Cuantificación Microbiana

Métodos de cuantificación
microbiana
AGM 19-I

http://www.pumagua.unam.mx/calidad_agua_bebederos_2014.html

Diagnóstico de la calidad del agua en bebederos de CU

A partir de análisis en la calidad del agua se ha
comprobado que el agua que es suministrada en Ciudad
Universitaria cumple con lo establecido en la normatividad
mexicana (NOM-127-SSA1-1994, modificada en el 2000)
siendo apta para uso y consumo humano. En PUMAGUA nos
preocupamos para que siga siendo así por lo cual realizamos
el monitoreo semanal de la calidad del agua en los
bebederos instalados a la red de distribución, asegurando así
la calidad del agua que es suministrada.

Microbiología General AGM

 Cuantificación Microbiana

Objetivos
Comentar los principales métodos de
cuantificación o medición microbiana.

Elaboración e interpretación de diluciones en

microbiología.

Correlacionar los métodos de cuantificación.

Integrar los conocimientos adquiridos en el curso.

Aplicar en diferentes áreas el tema de

cuantificación microbiana.

Antecedentes
•Manejo de operaciones con exponentes.
•Hacer e interpretar las diluciones.
•Conceptos: soluto, disolución, dilución, solución, curva
de crecimiento, inoculación, crecimiento, colonia …..
•Características nutrimentales de los microorganismos.
•Medios de cultivo: clasificación, uso, ….
•Condiciones de crecimiento.

Características de las muestras

Puras o mixtas
Con microorganismos benéficos o nocivos.

SIN microorganismos. Ej. productos estériles

Pocos microorganismos. Ej. Agua embotellada

Muchos microorganismos benéficos. Ej. Yogurt

Muchos microorganismos, la mayoría patógenos.

Ej. Agua contaminada.

Toxinas ¿?

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CRECIMIENTO MICROBIANO
DETERMINACION DEL CRECIMIENTO MICROBIANO
Método Microorganismos Tipo de Usos / Limitaciones
para los que se recuento
utiliza
Indirecto
Turbidez La mayoría de las Total Determina la turbidez con un espectrofotómetro; rápido y reproducible; la
bacterias y suspensión debe contener más de unos l0 millones de células por ml; se
levaduras requiere una curva patrón
Numero más Cualquier Viables Utilizado para microorganismos que son difíciles de cultivar en medio
probable microorganismo sólido y para determinar contaminación por Escherichia coli en aguas;
viable requiere un cierto tiempo
Recuento en Cualquier Viables Muy sensible ,puede detectar incluso una célula; lento y tedioso; para
placa microorganismo evitar el error debido al muestreo, se debe recontar un gran número de
unicelular viable colonias
Filtración Cualquier Viables Se concentra una muestra, de manera que se puede recontar un pequeño
microorganismo número de células a partir de grandes volúmenes de un líquido o de un
viable gas
Actividad Cualquier Viables Requiere un cierto tiempo y puede ser impreciso; puede utilizarse con
metabólica microorganismo materiales complejos
viable
Peso seco Cualquier Total Tedioso y requiere un cierto tiempo, pero preciso y reproducible
microorganismo
Directo
Recuento Cualquier Total Muy útil para el recuento de un tipo de células de una mezcla; requiere un
microscópico microorganismo cierto tiempo; no es adecuado para cultivos diluidos
unicelular
Recuento Cualquier Total Muy útil para el recuento de células de un cultivo axénico; rápido y
electrónico microorganismo preciso; no debe estar presente material extraño
unicelular

Cuantificación o medición de microorganismos

Cuantificar es conocer el número de

microorganismos presentes en una
muestra.

Medidas de crecimiento
microbiano
Células viables Células totales

1. Recuento en caja 1. Conteo

microscópico: Breed
Petri (placa)
•Vertido en placa 1. Turbidimetría:
•Extensión superficial Espectrofotometro.
•Miles-Misra
2. Contadores
2. Número más Electrónicos
probable(NMP)
3. Biomasa
3. Filtración

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Medidas de crecimiento
microbiano

Recuento de
células viables

Métodos para el conteo de

microorganismos viables

•Estos métodos se basan en

poner en evidencia la
presencia de los
microorganismos vivos.
•Requieren al menos 24 horas
para el cultivo y la
interpretación de resultados.
•Se emplean medios de cultivo
generales, enriquecidos
selectivos y diferenciales
dependiendo de los
microorganismos a cuantificar.

Cuenta en medios sólidos en caja Petri

Se determina el número de
microorganismos en una
muestra en relación a las
colonias que forman, las UFC
(Unidades Formadoras de
Colonias). Se emplean
soluciones diluidas o
diluciones de una muestra
concentrada para que cada
colonia formada provenga
de un solo microorganismo
aunque algunas
agrupaciones no pueden ser
separadas por las diluciones.

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Cuenta en medios sólidos en caja Petri

Se utilizan principalmente para la cuantificación de

bacterias, levaduras y hongos filamentosos.
Se reporta como: UFC ****/unidad de volumen o
peso

Técnica de dilución y vertido en

placa: conteo de colonias

Diluciones y cuenta en placa

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Cuenta de colonias

Criterio: 25 a 200 UFC por placa

Comentarios
acerca del método
•No usar para
muestras con pocos
microorganismos.
•Las diluciones mal
hechas, el medio
de cultivo muy
caliente, la mala
homogenización,
error al contar y en
los cálculos, pueden
ser
PUNTOS CRÍTICOS

Conteo en placas

Cajas Agar Dilución No. colonias UFC/100 UFC/ml

Nutritivo (UFC) ml

1:100000 132 1.32×107 1.32×108

1:10000 706 7.06×106 7.06×107

1:1000 1200 1.2×106 1.2×107

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Recordar:
La técnica de
siembra por
agotamiento
NO sirve
para cuantificar
microorganismos.

Vaciado en placa y extendido

en placa

VARIACIONES DEL RECUENTO EN PLACA

(Extensión superficial)

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Cuantificación fúngica

Contador automático de
colonias de alta resolución

Contador de colonias automático

Se pueden contar todo tipo de colonias en cualquier

tipo de medio, no importa qué tipo de colonias se
cuenten, el instrumento está equipado con una
cámara de alta resolución que detecta colonias de
1/15 mm aproximadamente.
El medio no es un problema, con un sistema de
iluminación patentado los medios con agar
transparentes/opacos no tienen dificultad.

Recuento de colonias, realizar medidas de zonas de

inhibición de antibióticos o conectar al Plate Handler
(muestreador de placas Petri automático).

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Miles y Misra

La técnica involucra la preparación de diluciones

seriadas de una suspensión bacteriana. Las placas
son divididas en sectores separados. Se inocula cada
sector una gota empleando una Pipeta Pasteur
calibrada o bien micropipetas inoculando 0.02mL.

Miles y Misra
Las placas se incuban de 18 a 24 horas a la
temperatura adecuada (37ºC). Se toman en cuenta
los sectores donde hay menos de 20 UFC. El número
de bacterias viables se obtiene calculando la media
de cada dilución en las repeticiones realizadas.

Miles y Misra
Integración

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Método de Miles y Misra

• No se emplea
para gran
cantidad de
microorganimos
en muestras.
Ventaja
• Duplicado o
triplicado en la
misma caja.
• Muestras líquidas y
sólidas.

Petrifilm

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Petrifilm

Asa calibrada
La utilización de agujas o
asas calibradas permite
tomar volúmenes pequeños,
que son inoculados en la
superficie del agar mediante
la técnica de siembra
masiva. Las colonias son
contadas y se multiplican
por el factor de dilución del
asa empleada. El uso más
frecuente de esté método
es en el urocultivo. Se
determinan las UFC/g o mL
de muestra.

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Filtración

La membrana de
celulosa retiene a los
microorganismos en su
malla con poros de 0.25-
0.45mm. Esta membrana
se transfiere a un medio
de cultivo para el
desarrollo de colonias.

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Cuantificación mediante
Filtración a través de un filtro membrana

Filtración
USOS
Sirve para
muestras:
•líquidas sin sólidos
•Con baja
cantidad de
microorganismos

12 UFC/100 mL

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Número Más Probable (NMP)

Número Más Probable (NMP)

También llamada técnica de dilución en tubo, proporciona
una estimación estadística de la densidad microbiana
presente con base a que la probabilidad de obtener tubos
con crecimiento positivo disminuye conforme es menor el
volumen de muestra inoculado.

Análisis Microbiológico del Agua

10-19-95 NORMA Oficial Mexicana NOM-112-SSA1-1994, Bienes y servicios.

Determinación de bacterias coliformes. Técnica del número más probable.

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Medidas de crecimiento
microbiano
Células totales

1. Conteo
microscópico:
Breed

2. Turbidimetría:
Espectrofotometro.

3. Contadores
Electrónicos

4. Biomasa

Nefelometría (Turbidimetría)

La turbidez producida por el

crecimiento microbiano de
microorganismos unicelulares puede ser
medida de acuerdo a la capacidad de Longitud de onda (l)
absorber la luz. La muestras a •Bacterias 540nm
determinar son generalmente •Protozoarios 580nm
translúcidas cuando no presentan •Levaduras 600nm
crecimiento microbiano.

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Turbidez

La turbidez se determina por la densidad óptica (DO) que puede

ser expresada como Absorbancia, % de Transmitancia o
Unidades Klett (UK).

Turbidimetric

Turbidimetric measurements as indicators of bacterial growth.

The greater the turbidity the larger the population density.

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Escala de Mc Farland
Tubo Vol (mL) Vol (mL) # de celulas
H2SO4 1% BaCl 2 1% /mL
0 10 0 0
1 9.9 0.1 3x108
2 9.8 0.2 6x108
3 9.7 0.3 9x108
4 9.6 0.4 12x108
5 9.5 0.5 15x108
6 9.4 0.6 18x108
7 9.3 0.7 21x108
8 9.2 0.8 24x108
9 9.1 0.9 27x108
10 9.0 1.0 30x108

Recuento microscópico

Recuentos Directos:
Es una técnica común, rápida y barata que utiliza un
equipamiento fácilmente disponible en un
laboratorio de microbiología. Para estos recuentos
se utilizan generalmente cámaras de recuentos.

Cuenta de Breed
• Muestra a evaluar (directa o diluida)
• Microscopio
• Objetivo micrométrico
• Asa calibrada o micropipeta
• Portaobjetos
• Colorantes de Gram u otros colorantes.

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Recuento microscópico

• Las cámaras más utilizadas son las de Hawksley, la

de Petroff-Hausser y la de Neubauer. La primera
tiene la ventaja que puede ser utilizada con
objetivos de inmersión, aunque la mayoría de los
recuentos se realizan con objetivos secos

Bibliografía

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