosis es un bacilo aeróbico estricto en forma de bastón que mide de 2 a 6 mm

de largo por 0.3 a 0.6 mm de ancho. Se reproduce en forma binaria en 18 a 24 horas, por
lo que en cultivo crece lentamente (15 a 30 días). Su principal característica es el alto
contenido de lípidos de su pared celular (que representa del 20 al 40% de su peso) y le
confiere la característica de ser alcohol-ácido resistente.
La transmisión de M. tuberculosis de persona a persona, de pacientes a los trabajadores

de la salud es de gran importancia para el personal de salud y personal de laboratorio
debido a la baja dosis infecciosa de M. tuberculosis para humanos <10 BAAR. Los casos
de tuberculosis deben considerarse potencialmente infecciosos y es mandatorio manejarlo
con las precauciones adecuadas.
TOMA Y MANEJO DE LA MUESTRA

Recomendaciones bioseguridad
El paciente puede producir aerosoles infecciosos por lo que es necesario tomar las
precauciones debidas.
Instruir al paciente de cubrir su boca cuando tosa
Nunca recolecte la muestra de esputo en el laboratorio
Recolecte la muestra de esputo lejos de otras personas y en espacios bien ventilados
No se pare frente al paciente cuando está tomando la muestra
Solicitud de análisis
Una solicitud de análisis de esputo debe incluir:
➢ Nombre de la unidad
➢ Fecha de la solicitud
➢ Información del paciente (ej, nombre, sexo, edad, dirección, número de registro del
paciente)
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➢ Número de muestra y tipo de muestra enviada para análisis

➢ Fecha de la toma de muestra
➢ Razón del análisis (ej, diagnóstico o seguimiento)
➢ Firma de la persona que solicita el análisis
Instrucciones al paciente
La mejor muestra es la que viene de los pulmones por lo que la saliva o secreciones
nasales no son muestras adecuadas
Las muestras no deben contener alimentos u otras partículas que pueden interferir en el
resultado de la prueba por lo que es recomendable seguir los siguientes pasos para obtener
una buena muestra:
➢ Lave su boca con agua limpia para eliminar alimentos y otras partículas
➢ Inhale profundamente 2 o 3 veces y exhale fuertemente cada vez
➢ Tosa profundamente para producir el esputo
➢ Coloque el recipiente de la muestra cerca de su boca para recolectar la muestra, evite la
contaminación fuera del recipiente.
➢ Posterior a la toma de muestra, lave sus manos.
El envase para la muestra debe reunir las siguientes características:

➢ Boca ancha que facilite la recolección y permita al laboratorista elegir la porción
mucopurulenta de la muestra.
➢ Tapa de rosca, para disminuir el riesgo de derramar la muestra durante el transporte y de
producir aerosoles al abrirla en el laboratorio.
➢ Etiquetado correctamente para que permita la identificación del envase.
➢ Capacidad de 50 a 60 ml aproximadamente, para recolectar un volumen suficiente de
muestra.
➢ De pared lisa y semitransparente, para poder ver la calidad de la muestra sin abrir el
envase.
➢ Desechable, para facilitar su eliminación.
Figura 1. Tipo de envase recomendado

por expectoración natural.
Una muestra adecuada y de buena calidad, así como cantidad suficiente, es vital para
asegurar resultados certeros: 1-4 ml de esputo purulento/ mucoide
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Transporte
Mientras más rápido llegue la muestra al laboratorio, mayor será la posibilidad de
encontrar micobacterias.
Es recomendado que la muestra se procese para baciloscopia o para cultivo el mismo día
de la recolección. Si esto no es posible, conservarla siempre en refrigeración (4°C no
congelar) o en un lugar fresco, protegido de la luz y no por más de cinco días.
La exposición de la muestra a la temperatura ambiente favorece la multiplicación de otros
gérmenes habituales de la boca que degradan mucopolisacáridos y proteínas, que licuan
la muestra y favorecen la muerte y degradación del bacilo.
Durante el transporte es indispensable evitar:
➢ Exposición al calor excesivo y a la luz solar directa.
➢ El derrame del contenido del envase.
➢ Cada muestra debe ir acompañada de la solicitud y triple embalaje:
Recepción de la muestra en el laboratorio

Revise la calidad y cantidad de la muestra:
Volumen (idealmente 1-4 ml)
Registre la consistencia del esputo (mucoide, purulento, sanguinolento, o acuoso)
Las muestras no deben contener alimentos u otras partículas
Revise que la información del paciente está
Rechace las muestras de acuerdo a los criterios establecidos
Revise y asegure que la información en la solicitud corresponde a las del recipiente de
la muestra.
Preparación y fijación del extendido

➢ Lavarse las manos colocarse la bata y guantes
➢ Ubicar en el mesón o papel embebido en hipoclorito de sodio al 1% sólo lo necesario
para realizar el extendido
➢ Ordenar las muestras según su número.
➢ Para cada muestra, numerar una lámina portaobjetos, siempre en el mismo borde.
➢ No tocar con los dedos la parte del portaobjetos destinada al extendido
Página | - 32 -
➢ Usar una lámina para cada muestra. No colocar extendidos de más de una muestra en una
lámina.
➢ Si las muestras estuvieron en movimiento, dejar reposar los envases durante 20 minutos
antes de comenzar a abrirlos.
➢ Tomar la primera muestra y la lámina correspondiente y colocarlas detrás del mechero
de manera que la llama quede entre el operador y el frasco, esta posición protegerá al
laboratorista de posibles formaciones de aerosoles al abrir el frasco.
➢ Destapar con cuidado el envase.
➢ Partir un aplicador en dos, tratando de que las puntas queden ásperas.
➢ Tomar una parte del aplicador con la mano izquierda y la otra con la derecha, entre el
pulgar y el índice, y con los extremos irregulares seleccionar la partícula más densa o
purulenta de la muestra de esputo. Enrollarla en una de los dos partes del aplicador con
la ayuda de la otra.
➢ Si la muestra contiene varias porciones mucopurulentas, tratar de mezclarlas con
movimientos muy suaves del palillo y luego tomar una porción de la mezcla.
➢ Si sólo hay pequeñas partí-culas purulentas, escoger tres o más y mezclarlas en el mismo
portaobjetos para homogeneizarlas.
➢ La selección de la partícula más purulenta de la muestra es uno de los pasos más
importantes para aumentar la probabilidad de identificar los casos de tuberculosis
mediante la baciloscopia directa de esputo.
➢ Colocar la(s) partícula(s) seleccionada(s) sobre el portaobjetos y extenderla(s) con el
aplicador con movimientos suaves, circulares, tratando de dispersarla en forma
homogénea en el centro de la lámina, dibujando un círculo u óvalo de 2 cm de largo por
1 a 2 cm de ancho, sin llegar a los bordes de la lámina para evitar que el operador se
contamine al manipularla
➢ Verificar que el extendido tenga grosor homogéneo y adecuado. Si es demasiado fino, es
posible producir un resultado falso negativo. Si es muy grueso, el material puede
desprenderse durante la coloración o puede resultar difícil la visualización de bacilos
debajo de una capa gruesa de mucus. El grosor adecuado es el que permite ver, pero no
leer un texto impreso a través del preparado.
➢ Dejar el extendido en un soporte para que se seque a temperatura ambiente
➢ El extendido no debe ser calentado a la llama mientras esté húmedo pues el calor fuerte
altera la estructura de los bacilos y su posterior tinción; además puede generar aerosoles.
➢ Desechar el aplicador en un frasco que contenga una solución de hipoclorito de sodio al
1%; este frasco irá al autoclave o directamente a incineración.
➢ Cerrar el envase de la muestra con la que se realizó el extendido y dejarlo en el lado
opuesto al lugar donde están los frascos con las muestras que aún no se han procesado,
para evitar confusiones.
➢ Tomar de a uno cada extendido con una pinza manteniendo la cara que contiene la
muestra hacia arriba, y pasarlos rápidamente sobre la llama de un mechero tres o cuatro
veces cuidando que no se caliente demasiado.
Página | - 33 -
Coloración Ziehl Neelsen

➢ Cubrir totalmente la superficie del extendido con fucsina básica fenicada recién filtrada.
Dispensar el colorante con suavidad, sin salpicar y sin tocar con el gotero o con el embudo
los extendidos
➢ Con la llama de un hisopo embebido en alcohol calentar suavemente por debajo de los
extendidos, con movimientos de vaivén, hasta que observe que se desprenden los
primeros vapores blancos. No calentar con mechero.
➢ En caso de derrame del colorante, reponer la fucsina, no dejar secar el preparado.
➢ En el término de aproximadamente cinco minutos calentar tres veces hasta emisión de
vapores; esto es suficiente para que la fucsina penetre adecuada-mente en el bacilo y se
fije a sus lípidos. No hervir la fucsina porque la pared de los bacilos puede destruirse y
colorearse mal.
➢ Lavar muy suave y cuidadosamente la superficie eliminando totalmente la solución de
fucsina.
➢ Decoloración: Cubrir la totalidad del extendido con solución decolorante y dejar actuar
aproximadamente 3 minutos
➢ Enjuagar con abundante agua a baja presión. Verificar que el extendido se ha decolorado
(las partes más gruesas del extendido a lo sumo conservan un leve tinte rosado). Si se
observan cúmulos rojos o coloración rosada intensa, volver a cubrir con solución
decolorante, dejarla actuar entre uno y tres minutos y enjuagar nuevamente
➢ Cubrir todo el extendido con solución de azul de metileno.
➢ Dejar actuar durante un minuto. Enjuagar las láminas en ambas caras con agua a baja
presión y limpiar la parte inferior con un algodón si ha quedado coloreada
➢ Dejar secar las láminas a temperatura ambiente, apoyándolas en posición vertical en un
soporte sobre un papel absorbente.
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Lectura de extendidos
La observación microscópica debe cumplir principalmente dos objetivos:
Determinar si en el extendido hay BAAR y en caso de positividad cuantificar los bacilos
Realizar:
De la placa entregada:
• Observar cada campo microscópico en superficie y profundidad, moviendo
permanentemente el micrométrico.
• Seguir un recorrido en líneas rectas, sistemático para recorrer el extendido evitando
repetir la lectura de algunos campos. Ej: de izquierda a derecha:
• Observar la calidad del extendido y de la coloración. Si no fuesen buena, reportar
• Contar el número de campos que ha leído y el número de BAAR que ha en la cuadrícula
de 10 cuadrados por 10 cuadrados, que representan los 100 campos microscópicos, como
ayuda para registrar la cuenta.
• En cada cuadrado anotar el número de BAAR que se observa. Si no observa BAAR
consignar 0.
• Para calcular el promedio de BAAR encontrados por campo, sumar el total de BAAR
contados y dividir ese total por el número de campos observados. Cuando los bacilos se
presentan agrupados, una estimación aproximada del número de bacilos presentes en el
cúmulo es suficiente para calcular este promedio
Placa Número: _____________________
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INFORME DE LOS RESULTADOS
Resultado del examen microscópico Informe

No se encuentran BAAR en los 100 campos No se observan bacilos ácido-alcohol resistentes
observados
Se observan de 1 a 9 BAAR en 100 campos Nº exacto de bacilos en 100 campos
observados
Se observa entre 10 y 99 BAAR en 100 campos Positivo (+)
observados
Se observan de 1 a 10 BAAR por campo en 50 Positivo (++)
campos observados
Se observan más de 10 BAAR por campo en 20 Positivo (+++)
campos observados
Resultado:

Tiene aporte individual el día 2 de la práctica
Reportar la baciloscopia de la placa problema
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Práctica 6
Identificación de bacilos Gram negativos (Enterobacterales)
de bacilos gram negativos.
2. Diferenciar los distintos géneros y especies de Enterobacterales de importancia clínica.
Introducción
Las enterobacterias son un grupo grande y heterogéneo de bacilos gram negativos cuyo
hábitat natural es el Tracto intestinal de humanos y animales. La familia incluye muchos
géneros como: (Escherichia, Shigella, Salmonella, Enterobacter, Klebsiella, Serratia,
Proteus, y otros). Algunos organismos entéricos como Escherichia coli, son parte de la
microbiota normal que ocasionalmente pueden causar enfermedades. Salmonella y
Shigella, son regularmente patógenos para los humanos.
Las enterobacterias son anaerobios o aerobios facultativos, fermentan una amplia gama
de carbohidratos, poseen una compleja estructura antigénica, y producen una variedad
de toxinas y otros factores de virulencia. Estas bacterias también pueden ser llamadas
coliformes.
PRUEBAS BIOQUÍMICAS UTILIZADAS EN LA DIFERENCIACIÓN DE

ENTEROBACTERIAS
1. TSI (Triple sugar iron agar) o en KIA (Kliger iron agar)
2. Utilización de Citrato
3. Decarboxilación y/o deaminación de amino ácidos
4. Producción de H2S
5. Producción de indol
6. Motilidad
7. Rojo de metilo
8. Voges - Proskauer
9. Utilización de Malonato
10. Hidrólisis de urea
TSI O KLIGER IRON AGAR

Fundamento: El medio contiene glucosa, lactosa y sucrosa, Kliger tiene glucosa y
lactosa; el Rojo fenol se añade como indicador de fermentación y el Sulfato ferroso para
indicar la producción de H2S (precipitado negro).
Estos medios se los preparan en tubos que proporcionan una parte profunda (3 cm) y una
inclinada. Al inocularlos, las bacterias utilizan las proteínas por oxidación por lo tanto
Página | - 37 -
este metabolismo se realizará en la parte inclinada del tubo, en cambio la fermentación

de carbohidratos (proceso anaerobio) se realizará en el fondo del tubo.
La concentración de glucosa con respecto a los otros azúcares es de 1/10; esto permite
identificar que las bacterias catabolizan y consumen la glucosa en primer lugar.
Las bacterias al oxidar las proteínas generan aminas y hacen que el medio sea alcalino
(rojo), en tanto que la fermentación de carbohidratos genera ácidos y el medio cambia a
amarillo. Si la bacteria solo fermenta glucosa (1/10 de la concentración de los otros
azúcares) produce poca cantidad de ácido que se observa solo en el fondo del tubo. En
cambio, si una bacteria fermenta todos los azúcares, la cantidad de ácidos producida se
manifiesta en todo el tubo, se logra tapar la alcalinidad producida en la parte inclinada
del tubo.
Procedimiento:
1. Con el asa en punta estéril y fría tomar la parte central de la colonia preferentemente,
sembrar por picadura en el fondo y estriar en zig zag en la superficie del tubo.
2. Incubar a 35 - 37° C por 24 horas (la tapa de los tubos debe estar floja)
Resultados:
• El cambio de color rojo a amarillo en el fondo del tubo significa fermentación de la
dextrosa o glucosa: K/A
• El cambio de color en todo el tubo demuestra la fermentación de los tres azúcares:
A/A
• El gas /G) se detecta por espacios o grietas en el agar
• El H2S se reconoce por el precipitado negro
UTILIZACIÓN DE CITRATO
Fundamento: Ciertas bacterias pueden utilizar el citrato como única fuente de carbono
con la producción de alcalinidad. El citrato es degradado primero a piruvato y luego a
acetato, acetoína, lactato. Estos productos hacen que el pH del medio de cultivo se vuelva
alcalino y el indicador de pH del medio (Azul de bromotimol) cambie de color verde (pH
6.9) a un azul (pH 7.6)
Procedimiento:
1. Sembrar la bacteria a examinarse en la parte inclinada del medio de cultivo
2. Incubar 24 horas a 35°C
Resultados:
• Positivo: Cambio de color a un azul
• Negativo: No hay cambio de color
DECARBOXILACIÓN Y DEAMINACIÓN DE AMINOÁCIDOS

Fundamento: Las bacterias pueden degradar los aminoácidos mediante enzimas
decarboxilasas (degradan a partir del grupo carboxilo –COOH) o por enzimas deaminasas
(degradan a partir del grupo amino –NH2).
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Para la identificación de enterobacterias se utiliza con más frecuencia la decarboxilación

de los aminácidos: lisina, ornitina y arginina. De la decarboxilación de estos aminoácidos
se obtiene las siguientes aminas:
Lisina → cadaverina Ornitina → putrecina
Arginina → citrulina
Sin embargo, para que se activen las enzimas decarboxilasas necesitan de energía para lo
cual se hace necesario añadir al medio de cultivo a más del aminoacido: glucosa, para que
la bacteria al fermentar la glucosa obtenga energía. Como estas reacciones implican
cambios de pH es necesario que el medio de cultivo tenga un indicador de pH que permita
detectar la fermentación de glucosa con la producción de ácido y luego la decarboxilación
del aminoácido con la producción de alcalinidad.
Por otro lado, la decarboxilación se realiza en anaerobiosis para lo cual se hace necesario
añadir aceite mineral o parafina al medio de cultivo semisólido MÖELLER o en medios
sólidos como Lysina Iron Agar, preparar tubos inclinados con un fondo de por lo menos
3 cm.; en los cuales la decarboxilación de lisina se observará solo en el fondo del tubo y
la deaminación, una reacción aeróbica, solo en la parte inclinada. El indicador de pH del
LIA es el púrpura de bromocresol (pH ácido 5.2 = color amarillo; pH alcalino 6.8 = color
púrpura). El medio LIA contiene Tiosulfato de sodio y Amonio férrico que permiten
observar la producción de H2S por la presencia de un precipitado negro
Procedimiento:
1. Con el asa en punta estéril y fría tomar la parte central de la colonia preferentemente,
sembrar por picadura en el fondo y estriar en zig zag en la superficie del tubo.
2. Incubar a 35 - 37°C por 24 horas (la tapa de los tubos debe estar floja)
Resultados:
• Positivo: El NO cambio de color en el fondo del tubo indica decarboxilación de lisina
(producción de la amina cadaverina.
• Negativo: El cambio de color de púrpura a amarillo en el fondo del tubo indica
ausencia de decarboxilación.
PRODUCCIÓN DE H2S
Fundamento: Ciertas bacterias por acción enzimática pueden liberar H2S a partir de
compuestos que contienen azufre. Pueden ser compuestos orgánicos: peptonas, cisteína,
cistina y de compuestos inorgánicos: tiosulfato. El H2S es un gas incoloro por lo que es
necesario añadir al medio de cultivo indicador (sales ferrosas o iones de metales como
plomo, hierro o bismuto), estos en contacto con H2S, forman precipitados negros
(sulfitos) en el medio de cultivo.
Procedimiento:
1. Sembrar la bacteria en el medio de cultivo que contiene una fuente de azufre y un
indicador de H2S.
Recomendaciones:
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• La sensibilidad de la detección de H2S varía con el tipo de indicador usado, por

ejemplo, el medio de SIM es más sensible que el KIA y este es más sensible que el
TSI. El acetato de plomo es el mejor indicador.
Resultados:
• Positivo: Presencia de precipitado negro
• Negativo: Ningún precipitado
PRODUCCIÓN DE INDOL
Fundamento: El triptófano es un amino ácido que puede ser oxidado por ciertas bacterias
y dar tres metabolitos indólicos: indol, skatole (metil-indol) e indolacéticos. Las enzimas
encargadas de estas reacciones son las triptofanasas. El ácido indol pirúvico es el
compuesto intermedio de mayor importancia en la degradación del triptófano y a partir
del cual el indol se puede formar por deaminación. La presencia de indol se puede detectar
al añadir un compuesto químico (para-dimetil-amino-benzaldehido) al cultivo de
bacterias (incubadas previamente 24 horas) y observar la formación de una sustancia
coloreada en la superficie del medio de cultivo.
Triptofanasa
Triptófano Indol + ácido pirúvico y amonio
deaminación
Para dimetil-amino-benzaldehido =
sustancia coloreada
Medios de cultivo:
- Caldo de triptófano, SIM, MIO
Reactivo de Ehrlich:
- Alcohol etílico 95% 190 ml
- Paradimetil amino benzaldehido 2g
- HCl concentrado 40 ml
Disolver el aldehido en el alcohol y lentamente añada el ácido. Guardar en botella oscura
en el refrigerador.
Procedimiento:
1. Sembrar por picadura la bacteria a examinarse en el medio de cultivo por 24 horas e
incubar a 35° C.
2. Añadir 0.5 ml de reactivo de Ehrlich. A veces es necesario añadir éter antes del
reactivo de Ehrlich para que se observe mejor la reacción
Resultados:
• Positivo: anillo rojo en la superficie del medio después de 5 minutos de haber añadido
el reactivo de Ehrlich.
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MOTILIDAD
Fundamento: La presencia de flagelos hace que una bacteria sea mótil. Existen
coloraciones especiales que permiten observar estos flagelos, sin embargo, en la rutina se
siembra la bacteria en un medio semisólido o se observa la motilidad en suspensión al
microscopio con lente 40X. En el medio semisólido si la bacteria solo crece en el lugar
de inoculación la bacteria será no mótil pero si se extiende hacia los lados y superficie la
bacteria será mótil. En suspensión cuando la bacteria es no mótil solo sigue el movimiento
browniano; si es mótil se mueve a todos los lados.
Medios de cultivo: SIM (motilidad, indol y H2S)
MIO (motilidad, indol, ornitina)
Procedimiento:
1. Sembrar la bacteria a examinarse por picadura (asa recta) en el medio
Resultados:
• Positivo: Crecimiento extendido, el medio se vuelve turbio
• Negativo: Crecimiento único en el sitio de inoculación
PRUEBA DE ROJO DE METILO
Fundamento: El rojo de metilo es un indicador de pH (rojo = ácido, amarillo = alcalino)
que permite identificar la concentración de iones hidrógeno presentes cuando un
microorganismo fermenta la glucosa. Las bacterias rojo de metilo (+) fermentan la
glucosa con la producción de ácidos estables: láctico, succinico, acético y fórmico,
manteniendo una alta concentración de iones hidrógeno (pH 4.2 o menor).
Medio de cultivo: Clark and Lubs Medium (MRVP) pH 6.9
Reactivo:
- Rojo de metilo
- Rojo de metilo 0.1 g
- Alcohol etílico 95% 300 ml
- Agua destilada 200 ml
Disolver el colorante en el alcohol, luego añadir el agua destilada.
Procedimiento:
1. Sembrar la bacteria a examinarse en 0.5 ml de MRVP
2. Incubar a 35°C por 24 - 48 horas
3. Añadir 5 a 6 gotas de rojo de metilo
4. Leer inmediatamente
Resultados:
• Positivo: color rojo brillante
• Negativo: amarillo, o colores intermedios se consideran negativos
Recomendaciones:
Página | - 41 -
• No se utiliza mucha cantidad de medio MRVP para facilitarle a la bacteria tiempo

suficiente para que consuma toda la glucosa del medio
PRUEBA DE VOGES - PROSKAUER

Fundamento: Esta prueba se utiliza para detectar la habilidad de ciertas bacterias de
producir acetoína (un producto final, neutral) a partir de la fermentación de glucosa. La
glucosa es metabolizada a ácido pirúvico, un producto intermedio, clave en la glicólisis;
a partir de ácido pirúvico las bacterias toman diferentes vías de degradación de la glucosa
y la producción de acetoína (acetil-metil-carbinol) puede ser una vía. En la presencia de
oxígeno atmosférico y un alcali (KOH) la acetoína es oxidada a diacetilo, el cual, produce
el color rojo característico de la prueba (+) de Voges-Proskauer.
El alfa naftol que también se añade al realizar la prueba sirve de catalizador en la
oxidación de acetoína a diacetilo.
Medios de cultivo: MRVP pH 6.9
Reactivo No. 1
Alfa naftol 5g
Alcohol etílico absoluto 100 ml
Reactivo No. 2
Hidróxido de potasio 40 g
Agua destilada 100 ml
Disolver los solutos en los disolventes
Procedimiento:
1. Sembrar la bacteria a examinarse en 1.0 ml del medio MRVP
2. Incubar 24 - 48 horas a 35°C
3. Añadir 0.6 ml de alfa naftol y 0. 2 ml de KOH 40%
4. Agitar suavemente el tubo y exponer el medio a O2 atmosférico para que se produzca
la oxidación de la acetoína y así observar el color rojo de la reacción (+)
5. Leer los resultados después de 10 a 15 minutos.
Resultados:
• Positivo: color rojo
• Negativo: color amarillo
Recomendaciones:
• Se puede utilizar NaOH 40% en lugar de KOH 40%
• En casos de duda incubar más tiempo (5 días)
UTILIZACIÓN DE MALONATO
Fundamento: Ciertas bacterias pueden utilizar malonato sódico como la única fuente de
carbono, con la producción de alcalinidad. El indicador azul de bromo timol a un pH 6.7
es de color verde (medio sin inocular) y a un pH 7.6 cambia a un color azul prusia.
Medio de cultivo: Malonato broth pH 6.7
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Procedimiento:
1. Sembrar la bacteria a examinarse en 1 ml de Malonato broth
Resultados:
• Positivo: Cambio de color de verde a azul
• Negativo: no cambio de color
HIDRÓLISIS DE LA UREA
Fundamento: Ciertas bacterias tienen la enzima ureasa que descompone a la urea en
amonio y CO2 con la producción de alcalinidad.
El medio de cultivo tiene como indicador de pH el rojo fenol, siendo de color amarillo-
rosado a un pH de 6.8 - 7
Procedimiento:
1. Sembrar la bacteria en tubos inclinados de Urea agar
Resultados:
Positivo: Cambio de color a rosado intenso o rojo, determina la hidrólisis de la urea
Se requiere identificar los siguientes asilamientos de muestras clínicas:
Tipo de muestra Orina Herida Sangre Traqueal
Pruebas de laboratorio Caso 1 Caso 2 Caso 3 Caso 4
Características
MaConkey
Gram
Catalasa
TSI
LIA
CIT
SIM
MR
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VP
Malonato
Urea
Otras:
Otras:
Género
Especie

Deber 4: Grupal
1. ¿Indique 3 galerías manuales comerciales, con sus respectivos sustratos para

identificación Bacilos Gram negativos, como funciona cada uno? (10 líneas)
2. ¿Indique 5 sistemas automatizados comerciales, con sus respectivos sustratos para
identificación Bacilos Gram negativos, como funciona cada uno? (Tabla)
3. ¿Explique qué métodos moleculares tenemos disponibles para identificación bacteriana,
que blancos específicos buscaría? (10 líneas)
4. Fundamento de la espectrometría de masas MALDI-TOF para identificación microbiana
(10 líneas)

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Práctica 7. Prueba de Kirby Bauer para estudio de resistencia antimicrobiana

1. Conocer el fundamento de uso de las diferentes pruebas de susceptibilidad
antimicrobianas.
2. Establecer las guías adecuadas para correcta interpretación del antibiograma
INTRODUCCIÓN
En el desarrollo de una enfermedad infecciosa de origen bacteriano, las pruebas de
susceptibilidad antibiótica pueden llegar a ser decisivas en la evolución favorable o
desfavorable de un paciente. Para que los resultados de sensibilidad o resistencia a los
antimicrobianos tengan validez y aporte en decisiones clínicas, es necesario que el
laboratorio de microbiología clínica demuestre la confiabilidad de sus procedimientos y
por ende de sus resultados.
Un programa de control de calidad interno del antibiograma permite asegurar que los
resultados obtenidos sean confiables, así como monitorear de manera constante el
comportamiento del método utilizado para determinar la susceptibilidad antimicrobiana
mediante la evaluación de varios parámetros como:
Variabilidad de pH y varios componentes químicos y físicos del Mueller -Hinton Agar.
Propiedades de los sensidiscos (Contenido y conservación). Preparación y concentración
adecuada del inóculo bacteriano de trabajo. Condiciones adecuadas de incubación,
tiempo y temperatura.
PRUEBA DE BAUER - KIRBY
La necesidad de pruebas de susceptibilidad antimicrobiana se hizo evidente tan pronto

como los antibióticos se empezaron a usar en el tratamiento de las enfermedades
infecciosas. Además, es universalmente conocido que el uso indiscriminado de
antibióticos es la mayor causa de aparecimiento de cepas resistentes, por esta razón, la
determinación de susceptibilidad de una bacteria in vitro a un determinado agente
antimicrobiano se debe realizar antes como una guía al tratamiento seleccionado.
El principio básico de este método señala que tan pronto como el disco de papel filtro que
contiene el antibiótico se pone en contacto con una superficie húmeda, permite la difusión
del antibiótico en el medio de cultivo y su concentración decrece logarítmicamente desde
su origen (disco) hasta la distancia en la cual ya no se inhibe el crecimiento bacteriano.
En la interpretación de este método se creía que mientras más grande era la zona de
inhibición, el antibiótico sería más efectivo en la terapéutica. Pero varios estudios han
demostrado que cada antibiótico desarrolla su zona específica de inhibición de acuerdo a
sus propiedades físico químicas.
A finales de los años 50, muchos métodos para determinar la susceptibilidad

antimicrobiana se utilizaban, pero los resultados variaban de laboratorio a laboratorio.
Por lo que, una prueba estándar se hacía necesaria para permitir la comparación de
Página | - 45 -
resultados entre laboratorios y asegurar la reproductibilidad de esos resultados dentro de

cada laboratorio.
Frente a estos parámetros el CLSI estandarizó esta técnica con lineamientos rigurosos
sobre el tipo de agar, pH y volumen del medio tamaño de la caja petri, concentración del
inóculo, potencia del antibiótico en el disco de papel filtro, temperatura, incubación,
tamaño de las zonas de inhibición e interpretación de los resultados.
MATERIALES
• Caldo nutritivo: TSB o BHI
• Mueller Hinton Agar (pH 7.2 - 7.4 a 25°C) en cajas petri de 15 cm. o 9 cm de diámetro
y con un espesor de agar de 4 mm.
• Standard MacFarland N° 0.5 (1.5 x 10 8 UFC/ ml.)
• Suero fisiológico estéril 0.85%
• Discos de antibióticos
• Hisopos estériles
• Pinzas
PROCEDIMIENTO
A. PREPARACIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO
1. Seguir las instrucciones de dilución y esterilización del medio Mueller Hinton Agar.
2. Medir el pH del Mueller Hinton Agar después de esterilizado a 25°C. El pH tiene que
estar entre 7.2 y 7.4.
3. Para bacterias que necesitan de sangre y/o suplementos añadir estos elementos al
medio de Mueller Hinton.
4. Distribuir el medio de Mueller Hinton en las cajas teniendo cuidado que el espesor sea
de 4 mm + 1.
B. PREPARACIÓN DEL INÓCULO

1. Inocular 2 ml de SS o BHI con 4 - 5 colonias aisladas y de diferentes sitios de la
bacteria a examinarse (cultivo puro).
• A partir de cultivos donde no se observa colonias aisladas tomar con el asa un inóculo
del tamaño de una cabeza de alfiler.
2. Incubar este inóculo a 35 -37°C por 2 horas o hasta llegar a la turbidez del estándar N°
0.5 de MacFarland.
3. Preparación del estándar N° 0.5 de MacFarland: 9.95 ml de H2SO4 1% + 0.05 de Cl2Ba
1%
C. REALIZAR ANTIBIOGRAMA
1. Anotar sobre la caja del M.H. la identificación del cultivo y el tipo de microorganismo
Gram (+) o Gram (-)
2. Agitar el estándar MacFarland # 0.5 y compararlo con el inóculo de bacterias en el SS
o BHI. En caso de turbidez aumentada, diluir hasta que sea igual a la turbidez del
Estándar MacFarland # 0.5.
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3. Inocular inmediatamente esta suspensión bacteriana con un hisopo estéril (descartando

el exceso de líquido en las paredes del tubo) sobre el Mueller Hinton Agar en tres
planos, cubriendo toda la superficie.
4. Colocar con una pinza estéril los diferentes discos de antibióticos a 2 cm de distancia
entre ellos. En cajas de 9 cm de diámetro colocar 6 discos, en cajas de 15 cm 12 discos.
5. Incubar aeróbicamente a 35 - 37°C por 18 - 24 horas.
6. Medir el diámetro de las zonas de inhibición y comparar con la tabla de interpretación
de resultados para cada antibiótico.
7. Determinar si la bacteria es sensible, moderadamente sensible o resistente para cada
antibiótico y de acuerdo con la interpretación anterior.
8. Realizar este mismo procedimiento con las cepas control y comparar los resultados
con las respectivas tablas.
NOTAS:
Se debe controlar cuidadosamente:
• El estándar de inoculación
• El contacto entre los discos de antibióticos y el agar
• La temperatura y tiempo de incubación
• Lectura y reporte de resultados
• Concentración y fechas de espiración de los discos
• El espesor, humedad del MH
• El cultivo tiene que ser puro
• Cuando se leen zonas de inhibición de Proteus tomar en cuenta la zona más
diferenciada.
DEFINICIONES:
Con las pruebas de difusión en agar existen tres categorías de bacterias:

• Susceptibles: bacterias inhibidas con niveles de antibióticos en sangre y tejidos
alcanzados con dosis comunes administradas parentalmente.
• Intermedio: bacterias inhibidas solamente con niveles altos de antibióticos en sangre
alcanzados con dosis máximas de antibióticos (pueden ser tóxicas). Algunas cepas
pueden tratarse, por ejemplo, si la infección surge en el tracto urinario donde las
concentraciones del antibiótico exceden a las alcanzadas en la sangre.
• Resistentes: bacterias que inhiben con niveles de antibióticos en dosis aplicables.
• SDD
Nota: Referirse a CLSI vigente para interpretación de pruebas de susceptibilidad de

acuerdo al patógeno de estudio
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Caso clínico: Paciente femenino de 43 años de edad, consulta a su médico de atención

primaria por malestar general y fiebre de hasta 39°C. A la exploración física el paciente
se encontraba febril aparente. No presentaba sintomatología respiratoria, pero si urinaria
Ante el empeoramiento, acude a urgencias de su hospital de referencia presentando
taquipnea, con palidez cutáneo mucosa, temperatura de 38,6°C, PA de 103/64mm Hg y
una frecuencia cardíaca de 92 lat./min. En la exploración física no se detectan hallazgos
significativos. Se solicita Urocultivo:
Microorganismo: _______________________________________________
Disco Concentración Resultado Interpretación

Deber 5: Grupal
Subir su reporte de caso con todos los parámetros requeridos y con resultados de antibiograma de
acuerdo a CLSI
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Página | - 49 -

Manual BCI 2019

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Carrera de Bioquímica Clínica

Docente: José Eduardo Villacís

DESCRIPCIÓN DEL CURSO

RESULTADO(S) DE APRENDIZAJE DE LA CARRERA AL / A LOS QUE LA

RESULTADOS DE APRENDIZAJE DE LA ASIGNATURA

✓ Valorar la información de los resultados de las pruebas diagnósticas por el laboratorio, la

NORMAS DEL LABORATORIO:

MEDIDAS EN CASO DE EMERGENCIA

➢ En el caso de derrames: Reportar el incidente al profesor. Colocarse guantes y cubrir con

MATERIALES PARA LABORATORIO:

CONTENIDOS DEL CURSO

BACTERIOLOGÍA CLÍNICA 1 LABORATORIO

Fecha Semana Práctica

18-22 feb 1 Laboratorio 1: Introducción al laboratorio y normas de bioseguridad

25-1 marzo 2 Laboratorio 2: Medios de cultivo, aislamiento e identificación de bacterias

4-8 marzo 3 Vacación

11-15 mar 4 Laboratorio 3: Identificación de cocos Gram positivos. Staphylococcus

18-22 mar 5 Laboratorio 4: Identificación de cocos Gram positivos. Streptococcus, Enterococcus

25-29 mar 6 Examen Parcial 1

1-5 abril 7 Laboratorio 5: Baciloscopia

29-3 mayo 11 Laboratorio 6: Identificación de bacilos Gram negativos (Enterobacterales)

6-10 mayo 12 Examen Parcial 2

13-17 mayo 13 Laboratorio 7: Identificación de bacilos Gram negativos no fermentadores

3-7 junio 16 Examen Parcial 3

10-14 junio 17 Examen Final

Estructura para la presentación del informe de laboratorio

Tema: Título de la práctica

Escala de calificación del informe Puntaje

Almacenamiento de compuestos químicos

Prácticas microbiológicas estándar

➢ Deben utilizarse guantes para manipular materiales que contengan microorganismos

Equipos de Seguridad (Barreras Primarias).

Diseño de Instalaciones (Barreras Secundarias)

Esta práctica NO TIENE INFORME.

Clasificación de acuerdo a la finalidad

Control de calidad de los medios de cultivo

Estabilidad y condiciones de conservación

Técnica de estriamiento en medios de cultivo.

Técnicas para realizar inoculaciones o siembras bacterianas

Inoculación de sólido a sólido: (medio de cultivo a medio de cultivo)

Inoculación de Sólido a líquido: (medio de cultivo a tubo o caja)

Inoculación de Líquido a líquido (tubo A + tubo B + tubo C + tubo D)

Indicar que cultivos tuvieron crecimiento en los diferentes medios de cultivo

Microoganismo ABS A. MaConkey Manitol EMB

Esta práctica NO TIENE INFORME.

Los microorganismos del género Staphylococcus, tienen la capacidad de producir diversas

Tabla 1. Pruebas que diferencian especies de Staphylococcus

Especie Clumping Free PYR Ureasa DNAsa Manitol

S. aureus POS POS NEG V POS POS

S. delphini NEG POS NEG POS NEG POS

S. schleiferi sub. NEG POS V POS POS V

El agua oxigenada y el anión superóxido son productos terminales o intermedios de la

PRUEBA MANITOL SALADO:

Tomado de: CLSI M100ED29

Microrganismo Características Coloración Coagulasa Coagulasa

Esta práctica TIENE INFORME. Grupal

Las especies bacterianas pertenecientes al género Streptococcus son cocos Gram

Tomado de: CLSI M100ED29

PRUEBA DE HIDRÓLISIS DEL HIPURATO DE SODIO

Realizar un inóculo denso de colonias sospechosas de Streptococcus grupo B a 0,5 ml al medio

PRUEBA DE HIDRÓLISIS DE BILIS ESCULINA

PRUEBA DE TOLERANCIA DE CLORURO DE SODIO AL 6.5%