Lizana D

UNIVERSIDAD DE CHILE
FACULTAD DE CIENCIAS FORESTALES

ESCUELA DE CIENCIAS FORESTALES
DEPARTAMENTO DE SILVICULTURA
ELABORACIÓN Y EVALUACIÓN DE EXTRACTOS DEL FRUTO DE

Melia azedarach L. COMO INSECTICIDA NATURAL
Memoria para optar al Título

Profesional de Ingeniero Forestal
DIEGO REINALDO LIZANA ROJAS
Profesores Guías: Ingeniera Forestal, Dra. Amanda Huerta Fuentes

Bioquímico, Dr. Italo Chiffelle Gómez
SANTIAGO – CHILE
2005
UNIVERSIDAD DE CHILE
FACULTAD DE CIENCIAS FORESTALES
ESCUELA DE CIENCIAS FORESTALES
DEPARTAMENTO DE SILVICULTURA
ELABORACIÓN Y EVALUACIÓN DE EXTRACTOS DEL FRUTO DE

Melia azedarach L. COMO INSECTICIDA NATURAL
Memoria para optar al Título

Profesional de Ingeniero Forestal
DIEGO REINALDO LIZANA ROJAS
Calificaciones: Nota Firma

Prof. Guía Dra. Amanda Huerta F. 7,0
Prof. Guía Dr. Italo Chiffelle G. 7,0
Prof. Consejera Sra. María Teresa Serra V. 7,0
Prof. Consejero Dr. Jaime Araya C. 7,0
SANTIAGO – CHILE
2005
1
A mis padres por su apoyo, entrega y educación entregada. Son inigualables.
A mi hermana por su apoyo constante y por darme a mis dos primeras princesas.
A mi novia Paula, y por nuestro futuro.
A todos aquellos que creen en sí mismos, que tienen ambiciones y sueños.
2
AGRADECIMIENTOS
Agradezco a todos aquellos que fueron parte directa o indirecta de esta memoria,
principalmente a:
 Mis profesores guías, Amanda Huerta e Italo Chiffelle, quienes me enseñaron que
un profesor guía no solo revisa y califica, sino que aconseja y escucha, respetando
todas las ideas y opiniones que el memorante pueda tener. Su incentivo y
responsabilidad fueron fundamentales para el desarrollo y pronto termino de este
estudio.
 Laboratorio de Química, a la señora Julia y especialmente a Tania quienes me
aguantaron en el laboratorio y disfrutaron de la comida que les preparaba a mis
moscas.
 Laboratorio de Biodeterioro y Preservación, en especial a Luis Frías por su ayuda
en distintas etapas de esta memoria.
 Mis profesores consejeros por su apoyo y consejo preciso que permitieron el
desarrollo normal de esta memoria.
 A mis fieles amigos, Gustavo, Techi, Gabi chica, Gabi grande, Andrea, Carola,
Chupones, y todos aquellos que confiaron en mí y me apoyaron en todo momento.
3
INDICE
1. INTRODUCCIÓN ............................................................................................................... 10
2. OBJETIVOS ....................................................................................................................... 11
2.1. Objetivo general ...................................................................................................... 11
2.2. Objetivos específicos .............................................................................................. 11
3. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA ............................................................................................. 12
3.1. Insecticidas sintéticos y la protección ambiental ................................................... 12
3.2. Clasificación de los insecticidas ............................................................................. 13
3.3. Ventajas y desventajas de los insecticidas naturales ............................................ 14
3.4. Persistencia de los insecticidas naturales.............................................................. 15
3.5. Especies vegetales con propiedades insecticidas ................................................. 15
3.6. Características de un insecticida ideal ................................................................... 16
3.7. Antecedentes generales sobre Melia azedarach ................................................... 16
3.7.1. Descripción botánica y características ecológicas ........................................ 16
3.7.2. Propiedades insecticidas................................................................................ 18
3.8. Antecedentes generales sobre Drosophila melanogaster ..................................... 21
4. MATERIALES Y MÉTODO ............................................................................................... 22
4.1. Materiales ............................................................................................................... 22
4.2. Método .................................................................................................................... 23
4.2.1. Obtención de los frutos .................................................................................. 23
4.2.2. Análisis proximal............................................................................................. 24
4.2.3. Elaboración de los extractos .......................................................................... 25
4.2.4. Evaluación de la eficacia del insecticida ........................................................ 25
4.2.5. Análisis de polifenoles .................................................................................... 26
5. RESULTADOS .................................................................................................................. 28
5.1. Caracterización física y química de los frutos de Melia azedarach ...................... 28
5.2. Propiedades insecticidas del producto................................................................... 29
5.3. Evolución de la mortalidad de Drosophila melanogaster ...................................... 32
5.4. Análisis de polifenoles ............................................................................................ 34
6. DISCUSIÓN ....................................................................................................................... 38
6.1. Caracterización física y química de los frutos de Melia azedarach ...................... 38
6.2. Propiedades insecticidas del producto................................................................... 38
4
6.3. Tendencia de mortalidad de Drosophila melanogaster ......................................... 41
6.4. Análisis de polifenoles ............................................................................................ 41
7. CONCLUSIONES .............................................................................................................. 42
8. BIBLIOGRAFÍA .................................................................................................................. 44
APÉNDICE 1. Análisis Estadístico 1 ..................................................................................... 50
APÉNDICE 2. Análisis Estadístico 2 ..................................................................................... 54
ANEXO 1. Medio de cría de Drosophila melanogaster.......................................................... 56
5
INDICE DE CUADROS
Página
CUADRO 1: Compuestos fenólicos patrones y recta de calibración utilizada. 27
CUADRO 2: Caracterización del fruto de M. azedarach. 28
CUADRO 3: Análisis proximal según el estado de madurez del fruto de M. 28
azedarach.
CUADRO 4: Mortalidades promedio de D. melanogaster por efecto de 29
extractos de frutos de M. azedarach de dos estados de
madurez, solventes y concentraciones.
CUADRO 5: Resultados de la prueba Probit sobre la mortalidad de D. 31
melanogaster ante extractos del fruto de M. azedarach en
etanol y agua para el EM1.
CUADRO 6: Compuestos fenólicos de bajo peso molecular en los frutos de 35
M. azedarach.
6
INDICE DE FIGURAS
Página
FIGURA 1: Melia azedarach. A) Árbol; B) Frutos en racimo. 17
FIGURA 2: Estructuras moleculares. A) Meliartenin; B) Azadirachtina. 19
FIGURA 3: Frutos de M. azedarach. A) Estado verde; B) Estado maduro. 22
FIGURA 4: Representación gráfica de la prueba Probit de la mortalidad de 32
D. melanogaster frente a distintas concentraciones de extractos
del fruto de M. azedarach con dos solventes.
FIGURA 5: Mortalidad de D. melanogaster con extractos en etanol y agua 33
de los frutos de M. azedarach a distintas concentraciones. A)
3.200 ppm; B) 7.500 ppm y C) 10.700 ppm.
FIGURA 6: Cromatografía por HPLC de la harina obtenida del fruto EM1 y 35
EM2 de M. azedarach.
FIGURA 7: Espectros correspondientes a los compuestos fenólicos de M. 36
azedarach.
7
RESUMEN
Se elaboraron extractos insecticidas a base dos estados de madurez del fruto de

Melia azedarach L. con los solventes etanol y agua. Las concentraciones ensayadas
correspondieron a 3.200, 7.500 y 10.700 ppm del extracto, el cual fue incorporado en la
dieta de Drosophila melanogaster a fin de determinar la efectividad del producto y su DL50.
Con el propósito de caracterizar el fruto en cuestión se le realizó un análisis

proximal, el cual permitió establecer diferencias físicas y químicas entre los dos estados
de madurez estudiados.
Los experimentos realizados fueron satisfactorios desde el punto de vista de

efectividad de los extractos, sin importar solvente ni concentración, lográndose mejores
resultados a concentraciones más elevadas. La DL50 correspondió a 2.071 y 4.382 ppm
para etanol y agua, respectivamente.
Adicionalmente, se realizó un análisis preliminar de polifenoles, donde se intentó

identificar los principales compuestos causantes del efecto insecticida del fruto de M.
azedarach, encontrándose 14 compuestos, de los cuales tres corresponderían a
flavonoides: una catequina y dos kaempferol.
Se recomienda en futuras investigaciones realizar pruebas de campo, para ver el

efecto de los extractos en condiciones reales de aplicación y continuar con la búsqueda
de los compuestos químicos del fruto de M. azedarach, a fin de contribuir al control
integrado de plagas.
PALABRAS CLAVES
Melia azedarach, insecticida botánico, insecticida vegetal, insecticida natural,

control integrado de plagas.
8
SUMMARY
Insecticide extracts were elaborated based on two states of maturity of the fruit
Melia azedarach L. using ethanol and water as solvents. The tried concentrations
correspond to 3,200, 7,500 and 10,700 ppm of the extracts, which was added to
Drosophila melanogaster diet by means of determining the product effectiveness and his
LD50.
With the objective to characterize the fruit in question, an approximate analysis was
made, which allows us to establish the physical and chemical differences between the two
states studied.
The experiments done were satisfactory to the extract effectiveness point of view,
without concerning the solvents concentration, resulting in a better outcome with higher
concentrations of the extract. The LD50 correspond to 2,071 and 4,382 ppm for ethanol and
water, respectively.
In addition, a preliminary substance analysis was made, where the objective was to
identify the main cause of the insecticide effect of the M. azedarach fruit, finding 14
compounds, which three of them correspond to a flavonoides, another to a catequina and
other two were kaempferol.
It is recommended in future investigations to make in-field tests, in order to see the

effect of the extracts in real application environments, and continue the search for the
chemical compounds from the M. azedarach fruit, to finally play an integral roll in the
control of plagues.
KEYWORDS
Melia azedarach, botanical insecticide, vegetal insecticide, natural insecticide, integrated

control of plagues.
9
1. INTRODUCCIÓN
El sector forestal chileno orienta el destino de sus productos principalmente hacia

mercados externos cada vez más exigentes, obligando a mejorar la productividad y
calidad del recurso. Además, el intercambio producido por la apertura de mercados ha
traído consigo el incremento de las probabilidades de ingreso de nuevas plagas al país, lo
que ha significado un endurecimiento en la aplicación de medidas sanitarias. En este
contexto, el control de plagas con insecticidas químicos ha sido eficiente en la mayoría de
los casos. Sin embargo, su uso ha causado una serie de problemas: niveles altos de
residuos en los alimentos, desequilibrio biológico por la eliminación de los enemigos
naturales, contaminación ambiental, intoxicación de personas y surgimiento de
poblaciones de insectos resistentes.
Con el fin de disminuir el uso de insecticidas sintéticos y apoyar el control de

plagas, se propone una búsqueda de insecticidas botánicos que resulten más saludables,
ecológicamente aceptables y eficientes, en un retorno a una práctica antigua, pero con
nuevas tecnologías. Estos compuestos son de naturaleza biodegradable y presentan una
seguridad relativa para los organismos benéficos, evitando el surgimiento de poblaciones
de insectos resistentes.
Existen estudios preliminares que indican que los extractos de hojas y semillas del
árbol “melia”, Melia azedarach L., (Meliaceae), causan una disminución en el consumo de
alimento, con efecto disuasivo que evita la acción de los fagoestimulantes de la dieta en
insectos con aparato bucal mordedor. Además, estos productos no son tóxicos para el
hombre, animales domésticos ni insectos benéficos; son repelentes, inhiben la
alimentación del insecto; no dañan a los cultivos ni causan mal gusto en los productos.
Esta investigación es un estudio preliminar de la elaboración de extractos

naturales del fruto de M. azedarach como agentes insecticidas y la evaluación de su
eficacia contra Drosophila melanogaster Meigen, a través de bioensayos de laboratorio,
con el fin de contribuir al manejo integrado de plagas.
10
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo general
 Evaluar la capacidad insecticida de extractos naturales del fruto de M. azedarach a

través de bioensayos de laboratorio.
2.2. Objetivos específicos
2.2.1 Caracterizar distintos estados de madurez del fruto a nivel físico y químico.
2.2.2. Elaborar los extractos de dos estados de madurez del fruto, con diversos
solventes y concentraciones.
2.2.3. Evaluar la eficacia del insecticida natural en distintos estados de desarrollo del
fruto mediante bioensayos de laboratorio con D. melanogaster.
11
3. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
3.1. Insecticidas sintéticos y la protección ambiental
En general, los insecticidas son sustancias con propiedades biocidas para los
insectos. Su efecto sobre la fisiología de estos organismos es complejo y tiene una serie
de reacciones físico-químicas que afectan a una especie de insecto en particular
(Romanyk y Cadahía, 2002).
Aunque los plaguicidas son herramientas importantes de control, su uso ha

demostrado también consecuencias negativas, como el desarrollo de resistencia a los
productos fitosanitarios por plagas y enfermedades, aparición de nuevas plagas,
eliminación de la fauna benéfica y contaminación ambiental y de cultivos alimenticios
(Carrero, 1996; Niemeyer, 1996; Villalobos, 1996).
El uso de extractos de plantas como insecticidas data de la época del Imperio

Romano. Sin embargo, sólo a partir de los años 30 del siglo recién pasado se produjeron
los avances más importantes en el uso de los insecticidas como: nicotina, rotenona,
cuasina y piretrinas (Villalobos, 1996, Rodríguez et al., 2003).
Estos avances fueron seguidos por el desarrollo de los compuestos orgánicos de

síntesis, incluyendo insecticidas clorados, fosforados y carbamatos, algunos de los cuales
han sido retirados del mercado por tener efectos no deseados en el ambiente. En la
actualidad existen centenares de materias activas y millares de productos técnicos que se
encuentran registrados en diversos países, y hay una tendencia hacia la elaboración de
productos cada vez más específicos, cuyo objetivo es alterar sólo alguna de las fases del
ciclo del insecto, como por ejemplo, inhibir la formación de la cutícula, alterar la muda o la
actividad hormonal juvenil, entre otros (Villalobos, 1996). Las investigaciones destinadas
a solucionar estos problemas han apuntado a la búsqueda de productos naturales
capaces de apoyar la labor de los insecticidas sintéticos, disminuyendo sus efectos
negativos (Pizarro y Diana, 2002).
12
3.2. Clasificación de los insecticidas
Los insecticidas pueden dividirse de acuerdo a sus componentes químicos y

propiedades, en la siguiente clasificación (Carrero, 1996; Mota-Sánchez et al., 2003):
Insecticidas inorgánicos: Los productos inorgánicos son de origen mineral y carecen,

por ende, de carbono. Comúnmente contienen arsénico, cobre, boro, mercurio, azufre,
estaño o zinc. Actualmente se usan principalmente en el control de enfermedades de las
plantas. Sin embargo, no son específicos y pueden ser tóxicos a una gran variedad de
organismos; es decir, son de amplio espectro. Estos productos son generalmente menos
efectivos que muchos de los compuestos orgánicos. Algunos ofrecen la ventaja de tener
una toxicidad aguda relativamente baja en las personas, aunque aquellos que contienen
plomo, mercurio y arsénico causan serios problemas de salud y contaminación del medio
ambiente, por lo que su uso se ha prohibido.
Insecticidas orgánicos: Los insecticidas orgánicos contienen carbono y pueden ser

tanto de origen natural como artificial. También contienen oxígeno, nitrógeno, fósforo,
azufre, y otros elementos. La mayoría de los insecticidas usados en la actualidad son
compuestos orgánicos. Cabe señalar que “orgánico” no quiere decir “natural”, y como
sustancias tóxicas, estos productos deben usarse con precaución.
Insecticidas microbiales: Los insecticidas microbiales son un grupo distinto de

productos para el manejo de plagas y están constituidos por bacterias, virus u hongos;
capaces de causar enfermedades en ciertas plagas. Aunque estos organismos pueden
generarse en forma natural, también son producidos a gran escala e introducidos
intencionalmente en cantidad suficiente, de manera que garanticen un alto nivel de control
de la plaga en cuestión. Son altamente específicos, y por ello no afectan a otras
especies. Hasta el momento sólo un pequeño número de estos insecticidas ha sido
registrado para su uso. El más conocido es Bacillus thuringiensis Berliner, bacteria que
ha sido usada efectivamente contra larvas de distintas especies, especialmente
lepidópteros.
Insecticidas vegetales: Los insecticidas orgánicos son derivados o extraídos

directamente de plantas y corresponden principalmente a mecanismos de defensa frente
a posibles daños por insectos.
13
3.3. Ventajas y desventajas de los insecticidas naturales
Al usar compuestos vegetales se debe ser cuidadoso y no depender de esta

táctica de manera única y exclusiva para el control de plagas, ya que se podrían producir
efectos no deseables para la salud humana o bien generar resistencia, de manera similar
a lo que ocurre con los insecticidas sintéticos, los de mayor toxicidad para el ser humano.
Por tanto, estos insecticidas son una herramienta más dentro de un sistema de Manejo
Integrado de Plagas. Entre las ventajas y desventajas de un insecticida natural es posible
mencionar las siguientes (COLPROCAH, 1996; Cañarte, 2000; Maggi, 2004):
Ventajas
 Material renovable.
 Biodegradable.
 Alta disponibilidad de material.
 Bajo costo.
 Menor efecto negativo sobre enemigos naturales y otros organismos benéficos.
 No contaminante.
 Bajo riesgo a la salud humana.
 Mantenimiento del equilibrio de la fauna entomológica.
Desventajas
 Poca información en pruebas de toxicología.

 Variabilidad en cantidad del ingrediente activo.
 Mayor requerimiento de personal calificado y mano de obra.
 Requiere equipo de procesamiento.
 Costo de oportunidad.
 No muy buena estabilidad en los extractos.
Otra gran ventaja de los insecticidas orgánicos, que paradójicamente Isman (1994)
definió como desventaja, se refiere a la inestabilidad de los componentes dentro de la
planta debido a factores climáticos; si dos extractos tienen los mismos compuestos, no
necesariamente están en las mismas concentraciones, y por ello, los insectos no son
14
sometidos siempre a la misma presión y por ende es muy difícil que desarrollen
resistencia.
3.4. Persistencia de los insecticidas naturales
Los compuestos vegetales no persisten mucho tiempo en el medio y sus

parámetros farmacocinéticos son poco tóxicos a organismos superiores (Isman, 1994), y
causan menos daños al medio ambiente (Lemma, 1973).
La actividad de los insecticidas naturales perdura normalmente entre 4 a 15 días

bajo condiciones de campo. En general, estos productos no presentan efectos nocivos
para artrópodos benéficos debido a su especificidad contra larvas de lepidópteros. Esto
constituye una ventaja en programas de protección donde se necesita una población alta
de insectos benéficos para combatir otras plagas (Cañarte, 2000).
3.5. Especies vegetales con propiedades insecticidas
Se ha estudiado diversa familias vegetales con propiedades bioinsecticidas. Entre

ellas destacan Meliaceae, Asteraceae, Fabaceae, Lamiaceae, Lauraceae, Apiaceae,
Brassicaceae, Euphorbiaceae, entre otras, de las que se han aislado algunos compuestos
activos (Villalobos, 1996).
Los factores climáticos influyen en la acumulación de compuestos químicos en los

árboles y sus estructuras morfológicas. Las regiones tropicales tienden a favorecer la
acumulación de sustancias químicas en los vegetales, por lo que las concentraciones
menores de un producto elaborado con material originario de esas zonas geográficas
producen mejores resultados que los elaborados en otras latitudes (Espinosa y Villaseñor,
2002).
Dos especies importantes de plantas con propiedades insecticidas pertenecen a la

familia Meliaceae, el árbol neem, Azadirachta indica L y el neem chino, Melia azedarach
L. Ambos son nativos de Asia y Australia meridional, y se cultivan principalmente con
fines ornamentales desde el siglo XVI. En la actualidad, estas especies se han
naturalizado en diversos países tropicales y subtropicales (Martínez, 1991; Villalobos,
1996). Este estudio se centra en M. azedarach, dada su buena adaptación en Chile.
15
3.6. Características de un insecticida ideal
Un insecticida no sólo debe cumplir con la exigencia mínima de matar una plaga
específica, sino que debe cumplir una serie de características para otorgarle la calificación
de insecticida ideal, entre las que destacan (Cañarte, 2000):
a. Eficacia para eliminar o disminuir la acción dañina de una plaga.

b. Precio adecuado para su aplicación en dosis correctas tanto en cultivos intensivos
como extensivos.
c. Posibilidad de adquisición permanente.
d. Características físico-químicas adecuadas, que permitan que sea fácilmente
aplicado, sin causar daños al equipo ni a las plantas.
e. No comprometer la salud de quien lo aplica.
f. No ser perjudicial para el medio ambiente.
Otra característica de un buen insecticida es que el solvente aconsejado para su

disolución, que muchas veces acarrea más problemas que el propio insecticida, debe
permanecer en el medio el tiempo suficiente que permita su ingesta por el insecto, por lo
que su grado de volatilización debe ser lo más bajo posible (Rodríguez et al., 2003).
Otros factores que ayudan a decidir el solvente más conveniente son su toxicidad
para el ser humano, precio, disponibilidad en el mercado y facilidad de manipulación
(Rodríguez, 1997).
3.7. Antecedentes generales sobre Melia azedarach
3.7.1. Descripción botánica y características ecológicas
Melia azedarach fue introducida en Chile con fines ornamentales y se conoce

como “melia”, “árbol del paraíso”, “cinamomo” o “neem chino”. Es un árbol caducifolio de
unos 10 a 15 m de altura, tronco recto y delgado, con corteza oscura y fisurada, y copa
globosa (Hoffmann, 1995) (Figura 1A). Tiene hojas alternas, normalmente bipinnadas, de
hasta 60 cm de longitud, con pinnas de 5–7 folíolos peciolados, ovales, ligeramente
dentados, de 2–5 cm de longitud, de color verde oscuro en el haz y más claro en el envés.
Las flores se disponen en panículas axilares, colgantes, numerosas, fragantes, de color
16
blanco y violeta, con los estambres reunidos en un tubo central. Florece entre abril y
mayo. Frutos drupáceos, globosos, de 1 cm de diámetro, amarillo-naranjados al principio,
dispuestos en racimos muy ornamentales que permanecen en el árbol todo el invierno, y
contienen 4–5 semillas (Roig, 1974; Martínez, 1991; Pennington y Sarukán, 1998;
Fuentes et al., 2001) (Figura 1B).
Figura 1. Melia azedarach. A) Árbol; B) Frutos en racimo. Foto: Diego Lizana R.
De su ecología se ha escrito poco, pero según descripciones generales de su

hábitat es probable que M. azedarach requiera sol directo, pues no es tolerante a la
sombra, y se adapta a una gama amplia de condiciones de humedad de suelo
(Henderson y Musil, 1984; Henderson, 1991).
Entre las características ambientales óptimas para su desarrollo, la altitud óptima

estaría en torno a los 500 msnm, con temperatura media de 18ºC y precipitaciones que
promedien anualmente los 500 mm. Esta especie es muy adaptable y puede soportar
heladas y períodos de sequía (Flinta, 1960; Niembro, 1986; Martínez, 1991; Von Carlowitz
et al., 1991; Pennington y Sarukán, 1998).
Melia azedarach se desarrolla en suelos preferentemente podzólicos, con

profundidad en torno a 50 cm, de texturas arcillosas, ligeramente arenosas y francas o
franco-arenosas, con buen drenaje, tanto en pH ácidos, alcalinos o neutros, con materia
orgánica abundante (Flinta, 1960; Evans y Rombold, 1984; Martínez, 1991; Von Carlowitz
et al., 1991).
17
Las hojas caídas de M. azedarach pueden aumentar significativamente la
alcalinidad y ceniza del suelo, junto con reducir el nivel de aluminio (Noble et al., 1996).
Además, estas hojas pueden reforzar la concentración de nitrógeno mineralizable del
suelo en una cantidad comparable a un abono nitrogenado con leguminosas (Singh et al.,
1996).
Melia azedarach florece y fructifica cuando alcanza el tamaño de un arbusto.

Tiene una alta producción de frutos y semillas, que persisten a la última caída de la hoja.
Los frutos son de larga maduración, venenosos para las personas y algunos otros
mamíferos. Sin embargo, los pájaros los consumen y dispersan las semillas, aunque a
veces se producen intoxicaciones (Burks, 1997).
Las semillas de M. azedarach son muy tolerantes al desecamiento, y llegan a

sobrevivir hasta con 3,5% de su volumen de humedad normal. Además pueden
permanecer viables por períodos prolongados, hasta al menos 26 meses (Hong y Ellis
1998).
Melia azedarach también se reproduce vegetativamente por formación de brotes

desde la raíz, capacidad que a menudo permite producir bosquecillos monotípicos densos
(Langeland y Burks, 1998).
3.7.2. Propiedades insecticidas
Muchas clases de compuestos naturales, tales como grasas, hidratos de carbono,

proteínas y ácidos nucleicos, intervienen en los procesos vitales de las plantas, tales
como respiración, fotosíntesis, entre otros. Estos productos naturales, junto con un
número relativamente pequeño de sustancias análogas, existen en casi todos los
organismos y se denominan “metabolitos primarios”, y los procedimientos por los cuales
se producen se llaman procesos metabólicos primarios. La mayoría de los organismos
vivos, producen ácidos grasos corrientes y ácidos carboxílicos sencillos (Izco, 1998;
Troiani, 2003).
Una segunda clase de productos naturales se denominan “metabolitos

secundarios”, los cuales, como su nombre indica, son el resultado del metabolismo
secundario, formando parte de procesos no vitales para las plantas. Estos compuestos
18
son precisamente a los que se adjudica las cualidades insecticidas de las plantas; los
grupos más destacados en esta labor son los flavonoides, terpenoides y alcaloides (Izco,
1998; Troiani, 2003).
La actividad insecticida de M. azedarach se encuentra en hojas, tallos, frutos y

semillas. De estas estructuras se han extraído, con acetona, agua, alcohol, cloroformo,
diclorometano y éter de petróleo, los siguientes compuestos: paraisina, cumarinas,
azederacol, meliacarpina, meliacarpinina, melianol, melianona, meliantriol, meliatina,
meliatoxina, nimbolida, nimbolidina, nimbolinina, oquinolida, sendanina, toosendanina y
vilasinina (Rodríguez, 1999; Gusberti et al., 2000; Padrón et al., 2003). Destacan
principalmente meliartenin (Figura 2A), limonoide (triterpeno) con cualidades
antialimentarias, y azadirachtina (triterpeno) (Figura 2B), el mayor compuesto natural
antialimentario conocido, proveniente de Azadirachta indica A. Juss (Pimentel, 1995;
Carpinella et al., 2002, 2003).
A B
O
O
CH3
HO
OH
CH3
H
O O
AcO OH
H
CH3
HO
Figura 2. Estructuras moleculares. A) Meliartenin; B) Azadirachtina. Fuente: Maggi, 2004.
La actividad insecticida de M. azedarach se debe a un grupo de triterpenoides

biológicamente activos, que tienen efecto antialimentario; es decir, inhiben la alimentación
de insectos fitófagos mordedores como coleópteros y larvas de lepidópteros (Vergara et
al., 1997; Gusberti et al., 2000; Carpinella et al., 2003; Maggi, 2004).
Los insecticidas naturales actúan de manera gradual. Por lo general, ninguna de

las especies vegetales insecticidas tiene la acción fulminante de los insecticidas
sintéticos. La población de insectos no disminuye rápidamente con el uso de insecticidas
botánicos. Entre los efectos de los insecticidas naturales en las plagas se encuentran: a)
repelencia en larvas y adultos, b) suspensión de la alimentación, c) reducción de la
movilidad del intestino, d) impedimento de la formación de quitina, e) bloqueo de la muda
en ninfas y larvas, f) reducción del desarrollo y crecimiento, g) toxicidad en larvas y
19
adultos, h) interferencia de la comunicación sexual en la cópula, i) suspensión de la
ovipostura, y j) esterilización de adultos. La mayoría de los efectos de los insecticidas
naturales son fisiológicos, por lo que el insecto tiene que ingerirlos (Rodríguez, 1998).
El efecto del o los compuestos activos de un insecticida vegetal depende de

factores genéticos, fenológicos, ambientales, fitosanitarios e incluso la elaboración y
aplicación del producto. Generalmente no se conoce el modo exacto de acción de estos
insecticidas, por lo que se debe mantener una experimentación constante (Rodríguez,
1998).
El mecanismo de acción de la mayoría de las substancias provenientes de M.

azedarach consiste en inhibir la acción de las oxidasas en el intestino medio, por lo que el
insecto inmaduro muere o se convierte en pupa o adulto anormal por deficiencia de
nutrientes o interferencia en los procesos fisiológicos. Esto se traduce en inhibición de la
alimentación, disminución del crecimiento y desarrollo, descenso de la tasa metabólica
relativa, emergencia de adultos deformes, inhibición de la ovipostura o mortalidad. La
inhibición de la alimentación ha sido estudiada a través de la repelencia a la alimentación,
reducción del consumo, tasa de consumo relativo, protección del 95% del área foliar y
descenso de peso. La inhibición del crecimiento se ha cuantificado por medio del
aumento de duración de la fase larvaria, índice de crecimiento, concentración que inhibe
el 50% de crecimiento y la tasa de crecimiento relativo (Rodríguez, 1999; Gusberti et al.,
2000).
Existen varias maneras de cuantificar y comparar la toxicidad de distintos

productos químicos y dosis. Una medida común es la dosis letal 50, o DL 50. Este índice
significa que una dosis determinada es letal para el 50% de los individuos expuestos.
Mientras menor es la DL50, mayor es la toxicidad del producto (Rodríguez, 1998).
Muñoz et al. (1998) estudiaron los efectos de extractos de frutos de M. azedarach,

A. indica y piretroides, sobre larvas de tercer estadío de la polilla del brote del pino,
Rhyacionia buoliana Den. et Schiff., y dedujeron que los extractos de frutos verdes de M.
azedarach fueron más activos (0,0077 ppm), requiriendo menos producto para matar el
50% de los insectos (DL50) en comparación con el piretroide cipermetrina (0,124 ppm),
extractos de frutos maduros de M. azedarach (0,229 ppm) y un preparado comercial de A.
indica (Bionim; 0,29 ppm).
20
En un estudio de Donoso (1998) sobre los efectos de extractos de A. indica y M.
azedarach sobre cuatro hongos fitopatógenos, esta última actúa sobre los hongos Botrytis
cinerea Pres. ex Fr. y Sclerotinia esclerotorium (Lib.) Massee, con un efecto considerable,
y características más selectivas que A. indica.
Como se señaló, el principal compuesto causante de la actividad insecticida en M.

azedarach corresponde a meliartenin, extraído principalmente de sus frutos, el cual actúa
como regulador de crecimiento y antialimentario. Sin embargo, la extracción y aislamiento
de este compuesto es difícil y cara (Carpinella et al., 2002; Troiani, 2003).
Los intentos por sintetizar el compuesto activo de M. azedarach no han sido

satisfactorios debido a la complejidad de la molécula. Las síntesis logradas han sido sólo
parciales y los hemi-compuestos obtenidos, no tienen actividad biológica, por lo que se
deduce que la bioactividad reside en la molécula completa (Gusberti et al., 2000).
3.8. Antecedentes generales sobre Drosophila melanogaster
La mosca del vinagre es pequeña (1 a 2 mm), de color ocre y con ojos

generalmente rojos. Su vuelo es lento y puede ser localizada fácilmente en frutas
maduras en proceso de descomposición o cerca de recipientes abiertos que contengan
vinagre o vino (Godoy, 2001).
El período medio desde la eclosión de los huevos hasta que D. melanogaster

emerge como adulto fluctúa entre 10 y 15 días a 25ºC, acortándose bastante en verano,
pues en gran medida depende de la temperatura. Las fases de desarrollo pasan por el
estado de huevo, que una hembra deposita en un medio apropiado (mezcla ácida) y en
pocos días se pueden ver larvas diminutas que se alimentan y recorren el recipiente.
Estas larvas se sitúan a media altura de las paredes del recipiente, donde pasan al estado
de pupa, fase en la que permanecen unos días, hasta que la metamorfosis se completa y
la mosca adulta sale, vuela e inicia de nuevo el ciclo (Godoy, 2001).
Drosophila melanogaster es muy utilizada en pruebas de genética y ensayos de

toxicidad de insecticidas, pues permite hacer bioensayos simples para determinar la DL 50
de componentes activos de extractos en un medio ácido (Moreno et al., 2000).
21
4. MATERIALES Y MÉTODO
4.1. Materiales
El material vegetal utilizado en este estudio fue el fruto de M. azedarach en dos

estados de madurez, obtenido desde árboles en el Campus Antumapu de la Universidad
de Chile en Santiago, donde se ha establecido como árbol ornamental, pues no existen
plantaciones de esta especie. Los frutos colectados se denominaron EM1 y EM2, los
cuales presentaban características de estado verde (Figura 3 A) y maduro (Figura 3 B),
respectivamente.
Figura 3. Frutos de M. azedarach. A) Estado verde; B) Estado maduro. Foto: Diego Lizana R.
El análisis proximal y la elaboración de extractos de los frutos se hicieron en los

laboratorios de Química del Departamento de Agroindustria y Enología de la Facultad de
Ciencias Agronómicas de la Universidad de Chile. Para ello se usaron los siguientes
equipos y materiales: molino mecánico, extractor Soxhlet, estufa de aire forzado, mufla,
centrífuga, colorímetro Minolta CR 300, balanzas analíticas, frascos de vidrio, lupa,
microscopio, reactivos y equipos de laboratorio de vidrio.
22
Los ejemplares de D. melanogaster fueron proporcionados por el Laboratorio de
Biología Celular y Genética de la Facultad de Medicina de la Universidad de Chile. Los
bioensayos con este insecto se llevaron a cabo en el Laboratorio de Entomología
Forestal, Departamento de Silvicultura, Facultad de Ciencias Forestales. El medio de cría
fue una mezcla ácida (Anexo 1) compuesta de agua, agar-agar, sémola (nutrina),
levadura seca, Nipagin (fungicida), azúcar, nitrato de sodio, fosfato y cloruro de potasio, y
sulfatos de magnesio y fierro1. Esta mezcla permitió que el insecto se desarrollara en
forma controlada, sin alteraciones que pudieran distorsionar los resultados.
Para el análisis de polifenoles de los frutos se usó un equipo de cromatografía

líquida de alta resolución Merck de Hitachi, el cual consta de una bomba Intelligent Pump L-
6200, un inyector automático Autosampler L-7200, un detector de arreglo de fotodíodos
alineados L-7455, y una columna Waters Nova-pak C18 de 3,9mm de diámetro interno por
300 mm de longitud para fenoles de bajo peso molecular.
4.2. Método
El método utilizado en esta memoria consideró cuatro etapas: obtención de los

frutos, análisis proximal, elaboración de extractos y evaluación de la eficacia del
insecticida. Además se hizo un análisis de polifenoles, no incluido en el proyecto original.
4.2.1. Obtención de los frutos
Los frutos de M. azedarach se obtuvieron a través de un muestreo aleatorio sobre

37 árboles, seleccionándose 15 ejemplares para la extracción del material. Los frutos se
colectaron al azar desde la copa de los árboles, sin identificar sectores en ella a causa de
la heterogeneidad en la maduración de los frutos, los que se pueden encontrar en
distintos estados de madurez dentro de una misma rama.
Cada fruto se clasificó según el estado de madurez, obtenido mediante su

diferenciación de color y apariencia externa. Esto permitió seleccionar los dos estados de
madurez con los que se trabajó durante el desarrollo de la investigación (Figura 3).
1
Sr. Enrique Zárate, Laboratorio de Biología Celular y Genética, Facultad de Medicina, Universidad
de Chile (Comunicación personal, 2003).
23
De cada estado de desarrollo de los frutos se colectó aproximadamente 1 kg.
Posteriormente se determinó el color a las muestras claramente diferenciadas y rotuladas,
utilizando el colorímetro bajo el método CIELab, a través de una medición triestímulo
identificando las coordenadas L*: correspondiente a la claridad (desde el negro al blanco);
a*: espectro desde el verde al rojo; y b*: espectro que oscila entre amarillo y azul
(Escalona, 1997). Las muestras se secaron a continuación en una estufa de aire forzado
a 37ºC durante 70 h y luego se molieron en un molino mecánico con un tamiz de
graduación Nº 60, para obtener la harina que sirvió para los análisis posteriores.
4.2.2. Análisis proximal
Con una porción de la harina generada luego de la molienda de los frutos se

determinó una serie de características químicas y físicas de los estados de madurez
estudiados, para así obtener un patrón de referencia para el producto y lograr una mejor
caracterización del fruto.
 Rendimiento: se determinó la pérdida de material producto de la molienda respecto

al fruto húmedo.
 Número de frutos por kg: se adaptó el método de cuantificación de semillas por kg
(Sandoval y Cabello, 2003).
 Lípidos: por extracción con solvente orgánico en extracto Soxhlet (AOAC, 1984).
 Fibra cruda: se determinó en caliente, mediante hidrólisis ácida y básica con ácido
sulfúrico e hidróxido de sodio, respectivamente (AOAC, 1984).
 Cenizas: se obtuvo mediante incineración en mufla a 550ºC hasta obtener la
calcinación total de los componentes orgánicos (color blanco) (AOAC, 1984).
 Proteínas: se determinó mediante el método de Microkjeldahl (AOAC, 1984),
utilizándose el factor 6,25 para multiplicar el porcentaje de nitrógeno obtenido.
 Extracto no nitrogenado: se obtuvo por diferencia de análisis anteriores.
 Humedad: se determinó a través de secado en estufa de aire forzado a 105ºC
hasta obtener un peso constante (AOAC, 1984).
24
4.2.3. Elaboración de los extractos
Los extractos se prepararon con la harina obtenida de los dos estados de madurez
del fruto, con tres solventes: agua, agua/etanol y etanol, en tres concentraciones (3.200,
7.500 y 10.700 ppm). Éstas se determinaron de acuerdo a la solubilidad de la harina en el
solvente respectivo. Para ello se secaron muestras de los extractos en estufa de aire
forzado, resultando como residuos remanentes la harina capaz de disolverse en el
solvente respectivo. Los resultados obtenidos se ajustaron mediante funciones
matemáticas para identificar la más adecuada y con ella obtener la concentración ideal
respecto a la DL50. Cabe señalar que el solvente agua/etanol en ensayos preliminares no
tuvo el éxito esperado por lo que se decidió eliminarlo del análisis global de este estudio.
4.2.4. Evaluación de la eficacia del insecticida
Para evaluar la eficacia de los extractos del fruto de M. azedarach se utilizaron las
variables: estado de madurez del fruto, solubilidad y concentración del producto. Su
eficacia se evaluó mediante bioensayos de laboratorio con ejemplares adultos de D.
melanogaster en función de las concentraciones patrones.
Para estos bioensayos se modificó el método propuesto por Cásares et al. (1997)
para un ensayo de toxicidad con moscas de la guayaba (Anastrepha striata Schiner). La
mezcla ácida descrita en materiales se puso en un frasco de vidrio de 300 mL, que sirvió
de alimento a los insectos, la que contenía además el extracto elaborado en base a M.
azedarach, según solvente y concentración definida para cada tratamiento. Luego se
introdujeron 10 moscas adultas (de unos 5 días después de la emergencia), que se
mantuvieron bajo observación permanente durante la duración del bioensayo (22 días),
contando las moscas muertas y vivas cada dos días, aproximadamente.
El estudio de los dos estados de madurez se hizo por separado, bajo los
siguientes modelos, para facilitar la comprensión y análisis de los datos (Canavos, 1988;
Taucher, 1999):
A) Modelo de efectos fijos: se utilizó para validar la efectividad del testigo en los
bioensayos, para discriminar si el experimento era válido.
25
B) Diseño bifactorial con tres repeticiones y dos variables (3x2), donde los factores
considerados fueron solubilidad y concentración del extracto. Este análisis
permitió determinar las diferencias entre los tratamientos y concentraciones
evaluados.
Para ambos análisis estadísticos se utilizó la prueba de rango múltiple de Duncan

(1955), cuando hubo diferencias estadísticas.
Para discriminar el mejor solvente y determinar el estado más efectivo se

compararon los resultados de mortalidad obtenidos con los dos estados de madurez.
Para estudiar la evolución de la mortalidad de las moscas en los solventes y

concentraciones de los extractos con el estado de madurez más efectivo, se hicieron
gráficos de tendencias hasta obtener modelos tentativos de mortalidad de los insectos.
Además se hizo un análisis Probit con los mejores resultados a fin de determinar la
DL50 (Cabrera, 2000).
4.2.5. Análisis de polifenoles
Para identificar los principales compuestos asociados al poder insecticida se hizo

un análisis de polifenoles para obtener los taninos totales y un análisis pormenorizado de
los compuestos polifenólicos de bajo peso molecular para los dos estados de madurez de
los frutos.
 Taninos totales, mediante la reacción de Bate-Smith (1981).

 Análisis pormenorizado de compuestos polifenólicos de bajo peso molecular,
mediante técnicas de individualización por cromatografía líquida de alta eficiencia
acoplada a un detector de fotodíodos alineados (HPLC-DAD).
Los compuestos fenólicos se identificaron, comparando su espectro de absorción y

tiempo de retención con su respectivo estándar. Su cuantificación se hizo utilizando los
mismos patrones que utilizó Erazo (2004), los que correspondieron a compuestos
distribuidos por la empresa química Sigma S.A. (Cuadro 1), y rectas de calibrado
obtenidas a una absorbancia de 280 nm.
26
Cuadro 1. Compuestos fenólicos patrones y recta de calibración utilizada.
Compuesto identificado Recta utilizada
(+) catequina catequina
ác. p-cumárico ác. p-cumárico
ác. fetárico ác. p-cumárico
ác. ferúlico ác. ferúlico
astilbin quercetina
miricetina quercetina
(-) epicatequina galato epicatequina
isoramnetina quercetina
quercetina quercetina
ác. p-cumárico+kaempferol kaempferol
flavonol glicósido quercetina
kaempferol kaempferol
ác. Gálico ác. Galico
procianidina B3 catequina
(+) catequina catequina
procianidina trímero catequina
(-) epicatequina galato (-) epicatequina
procianidina galato trímero catequina
Fuente: Erazo (2004).
27
5. RESULTADOS
5.1. Caracterización física y química de los frutos de Melia azedarach
Los frutos utilizados en el estudio presentaron un peso y diámetro promedios de

5,20 ± 0,19 g y 14 ±0,53 mm, y 4,06 ± 0,45 g y 12,8 ± 0,19 mm para los estados de
madurez EM1 y EM2, respectivamente (Cuadro 2).
Cuadro 2. Caracterización del fruto de M. azedarach.
Parámetro EM1 EM2

Peso (g) 5,20 ±0,19 4,06 ±0,10
Diámetro (mm) 14,0 ±0,53 12,8 ±0,45
Color del fruto
L* 50,9 60,3
a* -20,7 -17,6
b* 34,3 47,7
L*: claridad; a*: espectro desde verde a rojo; b*: espectro entre amarillo y azul.
El número de frutos por kilogramo fue variable, dependiendo de su tamaño, estado

de madurez y contenido de humedad. En promedio, el número de frutos se calculó en
576 unidades por kg para EM1 y 738 unidades por kg para EM2.
Los resultados del análisis proximal de los dos estados de madurez de los frutos
se presentan en el Cuadro 3.
Cuadro 3. Análisis proximal según el estado de madurez del fruto de M. azedarach.
EM1 EM2
ANÁLISIS REALIZADOS (%)
Promedio ± DE Promedio ± DE
Rendimiento 38,06 52,22
Humedad del fruto 59,66 44,10
Humedad de la harina 2,38 ± 0,04 5,05 ± 0,05
Cenizas 94,88 ± 0,10 95,56 ± 0,06
Proteínas 6,87 ± 0,15 5,98 ± 0,56
Lípidos 5,23 ± 0,17 5,17 ± 0,29
Fibra Cruda 35,70 ± 0,13 38,68 ± 0,93
El rendimiento promedio correspondió al porcentaje final obtenido con relación al

peso del fruto verde, contemplándose pérdidas en los dos estados de madurez de 38%
28
(EM1) y 52% (EM2), producto de la molienda y el secado del fruto para obtener la harina
utilizada en los distintos tratamientos (Cuadro 3).
El contenido de humedad de la harina con la cual se elaboraron los extractos fue

bajo (2–5%), producto del proceso de secado (Cuadro 3).
En el análisis de cenizas, lípidos y proteínas de los distintos estados de madurez

de los frutos, no hubo diferencias significativas en las proporciones obtenidas, y ambos
casos tuvieron desviaciones estándar bajas y similares entre sí. En la medición de la fibra
cruda, EM2 superó en 3% a EM1 (Cuadro 3).
5.2. Propiedades insecticidas del producto
El análisis estadístico entre los tratamientos y sus respectivos testigos arrojó

diferencias estadísticas entre los factores, lo que indicó que el solvente utilizado no tuvo
inferencia sobre la mortalidad de las moscas, comprobándose que el agua y el etanol por
sí solos no causan su muerte, por lo que los resultados de los bioensayos son producto
del extracto insecticida evaluado. En un sólo caso hubo ausencia de diferencia entre el
testigo y el tratamiento, explicado por el bajo poder insecticida de esa combinación (EM2,
solvente etanol y concentración de 3.200 ppm) (Apéndice 1).
Las mortalidades de D. melanogaster alcanzadas con los extractos a base de

etanol fueron superiores a las obtenidas con agua para un mismo estado de madurez de
los frutos, con la excepción de EM2 en la concentración más baja (3.200 ppm), que tuvo
la misma mortalidad en ambos solventes (Cuadro 4).
Cuadro 4. Mortalidades promedio de D. melanogaster por efecto de extractos de frutos de M.

azedarach de dos estados de madurez, solventes y concentraciones.
Mortalidad (%)
Solvente Estado de madurez
3.200 ppm 7.500 ppm 10.700 ppm
EM1 56,67 B 76,67 A 76,67 A
Etanol
EM2 16,67 C 43,33 B 63,33 A
EM1 43,33 B 60,00 A 73,33 A
Agua
EM2 16,67 C 36,67 B 53,33 A
EM1 y EM2: Estados de madurez 1 y 2. Las letras distintas en forma horizontal indican diferencias
significativas entre las concentraciones (P5%).
29
Los resultados más efectivos se observaron en los extractos del EM1 con etanol a
7.500 y 10.700 ppm, con cerca del 77% de mortalidad en ambos casos. Le siguió en
efectividad el extracto del mismo estado de madurez con la concentración de 10.700 ppm,
pero con agua, con 73% de mortalidad. Los tratamientos menos eficaces se presentaron
en los extractos de concentración más baja (3.200 ppm) del EM2 con ambos solventes,
con sólo 17% de mortalidad. Se distingue claramente el efecto de los extractos sobre los
insectos, esto es, a mayor concentración del producto la mortalidad fue mayor,
independiente del estado de madurez del fruto y de los solventes utilizados (Cuadro 4).
No obstante, el análisis estadístico bifactorial entre solventes y concentraciones

(Apéndice 2), no arrojó diferencias significativas entre los solventes utilizados, aunque sí
diferencias claras entre las concentraciones de los distintos extractos de los frutos
(Cuadro 4).
El comportamiento de D. melanogaster durante los bioensayos fue cambiando,

según el estado de madurez evaluado y la concentración en que se encontraba el
extracto. Dado que el producto estaba mezclado con el alimento de las moscas, éstas
tendían inicialmente a bajar hacia el medio contaminado, alejándose de él con el
transcurso de los días, especialmente en los extractos a base del EM1. Este
distanciamiento de las moscas del medio de crianza fue más notorio en aquellos
tratamientos con las dosis mayores del producto, en los que las moscas bajaban a comer
durante los tres primeros días para después permanecer en la parte superior del frasco.
Una observación importante durante el seguimiento fue comprobar la incapacidad

del insecto para reproducirse, principalmente en los bioensayos con las concentraciones
mayores del producto insecticida, en los que no hubo puestas de huevos por las hembras,
lo que fue más notorio en los frascos con extractos a base del EM1. En los extractos
originados del EM2 hubo ovipostura, aunque la mayoría de las veces el insecto
permaneció en estado de larva o pupa, y murió en etapas intermedias.
Aunque en las concentraciones más bajas de los extractos elaborados con ambos
estados de madurez hubo oviposturas, éstas no fueron capaces de desarrollarse
normalmente, y quedaron en su mayoría en etapas intermedias. Aquellos individuos que
lograron pupar y emerger, originaron adultos con alas vestigiales. Sin embargo, en los
30
frascos con medio de alimentación sin extracto insecticida (testigos), el comportamiento,
alimentación y reproducción de las moscas fueron completamente normales.
En los frascos con extracto insecticida se observó además una baja

descomposición del medio de crianza, a diferencia de los frascos testigos, donde la
proliferación de hongos se desarrolló normalmente.
Los resultados de la prueba Probit para determinar la DL50 se presentan en el

Cuadro 5, en el que se aprecia que los extractos a base de etanol fueron más efectivos,
con una DL50 para D. melanogaster de 2.071 ppm, a diferencia de los extractos en agua,
los que requirieron 4.382 ppm para alcanzar este mismo resultado de mortalidad.
Cuadro 5. Resultados de la prueba Probit sobre la mortalidad de D. melanogaster ante extractos

del fruto de M. azedarach en etanol y agua para el EM1.
VARIABLE ETANOL AGUA

DL50 (ppm) 2.071 4.382
R2 0,918 0,972
Ecuación Probit y = 17,835x - 86,181 y = 23,885x - 150,28
La mortalidad de D. melanogaster frente a las distintas concentraciones de etanol

y agua con el EM1 se presenta en la Figura 4. En ella se verifica, por un lado, la mayor
efectividad de los extractos al aumentar su concentración y por otro, la efectividad
permanente de los extractos en etanol sobre los en agua en todas las concentraciones
evaluadas. También se diferencian las DL50 obtenidas con los extractos de los frutos en
ambos solventes, con una efectividad mayor de los extractos en etanol.
31
Agua Etanol Lineal (Etanol) Lineal (Agua)
90
80
70
Mortalidad (%)
60
50
40
30
20
10
0
7,6 7,8 8,0 8,2 8,4 8,6 8,8 9,0 9,2 9,4
Ln Concentración del extracto
2.071 2.441 2.981 3.641 4.447 5.432 6.634 8.103 9.897

Concentración del extracto (ppm)
Figura 4. Representación gráfica de la prueba Probit de la mortalidad de D. melanogaster frente a

distintas concentraciones de extractos del fruto de M. azedarach con dos solventes.
Este análisis complementa los resultados obtenidos y expuestos en los puntos

anteriores, parece más adecuado que el planteado en el proyecto original, y deja un
precedente de la forma correcta de evaluación de los bioensayos de mortalidad en
laboratorio.
5.3. Evolución de la mortalidad de Drosophila melanogaster
La tendencia de la mortalidad obtenida con los extractos en etanol y agua a 3.200,

7.500 y 10.700 ppm se presenta en la Figura 5, respectivamente, considerando el estado
de madurez que obtuvo mejores resultados en los bioensayos (EM2). La regresión con
mejor ajuste en todos los casos fue polinomial de 2º.
32
8
7
2
6 y = -0,0056x + 0,3855x + 0,1119
R2 = 0,9562
5
4
A
3
2 y = -0,0144x2 + 0,5103x - 0,3375
R2 = 0,9608
1
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22
8
7
6 y = -0,0089x2 + 0,5445x + 0,0157
2
R = 0,9724
5
Nº de moscas muertas
4
B
3
2 y = 0,0038x2 + 0,173x + 0,1225
R2 = 0,8923
1
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22
6 y = -0,0021x2 + 0,4373x - 0,1536

R2 = 0,9799
5
4
C
3
2
2
y = 0,0124x + 0,0502x + 0,4179
1
R2 = 0,9417
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22
Días
Mortalidad acumulada Etanol Mortalidad acumulada agua

Línea tendencia etanol (polinómica) Línea tendencia agua (polinómica)
Figura 5. Mortalidad de D. melanogaster con extractos en etanol y agua de los frutos de M.

azedarach a distintas concentraciones. A) 3.200 ppm; B) 7.500 ppm y C) 10.700 ppm.
33
Como se observa en la Figura 5, la mortalidad de D. melanogaster con los
extractos a 3.200 ppm en ambos solventes, fue inicialmente muy similar, y aumentó del
mismo modo. A partir del día 12, los extractos en etanol marcaron una tendencia
ascendente superior a la obtenida con los extractos en agua.
La mortalidad de D. melanogaster producto de los extractos en 7.500 ppm con

ambos solventes aumentaron al transcurrir los días, pero en etanol hubo una superioridad
evidente respecto al agua. Tendencias similares de mortalidad se obtuvieron con la
concentración de 10.700 ppm con ambos solventes.
5.4. Análisis de polifenoles
Este análisis es muy importante en el estudio de los componentes químicos de las

plantas, y debe ser tratado como tema principal en un trabajo posterior. En este caso se
consideró un complemento del estudio principal, que no estaba en el proyecto original y
se abordó en forma preliminar.
La mayor proporción de taninos totales se concentró en EM1, con 3,9 g/L, mientras
que en EM2 fue sólo 2,56 g/L.
En el análisis de compuestos fenólicos de bajo peso molecular se obtuvieron 14

sustancias, identificándose sólo tres. El resto no correspondió a ninguno de los patrones
indicados en el Cuadro 1. Los principales compuestos encontrados con sus respectivos
tiempos de retención se presentan en el Cuadro 6.
34
Cuadro 6. Compuestos fenólicos de bajo peso molecular en los frutos de M. azedarach.
Cima Nº Compuesto Tiempo de retención
1 Desconocido 2,75
2 Desconocido 3,72
3 Desconocido 18,72
4 Catequina 23,00
5 Desconocido 30,48
6 Desconocido 42,27
7 Desconocido 48,43
8 Kaempferol 57,36
9 Kaempferol 62,33
10 Desconocido 2,81
11 Desconocido 3,87
12 Desconocido 19,59
En las cromatografías obtenidas para EM1 y EM2 (Figura 6) se observa con

claridad el comportamiento de los compuestos constituyentes del fruto de M. azedarach.
0,25
1
Unidades de absorbancia (280 nm)
10
0,20
0,15 8
7
11 3
14
0,10 2 12 13 6 9
5
0,05
4
0,00
0 10 20 30 40 50 60 70
Tiempo de retención (min)
EM1 EM2
Figura 6. Cromatografía por HPLC de la harina obtenida del fruto EM1 y EM2 de M. azedarach.
Los números sobre las cimas se relacionan con aquellos en el Cuadro 6.
Entre los compuestos con mayor participación en el fruto sólo se pudo reconocer
los correspondientes a las cimas 4, 8 y 9. El primero podría ser una catequina y los
demás kaempferol (Erazo, 2004). El espectro de las cimas más importantes se presenta
en la Figura 7.
35
Figura 7. Espectros correspondientes a los compuestos fenólicos de M. azedarach. Los números
sobre los espectros se relacionan con los del Cuadro 6.
36
En los cromatogramas de las muestras EM1 y EM2 (figura 6), se observan
compuestos que tienen características similares (tiempo de retención, forma y espectros
de absorción), lo que podría indicar que la gran mayoría de las moléculas están presentes
en ambos estados de madurez. Eso se puede observar al comparar la cima número 2 del
EM1 con la molécula encontrada en la cima número 11 del EM2. La misma situación
ocurre entre la cima 7 y 14.
37
6. DISCUSIÓN
6.1. Caracterización física y química de los frutos de Melia azedarach
El peso y dimensiones anatómicas de los frutos con que se elaboraron los

extractos fueron levemente inferiores a los presentados por Gusberti et al. (2000), quienes
obtuvieron un diámetro promedio de 15 mm entre todos los estados de madurez. Estas
diferencias se explicarían por las condiciones semi-desérticas o xerófitas del área de
nuestro estudio, siendo más favorable su desarrollo en zonas con climas tropicales.
Se observaron diferencias de color entre los frutos; EM2 presentó mayor claridad
(L*) y tonalidad más amarilla (b*) que EM1, el cual tendió a un color más verdoso (a*).
El rendimiento del EM1 en el análisis proximal fue inferior al del EM2, debido al
mayor contenido de humedad del fruto verde, el que al ser secado perdió casi 60% de
agua, mientras que EM2 sólo 44%. Cabe mencionar que los bajos contenidos de
humedad de las harinas obtenidas (2,38% en EM1 y 5,05% en EM2) facilitaron su
manipulación y almacenamiento, evitando la descomposición o deterioro de los
compuestos químicos, vitales para una investigación de esta índole. Por otra parte, la
proporción de fibra cruda detectada fue levemente superior en EM2, lo que se debería al
incremento de este elemento con la maduración.
Durante la investigación no se encontraron referencias sobre el análisis proximal ni

su aplicación en la caracterización del fruto de M. azedarach, principalmente porque este
análisis se efectúa en frutos o alimentos comestibles. Sin embargo, se consideró de
interés caracterizarlo en beneficio de su conocimiento general y de posibles
comparaciones con investigaciones futuras.
6.2. Propiedades insecticidas del producto
Los resultados de mortalidad en torno al 77% de los adultos de D. melanogaster

expuestos a los extractos de los frutos concuerdan con los obtenidos por varios autores,
sobre el poder antialimentario de M. azedarach. Así, Valladares et al. (1997) evaluaron
tres concentraciones (2, 5 y 10%), que tuvieron un efecto antialimentario en adultos de
38
Xanthogaleruca luteola (Müller) (Coleoptera: Chrysomelidae), que varió desde 75% hasta
un 100% de inhibición con la concentración mayor.
Los análisis estadísticos indicaron que el uso de etanol o agua como solvente para
elaborar extractos insecticidas a base de M. azedarach no influye significativamente en la
mortalidad de D. melanogaster. No obstante, los cuadros y figuras evidencian la
superioridad de los extractos obtenidos con etanol en vez de agua, sin importar los
estados de madurez y concentraciones evaluados. Esto puede deberse a que existe una
leve diferencia de efectos entre los solventes utilizados en ensayos, aunque no
perceptible estadísticamente.
Las concentraciones más eficaces obtenidas en esta investigación contrastan con

las de Vergara et al. (1997), quienes evaluaron extractos etanólicos de M. azedarach
sobre el crustáceo Artemia salina (L.) y obtuvieron resultados favorables con
concentraciones muy bajas, con niveles entre 1.000 a 3.000 ppm. Esto se explica por la
estrecha relación entre el clima y la acumulación de compuestos insecticidas en esta
especie y la sensibilidad del organismo animal objeto de estudio, según indican Espinosa
y Villaseñor (2002).
Por otra parte, la prueba Probit sobre el EM1 corroboró también la efectividad del
etanol. Considerando los dos solventes, las dosis para matar el 50% de los individuos
fluctuaron entre 2.071 y 4.382 ppm. Estos resultados son similares a los de Vergara et al.
(1997), quienes determinaron un óptimo aproximado para sobre Spodoptera frugiperda J.
E. Smith (Lepidoptera: Noctuidae) de 3.000 ppm. Pero al igual que lo comentado en los
puntos anteriores, estos niveles son mayores que los obtenidos en otras latitudes o en
estados inferiores de desarrollo del insecto. Como ejemplo, Muñoz et al. (1998),
obtuvieron DL50 inferiores a 1.000 ppm para larvas de la polilla del brote del pino,
Rhyacionia buoliana Den et Schiff.
La acción repelente de los extractos insecticidas y las malformaciones presentadas

por algunos individuos fueron similares a las observadas por Rodríguez y Vendramim
(1998). Estos autores comprobaron que el mecanismo de actividad de la gran mayoría de
las substancias a base a M. azedarach consiste en inhibir la acción de las oxidasas en el
intestino medio. Por ello, el insecto juvenil se convierte en pupa o adulto anormal por la
deficiencia de nutrientes o interferencia en los procesos fisiológicos, o bien muere.
39
Por otro lado, Vergara et al. (1997), Rodríguez (1999) y Gusberti et al. (2000),
sostienen que los efectos combinados de los compuestos en el fruto son más poderosos
que en forma individual. Esto permite inferir que es mejor un extracto a base del fruto
completo, en vez de aislar el principio activo, dado que al existir un conjunto de
compuestos, no sólo se incrementan las posibilidades de mortalidad de los insectos, sino
que además disminuye la probabilidad que éstos desarrollen resistencia a una mezcla de
ingredientes activos. Por tanto, el uso del fruto completo aumentaría la eficacia del
extracto si se compara con el efecto de cada componente por separado, pues es más
difícil destoxificar un complejo de sustancias que a una única molécula (Islan, 1997).
Al comparar cada tratamiento del EM1 con su similar en el EM2 en el Cuadro 4,

para todos los casos, el extracto elaborado con frutos en EM1 fue más eficiente, logrando
porcentajes mayores de mortalidad con concentraciones menores, siendo indiferente el
solvente o concentración utilizada. Esto se debería al proceso natural de disminución de
los compuestos polifenólicos una vez alcanzado el punto óptimo de madurez del fruto, que
una vez sobrepasado comienzan los cambios por deterioro y descomposición (García,
1999.
Por último, cuando el insecticida se aplica en terreno, las diferencias entre los
solventes a utilizar respecto a su efectividad y costo de elaboración pueden ser
significativas. Si se compara en estos aspectos al agua y etanol, este último presenta
desventajas asociadas principalmente a su mayor costo, a los cuidados que deben tener
los operadores al elaborar el extracto insecticida y a sus propiedades de volatilización.
Las condiciones ambientales que un producto debe soportar ser aplicado en un bioensayo
de laboratorio son controladas, a diferencia de las que ocurren en un vivero, plantación
forestal o cultivo agrícola, donde generalmente ocurren inclemencias climáticas. En este
sentido, el agua sería superior al etanol por su grado de volatilización menor, con lo que el
producto permanece más tiempo en el lugar aplicado. Estas observaciones son
compartidas por Rodríguez (1997) y Rodríguez et al. (2003), quienes indican que la
volatilización del solvente a utilizar es importante para lograr los efectos deseados en la
población de insectos perjudiciales. Todos estos factores favorecerían el uso del agua
para elaborar el extracto insecticida a nivel masivo, puesto que presenta cualidades
globales más favorables que el etanol.
40
6.3. Tendencia de mortalidad de Drosophila melanogaster
La regresión polinómica se ajustó mejor a la tendencia de mortalidad acumulada

de D. melanogaster, pues esta mortalidad fue incrementándose con el transcurso de los
días. Las moscas dejaron primero de comer por el efecto antialimentario, con un lapso de
tiempo en que soportaron la falta de alimentación para posteriormente comenzar a morir.
Si bien la Figura 5 presenta ecuaciones de mortalidad, éstas son exclusivas del
experimento dado que la composición del extracto varía según la procedencia del material
con que fue elaborado, lo que conlleva a extractos insecticidas con cualidades similares
pero con diferencias en la velocidad y efectividad de acción.
6.4. Análisis de polifenoles
Con los resultados obtenidos sólo se identificó en forma preliminar dos

compuestos fenólicos, catequina y kaempferol, pertenecientes a los grupo de los flavanos
3-oles y a los flavonoles, respectivamente. Ambos constituyen parte de los compuestos
llamados flavonoides, grupo al cual Izco (1998) y Troiani (2003) adjudican parte de los
efectos insecticidas de los vegetales. Los compuestos identificados en este estudio son
asociados principalmente al sabor y cualidades antioxidantes y prooxidantes, como lo
menciona Pérez (2003) en un estudio de flavonoides desarrollado para evaluar cualidades
antioxidantes y prooxidantes de dichos compuestos. Se sugiere continuar con esta línea
de investigación, que permitiría conocer los compuestos responsables de las cualidades
insecticidas de los frutos de M. azedarach y contribuir con ello al manejo integrado de
plagas vía insecticidas botánicos.
41
7. CONCLUSIONES
 Las características físicas del fruto, específicamente peso y diámetro de M.

azedarach con que se trabajó en este estudio fueron inferiores a los de estudios
similares con frutos de climas tropicales.
 El análisis proximal de ambos estados de madurez del fruto determinó un aumento

leve en el contenido de cenizas y fibra cruda en el transcurso de este proceso.
 Los extractos del fruto de M. azedarach evaluados mediante bioensayos de

laboratorio fueron eficaces como bioinsecticidas, y alcanzaron mortalidades de D.
melanogaster de hasta 77% con el EM1, etanol y las concentraciones de 7.500 y
10.700 ppm.
 Las mortalidades de D. melanogaster por efecto de los extractos a base de etanol

fueron superiores a las obtenidas con agua, para un mismo estado de madurez de
los frutos de M. azedarach, con excepción del EM2 con la concentración menor
(3.200 ppm), que tuvieron la misma mortalidad con ambos solventes. Sin
embargo, estas diferencias en mortalidad con etanol y agua no se reflejaron en el
análisis estadístico.
 En general, en los bioensayos con extractos no hubo descendencia viable de D.

melanogaster. Algunos individuos que sí se reprodujeron dieron origen a insectos
incapaces de desarrollarse o con malformaciones en sus alas.
 La menor dosis letal para matar al 50% de los individuos de D. melanogaster

(DL50) se logró con los extractos de EM1 con etanol (2.071 ppm).
 La mortalidad acumulada de D. melanogaster aumentó paulatinamente con el

transcurso de los días. Al comienzo los insectos se alimentaban de los extractos,
pero luego se manifestaba el efecto antialimentario del producto insecticida, hasta
producirse su muerte.
42
 En el análisis de polifenoles de los frutos de M. azedarach se encontraron
preliminarmente 14 compuestos, identificándose tres posibles flavonoides, una
catequina y dos kaempferol.
 En futuras investigaciones se recomienda hacer pruebas de campo, para ver el

efecto de los extractos en condiciones reales de aplicación. También se sugiere
continuar con la búsqueda de los compuestos químicos en extractos del fruto de
M. azedarach, a fin de incluirlos en control integrado de plagas.
43
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49
APÉNDICE 1. Análisis Estadístico 1
Modelo de efectos fijos entre el solvente agua y su correspondiente testigo para el EM1
Concentraciones (ppm)
Testigo 3.200 7.500 10.700
Repeticiones to t1 t2 t3
1 2 3 6 8
2 2 5 5 7
3 3 5 7 7
FV gl SC CM RAZON F Razón f tabla

Tratamiento 3 42,00 14,00 18,67 4,07
Error 8 6,00 0,75
total 11 48,00 F0>Fc
gl: grados de libertad
SC: suma de cuadrados
CM: cuadrados medios
Test de Rangos Múltiples de Duncan

T3 T2 T1 T0
7,33 6,00 4,33 2,33
T0 2,33 5,00* 3,67* 2,00* -
T1 4,33 3,00* 1,67* -
T2 6,00 1,33 -
T3 7,33 -
* Existe diferencia estadística.
Tratamientos Resultados
t0 C
t1 B
t2 A
t3 A
Tratamientos con letras iguales no acusan diferencia significativa al nivel 0,05
50
Modelo de efectos fijos entre el solvente etanol y su correspondiente testigo para el EM1
Testigo 3.200 7.500 10.700
1 3 5 8 10
2 2 6 7 4
3 2 6 8 9

Tratamiento 3 57,00 19,00 6,71 4,07
error 8 22,67 2,83
T3 T2 T1 T0
7,67 7,67 5,67 2,33
T0 2,33 5,33* 5,33* 3,33* -
T1 5,67 2,00 2,00 -
T2 7,67 0,00 -
T3 7,67 -
t0 B
t1 A
t2 A
t3 A
51
Modelo de efectos fijos entre el solvente agua y su correspondiente testigo para el EM2
Testigo 3.200 7.500 10.700
1 0 3 5 5
2 0 1 3 6
3 0 1 3 5
FV gl SC CM ECM RAZON F Razón f tabla

Tratamiento 3 48,67 16,22 21,630 4,066
error 8 6,00 0,75

T3 T2 T1 T0
5,33 3,67 1,67 0,00
T0 0,00 5,33* 3,67* 1,67* -
T1 1,67 3,67* 2,00* -
T2 3,67 1,67* -
T3 5,33 -
t0 D
t1 C
t2 B
t3 A
52
Modelo de efectos fijos entre el solvente etanol y su correspondiente testigo para el EM2
Testigo 3.200 7.500 10.700
1 0 2 5 6
2 1 2 4 6
3 1 1 4 7

Tratamiento 3 59,58 19,86 59,58 4,07
Error 8 2,67 0,33

T3 T2 T1 T0
6,33 4,33 1,67 0,67
T0 0,67 5,67* 3,67* 1,00 -
T1 1,67 4,67* 2,67* -
T2 4,33 2,00* -
T3 6,33 -
t0 C
t1 C
t2 B
t3 A
53
APÉNDICE 2. Análisis Estadístico 2
Análisis estadístico bifactorial entre solventes y concentraciones para el EM1
Concentración ppm
promedio
Solvente 3.200 7.500 10.700
a b c
Etanol R1 5 8 10
R2 6 7 4
R3 6 8 9
Agua R1 3 6 8
R2 5 5 7
R3 5 7 7
FV gl SC CM F0 Fc
Tratamiento - 27,11
Concentración 2 20,11 10,06 6,62 3,55
Solvente 1 5,56 5,56 3,66 4,41
Ambos 2 1,44 0,72 0,48 3,55
Error 18 27,33 1,52
Total 23 54,44

c b a
22,5 20,5 15
a 15 7,5* 5,5* -
b 20,5 2 -
c 22,5 -
Concentración Resultados
a B
b A
c A
Concentraciones con letras iguales no acusan diferencia significativa al nivel 0,05
54
Análisis bifactorial entre solventes y concentraciones para el EM2
Concentración promedio
ppm
Solvente 3.200 7.500 10.700
a b c
Etanol R1 2 5 6
R2 2 4 6
R3 1 4 7
Agua R1 3 5 5
R2 1 3 6
R3 1 3 5
FV gl SC CM F0 Fc
Tratamiento - 54,5
Concentración 2 52,33 26,17 58,88 3,55
Solvente 1 1,39 1,39 3,13 4,41
Ambos 2 0,78 0,39 0,87 3,55
Error 18 8,00 0,44
Total 23 62,5

c b a
17,5 12 5
a 5 12,5* 7* -
b 12 5,5* -
c 17,5 -
Concentración Resultados
a C
b B
c A
Concentraciones con letras iguales no acusan diferencia significativa al nivel 0,05
55
ANEXO 1. Medio de cría de Drosophila melanogaster
MEZCLA ÁCIDA Cantidad de medio a preparar

Agua (L) 1/4 1/2 1 2 3 4
Agar-Agar (g) 4 8 16 32 48 64
Sémola (Nutrina) (g) 15 30 60 120 180 240
Levadura seca (g) 3 5 10 20 30 40
Nipagin (mL) * 3 6 12 24 36 48
Azúcar (g) 10,75 21,5 43 86 129 172
Nitrato de sodio (g) 1,05 2,1 4,2 8,4 12,6 16,8
Fosfato de potasio (g) 0,3 0,6 1,2 2,4 3,6 4,8
Cloruro de potasio (g) 0,175 0,35 0,7 1,4 2,1 2,8
Sulfato de magnesio (g) 0,175 0,35 0,7 1,4 2,1 2,8
* Para preparar nipagin de utiliza la relación 1 L de alcohol absoluto por 120 g de nipagin en polvo.
Se ponen todos los ingredientes en un recipiente a excepción del nipagin. El

recipiente se calienta a fuego fuerte sin dejar de revolver; una vez que la mezcla hierve se
espera 10 minutos, sin dejar de revolver. Luego se apaga el fuego y se incorpora el
nipagin a la mezcla. La mezcla obtenida debe ser introducida caliente en los frascos de
cultivo, los cuales deben ser previamente esterilizados. La cantidad promedio de mezcla
por frasco es 24 g. Idealmente se debe utilizar mascarilla para evitar inhalar compuestos
tóxicos.
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UNIVERSIDAD DE CHILE

FACULTAD DE CIENCIAS FORESTALES

ELABORACIÓN Y EVALUACIÓN DE EXTRACTOS DEL FRUTO DE

Memoria para optar al Título

DIEGO REINALDO LIZANA ROJAS

Profesores Guías: Ingeniera Forestal, Dra. Amanda Huerta Fuentes

ELABORACIÓN Y EVALUACIÓN DE EXTRACTOS DEL FRUTO DE

Memoria para optar al Título

DIEGO REINALDO LIZANA ROJAS

Calificaciones: Nota Firma

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3.7. Antecedentes generales sobre Melia azedarach

3.7.1. Descripción botánica y características ecológicas

Melia azedarach fue introducida en Chile con fines ornamentales y se conoce

Figura 1. Melia azedarach. A) Árbol; B) Frutos en racimo. Foto: Diego Lizana R.

De su ecología se ha escrito poco, pero según descripciones generales de su

Entre las características ambientales óptimas para su desarrollo, la altitud óptima

Melia azedarach se desarrolla en suelos preferentemente podzólicos, con

Melia azedarach florece y fructifica cuando alcanza el tamaño de un arbusto.

Las semillas de M. azedarach son muy tolerantes al desecamiento, y llegan a

Melia azedarach también se reproduce vegetativamente por formación de brotes

3.7.2. Propiedades insecticidas

Muchas clases de compuestos naturales, tales como grasas, hidratos de carbono,

Una segunda clase de productos naturales se denominan “metabolitos

La actividad insecticida de M. azedarach se encuentra en hojas, tallos, frutos y

Figura 2. Estructuras moleculares. A) Meliartenin; B) Azadirachtina. Fuente: Maggi, 2004.

La actividad insecticida de M. azedarach se debe a un grupo de triterpenoides

Los insecticidas naturales actúan de manera gradual. Por lo general, ninguna de

El efecto del o los compuestos activos de un insecticida vegetal depende de

El mecanismo de acción de la mayoría de las substancias provenientes de M.