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Practica:

DETERMINACION DE COLIFORMES TOTALES

I. INTRODUCCION

Los coliformes son bacilos gram negativos, no esporógenos pertenecientes a la familia


Enterobacteriaceae que fermentan la lactosa en 48 horas (son las enterobacterias
fermentadoras de la lactosa) con producción de ácido y gas en presencia de sales
biliares.

El hábitat natural de los coliformes es el tracto intestinal humano y animal, aunque


también se pueden aislar de muestras medioambientales (tierra, polvo, aguas
superficiales y vegetales). Así, su procedencia puede ser tanto fecal como no fecal.
Los coliformes son resistentes a condiciones medioambientales adversas, soportan la
desecación, pero no condiciones de congelación o refrigeración. Esta última
característica hace que su investigación en alimentos congelados no tenga ninguna
relevancia. Solamente son útiles como indicadores de la calidad en ciertos tipos de
productos terminados o indicativos de la fase de conservación y almacenamiento.

En el grupo coliforme destacan por su mayor significación sanitaria los coliformes


fecales, entendiendo como tales aquellos capaces de desarrollarse entre 44 y 46ºC
(habitualmente 44,5º o 45,5ºC) con producción de ácido y gas a partir de lactosa.

II. OBJETIVO

Detectar la presencia de coliformes en una muestra de alimento utilizando el método


de recuento en placa y método del NMP.

III. MATERIALES Y EQUIPOS

Pipetas de 1ml y 10 ml estériles


Tubos de ensayo 16x160mm.
Placas Petri estériles
Asa de siembra
Gradillas.
Placas de Agar bilis rojo violeta (V.R.B.A.)
Placas de Agar EMB
Tubos con 10 ml caldo lactosado bilis verde brillante (CLVBB) y campana Durham.
Reactivo para la prueba citocromo-oxidasa
Estufa de cultivo
IV. PROCEDIMIENTO

Método de recuento en placas

1. Realizar diluciones decimales seriadas del alimento (10-1 a 10-4).

2. Depositar 1ml de cada dilución en placas Petri estériles.

3. Verter 15ml de V.R.B.A. atemperado a 45-47ºC.

4. Mezclar cuidadosamente, dejar solidificar e incubar a 37ºC durante 24-48 horas.

5. Contar las colonias de las placas que contienen entre 20 y 200 colonias, y que
sean colonias violeta rodeadas de un precipitado rojo violeta.

6. Multiplicar por el factor de dilución y el volumen inoculado.

7. Expresar el resultado en UFC/g de alimento.


Método de recuento por NMP

1. Realizar diluciones decimales seriadas del alimento (10-1 a 10-3).


2. Preparar para cada dilución: serie de tres tubos cada una con 10ml de CLVBB y
campana Durham.
3. Adicionar 1ml de cada una de las diluciones a cada uno de los tres tubos de cada
serie:

 A tres tubos de la primera serie se adiciona 1ml de dilución 1:10.

 A tres tubos de la segunda serie se adiciona 1ml de dilución 1:100.

 A tres tubos de la tercera serie se adiciona 1ml de dilución 1:1000.

4. Incubar a 37ºC durante 24 y 48 horas.


5. Realizar lecturas a las 24 y 48 horas.
6. Anotar los tubos que muestren producción de gas en la campana de Durham (más
de 1/3 de su volumen)
7. Sembrar por estría (aislamiento) con asa de siembra los tubos positivos en agar
EMB.
8. Incubar a 35ºC durante 24-48 horas.
9. La aparición de colonias con brillo verde metálico o negras confirma la presencia
de coliformes.
10. Anotar el número de tubos confirmados (tubos positivos) en cada serie y recurrir
a la tabla del NMP donde se obtiene el recuento por gramo o mililitro de alimento.
Tabla 2. NMP

Número de tubos positivos en cada dilución


Dilución 10-1 Dilución 10-2 Dilución 10-3 NMP por gramo o mililitro

0 0 0 <3

0 0 1 3

0 1 0 3

1 0 0 4

1 0 1 7

1 1 0 7

1 1 1 11

1 2 0 11

2 0 0 9

2 0 1 14

2 1 0 15

2 1 1 20

2 2 0 21

2 2 1 28

3 0 0 23

3 0 1 39

3 0 2 64

3 1 0 43

3 1 1 70

3 2 0 90

3 2 1 150

3 2 2 210

3 3 0 200

3 3 1 500

3 3 2 1100

3 3 3 >2400

* Para calcular el NMP de diluciones mayores de las que figuran en la tabla, multiplicar el NMP por el factor
adecuado. Ejemplo: Si los tubos seleccionados corresponden a las diluciones 10-3, 10-4 y 10-5 multiplicar por 100.
V. CUESTIONARIO

1. ¿Qué otros microorganismos aparte de los Coliformes podrían producir una


prueba presuntiva positiva?
2. Explique el significado del término “grupo coliforme”. ¿Qué importancia tiene
en bacteriología de aguas? ¿Cuáles bacterias lo integran?
3. Fuera de los Coliformes, ¿Qué otras bacterias conoce usted, como indicadores
de contaminación?
4. ¿Qué importancia tiene saber el número de microorganismos en una muestra
de alimento?

VI. BIBLIOGRAFIA

1. Luna Fontalvo, Jorge. Manual de prácticas de laboratorio de Microbiología. Editorial


Unimagdalena.España.2012
2. Madigan Michael, Martinko John: Brock–Biología de los Microorganismos.10a Ed.
Editorial Prentice Hall-Iberia. España 2004

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