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Hémoglobines
J. Bardakdjian-Michau

Les hémoglobinopathies sont devenues un problème de santé publique en France métropolitaine. Les
biologistes sont de plus en plus souvent appelés à en faire le diagnostic. La drépanocytose est
l’hémoglobinopathie la plus fréquemment rencontrée : 270 nouveau-nés atteints de drépanocytose
naissent en France chaque année. Un dépistage néonatal réservé aux nouveau-nés dont les parents sont
originaires de populations à risque, et une prise en charge thérapeutique de ces enfants ont été mis en
place depuis 1995, dans le cadre du programme national de l’Association française de dépistage et
prévention des handicaps de l’enfant (AFDPHE). L’identification précise des hémoglobines anormales,
maladies génétiques les plus fréquentes dans le monde, fait appel à un ensemble de techniques.
© 2007 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés.

Mots clés : Hémoglobinopathies ; Diagnostic biologique ; Isoélectrofocalisation (IEF) ; Densitométrie ;

Chromatographie liquide haute pression (CLHP)

Plan caractérisée par deux changements majeurs dans la composition

¶ Intérêt physiopathologique
¶ Étape préanalytique
Recueil de l’échantillon, conditions de transport et de conservation 1
Préparation de l’hémolysat
¶ Techniques de dosage et performances des techniques
Techniques de première intention
Examens spécialisés
¶ Interprétation des résultats
Pathologies et traitements interférant avec le taux d’expression de
l’hémoglobine A2
Pathologies et traitements interférant avec le taux d’expression de
l’hémoglobine F
■ Intérêt physiopathologique
Les hémoglobinopathies sont le plus souvent responsables
d’anémies hémolytiques. Les thalassémies et les hémoglobines
anormales, dont la plus fréquente est la drépanocytose, sont
endémiques dans certaines populations (origine africaine,
antillaise, méditerranéenne, asiatique), mais elles sont de plus
en plus souvent rencontrées, en raison des mouvements de
populations, en France comme dans tous les pays d’Europe du
Nord.
La drépanocytose est l’hémoglobinopathie la plus fréquem-
ment rencontrée : 270 nouveau-nés atteints de drépanocytose
naissent en France chaque année. Un dépistage néonatal réservé
aux nouveau-nés [1] dont les parents sont originaires de popu-
lations à risque, et une prise en charge thérapeutique de ces
enfants ont été mis en place depuis 1995, dans le cadre du
programme national de l’Association française de dépistage et
prévention des handicaps de l’enfant (AFDPHE).
Les maladies génétiques de l’hémoglobine sont dues princi-
palement à des mutations survenant soit au niveau des gènes
alpha (au nombre de 4 : a a /a a) soit des gènes bêta de globine
(qui sont 2 : b/b). La synthèse d’hémoglobine chez l’homme est
de l’hémoglobine (commutation : switch). Pendant les 3 pre-
miers mois de la gestation, les globules rouges humains
1
contiennent des hémoglobines embryonnaires. Ultérieurement
1 l’hémoglobine fœtale (HbF) prédomine (90 à 95 %) par rapport
à l’hémoglobine adulte (HbA) (5 à 10 %). Dès la 30e semaine
2 d’aménorrhée la synthèse d’HbF décline au profit de l’HbA, si
3 bien qu’à la naissance le pourcentage d’HbA est de 15 à 30 %,
3 Le switch est effectué à 90 % à 6 mois et à 95 % à 1 an. Il se
4 termine vers 5-6 ans avec une concentration résiduelle d’HbF de
4 0,1 à 1 %. La composition normale définitive de l’Hb est :
(HbA : a2b2, environ 97 %), HbA2 (a2d2, 2,2 à 3,2 %), et une
5 proportion d’HbF (HbF : a2c2, < 1 %) caractéristique de chaque
individu.
5 Les thalassémies a et b sont le résultat de modifications
survenues au niveau des gènes des globines correspondants,
aboutissant à une diminution ou une absence de synthèse des
chaînes a ou b de la globine.
Il existe une grande variété d’hémoglobines dites anormales,
c’est-à-dire comportant une modification dans la séquence
polypeptidique. Dans 95 % des cas, l’hémoglobine mutée est le
résultat de la substitution d’une seule base au niveau de l’ADN.
Trois quarts de ces modifications n’ont aucune conséquence
pathologique à l’état hétérozygote. On dénombre à ce jour, plus
de 800 variants de l’hémoglobine. Ces hémoglobines anormales
ont été découvertes soit chez des patients présentant des
manifestations cliniques ou biologiques, soit de manière fortuite
au cours d’une exploration électrophorétique ou chromatogra-
phique chez des patients explorés pour des raisons hématologi-
ques, génétiques ou métaboliques. Un certain nombre de ces
variants ont d’intéressantes caractéristiques de génétique
épidémiologique : (HbS, HbC, HbE, HbOarab).
■ Étape préanalytique
Recueil de l’échantillon, conditions
de transport et de conservation
Le sang prélevé est placé dans un récipient contenant un
anticoagulant, ACD (adénine-citrate-dextrose) de préférence ou

Biologie clinique 1
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EDTA. Un volume de 5 ml de sang est suffisant pour une étude
de l’hémoglobine par les méthodes classiques ; un volume
minimum de 500 µl est nécessaire pour les prélèvements
pédiatriques. Dans tous les cas il est nécessaire de respecter les
proportions de 1 volume ACD pour 4 volumes de sang (1/5). À
+ 4 °C l’échantillon de sang total se conserve au maximum
8 jours, il ne faut pas congeler l’échantillon mais l’analyser le
plus rapidement possible. La date de prélèvement, l’identifica-
tion du patient et sa date de naissance sont à mentionner sur
les tubes. En cas de recherche d’une hémoglobinopathie par
instabilité, l’échantillon est à traiter dans les 2 à 3 heures qui
suivent le prélèvement. Tout prélèvement doit impérativement
être accompagné de la feuille de demande d’examens avec les
renseignements indispensables (Fig. 1).
Préparation de l’hémolysat
Préparation de l’hémolysat à partir d’un culot
globulaire lavé
Pour les techniques classiques (électrophorèses), il faut
préparer un hémolysat soigneusement débarrassé des protéines
2 Biologie clinique
Figure 1. Fiche de renseignement
pour la recherche d’une anomalie de
l’hémoglobine.
plasmatiques et des stromas globulaires. Les globules rouges
sont lavés avec une solution de NaCl à 0,9 % (5 volumes NaCl
pour 1 volume de sang total bien homogénéisé). Le mélange est
homogénéisé par retournements successifs, centrifugé à environ
3 000 tours/min (10 minutes) à 4 °C et le surnageant est éliminé
en veillant à aspirer la couche cellulaire supérieure pour
éliminer les globules blancs. La préparation des hémolysats doit
se faire juste avant la migration électrophorétique. Une fraction
du culot globulaire est ajoutée à la solution hémolysante
contenant un détergent, selon les indications techniques
fournies par le fabricant. Le mélange est agité vigoureusement
(vortex) puis centrifugé à grande vitesse.
Préparation de l’hémolysat à partir de sang total
non lavé
Cette technique de préparation des hémolysats est indiquée
pour la chromatographie liquide de haute performance (CLHP)
en échange d’ions (système Variant® Biorad ou autre). Le mode
de préparation de l’hémolysat est précisé par le fabricant,
généralement 5 µl de sang total prélevés sur anticoagulant sont
dilués dans 1 ml de la solution hémolysante préconisée par le

Figure 2. Techniques de première intention pour la recherche d’une
anomalie de l’hémoglobine.
Figure 3. Électrophorèse sur acétate de cellulose à pH alcalin.
* % d’HBA2 déterminé par CLHP.
fabricant. En cas de suspicion d’un pic artefactuel, il est
conseillé de faire un contrôle sur globules rouges lavés.
■ Techniques de dosage
et performances des techniques [2]
Techniques de première intention
Les stratégies sont fonction de l’équipement du laboratoire.
La Figure 2 présente le principe d’une recherche d’une
anomalie de l’hémoglobine en première intention [3].
La pratique d’une seule technique (CLHP seule ou électro-
phorèse à pH alcalin seule) n’est pas recommandable, et, de
plus, un profil normal, quel que soit le système utilisé, ne
permet pas d’éliminer un mutant de l’hémoglobine. Ainsi, pour
exemples, les hémoglobines S et D ont la même migration en
électrophorèse sur acétate de cellulose (Fig. 3) mais sont séparées
dans d’autres systèmes ; en CLHP plusieurs mutants sont coélués
avec l’HbA, l’HbA2 ou l’HbF.
Il convient de tenir compte de l’âge du patient, en effet avant
l’âge de 3 mois, la présence majoritaire d’HbF diminue forte-
ment la sensibilité de l’électrophorèse à pH alcalin qu’il faut
remplacer impérativement par une isoélectrofocalisation
(Fig. 4) [4] complétée d’une électrophorèse sur Agar à pH acide
(Fig. 5) ou une chromatographie CLHP (Fig. 6) pour quantifica-
tion et identification.
Pour un dépistage en urgence chez une personne à haut
risque de drépanocytose, la stratégie suivante est préconisée :
Biologie clinique
Hémoglobines ¶ 90-10-0505
Figure 4. Isoélectrofocalisation en gel d’agarose (Isolab®).
Figure 5. Électrophorèse sur gel d’agar à pH = 6.
CLHP + test de solubilité (Itano), complétée ensuite par les
autres tests. Il est recommandé de ne faire l’analyse qu’à
distance de transfusions (3 mois minimum), sauf indications
particulières, et de confronter les résultats aux données clini-
ques, hématologiques et ethniques.
Les techniques de quantification des fractions HbA2 et HbF
par densitométrie des bandes d’électrophorèse sont à proscrire.
L’HbA2 est mesurable par CLHP [5] (thermostatée) par échange
d’ions ou par chromatographie sur microcolonnes, malheureu-
sement sensibles aux variations de température ambiante. Le
dosage d’HbF est réalisable par CLHP ou par la technique de
Betké [6] de résistance à la dénaturation alcaline, méthode valide
lorsque l’HbF est < 15 %.
Il est indispensable de mettre en place un contrôle de qualité
interne pour d’une part s’assurer de la correcte identification des
hémoglobines normales ou anormales et d’autre part valider la
répartition quantitative des différentes hémoglobines. Il peut
s’agir d’échantillons de contrôle achetés dans le commerce
(témoin AFSC Héléna pour les électrophorèses et la vérification
des temps de rétention en CLHP ; Lyphocheck® BioRad pour le
dosage de l’hémoglobine A2) ou d’échantillons analysés dans les
séries précédentes ou par une autre technique. Les échantillons
témoins doivent être conservés à – 20 °C pendant 1 mois
maximum ou à – 80 °C pendant quelques mois. Les échan-
tillons de contrôle de qualité doivent être différent des
calibrants.
Quelle que soit la technique utilisée, il faut toujours s’entou-
rer d’échantillons témoins (A, F, S, C) à raison minimale de
1/bande d’électrophorèse et 1/20 échantillons pour les analyses
en série, et tenir compte des valeurs de références recomman-
dées dans la trousse utilisée.
3
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Figure 6. Profils en chromatographie liquide haute performance (CLHP) sur colonne échangeuse de cations (programme b thal BioRad®).
A. Profil CLHP A/S.
B. Profil CLHP A/E.
C. Profil CLHP A/C.
Test de solubilité de l’HbS
[7]
Le test d’Itano de solubilité de l’HbS est essentiel pour
confirmer la présence d’HbS, et repose sur le principe que seule
l’HbS déoxygénée précipite. Quelques précautions sont à
respecter :
• travailler toujours par comparaison à un échantillon témoin
HbA ;
• il est indispensable d’éliminer soigneusement les stromas
globulaires ; leur présence peut provoquer l’apparition d’un
trouble dans le tube réaction et dans le tube témoin ;
• de fausses réactions négatives sont observées avec des hémo-
lysats trop dilués avec une concentration d’HbS égale ou
inférieure à 20 % ou en présence d’un pourcentage important
de méthémoglobine ;
• et toujours s’assurer de la qualité des réactifs (saponine,
hydrosulfite de sodium : à conserver sous dessiccateur) et
respecter les conditions opératoires (température).
Le test de falciformation peut être une alternative au test
d’Itano. Il doit toujours être confronté à un hémogramme et à
un frottis de sang frais coloré au May-Grünwald-Giemsa.
Examens spécialisés
Ils ne peuvent être pratiqués que dans les laboratoires
spécialisés qui maîtrisent les causes d’erreurs expérimentales et
l’interprétation des résultats. Tous ces examens sont faits sur
rendez-vous.
Test de stabilité
Les forces de cohésion internes de la molécule d’hémoglobine
diminuent dans un milieu apolaire ; le test à l’isopropanol est
le test de référence. Il doit être pratiqué sur un échantillon frais
ou conservé à + 4 °C depuis moins de 6 heures avec un témoin
prélevé dans les mêmes conditions. Le protocole à suivre est
celui décrit par Carrell et Kay [8]. Il existe des causes de faux
positifs : HbF, metHb, chaînes libres (HbH ou Bart’s), précipita-
tion des protéines non héminiques chez des patients ayant une
forte réticulocytose ; et de faux négatifs : hémoglobines hype-
rinstables, hémolysats extraits par des solvants, échantillons
non conformes. Il existe des variants légèrement instables in
vitro, sans retentissement hématologique ou clinique.
Mesure de l’affinité pour l’oxygène
La recherche d’une hémoglobine à affinité modifiée est à
effectuer dans le cadre soit d’une polyglobulie vérifiée par la
mesure de la masse sanguine, soit d’une anémie chronique
inexpliquée. Une étude de l’hémoglobine comportant isoélec-
trofocalisation, électrophorèse de globine en présence d’urée/
triton, et une étude de l’hémolysat par CLHP échange de
4 Biologie clinique
cations et CLHP en phase inverse permettent habituellement de
mettre en évidence la fraction d’hémoglobine anormale quand
elle existe. Cette étude doit être précédée par un calcul de la
P50 par co-oxymétrie sur sang veineux et par un dosage du
2-3DPG. L’étude fonctionnelle de l’hémoglobine est à réserver
aux cas déjà bien documentés. Les causes d’erreurs sur prélève-
ments de sang total sont multiples (pH anormal, taux de
2-3DPG diminué lors de la conservation, HbCO chez les
fumeurs ou pour d’autres expositions chroniques au CO,
oxydation [metHb] due aux conditions de conservation ou à des
problèmes toxiques).
Dosages chromatographiques particuliers
L’exemple est la caractérisation des chaînes de globines en
CLHP en phase inverse [9], particulièrement intéressante pour le
typage des hémoglobines embryonnaires et fœtales et l’analyse
de chaînes mutantes.
Analyse spectrophotométrique pour la mise en évidence
de la méthémoglobine
Lorsque le fer de l’hémoglobine passe sous forme oxydée
(Fe +++ ), il y a formation de méthémoglobine impropre au
transport de l’oxygène, détectable par l’étude spectrophotomé-
trique à 630 nm avec et sans KCN. Cette détection, au cours des
intoxications comporte un caractère d’urgence en vue de la
mise en place d’un traitement adéquat. Certains appareils de
gazométrie sanguine permettent la mise en évidence de méthé-
moglobine. L’étude spectrale dans le visible et l’UV proche
permet l’identification des HbM.
Place de la biologie moléculaire
L’étude de l’ADN n’est indispensable que pour la caractérisa-
tion des syndromes drépanocytaires majeurs, des b- ou
a-thalassémies et des mutants non identifiables par les métho-
des protéiques.
La transmission des principales hémoglobinopathies se fait
selon un mode autosomique récessif. Le but ultime du dépistage
de porteurs sains est d’identifier, non pas des porteurs sains
isolés, mais des couples dont les deux membres sont porteurs et
qui présentent donc un risque sur quatre à chaque grossesse de
donner naissance à un enfant malade.
■ Interprétation des résultats
L’interprétation des résultats peut être difficile. En particulier
pour connaître l’étiologie d’une microcytose : en cas de carence
en fer ou en l’absence de renseignement concernant le statut
martial, en cas de carence en folates qui peut masquer la
microcytose, ou en cas de transfusion récente, le résultat doit
être alors assorti de réserves.

Pathologies et traitements interférant avec
le taux d’expression de l’hémoglobine A2
À partir de l’âge de 6 mois et en l’absence de toute hémoglo-
binopathie, le taux d’HbA2 est de 2,2 à 3,2 %. Son dosage n’est
pas réalisable en présence d’un mutant lent de l’hémoglobine
coéluant avec cette fraction : HbE, HbD Korle-Bu, ...
Dans certaines circonstances, le taux d’expression de l’HbA2
peut se trouver modifié.
Absence complète d’expression de l’HbA2 : cette situation se
produit dans les cas rares de d ou d-b-thalassémies homozygotes
ou de certains variants de l’HbA2 à l’état homozygote.
Diminution d’expression de l’HbA2 : inférieure à 2 %, chez les
patients a-thalassémiques (3 gènes a non fonctionnels : HbH),
lors d’une carence martiale profonde, chez les porteurs d’une
d-b-thalassémie, lors de la présence de certains mutants des
chaînes a ou d de l’hémoglobine, dans les anémies sidéroblasti-
ques congénitales et de manière « artefactuelle » pour des
échantillons ayant des modifications post-traductionnelles ou
« vieillis ».
Augmentation d’expression de l’HbA2 : supérieure ou égale à
3,2 %, il peut s’agir :
• d’une augmentation d’origine génétique, le plus souvent
associée à une microcytose chez les porteurs d’un trait
b-thalassémique, parfois chez les patients b-thalassémiques
intermédiaires (l’HbF est alors augmentée) ;
• des augmentations non génétiques du taux de l’HbA2, sans
microcytose associée, et retrouvées dans l’hyperthyroïdie non
traitée, chez les patients traités par antiviraux, dans les
anémies mégaloblastiques ;
• d’augmentations « artefactuelles » de l’HbA2 par contamina-
tion : l’hémoglobine peut subir de nombreuses modifications
post-traductionnelles (glycation, carbamylation par l’urée ou
l’hydroxyurée, désamination, fixation de glutathion, ...), ce
qui génère des fractions d’élution plus rapide en CLHP par
échange de cations. Quand un mutant d’élution plus lente
que l’HbA2 est présent, l’HbA2 est contaminée par les frac-
tions mineures de ce mutant ; c’est le cas, chez les porteurs
du trait drépanocytaire (A/S), les syndromes drépanocytaires
majeurs et les patients porteurs d’autres mutants lents (HbD,
HbC, HbOarab...).
Pathologies et traitements interférant avec
le taux d’expression de l’hémoglobine F
Une légère augmentation de l’HbF (< 3 %) peut persister
jusqu’à l’âge de 5 ans, en l’absence de toute hémoglobinopa-
thie. L’HbF est constituée de deux fractions : une fraction
majeure (HbF0) et une fraction mineure acétylée (HbF1, 9 à
12 %). Lors du dosage en CLHP, la fraction quantifiée identifiée
comme HbF correspond à la fraction plus tardive d’HbF0.
J. Bardakdjian-Michau (josiane.michau@hmn.aphp.fr).
Laboratoire de Biochimie, Hôpital Henri-Mondor, 51, avenue du Maréchal-de-Lattre-de-Tassigny, 94010 Créteil, France.
Toute référence à cet article doit porter la mention : Bardakdjian-Michau J. Hémoglobines. EMC (Elsevier Masson SAS, Paris), Biologie clinique, 90-10-0505,
2007.
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Biologie clinique
Hémoglobines ¶ 90-10-0505
Les augmentations constitutionnelles de l’HbF sont consti-
tuées par les persistances héréditaires de l’hémoglobine fœtale
(PHHF), les d-b-thalassémies délétionnelles ou non délétionnel-
les, les b-thalassémies, les syndromes drépanocytaires majeurs,
les dysérythropoïèses congénitales et certaines hémolyses
congénitales.
Les augmentations acquises de l’HbF sont observées lors des
perturbations de l’hématopoïèse avec participation érythroïde
(hémolyses acquises, dysmyélopoïèses acquises spontanées ou
secondaires, anémie de Fanconi, anémie aplastique, hémoglobi-
nurie paroxystique nocturne, chimiothérapies [hydroxyurée,
5-azacytidine, butyrate...] ou traitement par l’acide valproïque),
mais également lors de la grossesse, le diabète ou l’hyperthyroï-
die, ou lors des phases de récupération des anémies carentielles.
Lors du dosage de cette fraction en CLHP, l’HbF peut être
contaminée, soit par les fractions glyquées de l’HbA, soit par la
lactescence de l’échantillon. Dans certains cas, un mutant
rapide d’Hb peut être élué en position de l’HbF. Les échantillons
vieillis peuvent également augmenter « artefactuellement » le
taux d’HbF. La méthode de Betké permet alors un diagnostic
différentiel.
■ Références
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politaine. Association française pour le dépistage et la prévention des
handicaps de l’enfant (AFDPHE)]. Arch Pediatr 1996;3:1026-31.
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characterisation of seventy variants, and to the study of modified frac-
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liquid-chromatography for presumptive identification of haemoglobin
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high performance liquid chromatography: recent developments.
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légaux au patient supplémentaires évaluations
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