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UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO VILLAREAL

FCCNM – EAP BIOLOGÍA BIOQUÍMICA I – 2017 PRÁCTICA

Reporte N° 1 Fecha de Entrega: 2017 – 04 – 20


Código, Apellidos y Nombres:
 2015003686, Betancourt Jiménez, Elizabeth
 2015003668, Cerrato Huapaya, Luis Alejandro
 2015003383, Flores Bancayan, Carlos Alonso
 2015231304, Valencia Velasco, Fernando Gabriel

LA CENTRIFUGACIÓN

Muestras Utilizadas:
 1 gr. de hojas de espinaca.
 Tris Buffer Salino (TSB).
 Tris Buffer Salino – Urea 6M.
 Tris Buffer Salino – Tritón X-100 al 2%.

Materiales Utilizados:
 Centrífuga
 Tubos de prueba
 Papel Filtro
 Pipetas

Características de las muestras o el método utilizado:


La muestra utilizada en este informe fue la espinaca y las soluciones TSB, en 3 medios:
Isotónico, Hipertónico e Hipotónico, el TSB es una solución amortiguadora, ya sea con
urea 6M o tritón x-100 al 2%, la cual se adiciona para la trituración de la espinaca y
obtener un homogenado celular. El método utilizado durante la práctica fue el de
centrifugación diferencial, el cual nos sirve para la separación de partículas más densas
del homogenado o solución, mediante centrifugaciones continuas, que difieren en
revoluciones por minuto (rpm), fuerza centrífuga relativa (FCR) y tiempo, aunque este
último es independiente en el método, donde la primera centrifugación se realizara en
200 g a 1 minuto y la segunda en 1300 g a 5 minutos.
Coeficiente de Sedimentación.- Se entiende como la velocidad en la que una partícula se
desplaza por la aceleración aplicada, este es dependiente de la masa de la partícula, las
revoluciones por minuto, el radio del rotor, los tiempos aplicados en la centrifugación
diferencial y la longitud en centímetros del Pellet y el sobrenadante.
Se expresa mediante un Svedberg (S), que es igual a 10-13 segundos.
Los cálculos necesarios para el desarrollo de este método se realizan con las siguientes
formulas:
𝐹𝐶𝑅 = 1.118 𝑥 105 𝑥 𝑟 𝑥 (𝑟𝑝𝑚)2
Donde:
FCR = Fuerza de Centrifugación Relativa; RPM = Revoluciones por Minuto; r = radio
del rotor

𝑋1
210 𝑥 𝐿𝑜𝑔(𝑋2)
𝐶𝑜𝑒𝑓𝑖𝑐𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒 𝑑𝑒 𝑆𝑒𝑑𝑖𝑚𝑒𝑛𝑡𝑎𝑐𝑖ó𝑛 (𝑆) =
(𝑟𝑝𝑚)2 𝑥 (𝑡2 − 𝑡1)

Donde:
B Sobrenadante
X1 = radio del rotor – A
X2 = radio del rotor – B
A Sedimentado o “Pellet”

T1 = Tiempo de la primera centrifugación = 1 minuto o 60 segundos.


T2 = Tiempo de la segunda centrifugación = 5 minutos o 300 segundos.

Objetivos:
1. Determinar los cálculos de la Fuerza Centrífuga Relativa despejando las
revoluciones por minuto, para el método de centrifugación.
2. Diferenciar los cloroplastos de la espinaca en los 3 medios con TSB, TSB-Urea
6M y TSB-Tritón X-100 2%.
3. Observar las diferencias del homogenado con cada tipo de Tris Buffer Salino, en
color, y características especiales.

RESULTADOS:
De acuerdo al desarrollo de la práctica los resultados obtenidos los exponemos de la
- Determinación de las velocidades de centrifugación requeridas para el aislamiento
de cloroplastos.
RADIO DEL ROTOR RPM PARA 200 G RPM PARA 1300 G
13,5 cm 1200 RPM 3000 RPM
El radio del rotor fue hallado de acuerdo a la centrifuga utilizada, con la ayuda de dos
reglas de 30 cm, una desde el centro del rotor hasta la otra dispuesta de manera
perpendicular al rotor, las revoluciones por minuto fueron halladas por la fórmula de FCR.
- Observaciones de los tubos de prueba en las tres preparaciones.

Tris-NaCl Tris-NaCl-Úrea 6M Tris-NaCl-Tritón X-100 2%

Se observó partes del tubo


Se observó una tonalidad de prueba de color verde Se observó la preparacion de
de verde mas oscura en translucidas en la parte una tonalidad de verde
comparación a las inferior y una tonalidad de translucido de manera
demas sustancias. verde mas oscuro en la homogenea.
parte media.

Luego de la preparación con el TSB y la espinaca, una vez colocado el tubo de prueba se
observaron las diferencias del homogenado celular, previa colocación en la centrífuga.
- Observaciones microscópicas de la fracción de cloroplastos.

Los cloroplastos presentan un tamaño mediano, se


Cloroplastos con TSB
encuentran en condiciones normales en medio isotonico

Los cloroplastos presentan un tamaño hinchado, se


encuentran en turgencia, se han tornado de un color
Cloroplastos con TSB-Úrea 6M
verde muy claro casi fosforescente, se encuentran en un
medio hipotónico.

Los cloroplastos casi no son visibles, son muy pequeños,


Cloroplastos con TSB-Tritón X-100 2% arrugados o crenados; se encuentran en un medio
hipertonico.

Cálculos:
Los cálculos se realizaron para hallar la velocidad con la que la centrifuga trabajaría en
determinada fuerza centrífuga relativa, teniendo en cuenta el radio del rotor, teniendo así:
Radio del rotor: 13,5 cm
FCR: 200 g
Aplicando Fórmula de la FCR:
200
= (𝑟𝑝𝑚)2 1151,13 = rpm  1200 rpm
1,118 𝑥 10−5 𝑥 13,5

- Esta velocidad se aplicará en la primera centrifugación del homogenado celular


de espinaca con cada tipo de Tris-NaCl.
FCR: 1300 g
Aplicando Fórmula de la FCR:
1300
= (𝑟𝑝𝑚)2 3000 = rpm
1,118 𝑥 10−5 𝑥 13,5

- Esta velocidad se aplicará en la segunda y última centrifugación del homogenado


celular de espinaca con cada tipo de Tris-NaCl.

El coeficiente de sedimentación se halló con respecto a la última centrifugación,


midiendo el tamaño en centímetros del pellet y el sobrenadante, aplicando la respectiva
fórmula para cada preparado con Tris-NaCl, Tris-NaCl-Úrea 6M y Tris-NaCl-Tritón X-
100 2%., teniendo en cuenta los tiempos en segundos, 60 y 300 segundos.
Tris-NaCl TOTAL
X1 13,5 cm 1 cm 12,5 cm
X2 13,5 cm 6 cm 7,5 cm

Tris-NaCl-Úrea 6M TOTAL
X1 13,5 cm 0,6 cm 12,9 cm
X2 13,5 cm 6 cm 7,5 cm

Tris-NaCl -Tritón X-100 2% TOTAL


X1 13,5 cm 1 cm 12,5 cm
X2 13,5 cm 5,4 cm 8,1 cm

Coeficiente de Sedimentación para Tris-NaCl:


210 𝑥 𝐿𝑜𝑔(1,66)
𝑆= 2,13 x 105S
(3000)2 𝑥 240

Coeficiente de Sedimentación para Tris-NaCl-Úrea:


210 𝑥 𝐿𝑜𝑔(1,72)
𝑆= 2,29 x 105S
(3000)2 𝑥 240

Coeficiente de Sedimentación para Tris-NaCl-Tritón X-100 2%.


210 𝑥 𝐿𝑜𝑔(1,54)
𝑆= 1,82 x 105S
(3000)2 𝑥 240

El tamaño de los cloroplastos es relativamente más grande en comparación a los


ribosomas los cuales presentan dos subunidades, la superior con 50S y la inferior o más
pequeña de 30S.
Discusión de Resultados
- Las tonalidades del homogenado pueden diferir con respecto a la preparación y a
la solución salina que se utilizó, en el caso del homogenado celular con Tris-NaCl-
Tritón X-100 2%, resulta en una tonalidad verde translúcida, esto se puede deber
a que por el mismo medio en que esta solución (medio hipertónico) condiciona a
los cloroplastos de la espinaca a realizar una lisis o crenación.

- Las células y organelas como los cloroplastos de acuerdo al medio en el que se


encuentren pueden llegar a realizar fenómenos de turgencia o crenación, estos
ocurren por el intento de la célula de mantener un equilibrio con el medio, en
dicho intento dependiendo del medio (Hipotónico o Hipertónico), ya sea con el
paso de agua o con la expulsión de este, Sin embargo según James E. Darnell,
existe un fenómeno adicional el cual no permite que la célula explote por turgencia
llamado retención parietal.

- La cantidad de homogenado celular puede contribuir a que las mediciones para la


obtención de X1 y X2 varíen, dándonos resultados diferentes de acuerdo al tamaño
del pellet y sobrenadante, de ahí se desprende que los valores de los coeficientes
de sedimentación varíen con respecto a los resultados de otros grupos.

CONCLUSIONES
1. La fuerza de centrifugación relativa, el radio del rotor y la velocidad en rpm,
son indispensables para el desarrollo de una correcta centrifugación
diferencial, además de estar ligada a la fórmula del coeficiente de
sedimentación.

2. De acuerdo el medio donde se ubiquen los cloroplastos estos presentaran


fenómenos como turgencia o crenación incluso puede no llegar a alterarse, de
acuerdo con las soluciones Tris-NaCl.

3. El homogenado variará en la tonalidad dado las características de las


soluciones TSB, en sus 3 medios.

BIBLIOGRAFÍA
 Harvey Lodish y James E. Darnell, (1993). Biología celular y molecular. Mexico:
Panamericana 4ta ed.
 Julian Perez. (2012). Turgencía. Actualizado [ 2015-03-10]. Disponible en:
http://definicion.de/turgencia/
 Frederick M. Ausubel et al. (2003). Current Protocols in Molecular Biology.
Appendix 2, A.2.5, Supplement 40.