Manua Bioca

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE CIUDAD JUÁREZ
INSTITUTO DE CIENCIAS BIOMÉDICAS
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS QUÍMICO – BIOLÓGICAS
ACADEMIA DE BIOQUÍMICA
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA GENERAL PARA
MEDICINA (PLAN 2014).

Documento modificado, actualizado y revisado por:
M. en C. Leny Judith Álvarez Araujo
M. en I. Edith Enríquez Gallosa
Docentes y Técnicos Académicos de la Academia de Bioquímica
Vo.Bo.:
Dra. Laura Alejandra de la Rosa Carrillo
Coordinador de la Academia de Bioquímica
Autorizado por:
Ph.D. Alejandro Martínez Martínez
Jefe del Departamento de Ciencias Químico Biológicas
Cd. Juárez Chihuahaua
Revisión Enero del 2015
Manual de Prácticas de Laboratorio de Bioquímica General 1997
Instituto de Ciencias Biomédicas
Universidad Autónoma de Ciudad Juárez
Semestre regular Enero – Mayo 20XX
Semestre regular Agosto – Noviembre 20XX
Curso de Verano Junio – Julio 20XX

NOMBRE DEL ALUMNO____________________________________
MATRICULA ____________________
HORARIO DE TEORIA ____________________
HORARIO DE LABORATORIO_______________
GRUPO DE LABORATORIO _________________
NUMERO Y/O NOMBRE DEL EQUIPO ______________________

INDICE
PROLOGO.................................................................................................................................. I
PRESENTACIÓN....................................................................................................................... II
REGLAS PARA LOS ALUMNOS QUE ASISTEN A LOS LABORATORIOS DE BIOQUÍMICA. .III
INSTRUCCIONES PARA EL USO DE ESTE MANUAL ............................................................. V
PRÁCTICA # 1 ........................................................................................................................... 1
BIOSEGURIDAD Y MANEJO INTEGRAL DEL LABORATORIO DE BIOQUÍMICA ..................... 1
PRÁCTICA # 2 ........................................................................................................................... 7
ESTRUCTURA Y CLASIFICACIÓN DE AMINOÁCIDOS Y PROTEÍNAS .................................. 7
PRÁCTICA # 3 ..........................................................................................................................18
ANÁLISIS ENZIMÁTICO CUALITATIVO ...................................................................................18
PRÁCTICA # 4 ..........................................................................................................................23
CINÉTICA ENZIMÁTICA 1: EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DEL SUSTRATO ................23
SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA ......................................................................................23
PRÁCTICA # 5 ..........................................................................................................................28
CINÉTICA ENZIMÁTICA 2: EFECTO DEL PH Y TEMPERATURA ...........................................28
PRÁCTICA # 6 ..........................................................................................................................33
DETERMINACIÓN DE UREA Y CREATININA SÉRICA ...........................................................33
PRÁCTICA # 7 ..........................................................................................................................39
EXTRACCIÓN DE GLUCÓGENO Y REACCIONES DE IDENTIFICACIÓN DE
CARBOHIDRATOS ...................................................................................................................39
PRÁCTICA #. 8 .........................................................................................................................45
CUANTIFICACIÓN DE COLESTEROL SÉRICO ......................................................................45
PROLOGO
El siguiente manual ha sido modificado de acuerdo a las necesidades de la nueva Curricula 2014 de la
carrera de Medicina, por lo que se espera que el alumno aproveche en su totalidad la información aquí
presentada.
El curso de Bioquímica General se imparte en el Instituto de Ciencias Biomédicas como parte del programa
integral del Departamento de Ciencias Químico Biológicas y se requiere del curso de Fisicoquímica como
materia antecedente.
En este curso se presenta una completa orientación hacia el área Médica en donde se correlacionan
aspectos del metabolismo integral con las funciones específicas de los órganos y sistemas con un carácter
muy fundamental teniendo en cuenta que dichas funciones se tratarán con mayor detalle en las nosologías
y las clínicas respectivas.
2014
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PRESENTACIÓN
Uno de los aspectos fundamentales de la enseñanza de materias correspondientes al área de las Ciencias
Básicas, es que el estudiante debe de comprender los elementos teóricos revisados. Con el fin de reafirmar
dichos conocimientos es necesario que los practique en el Laboratorio y como consecuencia reciba los
refuerzos apropiados y al final de dicho curso este compenetrado con la materia analizada.
En la Academia de Bioquímica siempre ha existido el interés de que los alumnos que cursen dichas
materias tengan la capacidad de comprender los fenómenos moleculares tanto a nivel celular como del
organismo.
El individuo que se dedique a la investigación y/o a la enseñanza de la Bioquímica, debe de estar

convencido de que el ensayo de formas más eficientes de involucrar al alumno en el estudio de ésta
interesante área, es la única manera de evolucionar positivamente en la investigación y en la excelencia
académica.
Este manual de prácticas es el resultado del esfuerzo común de la Academia de Bioquímica, con el único
fin de fomentar la interrelación de los conocimientos teóricos con la actividad práctica, de una manera más
organizada, en aras de un mayor aprovechamiento de la enseñanza Bioquímica. En base a este
pensamiento, nos comprometimos a elaborar el "Manual de Prácticas de Laboratorio de Bioquímica
general" el cual esperamos sea útil durante los cursos de Bioquímica.
En este Manual se pretende dar al alumno una información básica, que lo motive a desarrollar un diseño
experimental predeterminado y a deducir por medio del análisis objetivo de los resultados, las posibles
implicaciones que se tengan para demostrar un hecho que fue discutido previamente en la clase teórica.
Agradecemos la cooperación y el apoyo recibido por parte de las autoridades Universitarias para lograr la
publicación de este Manual.
Atentamente Comisión Elaboradora
Academia de Bioquímica
M.C. Héctor Reyes Leal Biol. Héctor Esparza Valencia
Q.F.B. Gilberto Reyes Leal Biol. Daniel Chávez Licón
Q.F.B. Graciela Manjarrez G. Q.B.P Jorge Baylón Monárrez
Q.B.P. J. Ángel Araujo Dr. David Reyes Ruvalcaba.
Q.B.P. Oscar Barrozo
1997
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REGLAS PARA LOS ALUMNOS QUE ASISTEN A LOS LABORATORIOS DE
BIOQUÍMICA.
1. - Al inscribirse en la materia queda automáticamente inscrito en un grupo de Laboratorio. El maestro

no está facultado para realizar cambios de grupo y/o permutas.
2. - La asistencia a los laboratorios es obligatoria y deberán presentarse con un retardo no mayor de
10 min. de la hora de entrada.
3. - Para tener derecho a calificación final del laboratorio se requiere un 80 % de asistencias.
4. - Toda falta a la práctica equivale a cero en su reporte.
5. - Es obligatorio presentarse con bata blanca de manga larga a las sesiones de laboratorio.
6. - Durante las sesiones de laboratorio queda estrictamente prohibido fumar e ingerir alimentos.
7.- En caso de reprobar el laboratorio, automáticamente queda reprobado en la clase de teoría.
8.- La calificación final de laboratorio corresponde al promedio obtenido en las prácticas, exámenes y
trabajo en el laboratorio.
9.- Los reportes de la semana se entregarán obligatoriamente en el horario establecido por el maestro.
La aceptación extemporánea de reportes queda a consideración del docente. El Reporte es individual.
10.- Los reportes ya calificados, se devolverán a la semana siguiente.
11.- El material que sea dañado por el alumno, deberá reponerse antes de finalizar el curso acompañado
con la factura de compra. De no ser así no se condicionará la calificación del alumno.
12.- Si parte del material es dañado o se pierde y se desconoce al responsable, el material será repuesto
por el grupo asistente a la práctica.
13.- Se realizarán los exámenes de laboratorio pertinentes en las fechas indicadas en la calendarización
de la academia.
14.- Es obligación del alumno entregar el material limpio cada vez que termine su práctica.
15.- Se recomienda mantener limpia su mesa de trabajo y guardar el mayor orden posible.
16.- El alumno se deberá comprometer a regresar el material en las mismas condiciones en que lo
recibieron.
17.- Los reportes o bitácora se calificarán en base a los acuerdos de la academia, teniendo mayor peso
los siguientes apartados:
A) Resultados
B) Discusión
C) Conclusiones
D) Cuestionario
E) Bibliografía
El maestro detallará la forma de reportar dentro del encuadre, el día de la recepción del grupo.
Incluyendo el trabajo experimental y la discusión y participación en la práctica.
18.- Es obligación del alumno investigar sobre el tema de la práctica previa realización de ésta, en caso
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de presentarse sin haber estudiado se considerará como falta de interés, afectando la calificación de la
participación de la misma.
19.- De igual manera, para aquél alumno que no se prepare para la discusión de las prácticas, se verá
afectado en la parte de su calificación de correspondiente a la misma.
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INSTRUCCIONES PARA EL USO DE ESTE MANUAL
Con la idea de que el alumno pueda manejar de manera más eficiente este Manual se hacen las
siguientes recomendaciones:
1.- Al principio del Manual se incluye un índice de las prácticas a realizar, que permite su rápida
localización.
2.- La secuencia de prácticas, está en función de los programas de teoría y cabe aclarar que en la primera
sesión se les indicará cuales prácticas se van a realizar durante el semestre.
3.- Todas las prácticas están subdivididas en dos partes:
a) Incluye la descripción metodológica de la práctica, que a su vez se subdivide en:
- Título de la práctica
- Objetivo de la práctica
- Prerrequisitos
- Introducción
- Material y Métodos
b) Contiene los elementos correspondientes al reporte de la práctica y se subdivide en:
- Resultados
- Discusión
- Conclusiones
- Cuestionario
- Bibliografía consultada
4.- A continuación se mencionan algunos aspectos significativos de cada uno de estos elementos:
a) Título de la práctica.- Indica el nombre de la práctica y la de manera específica de lo
que se va a realizar durante la sesión.
b) Objetivo de la práctica.- Señala lo que se espera que el alumno logre al término de esta.
c) Prerrequisitos.- Comprende una serie de puntos, que el alumno debe de conocer su
significado con anterioridad a la explicación de la práctica, para lo cual se recomienda
consultar la bibliografía recomendada al final de este Manual.
d) Introducción.- Información básica y muy breve, referente a la práctica a realizar.
e) Métodos y Materiales.- Es la descripción del desarrollo de la práctica, señalando el
equipo, cristalería y soluciones a utilizar en la práctica.
Es importante que el alumno entienda la secuencia del desarrollo antes de iniciar el
experimento, por lo cual es necesario que se lea antes de la sesión de explicación de la
práctica, para que pueda consultar sus dudas con el Docente.
f) Resultados.- En esta sección se anotan los datos obtenidos durante la sesión de la
práctica, de acuerdo a las indicaciones tanto del Manual como del Profesor.
h) Discusión.- Es una de las partes principales de todo experimento, ya que consiste en
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realizar un análisis comparativo de los resultados esperados con respecto a los obtenidos,
llevando a cabo la argumentación necesaria de dichos resultados.
i) Conclusiones.- En base a los resultados obtenidos y a la discusión desarrollada,
concluir cuales son los puntos principales y que consecuencias a futuro plantean esta
práctica.
j) Bibliografía consultada.- En este punto se deben incluir las referencias bibliográficas
de los libros o artículos consultados, de acuerdo a los siguientes lineamientos:
En el caso de revistas:
Nombre(s) del autor(es), (año), Título del artículo Nombre de la Revista,
Volumen, Páginas consultadas
En el caso de libros:
Nombre(s) del autores), (año), Nombre del capítulo. Nombre del libro.
Editorial. Edición. País. Páginas consultadas.
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PRÁCTICA # 1
BIOSEGURIDAD Y MANEJO INTEGRAL DEL LABORATORIO DE BIOQUÍMICA
OBJETIVO:
El alumno aprenderá acerca de la normatividad que rige en el laboratorio de bioquímica para evitar
cualquier riesgo de accidente y trabajar de forma segura, así como de los materiales, equipo, reactivos y
de los usos adecuados de los mismos.
PRERREQUISITOS:
1. Diferencias entre regla, reglamento, norma y ley.

2. Diferencia entre ley y costumbre.
3. Organismos que rigen las normatividades.
4. Normas involucradas en la seguridad de los laboratorios.
5. Conocimientos sobre soluciones, diluciones y mezclas.
6. Diferencia entre fotocolorímetro, colorímetro y espectrofotómetro.
7. Definiciones y diferencias entre soluciones Molar, Normal y % w/v.
INTRODUCCIÓN:
 Bioseguridad es una palabra compuesta por bio (del latín que significa vida) y seguridad (del
latín securitas que significa ausencia de riesgo).
El riesgo es la vulnerabilidad ante un daño para personas, cosas y/o el medio ambiente. Existe una
variedad de riesgos en los que se encuentran los riesgos físicos, químicos, biológicos, ambientales,
laborales, financieros, políticos, etc.
Sin embargo, en el trabajo dentro de un laboratorio, el nivel de seguridad depende del grupo de riesgo. De
acuerdo al manual de la Organización Mundial de Salud (2005), hace referencia al grupo de riesgo con el
nivel de bioseguridad y el tipo de laboratorio en que se trabaje, incluyendo como una consecuencia las
prácticas de laboratorio y el equipo de seguridad a utilizar, como se establece en la tabla 1.
En los laboratorios de docencia mismos en los que se encuentra clasificado la academia de bioquímica de
esta Institución (UACJ), el material y el equipo deberán contar con un manual de procedimientos para el
uso adecuado de los mismos y en consecuencia evitar riesgos posibles de accidentes o incidentes que
puedan dañar al personal y al mismo tiempo al material y equipo en cuestión.
En el manejo de sustancias químicas reactivas también se encuentran presentes los riesgos, es por eso
que de acuerdo a la Secretaria de Trabajo y Prevención Social en su Norma 018-STPS-2000 y al programa
de Comunicación de Riesgos de la OSHA (Occupational Safety and Health Administration), ha sido
implementado el uso de las hojas de uso seguro de los materiales o material safety data sheet (MSDS por
sus siglas en ingles), mismas que están al alcance de todo el personal usuario.
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Cada sustancia que se maneje en los laboratorios deberá estar debidamente etiquetada y referenciada
con un esquema el cual manifiesta el grado de riesgo de las sustancias químicas. Mismo con el cual
podemos identificar rápidamente el tipo de riesgo al que estamos expuestos (Figura 1).
Tabla I Relación de los grupos de riesgo con los niveles de bioseguridad, las prácticas y el equipo. OMS (2005)
Grupo de Nivel de Tipo de laboratorio Prácticas de laboratorio Equipo de seguridad
riesgo bioseguridad
1 Básico Enseñanza básica, TMA (Técnicas Ninguno; trabajo en mesa de

investigación Microbiológicas Apropiadas) laboratorio al descubierto
Nivel 1
2 Básico Servicios de TMA y ropa protectora; señal Trabajo en mesa al descubierto y

atención primaria; de riesgo biológico CSB (Cámara de Seguridad
Nivel 2 diagnóstico, Biológica) para posibles aerosoles
investigación
3 Contención Diagnóstico Prácticas de nivel 2 más ropa CSB además de otros medios de
especial, especial, acceso controlado y contención primaria para todas las
Nivel 3 investigación flujo direccional del aire actividades
4 Contención Unidades Prácticas de nivel 3 más CSB de clase iii o trajes

máxima patógenos cámara de entrada con cierre presurizados junto con CSB de
peligrosos hermético, salida con ducha clase ii, autoclave de doble puerta
Nivel 4 y eliminación especial de (a través de la pared), aire filtrado
residuos
Figura 1 Rombo de riesgos químicos
El Sistema de Comunicación de Riesgos (Right To Know) muy utilizado en los E.U.A. nos refiere de manera
explícita de los riesgos y daños a los cuales estamos expuestos por el manejo de una sustancia y qué
equipo de protección personal se debe de utilizar. Aquí en México la Secretaria de Trabajo y Previsión
Social también se preocupa por los riesgos ocupacionales de los diferentes centros de trabajo junto con la
Secretaria de Salud, por lo que también existen señalizaciones para determinar las áreas de trabajo,
puertas de acceso, y salidas, áreas despejadas, código de tuberías para sustancias que corran en ellas,
etc. Es por eso que es muy importante tomar en cuenta las barreras de protección y el tipo de ellas, según
su clasificación: física, química y biológica.
También es importante hacer hincapié en el manejo apropiado de los desechos de las sustancias
químicas, tejidos, agares y material peligroso biológico infeccioso (RPBI), que se manejan en los
laboratorios los cuales son vigilados por la SEMARNAT ya que estos son dispuestos al medio ambiente,

llámese agua (a los drenajes que a pesar de llegar a una planta de tratamiento de agua residuales en
algunas ocasiones, estas siguen su curso a canales de irrigación y/o acequias para riego de cultivos y por
ende al subsuelo), cielo abierto (por la emisión de los gases y que contaminan el aire que respiramos) o
tierra (con la disposición de los residuos sólidos que impactan a el medio alterando los ciclos naturales
biológicos).
Los residuos RPBI, son aquellos que se generan durante las actividades asistenciales a la salud de
humanos o animales en los centros de salud, laboratorios clínicos o de investigación, bioterios, centros de
enseñanza e investigación, principalmente; que por el contenido de sus componentes puedan representar
un riesgo para la salud y el ambiente.
De acuerdo a la Norma Oficial Mexicana NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002, son considerados los

siguientes como se muestra en la tabla 2:
Tabla II Características físicas y biológicas de los residuos infecto-contagiosos
TIPO DE RESIDUO EDO. FÍSICO ENVASADO COLOR

Sangre Líquidos Recipientes herméticos Rojo
Cultivos y cepas de agentes
Sólidos Bolsa de polietileno Rojo
infecciosos
Patológicos Sólidos Bolsa de polietileno Amarillo
Líquidos Recipientes herméticos Amarillo
Residuos no anatómicos Sólidos Bolsa de polietileno Rojo
Líquidos Recipientes herméticos Rojo
Recipientes rígidos
Objetos punzocortantes Sólidos Rojo
poliprolileno
 Manejo Integral de un Laboratorio

Por otro lado, para llevar a cabo un experimento en cualquier laboratorio obteniendo los mejores
resultados, es necesario que se manejen técnicas básicas de experimentación tales como se indica a
continuación, de acuerdo a los procedimientos de manejo y a la clasificación del material y el equipo
- Técnicas de medición de líquidos.

- Técnicas de pesado de sólidos.
- Técnicas de separación de líquidos y sólidos.
- Técnicas de cuantificación de líquidos y sólidos
- Técnicas de mezclado de líquidos y sólidos.
Todas estas técnicas se relacionan con frecuencia con las actividades que cotidianamente se llevan a cabo
en el laboratorio de Bioquímica. Es importante dentro del trabajo de un laboratorio tomar en cuenta
conceptos tales como precisión, exactitud y confiabilidad.

De acuerdo al Centro Español de Metrología
Exacto: es la capacidad de obtener valores o indicaciones próximas al valor verdadero de la magnitud

medida es decir, será más exacto cuanto más pequeño sea el error sistemático de medida
Preciso: es la capacidad de obtener valores o indicaciones próximas entre sí al efectuar mediciones

repetidas, será pues más preciso cuanto menor sea la dispersión que presentan entre sí los sucesivos
resultados obtenidos Por lo que podemos tener 4 tipos de resultados:
1._ Exacto y preciso: Resultados muy próximos entre sí, con un valor medio muy cercano al valor
verdadero.
2._ Exacto pero no preciso: Valor medio muy cercano al valor verdadero, pero gran dispersión de los
resultados en torno al valor medio.
3._ Preciso pero no exacto: Resultados muy próximos entre sí pero valor medio alejado del valor
verdadero.
4._ Ni preciso ni exacto: Gran dispersión de los resultados en torno al valor medio y valor medio alejado
del valor verdadero.
De acuerdo a la Escuela Colombiana de Metrología
Confiabilidad: Es cuando los resultados obtenidos son iguales a los pronosticados.
Para la medición de líquidos:
Los instrumentos más utilizados son: pipetas (serológicas y volumétricas), buretas, probetas y
matraces volumétricos o aforados. Estos materiales de vidrio pueden modificar la exactitud de la medición
debido a cambios extremosos de temperatura. La temperatura promedio de trabajo es de 25 °C.
Para el pesado de sólidos:
El equipo utilizado son las balanzas granatarias, analítica y hace muchos años las de torsión. Las
balanzas de granatarias son útiles en el laboratorio de bioquímica como una herramienta para el buen uso
de la centrífuga, ya que para equilibrar los tubos de centrífuga siempre debe hacerse en base al peso y
volumen del contenido.
Para la separación de líquidos y sólidos:
Se encuentran todas las centrífugas (clínicas y micro centrífugas), donde se separan las fases
diferentes a alta velocidad, quedando en la base del recipiente contenedor el sedimento y la porción líquida
en la parte superior como sobrenadante.
Para la cuantificación de líquidos y sólidos:
Los fotómetros, colorímetros y especialmente los espectrofotómetros son los equipos mayormente
usados en la cuantificación de soluciones, donde dependiendo de la cantidad de los solutos dan una
turbidez o coloración que detectan estos aparatos a una longitud de onda. Estas soluciones están basadas
en el mezclado de líquidos y sólidos.
Mezclado de líquidos y sólidos:

Las soluciones normales, molares y porcentuales así como los diferentes tipos de diluciones son
las mezclas más utilizadas en el laboratorio. Frecuentemente, las soluciones involucran mezclas de sólidos
en líquidos o de líquidos en líquidos en tanto que las diluciones solo involucran mezclas líquidos en
líquidos. De la destreza con que se lleven a cabo estas mezclas depende el buen resultado de la
experimentación en el laboratorio.
El propósito de esta parte de la práctica, es evaluar la capacidad de cada alumno para la aplicación
de todas las técnicas antes descritas, que son una base importante para el desarrollo de prácticas
posteriores.
MATERIAL:
a) En lo referente a bioseguridad, normas aplicables a el uso y manejo de laboratorios

b) En lo referente al material y equipo:
1. 1 pipeta de 10 ml
2. 1 pipeta de 5 ml
3. 1 pipeta de 2 ml
4. 1 pipeta de 1 ml
5. 1 pipeta de 0.5 ml
8. 1 micropipeta de 10 a 100 microlitros
9. 1 micropipeta de 100 a 1000 microlitros
10. 1 probeta de 100 ml
13. 1 bureta de 50 ml
14. 1 matraz Erlenmeyer de 125 ml
15. 1 balanza granataria
16. 1 espectrofotometro
METODOS:
Investigación y experimentación
Procedimientos:
A.
Investigue en las diferentes referencias impresas o computarizadas el marco teórico sobre
el cual se sustenta la minimización de los riesgos para la realización del trabajo seguro
en cualquier laboratorio
B.
En presencia del maestro, haga un listado de todo el material del laboratorio de acuerdo
a su material de elaboración, e investigue la función de cada uno de ellos, por ejemplo:

Cristalería Función
Tubos de ensaye -
Pipetas serológicas -
Pipetas volumétricas -
Matraces Erlenmeyer -
etc.
Porcelana
Morteros con pistilos -
Metálico
Soporte universal -
Gradilla -
Pinzas para bureta -
Haga lo mismo para el equipo localizado en el laboratorio
C. En equipos de trabajo según lo indique el maestro, irán los alumnos conociendo,

manipulando y a su vez comparando todo el material que requieran para hacer los
siguientes experimentos.
 Medición de líquidos._ Utilizando pipetas serológicas de diferentes volúmenes y
en presencia del profesor, seleccione la pipeta adecuada para hacer las siguientes
mediciones:
a) 0.05 ml b) 5 décimas de mililitro c) 2.4 ml
b) d) 5.6 ml e) 9.8 ml
Así mismo, utilizando la probeta adecuada mida también los siguientes volúmenes:
a) 28 ml b) 125 ml c) 265 ml
Utilizando la probeta de 100 ml, llene hasta 50 ml y vacié a la bureta y
posteriormente vacié al matraz Erlenmeyer de 125 ml. Observe y registre todos
los detalles del proceso
 Medición de sólidos._ Utilizando la balanza granataria y en presencia del

profesor, realice las siguientes pesadas:
a) 1.5 g b) 5.5 g c) 9.8 g d) 27.5 g e) 60 g
 Cuantificación de líquidos y sólidos
Diluciones dobles._ Utilizando una solución madre de permanganato de potasio,
realice las siguientes diluciones de tal manera que contenga un volumen total de
4 ml:
a) Dilución 1:2 b) dilución 1:4 c)dilución 1:8 d) dilución 1:16
Mida en el espectrofotómetro la absorbancia de cada dilución a una longitud de onda de
520 nm. Registre sus absorbancias.
 Mezclado de líquidos y sólidos

Soluciones._ Utilizando un reactivo sólido que indique el profesor, prepare las
siguientes soluciones:
a) Solución 1.5% peso/volumen
b) Solución 0.1 molar
c) Solución 0.5 normal
Una vez hechas las soluciones, proceda a medir las absorbancias en el espectrofotómetro
a la longitud de onda que le indique el profesor. Registre los valores de absorbancia.

 Separación de líquidos y sólidos
De las soluciones anteriores coloque 5 ml de cada una de las soluciones en tubos
de ensaye y coloque un cuarto tubo con 5 ml de agua destilada, centrifugue y
observe y registre los resultados.
RESULTADOS:
____________________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
DISCUSIONES:
____________________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
CONCLUSIONES:
____________________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
BLIBLIOGRAFIA CONSULTADA:
Manual de Bioseguridad en el Laboratorio. Organización Mundial de la Salud. Tercera Edición.Ginebra

2005
Hanbook of Good Laboratory Practice (GLP). World Health Organization, TDR For Research on diseases
of poverty UNICEF – UNDP – World Bank – Who. Switzeiland. Second Edition
Centro Español de Metrología. www.cem.es/preguntas_frecuentes/ 02-mayo-2013
Escuela Colombiana de Metrología. Metrología y Mecánica de Banco. Protocolo. Escuela Colombiana de

Ingeniería “Julio Garavito”, Edición 2007-1 Pág. 12 02-mayo-2013
www.escuelaing.edu.co/programas/ing_industrial/.../metrologia.pdf
PRÁCTICA # 2
ESTRUCTURA Y CLASIFICACIÓN DE AMINOÁCIDOS Y PROTEÍNAS
OBJETIVOS:

1.- Al término de esta práctica el alumno será capaz de diferenciar a los aminoácidos utilizando técnicas
colorimétricas más comunes para identificarlos, así como, relacionar la estructura de los aminoácidos con
su reactividad y sus funciones en el organismo.
2.- El alumno deberá ser capaz de describir algunas de las técnicas de detección cualitativa de proteínas
en base a los componentes de su estructura.
3.- El alumno será capaz de describir el efecto de los solventes sobre las propiedades electroquímicas de
las proteínas de diferente PM de acuerdo a las siguientes variables:
a) Solubilidad de las proteínas en diferentes soluciones de sales.

b) Propiedades electroquímicas de las proteínas.
c) Efecto del ácido acético sobre el punto isoeléctrico de una proteína.
PRERREQUISITOS:
1.- Conocer las características diferenciales de la estructura de los aminoácidos.

2.- Identificar las diferencias y semejanzas de los aminoácidos con otros monómeros (por ejemplo:
carbohidratos y lípidos).
3.- Identificar las propiedades químicas en base a su polaridad.
4.- Definición de Péptido, Polipéptido y Proteína.
5.- Clasificación de las Proteínas.
6.- Niveles de complejidad estructural de las Proteínas.
7. - Salting In y Salting Out.
8.- Agentes precipitantes de proteínas.
9.- Propiedades fisicoquímicas del agua.
10.- Ecuación de Henderson/Hasselbach.
INTRODUCCIÓN:
AMINOÁCIDOS
Los aminoácidos son los monómeros que dan la estructura de los polímeros conocidos como
proteínas o polipéptidos. Existen cientos de aminoácidos, pero solo 20 de ellos son los principales
componentes de las proteínas, a estos se les conoce como aminoácidos naturales, los cuales poseen las
siguientes características estructurales (Koolman & Röhm, 2004) (Figura 1):
Contienen un carbón asimétrico (con excepción de la glicina) llamado carbono alfa. Al cual se le unen
cuatro radicales que son:
- un grupo carboxilo (COO-)
- un grupo amino (+NH3)
- un átomo de hidrógeno (H)

- un radical de composición variable que permite diferenciar a los aminoácidos (R). Llamado cadena lateral.
Figura 1.- Estructura de un

aminoácido
El cuerpo humano es incapaz de sintetizar los 20 aminoácidos requeridos para la formación de todas las
proteínas y por lo cual partiendo de esta base, los aminoácidos se dividen en: esenciales; porque es
necesario que el individuo ingiera en la dieta y no esenciales; los cuales son producidos por el propio
organismo y por lo tanto no es crítico si el individuo no los consume en su dieta.
Debido a las características fisicoquímicas de la cadena lateral, es posible relacionar su posición, dentro
de la estructura proteica ya que si es de características no polares (hidrofóbico), al contacto con el agua
tenderá a esconderse; o en su defecto, si es de características polares (hidrofílico), tenderá a interaccionar
con el agua. Desde luego, para saber cuál es la estructura de la cadena lateral debemos de conocer cuál
es el pH de la solución ya que dependiendo del pH la cadena lateral estará protonada (H+) o desprotonada,
este parámetro se puede conocer utilizando los pKa de cada aminoácido y la ecuación de Henderson-
Hasselbach lo cual permite determinar cuál es la estructura predominante a un pH dado (Voet & Voet,
2006).
Los cambios de carga dependen del pH en que se encuentre el aminoácido, es decir, bajo condiciones
ácidas el aminoácido está totalmente protonado y en condiciones alcalinas está totalmente desprotonado,
esto se debe a que los aminoácidos son ácidos débiles y por lo tanto tienen una constante de disociación
por cada grupo o radical capaz de comportarse como ácido o base débil. Esto permite conocer el punto
isoeléctrico de un aminoácido, el cual se define como el pH en el cual la carga neta es cero (Voet & Voet,
2006; Peña, et al, 2004).
PROTEÍNAS
La unión de dos o más aminoácidos por uniones ácido – amida genera macromoléculas lineales
que a partir de una longitud de cadena de aproximadamente 100 residuos de aminoácidos se denominan
proteínas (polipéptidos). Las proteínas estas compuestas por aminoácidos naturales ordenados en una
secuencia discreta y unida entre sí por enlaces peptídicos que siempre involucran los radicales amino y
carboxilo de cada aminoácido, lo cual da lugar a un enlace covalente de tipo carbamida y que tiene algunas
características peculiares como (Koolman & Röhm, 2004):
a) El enlace C-N tiene cierto carácter de doble enlace, por lo cual le confiere rigidez a la molécula.
b) El oxígeno y el nitrógeno quedan en posición trans.
c) Todos los elementos que componen el enlace se encuentran ubicados en el mismo plano.
d) La rotación de la molécula formada queda restringida a los carbonos alfa.

El proceso de la síntesis protéica se da siempre en la célula, dónde los aminoácidos se van uniendo
sucesivamente uno tras uno, solamente se utilizan los L-aminoácidos. El grupo carboxilo de un
aminoácido se une al grupo α – amino de un segundo aminoácido, formando un enlace peptídico y
liberando agua (Müller – Esterl, 2008) (Figura 2).
Figura 2.- Formación de un enlace peptídico
La variabilidad de las proteínas se debe a una serie de aspectos tales como: complejidad estructural,
residuos aminoacídicos que la forman, propiedades químicas y físicas y funciones específicas de cada
proteína en el organismo que la contiene, estas proteínas puede llegar a pesar hasta 5000 D (Daltons).
Toda organización estructural que implique determinado orden requiere de la presencia de una fuerza
estabilizadora, que en el caso de las proteínas estaría constituida por diferentes tipos de enlaces o
interacciones físicas y químicas que se enuncian en el cuadro siguiente (Müller – Esterl, 2008; Voet & Voet,
2006):
NIVEL DE ORGANIZACIÓN ENLACES QUE LO MANTIENEN
Primario Enlace peptídico
Secundario Puentes de hidrógeno entre los elementos del enlace

peptídico
Terciario Puentes de hidrógeno entre las cadenas laterales de los

aminoácidos, interacciones hidrofóbicas, electrostáticas,
puentes disulfuro, enlace éster
Cuaternario Los mismos que para el nivel terciario, más las fuerzas
de Van der Walls
La complejidad estructural de las proteínas se manifiesta desde el punto de vista funcional en una gran
diversidad de funciones biológicas: Enzimas, proteínas estructurales, de transporte, contráctiles, acción
hormonal, de reservas (Peña, et al., 2004).
En las proteínas existen aminoácidos hidrofóbicos e hidrofílico. Luego del doblamiento en solución acuosa,
los aminoácidos hidrofóbicos usualmente se encuentran en áreas protegidas, mientras que los
aminoácidos hidrofílico interactúan con las moléculas del solvente, permitiendo la formación de puentes
de hidrógeno con las moléculas de agua del medio. Si hay suficiente superficie hidrofílica, la proteína puede
ser disuelta en agua.

PROPIEDADES DE LAS PROTEÍNAS
Punto isoeléctrico
La carga neta de las proteínas depende del pH. En el punto de neutralidad (punto isoeléctrico, pI) las
cargas acidas y básicas de las cadenas laterales de la proteína están en equilibrio: la proteína ya no se
desplaza a un campo eléctrico.
La carga total de la molécula proteica depende pues, del pH de la solución y del número relativo de cada
aminoácido en la molécula. Así, cuando el pH de la solución es tal que la carga neta de la molécula proteica
es cero, es decir, cuando el número total de cargas negativas iguala al número total de cargas positivas
presentes en la molécula, se llama a este valor de pH, punto isoeléctrico o pH isoeléctrico.
Solubilidad de las proteínas

La solubilidad de las proteínas depende de la composición iónica del medio. Las proteínas generalmente
no se disuelven bien en el agua pura, su solubilidad aumenta al incrementar la fuerza iónica, ya que los
iones inorgánicos se unen a la superficie de la proteína e impiden la agregación de las moléculas, a este
proceso se le conoce como “Salting in” o disolución. Cuando la concentración de sales aumenta aún más,
algunas de las moléculas de agua son atraídas por los iones salinos, lo cual disminuye la cantidad de
moléculas de agua disponibles para su interacción con la proteína. Como resultado de esto, las
interacciones proteína-proteína se hacen más fuertes que las interacciones proteína-solvente por lo que
las proteínas coagulan formando interacciones hidrofóbicas entre ellas, proceso al cual se le conoce como
Salting-out (Koolman & Röhm, 2004; Peña, et al., 2004).
Métodos para cuantificación de proteínas

Existen diversas técnicas de detección y cuantificación de proteínas algunas más complicadas que otras
y algunas más confiables que otras. A continuación se muestra una tabla con los métodos más utilizados:
Método Ventajas inconvenientes

Métodos de absorción No se pierden las muestras Interfieren muchos compuestos que
absorben en el UV
Métodos Derivados Colorimétricos
Biuret Bastante específico para proteínas Tiene poca sensibilidad
Muestra pocas interferencias
Es barato
Lowry Tiene bastante sensibilidad No todas las proteínas reaccionan igual
Muestra muchas interferencias como
detergentes no iónicos, sulfato amónico,
etc.
Bradford Muy sensible Muestra interferencias con detergentes
BCA Es el método más sensible
Es el que muestra menos interferencias
Métodos Derivados Fluorimétricos
o- ftalaldehido Muy sensible La interferencia de aminas
contaminantes en la muestra
No todas las muestras reaccionan igual
De todas las antes mencionadas, Una de las reacciones más utilizadas es la de Biuret; en esta reacción,
el sulfato de cobre alcalino reacciona con compuestos que contienen dos o más enlaces peptídicos, ya
que el radical carbamilo que se forma en el enlace peptídico es muy afín a los iones de cobre. Se le da el
nombre de Biuret porque este es un compuesto que da una reacción típicamente positiva con el sulfato de

cobre alcalino. La formación del color violeta es directamente proporcional al número de enlaces peptídicos
que contenga la proteína y no es sensible a péptidos (Clark J.,1964)
MATERIAL:
Tubos de ensaye
Gradilla
Pipetas 1, 5 y 10 ml
Propipetas
Vasos de precipitado
EQUIPO:
Platina caliente
REACTIVOS:
Nitroprusiato de sodio al 5%
Hidróxido de amonio (NH4OH) concentrado
Cianuro de sodio (NaCN) al 5%
Aminoácidos al 1%
Nitrosonaftol al 1%
Ninhidrina al 1%
Solución de Biuret
Ácido nítrico (HNO3) concentrado
Proteínas al 0.5%
Ac. Acético 0.01N
Ac. Acético 0.1
Ac. Acético 1.0N
Albuminato de Sodio 0.1N
PROCEDIMIENTO:
Experimento No. 1 Prueba de Sullivan
Colocar en una gradilla una serie de tubos y etiquetarlos acorde indica la siguiente tabla:
REACTIVOS BLANCO PATRÓN PROBLEMA

Agua 0.5 ml -------- --------
Cisteína ------- 0.5 ml --------
NH4OH 2 gotas 2 gotas 2 gotas
NaCN 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml
Nitroprusiato de Sodio 2 gotas 2 gotas 2 gotas
Sol. problema -------- --------- 0.5 ml
Observar los resultados obtenidos, una coloración rosa – roja indica resultados positivos.

Experimento No. 2 Reacción de identificación de fenoles p-sustituidos (tirosina)

Agua 1.0 ml ----- -----
Tirosina ----- 1.0 ml -----
Sol. problema ----- ----- 1.0 ml
Nitrosonaftol 2 gotas 2 gotas 2 gotas
Mezclar y calentar en baño de ebullición durante 5 minutos, sacar y dejar enfriar. Posteriormente agregar
2 gotas de Ácido Nítrico a todos los tubos sin mezclar. Observar los resultados obtenidos. La aparición
de un color rosa violáceo es positiva.
Experimento No. 3 Reacción de identificación de aminoácidos con ninhidrina
La ninhidrina (hidrato de tricetohidrindeno) es un agente oxidante que reacciona con todos los alfa
aminoácidos dando un color purpura. La prolina e hidroxiprolina da un color amarillo.

Aminoácido ------ 1.0 ml -----
Problema ----- ----- 1.0 ml
Ninhidrina 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml
Agua destilada 1.0 ml ----- -----
Mezclar y calentar en baño de agua hirviendo, sacar en cuanto cambien de color.
Experimento No. 4 Reacción de Biuret
Preparar una serie de tubos de acuerdo a la siguiente tabla:
TUBO 1 2 3 4 5
Agua destilada 1 ml -- -- -- --
Albúmina -- 1 ml -- -- --
Peptona -- -- 1 ml -- --
Gelatina -- -- -- 1 ml --
Tirosina -- -- -- -- 1 ml
Biuret 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml
Agitar y dejar reposar los tubos durante 15 min. Observar la coloración y su intensidad.

Experimento No. 5 Determinación del punto Isoeléctrico de la Albúmina por adición de un ácido.
Fundamento Químico: Con la adición de un ácido o una base a una solución protéica se alcanza un estado
en que hay el mismo número de aniones que de cationes. Este efecto, neutraliza la carga de la proteína y
tiende a precipitar. El pH que determina el número igual de cargas de signos opuestos se denomina punto
isoeléctrico.
Preparar una serie de tubos como se indica a continuación:
Albuminato
Tubo pH Agua Ac. Acético 0.01N Ac. Acético 0.1 Ac. Acético 1.0N
0.1N
1 8.38 0.62 0 0 1.0
2 7.75 1.25 0 0 1.0
3 8.75 0 0.25 0 1.0
4 8.5 0 0.5 0 1.0
5 8.0 0 1.0 0 1.0
6 7.0 0 2.0 0 1.0
7 5.0 0 4.0 0 1.0
8 1.0 0 8.0 0 1.0
9 7.4 0 0 1.6 1.0
10 5.8 0 0 3.2 1.0
Mezclar bien y observar los cambios que presente la solubilidad del albuminato en cada tubo.
Calcular el pH de cada tubo utilizando la ecuación de Hendersosn-Hasselbach.
RESULTADOS:
Experimentos No.1, 2 y 3 Identificación de aminoácidos
En la siguiente tabla indicar si los resultados del problema fueron positivos o negativos.
TUBOS AMINOACIDOS Exp. No. 1 Exp. No. 2 Exp. No.3

1
2
3
4
5
6
7
8
9

Experimento No. 4 Reacción de Biuret
Reportar los resultados de la siguiente forma: (++) = violeta intenso; (+) = ligeramente coloreado; (-) = no
formación de color.
Experimento No. 5 Determinación del punto Isoeléctrico de la caseína por adición de un ácido.
TUBO pH SOLUBILIDAD
10
Cuál es el punto isoeléctrico de la proteína?
DISCUSIÓN:
1.- Describir y explicar mediante un esquema la reacción entre el Reactivo de Biuret y los enlaces
peptídicos.
2.- Correlacionar los pesos moleculares y los componentes aminoacídicos de la albúmina, peptona,
gelatina y tirosina.
3.- Explique porque cada proteína se comporta de diferente manera en las reacciones de Biuret y
Xantoproteica.
4.- Analice las dos reacciones y diga si son confiables para una determinación a nivel clínico.
5.-¿Cuál es el efecto de la adición de una sal metálica a una solución proteínica?
6.-¿De qué factores depende la solubilidad de una proteína en el agua?
7.-Explique en términos fisicoquímicos el efecto que provoca la adición de un ácido o una base fuerte.
8.-Explique cómo afecta un cambio en la constante dieléctrica del agua a la solubilidad de una proteína.
9.-¿Qué relación existe entre el punto isoeléctrico y la solubilidad de una proteína?
10.-¿Qué es la ecuación de Henderson-Hasselbach y en qué casos está indicado utilizarse?
11.-Diga si es posible tener dos proteínas con puntos isoeléctricos muy alejados solubles en un mismo
solvente. ¿Por qué?

CUESTIONARIO:
1.- Mencione 5 diferencias fundamentales tanto químicas como bioquímicas que permiten diferenciar a los
aminoácidos de los carbohidratos y de los lípidos.
2.- Existe un enorme grupo de aminoácidos no naturales, mencione 10 ejemplos e indique su importancia
bioquímica.
3.- ¿Cómo se calcula el punto isoeléctrico de un aminoácido?
4.- ¿Qué importancia médica tiene la identificación de los aminoácidos?
5.- ¿Cuál es el mecanismo de identificación de aminoácidos al utilizar ninhidrina?
6.- ¿Cuál es la función del cianuro de sodio en la reacción del nitroprusiato?
7.- ¿Qué es el Salting in y que tipo de compuestos pueden promoverlo?
8.- ¿Qué es el Salting out y que tipo de compuestos pueden promoverlo?
9.- Mencione y describa dos reacciones que sean análogas a la xantoproteica.
10.- Mencione dos reacciones que sirvan para cuantificar proteínas
11.- Describa el método de Sanger y mencione qué papel juega en la identificación de proteínas.
12.- Defina el término Secuenciación proteica.
13.- Mencione tres reacciones de identificación que se utilicen en la secuenciación de proteínas.
14.- Analice detalladamente una técnica que se utilice para secuenciar a las proteínas.
15.- Las proteínas Bence Jones precipitan a una temperatura mayor de 60°C. Las Crioglobulinas precipitan
a una temperatura de 4°C. La albúmina de huevo precipita a una temperatura mayor de 90°C y también
precipita a un pH menor de 4.5. Explique el comportamiento de cada una de estas proteínas tomando en
cuenta los siguientes parámetros: Fuerza iónica del solvente, interacciones electrostáticas soluto-solvente,
agentes desacoplantes de la interacción soluto-solvente.
16.- Mencione que propiedades fisicoquímicas de la albúmina le permiten interaccionar y transportar
cualquier compuesto incluyendo hidrofóbicos a través de un medio acuoso.
17.- El punto Isoeléctrico de la Gelatina es de 4.7 y el de la colágena es de 8.4. Se sabe que la colágena
es una proteína fibrilar precursora de la gelatina. Explique porque hay una diferencia tan grande entre los
puntos isoeléctricos de ambas.
18.- El Ac. Tricloroacético, el Ac. Sulfosalicílico y el Ac. Fosfotúngstico tienen la propiedad de precipitar
proteínas. Cuál es el mecanismo fisicoquímico que ocurre en esta precipitación.
19.- Especifique cual es el efecto del plomo sobre las propiedades electroquímicas de las proteínas de la
sangre.
20.- Determine el efecto del litio cuando se encuentra en altas concentraciones sobre las proteínas de las
células nerviosas.

BIBLIOGRAFÍA CONSULTADA:
Koolman J., Röhm C.H. Bioquímica: Texto y atlas. Madrid, España: Panamericana, 2004.
Müller - Esterl W. Bioquímica: Fundamentos para medicina y ciencias de la vida. Barcelona, España:
Reverté, 2008.
Peña A., Arroyo A., Gómez A., Tapia R. Bioquímica. México: Limusa, 2004.
Voet D., Voet G. Bioquímica. Madrid, España: Panamericana, 2006
Clark J. Experimental Biochemistry. USA: W. H. Freeman and Company, 1964

PRÁCTICA # 3
ANÁLISIS ENZIMÁTICO CUALITATIVO
OBJETIVO:
Al término de esta práctica, el alumno será capaz de definir el efecto fisicoquímico que generan las enzimas
sobre diferentes sustratos. Indicando además, las propiedades químicas que permiten que una enzima
catalice la modificación de un sustrato.
PRERREQUISITOS:
1. Definición de enzima, substrato, apoenzima, holoenzima, proenzima, zimógeno, coenzima, cofactor.

2. Determine lo que significa: especifidad enzimática y alosterismo.
3. Defina el efecto de una hidrolasa, oxidoreductasa, transferasa, liasa, ligasa e isomerasa.
INTRODUCCIÓN:
Las enzimas son biocatalizadores que aceleran las reacciones químicas. De igual manera,
participan en muchos mecanismos de regulación que de este modo permiten que el metabolismo se adapte
a diferentes situaciones. Casi todas las enzimas son proteínas pero también hay ácidos nucleicos
catalíticamente activos conocidos como “ribozimas” (Koolman & Röhm, 2004).
Las enzimas están formadas por una parte proteica o apoenzima inactiva. La unión de un cofactor o grupo
prostético de forma covalente a la apoproteina da lugar a lo que denominamos holoenzimas, que ya
presenta actividad catalítica (enzima activa). Los cofactores son moléculas pequeñas de naturaleza
orgánica o inorgánica que requieren las enzimas para poder presentar actividad. Los cofactores
inorgánicos pueden estar constituidos por uno o varios iones, como hierro, magnesio, zinc, cobre,
manganeso, entre otros; o bien, por un complejo orgánico o metaloorgánico, en cuyo caso reciben el
nombre de coenzima (Teijón, et al., 2006).
Las enzimas modifican la velocidad de una reacción química sin afectar el equilibrio final y sólo se requieren
pequeñas cantidades para efectuar la transformación de un gran número de moléculas de sustrato. La
actividad de la mayor parte de las enzimas es bastante específica tanto para el tipo de acción catalizada
como por los compuestos o sustratos cuya modificación catalizan (Especificidad de sustrato), así mismo
las enzimas funcionan solo bajo condiciones muy definidas de pH, temperatura, concentración de sustrato,
coenzimas etc. (Teijón, et al., 2006; Koolman & Röhm, 2004).
Clasificación de las enzimas
En la actualidad hay un gran número de enzimas (más de 2000), para su clasificación se usa un sistema
que toma en cuenta tanto la especifidad de acción como la especificidad del sustrato. La International
Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB) ha establecido un sistema en donde las enzimas se
clasifican en 6 grupos de acuerdo con el tipo de reacción que catalicen (Figura 1): Oxidoreductasas,
Transferasas, Hidrolasas, Liasas, Isomerasas, Ligasas o Sintetasas (Teijón, et al., 2006; Voet & Voet,
2006; Koolman & Röhm, 2004).

En el catálogo de enzimas, cada una de ellas está indicada por un número EC (Enzyme Comission
Numbers) de varias cifras, donde el primer número indica que la enzima corresponde a una de las seis
clases principales de enzimas, los dos números siguientes definen la subclase y la sub-subclase y el último
número es el número progresivo dentro de la sub-subclase (Teijón, et al., 2006; Koolman & Röhm, 2004).
Por ejemplo, en el caso de la enzima tripeptido aminopeptidasa tiene el código EC 3.4.11.4, construido
así:
3 por hidrolasa (enzima que usa el agua para catalizar algunas reacciones).
3.4 por hidrolasa, que actúa sobre los enlaces peptídicos.
3.4.11 por aquellas que actúan sobre el terminal amino de aminoácido de un polipéptido.
3.4.11.4 por aquellas que actúan sobre el terminal amino final de un tripéptido.
Figura 1.- Esquema de las clases de enzimas

MATERIAL:
Tubos de ensaye
Pipetas de 1.0 ml
Pipetas de 5.0 ml
Propipetas
Gradillas
Tapones de algodón
EQUIPO:
Platina caliente
Incubadora 37°C
REACTIVOS:
Semilla vegetal (semilla de sandía u otra que contenga ureasa)
Urea al 2%
Solución de Azul de bromotimol – NaOH
Leche
Oxalato de amonio 2%
Solucion de Renina
Cloruro de calcio 10%
PROCEDIMIENTO:
Experimento No. 1 Efecto del calor sobre la actividad de las enzimas "Actividad de la ureasa”.
Tubo 1 2 3
Semilla Vegetal pizca pizca pizca
Agua destilada 0 5.0 ml 5.0 ml
Mezclar para tratar de homogenizar el polvo de sandía y enseguida coloque un tapón de algodón a los
tubos 1 y 2 y colóquelos en baño a ebullición durante 20 minutos. (Cuidar que no se acabe el agua del
baño).
Agua 5.0 ml 0 0
Azul de 2 Gotas 2 Gotas 2 Gotas
Bromotimol
Añadir ácido débil (GOTAS) en caso de que la solución tenga un color azul.
Urea 5.0 ml 5.0 ml 5.0 ml
Mezclar y tomar el tiempo que transcurre hasta alcanzar el vire del color amarillo al azul en cada uno de
los tubos.

Experimento No. 2 Determinación de actividad de la Renina.
Tubo 1 2 3
Leche 3.0 ml 3.0 ml 3.0 ml
Oxalato de
0 0.5 ml 0.5 ml
Amonio
Solución renina 3 Gotas 3 Gotas 3 Gotas
Mezclar e incubar a 37°C durante 10 minutos y anotar los cambios observados en cada uno de los tubos.
Posteriormente, calentar el tubo No. 2 a ebullición y enfriar. Cuando ya estén fríos los tubos agregar:
Cloruro de Calcio 0 10 Gotas 10 Gotas

Mezclar y comparar los cambios observados en los tubos No 2 y 3 con el 1.
RESULTADOS:
____________________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________
DISCUSIÓN:
____________________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
CONCLUSIÓN:
____________________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
CUESTIONARIO:
1.- ¿De acuerdo a la clasificación enzimática a que clase pertenecen las enzimas utilizadas (renina y
ureasa) y por qué?
2.- Mencione 3 bacterias que contengan la enzima ureasa:
3.- ¿Qué grupos químicos participan en el sitio activo de las enzimas?
4.- Las enzimas cambian la constante de equilibrio de las reacciones que catalizan sí, no; ¿por qué?
5.- ¿Por qué algunas proteínas actúan como catalizadores (enzimas) de reacciones con alta
especificidad, mientras que otras proteínas que también contienen aminoácidos en su estructura no lo
hacen?

Koolman J., Röhm C.H. Bioquímica: Texto y atlas. Madrid, España: Panamericana, 2004.
Teijón J.M., Garrido A., Gaitán D., Villaverde C., Mendoza C., Ramírez J. Fundamentos de bioquímica
estructural. Madrid, España: Tébar. 2006

PRÁCTICA # 4
CINÉTICA ENZIMÁTICA 1: EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DEL SUSTRATO
SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
OBJETIVOS:
El alumno observará el comportamiento de la actividad enzimática de acuerdo a los parámetros de

concentración tanto del sustrato determinando los valores de:
a) Vmax (velocidad máxima de la reacción).
b) 1/2 Vmax
c) Km (constante de Michaelis).
d) [S] óptima (concentración óptima de sustrato).
PRERREQUISITOS:
1. Describir el mecanismo de acción de las enzimas en las reacciones químicas.

2. Cuál es la relación que existe entre la velocidad de una reacción catalizada y la concentración de
enzima.
3. Definir la relación entre la concentración de sustrato y la velocidad de la reacción enzimática.
4. Interpretar la cinética de Michaelis-Menten y la de Lineweaver-Burk.
INTRODUCCIÓN:
La cinética química es el estudio de la velocidad de cambio que existe entre el estado inicial de
reactantes y productos y el estado final. La velocidad es expresada en términos de cambios de
concentración de sustrato o producto por unidad de tiempo, esto se puede seguir, determinando la
desaparición de reactantes o aparición de productos en función del tiempo. Es particularmente importante
hacer notar que constantemente hay cambios en la velocidad de reacción conforme procede la reacción
hasta llegar al equilibrio, una vez alcanzado éste, los cambios de velocidad son iguales a cero (Koolman
& Röhm, 2004).
Cinética de Michaelis - Menten
En la mayoría de las reacciones enzimáticas al seguir su comportamiento cinético se pueden obtener

generalmente varios órdenes de reacción; al examinar la curva de velocidad respecto a la concentración
de sustrato, La figura 1 muestra el efecto de distintas concentraciones de sustrato sobre la velocidad inicial
de la reacción catalizada por un enzima (Müller – Esterl, 2008).

Figura 1.- Gráfica de una curva de saturación de una enzima
Si se observa la gráfica, se pueden observar tres regiones distintas donde la velocidad responde en forma
característica a los aumentos de concentración de sustrato (Müller – Esterl, 2008; Voet & Voet, 2006;
Fersht, 1980):
a) A muy bajas concentraciones de sustrato el comportamiento de velocidad con respecto a la

concentración de sustrato es esencialmente lineal, esto es, la velocidad es directamente proporcional a la
concentración de sustrato y en esta región se presenta la cinética de primer orden.
b) En la etapa final de la curva observamos que la velocidad es esencialmente independiente de la

concentración de sustrato, aquí la cinética es de orden cero.
c) Para concentraciones de sustrato intermedias la velocidad del proceso deja de ser lineal, y a esta zona
se la denomina de cinética mixta.
Este tipo de estudio cinético fue desarrollado por primera vez por Michaelis-Menten y formularon la
siguiente ecuación:
V = Vmáx [S]
Km + [S]
Donde las constantes Vmáx y Km (constante de Michaelis) son características para cada enzima bajo
ciertas condiciones.
La velocidad máxima (Vmáx) se obtiene cuando la velocidad de reacción se hace independiente de la

concentración de sustrato, cuando esto ocurre la velocidad alcanza un valor máximo. Este valor depende
de la cantidad de enzima que se tenga.
La constante de Michaelis (Km) nos indica la concentración de sustrato a la cual la velocidad de reacción
es la mitad de la velocidad máxima. Este parámetro es independiente de la concentración de enzima, y es
característico de cada enzima según el sustrato utilizado (si tiene varios). La Km también indica la afinidad
que posee la enzima por el sustrato, siendo ésta mayor, cuanto menor es la Km. Cuanto Menor sea la Km
menor será la cantidad de sustrato necesaria para alcanzar la mitad de la velocidad máxima, por lo que

mayor será la afinidad del enzima hacia ese sustrato (Müller – Esterl, 2008; Voet & Voet, 2006; Fersht,
1980).
MATERIAL:
Tubos de ensaye
Gradillas
Pipetas
Propipetas
Celdas de espectrofotómetro
EQUIPO:
Espectrofotómetro de luz visible
Platina caliente
REACTIVOS:
Solución de Invertasa 0.001%
Buffer de fosfatos pH 4.7
Sacarosa 0.02M, 0.03M, 0.05M, 0.1M, 0.3M y 0.5M
Solución de 3,5 Dinitrosalicilato
PROCEDIMIENTO:
La invertasa es una enzima hidrolítica que actúa sobre sacarosa (un disacárido) liberando glucosa y
fructosa. La actividad de la enzima se detiene al añadir una solución alcalina y el poder reductor de los
productos se mide haciéndolos reaccionar con el reactivo de 3,5-dinitrosalicilato.
Preparar una serie de tubos como se muestra en la siguiente tabla:
Tubo 1 2 3 4 5 6 7
Invertasa 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
Amortiguador 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
Sacarosa 0.02 M 1.0 0 0 0 0 0 0
Sacarosa 0.03 M 0 1.0 0 0 0 0 0
Sacarosa 0.05 M 0 0 1.0 0 0 0 0
Sacarosa 0.10 M 0 0 0 1.0 0 0 0
Sacarosa 0.30 M 0 0 0 0 1.0 0 0
Sacarosa 0.5M 0 0 0 0 0 1.0 0
Agua destilada 0 0 0 0 0 0 1.0

Mezclar e incubar a 35° C durante 20 min, sacar los tubos y agregarles 1 ml de Dinitrosalicilato. Mezclar y
calentar en baño de agua a ebullición hasta que cambien de color. Enfriar y leer a 540 nm ajustando a
cero con el tubo No. 7
RESULTADOS:
1.- Graficar los valores de As vs. [S]
2.- Graficar los valores de 1/As vs. 1/[S]
3.- Determinar los valores de:
Gráfica de M - M Gráfica de L - B
Vmáx
Km
½ Vmáx
[S] óptimo
DISCUSIÓN:
____________________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
CONCLUSIÓN:
____________________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
CUESTIONARIO:
1.- La velocidad inicial de una reacción enzimática es dependiente exclusivamente de la cantidad de

sustrato presente, si, no, ¿por qué?
2.- ¿Cuál es la diferencia entre los cambios de energía libre que existen entre un proceso catalizado por
una enzima y el mismo proceso no catalizado.?
3.- ¿Por qué a concentraciones de sustrato mucho mayores que el valor de la Km la velocidad de la
reacción es independiente de la concentración de sustrato?
4.- La Km de una enzima varía con la concentración de enzima, si, no, ¿por qué?

Fersht A. Serie de Biología Fundamental: Estructura y mecanismo de los enzimas. Barcelona, España:
Reverté. 1980
Koolman J., Röhm C.H. Bioquímica: Texto y atlas. Madrid, España: Panamericana, 2004
Müller - Esterl W. Bioquímica: Fundamentos para medicina y ciencias de la vida. Barcelona, España:
Reverté, 2008

PRÁCTICA # 5
CINÉTICA ENZIMÁTICA 2: EFECTO DEL PH Y TEMPERATURA
OBJETIVOS:
El alumno analizará el efecto del pH y de la temperatura sobre la actividad enzimática en una reacción.
Basado en:
a. Discutirá el efecto sobre el comportamiento catalítico de una enzima al variar el pH de la mezcla de
reacción.
b. Discutirá los cambios que se presentan en la cinética enzimática al variar la temperatura de reacción.
c. Determinará las condiciones óptimas de reacción en función de estos dos factores (pH, temperatura).
PRERREQUISITOS:
1. Describir el efecto del pH sobre la estabilidad y actividad de una enzima.

2. Describir el efecto de la temperatura sobre la estabilidad y actividad de una enzima.
3. Describir el sitio activo y sitio de enlace de una enzima.
4. Describir los agentes desnaturalizantes y su mecanismo de acción sobre una enzima.
5. Explicar los conceptos de pH y temperatura óptimos de una enzima en una reacción catalizada.
INTRODUCCIÓN:
Efecto del pH sobre la actividad enzimática
Es lógico pensar que el pH de una solución influye sobre la velocidad de una reacción catalizada por
enzimas. El sitio activo y el sitio de enlace de una enzima generalmente están compuestos por grupos
ionizables que deben presentarse con una forma iónica apropiada o específica, de tal manera, que se
pueda mantener la conformación adecuada de estos sitios en la enzima y pueda llevarse a cabo la unión
del sustrato y su transformación hacia productos.
La curva actividad-pH puede ser diferente para cada tipo de enzima (Figura 1). En el caso más general la
curva tiene forma de campana. El valor de pH al cual la actividad es máxima se denomina pH óptimo; dicho
pH no tiene por qué coincidir con el pH intracelular. La relación entre el pH y la actividad depende del
comportamiento ácido-base de la enzima y del propio sustrato. Sustrato y enzima (centro activo) pueden
contener grupos funcionales ácidos y básicos, siendo su grado de disociación dependiente del pH, lo que
Determinará, entre otros aspectos, la conformación de la proteína, la capacidad de unión del sustrato al
centro activo del enzima (Km) y la capacidad de transformación del sustrato (kcat). Los estudios cinéticos
a diferentes valores de pH nos proporcionan información sobre el mecanismo catalítico de las enzimas y
la naturaleza de los aminoácidos más directamente implicados en la catálisis (Tena & Jorrín, 2005).

Figura 1.- Efecto del pH sobre la actividad de diferentes enzimas
Igualmente puede existir un sustrato con grupos ionizables y debe contener una forma iónica específica
para que pueda unirse a la enzima y posteriormente se realice la catálisis. Los efectos de pH sobre la
estabilidad de una enzima se deben tomar en cuenta en cualquier estudio de efecto de pH sobre la catálisis
de sustrato.
Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática
Otro de los factores que afectan la velocidad de una reacción es la temperatura, de tal suerte que un
incremento de temperatura proporciona mayor energía cinética a las moléculas reactantes, dando como
resultado choques más productivos por unidad de tiempo. La actividad catalítica de las enzimas resulta de
una estructura altamente ordenada. Si la molécula absorbe mucha energía, la estructura se rompe y la
enzima se desnaturaliza y por lo tanto pierde su actividad catalítica.
Figura 2.- Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática
Si se grafica velocidad vs. Temperatura se obtiene una curva en forma de campana, en el cual el pico se
conoce como temperatura óptima (Figura 2). La estabilidad a la temperatura, de una enzima depende del
pH, fuerza iónica del medio, así como de la presencia o ausencia de metales. La mayoría de los sustratos
ejercen un efecto de protección a la enzima contra la desnaturalización por temperatura. Las enzimas de
bajo PM compuestas de cadenas sencillas y que poseen enlaces disulfuro son más estables al calor que

las de alto PM. Las enzimas obtenidas de un extracto crudo libre de células son más estables al calor por
la alta concentración de otras proteínas (efecto protector) (Tena & Jorrín, 2005).
MATERIAL:
Tubos de ensaye
Gradillas
Pipetas
Propipetas
Celdas para espectrofotómetro
EQUIPO:

Platina caliente
REACTIVOS:
Solución de Invertasa 0.001%

Buffer de citratos pH: 2.5, 3.5, 4.5, 5.5, 6.5, 7.5
Sacarosa 0.03M
3,5 Dinitrosalicilato
PROCEDIMIENTO:
Experimento No. 1 Efecto del pH
Tubo 1 2 3 4 5 6 7
Sacarosa 0.3 M 1.0 ml 1.0 ml 1.0 ml 1.0 ml 1.0 ml 1.0 ml 0
Amortiguador pH = 2.5 0.5 ml 0 0 0 0 0 0
Amortiguador pH = 3.5 0 0.5 ml 0 0 0 0 0
Amortiguador pH = 4.5 0 0 0.5 ml 0 0 0 0
Amortiguador pH = 5.5 0 0 0 0.5 ml 0 0 0
Amortiguador pH = 6.5 0 0 0 0 0.5 ml 0 0
Amortiguador pH = 7.5 0 0 0 0 0 0.5 ml 0
Invertasa 1.0 ml 1.0 ml 1.0 ml 1.0 ml 1.0 ml 1.0 ml 1.0 ml
Agua 0 0 0 0 0 0 1.5 ml

Mezclar e incubar a 35°C durante 20 min. Posteriormente agregar 1 ml de Dinitrosalicilato a cada uno de
los tubos. Mezclar y calentar en baño de agua a ebullición hasta cambio de color. Enfriar y leer a 540 nm
ajustando a cero con el tubo No. 7
Experimento No. 2 Efecto de la Temperatura (Clark J, 1964)
Tubo 1 2 3 4 5 6 7
Sacarosa 0.3 M 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 0
Amortiguaor pH = 4.7 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
Invertasa 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
Agua 0 0 0 0 0 0 1.0
Temperatura °C 4 26 37 45 60 100 25
Mezclar e incubar 20 minutos a la temperatura indicada.
Agregar 1 mL de Dinitrosalicilato a todos los tubos.
Mezclar y calentar en baño de agua a ebullición hasta cambio de color. Enfriar y leer a 540 nm ajustando
a cero con el tubo No. 7
RESULTADOS:
1.- Grafique los resultados obtenidos de velocidad vs pH.
2.- Grafique los resultados obtenidos de velocidad vs temperatura.
3.- Indique cuales son los valores de pH y temperatura óptimos obtenidos.
DISCUSIÓN:
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____________________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
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CONCLUSIÓN:
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____________________________________________________________________________________
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CUESTIONARIO:
1.- La pepsina presenta su máxima actividad a un pH » 1. Mencione cuáles podrían ser los grupos
funcionales presentes en el sitio activo y sobre cuales residuos de aminoácidos rompe los enlaces
peptídicos.
2.- Si la concentración de sustrato en una reacción enzimática es igual a un 1/3 de Km. Cuál será la
velocidad inicial de la reacción.
3.- De acuerdo a la clasificación de las enzimas a que clase pertenece una enzima que participa en la
conversión de un azúcar de tipo aldosa a un azúcar de tipo cetosa.
4.- En esta práctica se ha observado cómo influye el pH en la actividad de invertasa, a una concentración
de sacarosa dada. La estaquiosa es un tetrasacárido y es un sustrato para esta enzima y se ha observado
que es hidrolizado a una velocidad igual al 5% de la sacarosa, bajo las mismas condiciones de
concentración y pH. Cómo explicaría esta velocidad máxima tan baja en relación al pH de la reacción. ( a-
Gal-a-Gal-a-Glu-ß-Fru ).
5.- Cuando las soluciones enzimáticas son calentadas, hay una pérdida progresiva de la actividad catalítica
con el tiempo. Así, una solución de hexocinasa incubada a 45°C durante 12 minutos pierde el 50% de su
actividad; pero cuando la hexocinasa se incuba a 45°C, en presencia de altas concentraciones de glucosa
durante el mismo tiempo, solamente se pierde un 3% de su actividad. Explique el porqué de la variación
desnaturalizante de la hexocinasa por efecto de la temperatura en ausencia y presencia del sustrato.
BIBLIOGRAFIA CONSULTADA:
Tena M., Jorrín J. Estudio cinético de la actividad invertasa de levadura de panadería. Universidad de
Córdova, 2005.

PRÁCTICA # 6
DETERMINACIÓN DE UREA Y CREATININA SÉRICA
OBJETIVO:
Al finalizar esta práctica, el alumno deberá tener los fundamentos para poder interpretar desde el
punto de vista clínico, los resultados obtenidos de la cuantificación de urea y creatinina de una muestra de
suero de un paciente.
PRERREQUISITOS:
1.- Describir los puntos principales del ciclo de la urea.

2.- Describir los mecanismos de producción de la creatinina.
3.- Identificar los principales tejidos productores de urea y creatinina.
4.- Interpretación de aumento y disminuciones de los analitos anteriormente analizados.
INTRODUCCION:
UREA
La urea es el principal producto de excreción, proveniente del catabolismo de las proteínas, el cual
se origina a partir de los grupos amino de los aminoácidos. Esta vía, es el principal medio de excreción de
nitrógeno por el organismo. La urea es sintetizada en el hígado por medio del ciclo de la urea, donde
intervienen los aminoácidos ornitina y arginina, cuya función fundamental es convertir el amoniáco y el
bióxido de carbono en urea (Figura 1).
Figura 1.- Ciclo de la Urea

El contenido de urea se puede expresar ya sea como concentración de urea o como concentración de
nitrógeno ureico (BUN). Para convertir un valor de BUN a su equivalente en urea, debe de multiplicarse
por 2.14, factor resultante de la relación de pesos moleculares de la urea entre el nitrógeno que contiene.
La urea se elimina por el riñón mediante un mecanismo pasivo de filtración a nivel glomerular. Debido a la
gran solubilidad de la urea esta filtración es importante, siendo iguales las concentraciones de urea en el
filtrado glomerular y en el plasma. Sin embargo, no toda la urea filtrada a nivel glomerular es eliminada con
la orina, solamente un 30 a 60% es eliminada, el resto es reabsorbida a nivel tubular (Portillo, et al., 1997).
Los niveles plasmáticos de urea dependen principalmente de cuatro factores: la dieta, el metabolismo
proteico, la función renal y la función hepática, órgano en el que se lleva a cabo la síntesis de urea.
El término de azoemia es aplicado a cualquier aumento significativo de la concentración plasmática de

compuestos nitrogenados no proteicos, principalmente urea y creatinina. Tradicionalmente la azoemia se
clasifica como prerrenal, intrarrenal o renal y postrenal.
CREATININA
La creatina se forma a partir de la síntesis de arginina y glicina, esto se lleva a cabo en el riñón, hígado y
páncreas. La creatina es transportada por el torrente sanguíneo hacia musculo y cerebro donde es
fosforilada a fosfocreatina (PCr). Alguna creatina y fosfocreatina libre en musculo es convertida a creatinina
la cual se difunde en la sangre y después es excretada por los riñones (Figura 2). La cantidad que se
produzca de está, es proporcional a la masa muscular de cada individuo. En ausencia de una enfermedad
renal, el rango de excreción en un individuo debe de ser constante. Debido a que los riñones son los
responsables de eliminar la creatinina de la sangre, el medir los niveles de está en suero es un muy buen
indicador de las funciones renales (Cayman chemical company, 2014).
Figura 2.- Síntesis de Creatinina
La Creatinina sufre filtración glomerular pero no se reabsorbe y su secreción tubular es mínima. La razón
más importante del aumento de este metabolito en sangre es la mala filtración glomerular. Esto se puede
valorar rápidamente con la determinación de creatinina en sangre cuando está presente en valores por
encima de los normales y combinando posteriormente estos resultados con los niveles en orina
(Aclaramiento de creatinina). El aumento de los niveles en sangre también podría indicar un gran recambio

muscular patológico porque el músculo se está “rompiendo”, o bien fisiológico si el individuo presenta una
gran masa muscular (deportistas por ejemplo). Una de las aplicaciones clínicas de emergencia más
importantes de la determinación de creatinina en sangre es la detección de la Insuficiencia Renal Aguda
que es la disminución rápida en horas o días de la función renal con caída de la filtración glomerular y en
algunos casos disminución en la producción de orina acompañada de retenciones nitrogenadas y
alteraciones hidroeléctricas y acido básicas. Durante el curso de esta enfermedad los valores de creatinina
sufren un gran aumento en un periodo corto mostrando valores que superan los 1.5 mg/dl (Perazzi, 2011).
En el laboratorio se medirá la cantidad de miligramos de creatinina que hay en un decilitro de sangre

(mg/dL). Las concentraciones de creatinina en la sangre pueden variar. Cada laboratorio tiene su escala
de referencia. En muchos laboratorios la referencia normal de creatinina es 0,6 a 1,2 mg/dL. Si la
concentración de creatinina en sangre es apenas superior a esta referencia, probablemente no se sienta
enfermo, pero el aumento es una señal de que sus riñones no están funcionando a pleno. Una fórmula
para estimar la función renal establece que 1,7 mg/dL de creatinina en el hombre, y 1,4 mg/dL en la mujer,
equivalen a 50 por ciento de función renal normal. Sin embargo, como los valores de creatinina son muy
variables y son afectados por la alimentación, deberá controlar regularmente su nivel de creatinina para
saber si su función renal decrece. El médico puede referirse a la cantidad de creatinina de su sangre con
el término "creatinina en suero". No confunda el valor de creatinina en suero con el valor de depuración de
creatinina.
MATERIAL:
Pipetas 5.0 ml
Pipetas 1.0 ml
Pipetas 0.1 ml
Propipetas
Tubos de ensaye
Agujas
Ligadura
Camisa para tubo vacutainer
Tubos vacutainers
EQUIPO:

Platina caliente

REACTIVOS:
Solución de Diacetilmonoxima (DAM)

Solución de Reactivo ácido (H2SO4 al 6% y Ac. Fosfórico del 85% al 1%)
Tungstato de sodio 10%
Ácido sulfúrico 2/3N
Solución de Acido pícrico
Hidróxido de sodio 0.75N (NaOH)
PROCEDIMIENTO:
Tomar una muestra de sangre por punción venosa (3.0 ml aproximadamente) de uno de sus compañeros,
con o sin anticoagulante, centrifugar la muestra y separe el suero o plasma según sea el caso.
Experimento No. 1 Cuantificación de urea
Reactivos Blanco Estándar Problema
Diacetilmonoxima 3 ml 3 ml 3 ml
Agua 0.05 ml ----- ------
Solución estándar ------ 0.05 ml ------
Suero o plasma ----- ----- 0.05 ml
Reactivo ácido 3 ml 3 ml 3 ml
Mezclar y calentar en baño a ebullición durante 15 minutos. Enfriar al chorro de agua y leer las
absorbancias ajustando con el blanco a cero a una longitud de onda de 520 nm.
CALCULOS:
Absorbancia del problema Concentración

Nitrógeno ureico = --------------------------------------------- X del estándar o control
Absorbancia del estándar o control que se esté usando
= [ ] mg/dl
mg
-------- Urea = Nitrógeno ureico (2.14)
dl
Experimento No. 2 Cuantificación de creatinina sérica (Reacción de Jaffé, modificado por Folin -
Wu)

REACTIVOS BLANCO ESTANDAR PROBLEMA
Agua 4.0 ml 3.5 ml 3.5 ml
Tungstato de sodio
0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml
10%
Ácido sulfúrico 2/3N 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml
Suero o plasma (ml.) ---- --- 0.5 ml
Solución estándar
--- 0.5 ml ---
(ml.)
Centrifugar los tubos donde exista turbidez (Estándar y Problema) a 2,500 rpm por 10 min
Tomar sobrenadante y realizar lo siguiente:
REACTIVOS BLANCO ESTANDAR PROBLEMA
Sobrenadante 3.0 ml 3.0 ml 3.0 ml
NaOH 0.75 N 1.0 ml 1.0 ml 1.0 ml
Ácido Pícrico 1.0 ml 1.0 ml 1.0 ml
Reposar por 15 min a temperatura ambiente y leer absorbancia a 490 nm del tubo patrón y problema,
ajustando a cero de absorbancia con el tubo blanco.
CALCULOS
mg Absorbancia del problema Concentración del estándar

-------- Creatinina = ---------------------------------------------------- X o control que se esté usando
dl Absorbancia del estándar o control
Valores de referencia:
Nitrógeno ureico: 10 – 18 mg/dl

Urea: 22 – 40 mg/dl
Creatinina:
Hombres 0.7 a 1.2 mg/dl
Mujeres 0.5 a 1.0 mg/dl

RESULTADOS:
____________________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
DISCUSIÓN:
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____________________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
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CUESTIONARIO:
1. ¿En qué consiste la Azoemia prerrenal, intrarrenal y postrenal?

2. Mencione otras circunstancias por las cuales puede aumentar o disminuir la urea en sangre
3. Mencione otras causas por las cuales puede aumentar o disminuir el valor normal de creatinina
en sangre.
4. ¿Qué es y en qué consiste el método de depuración de creatinina?
BIBLIOGRAFÍA:
Díaz J., Fernandez del Barrio M.T., Paredes F. Aspectos básicos de bioquímica clínica. Madrid: Días de
santos, 1997.
Fundación norteamericana de riñón y urología www.kidneyurology.org Fecha de consulta 12 de enero

2015

PRÁCTICA # 7
EXTRACCIÓN DE GLUCÓGENO Y REACCIONES DE IDENTIFICACIÓN DE

CARBOHIDRATOS
OBJETIVOS:
a) Desarrollar una técnica de extracción de glucógeno a partir de tejido hepático de conejo o rata y
determinar la calidad del glucógeno obtenido por medio de reacciones cualitativas de caracterización.
b) Conocer las técnicas de análisis cualitativo que permiten identificar carbohidratos y su utilización como
herramienta de trabajo en ciertos experimentos.
PREREQUISITOS:
1. Identificar la composición del glucógeno y sus diferencias estructurales y funcionales con el almidón.
2. Diferenciar los efectos sobre el metabolismo del glucógeno de las siguientes hormonas: Insulina,
Glucagón y Adrenalina
3. Identificar las características de por lo menos tres enfermedades por almacenamiento de glucógeno.
4. Definir el término carbohidrato.
5. Diferenciar los tipos de carbohidratos y mencionar ejemplos.
6. Identificar las propiedades químicas de los carbohidratos.
INTRODUCCIÓN:
Los hidratos de carbono o sacáridos son componentes esenciales de los organismos vivos y
constituyen la clase más abundante de moléculas biológicas. El nombre carbohidrato, que significa “hidrato
de carbono” surge de su composición química, que es aproximadamente (C – H2O)n en la que n≥ 3. Las
unidades básicas de los hidratos de carbono se conocen como monosacáridos.
Los carbohidratos son derivados aldehídicos o cetónicos de alcoholes superiores polivalentes (más de un
OH). Se clasifican en base al número de moléculas que los componen. Monosacáridos (azúcares simples)
no se pueden hidrolizar en moléculas más sencillas, pueden subdividirse en triosas, tetrosas, pentosas,
hexosas etc. (Figura 1). según el número de átomos de carbono que tengan. Los oligosacáridos presentan
algunas unidades de monosacáridos ligadas de forma covalente, se encuentran unidos a proteínas
(glucoproteínas) y lípidos (glucolipidos). Los polisacáridos presentan en muchas unidades de
monosacáridos ligadas de forma covalente y poseen funciones estructurales indispensables en todos los
tipos de organismos (celulosa, almidón, glucógeno, entre otros) (Voet & Voet, 2006; Melo & Cuamatzi,
2007).

Figura 3.- Estructura de carbohidratos simples. De izquierda a derecha: triosa, tetrosa, pentosa y hexosa.
Los monosacáridos se clasifican según la naturaleza química de su grupo carbonilo y el número de sus
átomos de C. Si el grupo carbonilo es un aldehído, como en la glucosa, el azúcar es una aldosa. Si el
grupo carbonilo es una cetosa, como la fructosa, el azúcar es una cetosa (Figura 2).
Figura 4.- Diferencia entre una aldosa y una cetosa
Los monosacáridos se unen entre sí a través de un enlace glucosídico. En este proceso de condensación
de dos moléculas de monosacáridos, se elimina una molécula de agua (Figura 3).
Figura 5.- Formación de un enlace glucosídico

Existen diferentes tipos de pruebas para determinar el tipo de carbohidrato que hay en alguna muestra:
 Carbohidratos en general (Prueba de Molish)

 Cetosas (prueba de Seliwanoff)
 Azucares con capacidad reductora (Prueba de Fehling)
 Oligosacáridos y Polisacáridos (Prueba de Yodo-Lugol)
MATERIAL:
Tubos de ensaye
Mortero con pistilo
Pipetas de 1, 5 y 10 ml
Propipetas
Vasos de precipitados
Gradilla.
Vidrio de reloj
Probeta de 100 ml.
EQUIPO:
Balanza granataria
Platina caliente
REACTIVOS:
Ácido tricloroacético (TCA) 10%

Alcohol etílico 96%
Solución de Yodo - Lugol
Solución de Molish
Reactivo de Fehling A
Reactivo de Fehling B
Reactivo de Selliwanoff
Carbohidratos al 1%
Ácido sulfúrico (H2SO4) concentrado
PROCEDIMIENTO:
Experimento No. 1 Extracción de Glucógeno
1. Pese 5g de tejido hepático y cortarlo en trozos pequeños (utilizar el vidrio de reloj).

2. Coloque los trozos en un mortero frío al cual se le añade TCA al 10 % en proporción de 1.0 ml por cada
gramo de tejido y una pizca de arena lavada.
3. Centrifugue 10 min. a 2500 r.p.m.
4. Recupere todo el sobrenadante en una probeta de 100 ml y medir el volumen.

5. Añada 2 volúmenes de alcohol al 96 % por volumen de sobrenadante agitando lentamente hasta que el
glucógeno flocule.
6. Vacíe en tubos de ensaye limpios de igual tamaño y centrifugue a 2 500 r.p.m. 10 min.
7. Deseche el sobrenadante y resuspender el precipitado en 5.0 ml. de agua destilada.
8. Utilice la suspensión de glucógeno como muestra problema, desarrolle las técnicas de Fehling, Molish,
Selliwanoff y Yodo – Lugol al mismo tiempo que los carbohidratos proveídos por el profesor.
EXPERIMENTO # 2 REACCIÓN DE FEHLING (IDENTIFICACIÓN DE COMPUESTOS REDUCTORES)
Esta reacción nos identifica carbohidratos con capacidad reductora, se basa en que algunos azúcares en
un medio fuertemente alcalino y en presencia de oxígeno o de diversos agentes oxidantes ej. Cu, Ag dan
las reacciones de reducción que dependen de la existencia de un grupo carbonilo libre como en la glucosa,
galactosa, fructosa, maltosa y lactosa. Si la prueba se efectúa con una solución que contenga cloroformo
como conservador, puede obtenerse un resultado positivo, sin que exista azúcar, las sales de amonio
también interfieren en la reacción. Si la solución problema es ácida debe neutralizarse antes de efectuar
la prueba.
Fundamento: si calentamos una solución de Cu(OH)2 en un medio alcalino formamos oxido cúprico (negro)
CuO y en presencia de sustancias reductoras se precipita como oxido cuproso Cu 2O de color café rojizo
pardo. (Pileggi & Szustkiewicz, 1974)
Solución A contiene sulfato de cobre.

Solución B contiene tartrato de sodio y potasio e Hidróxido de potasio.
METODO:
A 1.0 ml de muestra (carbohidratos señalados y glucógeno), agregar 0.5 ml de solución de Fehling A y 0.5
ml de solución de Fehling B, mezclar y calentar a baño a ebullición por 5 min, la presencia del color rojo
indicará positivo
EXPERIMENTO # 3 REACCIÓN DE MOLISH-UDRANSKY.(Clark J.,1964; Plummer D.,1981)
Esta prueba es positiva con aldehídos y algunos ácidos como el fórmico, oxálico, láctico, cítrico, etc. Esta
reacción es muy sensible, dicha sensibilidad para la glucosa es de hasta 0.001% y para sacarosa de
0.0001%.
METODO:
A 1.0 ml de muestra (carbohidratos señalados y glucógeno), agregar 3 gotas de Reactivo de Molish
Mezclar y añadir 0.5 ml de ácido sulfúrico concentrado (resbalando por la pared del tubo) NO mezclar.
La aparición en la interfase de un anillo violáceo es indicativa de que la prueba resultó positiva.
EXPERIMENTO # 4 REACCIÓN DE SELLIWANOFF (Clark J., 1964; Plummer D., 1981)
Está reacción permite diferenciar Aldosas de Cetosas. Anote el tiempo en el cual aparece el color en cada
uno de los tubos. Una reacción positiva está dada por la aparición de un color rojo. Es utilizada para
diferenciar Cetosas de Aldosas (Reacción de Seliwanoff)

METODO:
A 1.0 ml de muestra (carbohidratos señalados y glucógeno), agregar 5.0 ml del reactivo de Selliwanoff
Mezclar y calentar en baño de ebullición durante 1 minuto, anote el resultado.
Las Cetosas dan un color rojo y las aldosas dan la prueba débil y lentamente.
EXPERIMENTO # 4 REACCIÓN DE YODO – LUGOL
Esta reacción identifica los polisacáridos como Amilosa, Amilopectina, Glucógeno, Almidón formando un
complejo adsortivo (nube electrónica) (Van Holde Mathus, 2002) entre el Iodo y las cadenas helicoidales
del polisacárido (enlaces alfa 1,4 glucosídicos y enlaces alfa 1,6 glucosídicos de entre 8 a 12 residuos de
glucosas).
METODO:
A 1.0 ml de muestra (carbohidratos señalados y glucógeno), agregar 3 gotas del reactivo de Yodo – Lugol
(Plummer D.,1981; Martin-Sánchez et al.,2013), mezclar y si es necesario calentar solo por 2 segundos en
baño de ebullición.
La aparición de los colores azul violeta, café y negro indican la presencia de oligosacárido y/o polisacárido
según sea el caso.
RESULTADOS:
MUESTRA FEHLING LUGOL MOLISH SELLIWANOFF
Glucógeno
Glucosa
Sacarosa
Fructuosa
Galactosa
Amilosa
Amilopectina
Almidón
Lactosa
DISCUSIONES:
____________________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________

CONCLUSIONES:
____________________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
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________________________________________________________________________________
CUESTIONARIO:
1. Mencione las diferencias en las propiedades químicas de los monosacáridos con los aminoácidos y los
lípidos.
2. Mencione 3 funciones fundamentales de los carbohidratos en la célula, ejemplificando en cada caso.
3. Mencione 2 homopolisacaridos y 3 heteropolisacaridos y su composición, indicando también los tipos

de enlaces que presentan.
4. Defina y ejemplifique con carbohidratos los siguientes conceptos: Isomería óptica, Anomerismo,
Epimerismo.
5. Explique el mecanismo de acción de los segundos mensajeros en la regulación hormonal y enzimática

del metabolismo del glucógeno.
6. Describa las implicaciones bioquímicas que se presentan en la enfermedad de Von Gierke
7. Describa dos eventos bajo los cuales se puede activar la vía de la glucogenolisis.
BIBLIOGRAFÍA
Melo V., Cuamatzi O. Bioquímica de los procesos metabólicos. Barcelona: Reverté, 2007
Pileggi V., Szustrkiewicz C. Clinical Chemistry Principles and Technics. USA: Harper and Row, 1974
Mathus C. Van Holde K Ahern K. Bioquímica. España: Pearson Addison Wesley, 2002
Martin – Sánchez M., Martin – Sánchez T., Pinto G. Reactivo de Lugol: Historia de su Descubrimiento y
Aplicaciones Didácticas. Educ. Quím. 24 (1). 2013. [Enero 30,2015]
Plummer D. Bioquímica Práctica. Bogotá Colombia: McGraw Hill, 1981

PRÁCTICA #. 8
CUANTIFICACIÓN DE COLESTEROL SÉRICO
OBJETIVO:
Determinar la concentración de colesterol sérico y analizar las implicaciones clínicas de niveles anormales
de colesterol.
PRERREQUISITOS:
1. Estructura, función y tipos de colesterol

2. Relación metabólica entre el colesterol y las lipoproteínas
3. Análisis de la digestión del colesterol esterificada y no esterificado
4. Relación de las Lipoproteínas plasmáticas con la Aterogénesis.
INTRODUCCIÓN:
El colesterol es uno de los lípidos que se encuentran en mayor concentración en la sangre, se

puede afirmar que la fracción lipídica del colesterol, es la segunda en cuanto a concentración y ésta se
localiza principalmente formando parte de las lipoproteínas. Químicamente el colesterol es un compuesto
cíclico con estructura básica de perhidrofenantreno con un total de 27 carbones, un radical OH en el
carbono 3 y un doble enlace entre los carbonos 5 y 6 (Devlin, 2006) (figura 1).
Figura 1.- Estructura del colesterol
El colesterol es un lípido muy poco soluble en agua (0.2 mg/100 ml). La concentración de colesterol en el
plasma de individuos sanos es de 150 a 200 mg/100 ml, lo que constituye una concentración doble de la
concentración normal de glucosa sanguínea. El colesterol existe en dos formas: como colesterol libre en
muy pequeñas cantidades y como colesterol esterificado mediante la unión de un ácido graso no saturado
de cadena media al carbono 3. Este tipo de colesterol es el más frecuente tanto en sangre como en tejidos
(Devlin, 2006).
La mayor parte de colesterol que existe en el organismo es sintetizado en el hígado, esto implica que el
colesterol exógeno tenga menor importancia metabólica. La síntesis de colesterol endógeno es activada
en primera instancia ante el excedente de Acetil-S-CoA que haya en el hepatocito, ya que éste funciona
como metabolito precursor y en segunda instancia ante la presencia de efectores hipercolesterolémicos
que aumentan la síntesis de colesterol o bien disminuyen el catabolismo del colesterol ya formado.

Determinación de colesterol total
Existen dos métodos para la determinación del colesterol: los químicos y los enzimáticos. Los primeros se
basan en la clásica reacción de Lieberman – Burchard y posterior medición colorimétrica. Estos métodos
han quedado obsoletos y abandonados por su imprecisión, inexactitud, complejidad y frecuentes
interferencias analíticas.
Los métodos enzimáticos se basan en el empleo de la enzima colesterol esterasa que hidroliza los esteres
de colesterol, y el colesterol libre es el substrato de la enzima colesterol oxidasa, que oxida
específicamente al colesterol según la siguiente reacción;
Colesterol Colestona + H2O2
Determinándose a continuación el agua oxigenada liberada mediante unas reacciones enzimáticas

auxiliares. Entre ellas las más difundidas son las que emplean la enzima peroxidasa y el sistema
cromogénico fenol – antipirina. La mayoría de los métodos enzimáticos incorporan todas las enzimas en
un solo reactivo, facilitándose su utilización y automatización en el laboratorio (Díaz, et al., 1997).
MATERIAL:
Tubos de ensaye
Gradilla
Micropipeta de 25 microlitros
Puntas para micropipeta
Agujas
Tubos Vacutainer
Ligadura
Pipeta de 5 ml
Propipetas
EQUIPO:
REACTIVOS:
Reactivo de colesterol
Estándar de colesterol
PROCEDIMIENTO:
Preparar una serie de tubos acorde a la siguiente tabla:
REACTIVOS BLANCO ESTÁNDAR COLESTEROL

Suero ---- ----- 0.025ml
Solución estándar ---- 0.025ml ----
Agua destilada 0.025ml ---- ----
Reactivo de Colesterol 2.5ml 2.5ml 2.5ml

Mezclar y dejar que se lleve a cabo la reacción durante 20 minutos a temperatura ambiente. Leer la
absorbancia del problema y el patrón ajustando a cero con el tubo blanco a una longitud de onda de 640nm.
CALCULOS:
mg Absorbancia del problema Concentración del estándar

-------- Colesterol total = ---------------------------------------------------- X o control que se esté usando
dl Absorbancia del estándar o control
Valores de referencia:
Hasta 29 años: 120 – 215 mg/dl

30 39 años: 135 – 240 mg/dl
40 – 49 años: 140 – 280 mg/dl
50 – 59 años: 145 – 295 mg/dl
RESULTADOS:
____________________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
DISCUSIÓN:
____________________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
CONCLUSIÓN:
____________________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
CUESTIONARIO:
1. ¿Qué tipos de colesterol hay?

2. Mencione algunas enfermedades relacionadas con los niveles altos de colesterol
3. ¿Cómo regula el colesterol su propia síntesis?
4. Resuma los acontecimientos químicos de la biosíntesis de colesterol
BIBLIOGRAFÍA:
Devlin T.M., Bioquímica: texto con aplicaciones clínicas. España: Reverté, 2006
Díaz J., Fernández T., Salido F. Aspectos básicos de bioquímica clínica. Madrid, España: Días de Santos,
1997

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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE CIUDAD JUÁREZ

INSTITUTO DE CIENCIAS BIOMÉDICAS

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS QUÍMICO – BIOLÓGICAS

MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA GENERAL PARA

MEDICINA (PLAN 2014).

M. en C. Leny Judith Álvarez Araujo

M. en I. Edith Enríquez Gallosa

Docentes y Técnicos Académicos de la Academia de Bioquímica

Dra. Laura Alejandra de la Rosa Carrillo

Coordinador de la Academia de Bioquímica

Ph.D. Alejandro Martínez Martínez

Jefe del Departamento de Ciencias Químico Biológicas

Cd. Juárez Chihuahaua

Revisión Enero del 2015

Manual de Prácticas de Laboratorio de Bioquímica General 1997

Instituto de Ciencias Biomédicas

Universidad Autónoma de Ciudad Juárez

Semestre regular Enero – Mayo 20XX

Semestre regular Agosto – Noviembre 20XX

Curso de Verano Junio – Julio 20XX

HORARIO DE TEORIA ____________________

GRUPO DE LABORATORIO _________________

NUMERO Y/O NOMBRE DEL EQUIPO ______________________

Rev. Enero 2015 Page I

El individuo que se dedique a la investigación y/o a la enseñanza de la Bioquímica, debe de estar

Atentamente Comisión Elaboradora

M.C. Héctor Reyes Leal Biol. Héctor Esparza Valencia

Q.F.B. Gilberto Reyes Leal Biol. Daniel Chávez Licón

Q.F.B. Graciela Manjarrez G. Q.B.P Jorge Baylón Monárrez

Q.B.P. J. Ángel Araujo Dr. David Reyes Ruvalcaba.

Q.B.P. Oscar Barrozo

Rev. Enero 2015 Page II

1. - Al inscribirse en la materia queda automáticamente inscrito en un grupo de Laboratorio. El maestro

Rev. Enero 2015 Page III

Rev. Enero 2015 Page IV

Rev. Enero 2015 Page V

Rev. Enero 2015 Page VI

BIOSEGURIDAD Y MANEJO INTEGRAL DEL LABORATORIO DE BIOQUÍMICA

1. Diferencias entre regla, reglamento, norma y ley.

Rev. Enero 2015 Page 1

1 Básico Enseñanza básica, TMA (Técnicas Ninguno; trabajo en mesa de

2 Básico Servicios de TMA y ropa protectora; señal Trabajo en mesa al descubierto y

4 Contención Unidades Prácticas de nivel 3 más CSB de clase iii o trajes

Figura 1 Rombo de riesgos químicos

Rev. Enero 2015 Page 2

De acuerdo a la Norma Oficial Mexicana NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002, son considerados los

Tabla II Características físicas y biológicas de los residuos infecto-contagiosos

TIPO DE RESIDUO EDO. FÍSICO ENVASADO COLOR

 Manejo Integral de un Laboratorio

- Técnicas de medición de líquidos.

Rev. Enero 2015 Page 3

Exacto: es la capacidad de obtener valores o indicaciones próximas al valor verdadero de la magnitud

Preciso: es la capacidad de obtener valores o indicaciones próximas entre sí al efectuar mediciones

De acuerdo a la Escuela Colombiana de Metrología

Confiabilidad: Es cuando los resultados obtenidos son iguales a los pronosticados.

Para la medición de líquidos:

Para el pesado de sólidos:

Para la separación de líquidos y sólidos:

Para la cuantificación de líquidos y sólidos:

Mezclado de líquidos y sólidos:

Rev. Enero 2015 Page 4

a) En lo referente a bioseguridad, normas aplicables a el uso y manejo de laboratorios

Rev. Enero 2015 Page 5

Haga lo mismo para el equipo localizado en el laboratorio