Manual de Medios de Cultivo

GENERALIDADES DE LAS BACTERIAS Y MEDIOS UTILIZADOS
Uno de los sistemas más importantes para la identificación de

microorganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias
artificiales preparadas en el laboratorio. El material alimenticio en el que
crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento de los
microorganismos es el Cultivo. Se han preparado más de 10.000 medios de
cultivo diferentes.
Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial

debe reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de
humedad y presión de oxígeno adecuadas, así como un grado correcto de
acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y
factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de todo
microorganismo contaminante.
La mayoría de las bacterias patógenas requieren nutrientes complejos

similares en composición a los líquidos orgánicos del cuerpo humano. Por eso,
la base de muchos medios de cultivo es una infusión de extractos de carne y
Peptona a la que se añadirán otros ingredientes.
El agar es un elemento solidificante muy empleado para la

preparación de medios de cultivo. Se licua completamente a la
temperatura del agua hirviendo y se solidifica al enfriarse a 40
grados. Con mínimas excepciones no tiene efecto sobre el
crecimiento de las bacterias y no es atacado por aquellas que
crecen en él.
La Gelatina es otro agente solidificante pero se emplea mucho

menos ya que bastantes bacterias provocan su licuación.
En los diferentes medios de cultivo se encuentran numerosos

materiales de enriquecimiento como hidratos de carbono, suero, sangre
completa, bilis, etc. Los hidratos de Carbono se adicionan por dos motivos
fundamentales: para incrementar el valor nutritivo del medio y para detectar
reacciones de fermentación de los microorganismos que ayuden a
identificarlos. El suero y la sangre completa se añaden para promover el
crecimiento de los microorganismos menos resistentes.
También se añaden colorantes que actúan como indicadores para detectar, por
ejemplo, la formación de ácido o como inhibidores del crecimiento de unas
bacterias y no de otras (el Rojo Fenol se usa como indicador ya que es rojo en
pH básico y amarillo en pH ácido. La Violeta de Genciana se usa como
inhibidor ya que impide el crecimiento de la mayoría de las bacterias Gram-
positivas).
CONDICIONESS GENERALES PARA EL CULTIVO DE

MICROORGANISMOS
El desarrollo adecuado de los microorganismos en un medio de cultivo se ve

afectado por una serie de factores de gran importancia y que, en algunos casos,
son ajenos por completo al propio medio.
Disponibilidad de nutrientes adecuados
Un medio de cultivo adecuado para la investigación microbiológica ha de

contener, como mínimo, carbono, nitrógeno, azufre, fósforo y sales
inorgánicas. En muchos casos serán necesarias ciertas vitaminas y otra
sustancia inductoras del crecimiento. Siempre han de estar presentes las
sustancias adecuadas para ejercer de donantes o captadores de electrones para
las reacciones químicas que tengan lugar.
Todas estas sustancias se suministraban originalmente en forma de infusiones

de carne, extractos de carne o extractos de levadura. Sin embargo, la
preparación de estas sustancias para su aplicación a los medios de cultivo
provocaba la pérdida de los factores nutritivos lábiles.
Actualmente, la forma más extendida de aportar estas sustancias a los medios

es utilizar peptona que, además, representa una fuente fácilmente asequible de
nitrógeno y carbón ya que la mayoría de los microorganismos, que no suelen
utilizar directamente las proteínas naturales, tienen capacidad de atacar los
aminoácidos y otros compuestos más simples de nitrógeno presentes en la
peptona.
Ciertas bacterias tienen necesidades nutritivas específicas por lo que se añade

a muchos medios sustancias como suero, sangre, líquido ascítico, etc
Igualmente pueden ser necesarios ciertos carbohidratos y sales minerales
como las de calcio, magnesio, manganeso, sodio o potasio y sustancias
promotoras del crecimiento, generalmente de naturaleza vitamínica.
Muy a menudo se añaden al medio de cultivo ciertos colorantes, bien como

indicadores de ciertas actividades metabólicas o bien por sus capacidades de
ejercer de inhibidores selectivos de ciertos microorganismos.
Consistencia adecuada del medio
Partiendo de un medio líquido podemos modificar su consistencia añadiendo

productos como albúmina, gelatina o agar, con lo que obtendríamos medios en
estado semisólido o sólido.
Los medios solidificados con gelatina tienen el gran inconveniente de que

muchos microorganismos no se desarrollan adecuadamente a temperaturas
inferiores al punto de fusión de este solidificante y de que otros tienen la
capacidad de licuarla.
Actualmente los medios sólidos son de uso universal, por su versatilidad y

comodidad, pero hay también gran cantidad de medios líquidos cuyo uso está
ampliamente extendido en el laboratorio.
Presencia (o ausencia) de oxígeno y otros gases
Gran cantidad de bacterias pueden crecer en una atmósfera con tensión de

oxígeno normal. Algunas pueden obtener el oxígeno directamente de variados
sustratos. Pero los microorganismos anaerobios estrictos sólo se desarrollarán
adecuadamente en una atmósfera sin oxígeno ambiental. En un punto
intermedio, los microorganismos microaerófilos crecen mejor en condiciones
atmosféricas parcialmente anaerobias (tensión de oxígeno muy reducida),
mientras los anaerobios facultativos tienen un metabolismo capaz de adaptarse
a cualquiera de las citadas condiciones.
Condiciones adecuadas de humedad
Un nivel mínimo de humedad, tanto en el medio como en la atmósfera, es

imprescindible para un buen desarrollo de las células vegetativas microbianas
en los cultivos. Hay que prever el mantenimiento de estas condiciones
mínimas en las estufas de cultivo a 35-37ºC proporcionando una fuente
adecuada de agua que mantenga la humedad necesaria para el crecimiento de
los cultivos y evitar así que se deseque el medio.
Luz ambiental
La mayoría de los microorganismos crecen mucho mejor en la oscuridad que

en presencia de luz solar. Hay excepciones evidentes como sería el caso de los
microorganismos fotosintéticos.
pH
La concentración de iones hidrógeno es muy importante para el crecimiento de

los microorganismos. La mayoría de ellos se desarrollan mejor en medios con
un pH neutro, aunque los hay que requieren medios más o menos ácidos. No
se debe olvidar que la presencia de ácidos o bases en cantidades que no
impiden el crecimiento bacteriano pueden sin embargo inhibirlo o incluso
alterar sus procesos metabólicos normales.
Temperatura
Los microorganismos mesófilos crecen de forma óptima a temperaturas entre

15 y 43ºC. Otros como los psicrófilos crecen a 0ºC y los termófilos a 80ºC o
incluso a temperaturas superiores (hipertermófilos). En líneas generales, los
patógenos humanos crecen en rangos de temperatura mucho más cortos,
alrededor de 37ºC, y los saprofitos tienen rangos más amplios.
Esterilidad del medio
Todos los medios de cultivo han de estar perfectamente estériles para evitar la
aparición de formas de vida que puedan alterar, enmascarar o incluso impedir
el crecimiento microbiano normal del o de los especimenes inoculados en
dichos medios. El sistema clásico para esterilizar los medios de cultivo es el
autoclave (que utiliza vapor de agua a presión como agente esterilizante
.Staphylococcus aureus
Son cocos Gram positivos, aunque en cultivos viejos y células fagocitadas,

pueden presentarse Gram negativo, no esporulado, móviles, de 0.8 a 1 micra
de diámetro. Se divide en varios planos formando agrupaciones en forma de
racimos en medios sólidos; en medios líquidos se pueden observar
individuales o en pares y prefieren los ambientes aerobios mas que anaerobios.
Poseen una enzima β – Lactamasa lo que les confiere resistencia a la
penicilina y algunos de sus derivados. Las cepas de S. aureus que pertenecen
al fagogrupo III. Al desarrollarse en un alimento. Pueden producir una toxina
que es la causante de la intoxicación; esta toxina es estable al calor y no se
destruye durante la cocción de alimentos a 100ºC/15 a 30 minutos, aunque el
microorganismo si aparece a 60ºC/30 minuto, aproximadamente dependiendo
de la cepa y la concentración.
Las cepas perteneciente al fagogrupo II, en general son causante de las

infecciones nosocomiales vehiculizadas por el personal medico, paramédico, y
los implementos utilizados en las practicas diarias. La presencia de este
microorganismo en la piel puede provenir de la piel, la garganta, la nariz de
los manipuladores de los alimentos que actúan como portadores sanos, los
materiales y equipos sucios, materia prima de origen animal contaminadas y
en general por una falta de higiene en los procedimientos. Una alta
concentración de dicho microorganismo en un alimento es buen indicador que
la manipulación, el control sanitario y la temperatura de almacenamiento no
han sido los correctos. El consumo de
alimentos principalmente lácteos, pastel rellenos de cremas, productos de
carnes de res, aves, pescado, jamón y en especial en alimentos excesivamente
manipulados y con deficiencia de higiene, pueden dar origen a la proliferación
de S. aureus con la consecuente formación de toxinas. Causando
Gastroenteritis conocida como: “intoxicación alimentaría por Estafilococo a
intoxicación estafilocócica.”
PRUEBAS BIOQUIMICAS
PRUEBA Staphylococcus
aureus
Coagulasa libre +
Coagulasa ligada +
catalasa +
Voges proskauer +
rojo de metilo -
Acido aeróbica y anaeróbicamente +
a partir del manitol, glucosa,
lactosa y maltosa
Acido aeróbica y anaeróbicamente -
a partir de arabinosa, inositol,
rafinosa, , ramnosa y xilosa
alfatoxina +
Endonucleasas resistentes al calor +
(termonucleasa)
DNasa +
Requerimiento de biotina -
Reducción de nitratos -
Hidrólisis de esculina y almidón -
Hidrólisis de urea, arginina, acido +
glutámico
Descarboxilación de la lisina -
PRUEBA DE COAGULASA
La coagulasa es un enzima capaz de desnaturalizar la fibrina del plasma. La

mayoría de las cepas de Staphylococcus aureus patógenas (enterotoxigénicas)
producen esta enzima. Se añade una suspensión densa de bacterias a un tubo
pequeño con plasma y se incuba a 37 oC. Se observa la coagulación entre las 4
y 24 horas. Esta prueba permite diferenciar Staphylococcus aureus (coagulasa
positivo) del resto de especies de Staphylococcus (coagulasas negativos). La
técnica en tubo detecta coagulasa libre y ligada. El mecanismo de acción de la
coagulasa libre: procoagulasa (enzima extracelular bacteriana) reacciona con
un factor activador presente en el plasma sanguíneo similar a la protombina,
dando lugar a un complejo análogo a la trombina (coagulasa propiamente
dicha) que reacciona con fibrinógeno formando un coágulo de fibrina en
ausencia de Ca2+.La coagulasa ligada o factor de agregación actúa
directamente sobre el fibrinógeno y lo convierte en fibrina. No requiere la
presencia de activadores plasmáticos.
FIG 1-2 parte izquierda negativo (no coagulación), parte derecha positivo (el
contenido no cambia cuando el tubo no es invertido; completa coagulación)
PRUEBA MRVP (rojo metilo Voges-Proskauer)
Las enterobacterias son anaerobios facultativos que utilizarán la glucosa en

dos fases:
1. Metabolismo aeróbico (respiración oxibióntica) consumiendo rápidamente
el oxígeno del medio.
2. Metabolismo anaeróbico (fermentación) que puede ser de 2 tipos

dependiendo de los productos finales obtenidos:
2.1 fermentación ácido-mixta: productos finales son ácidos orgánicos
(Fórmico, acético, láctico y succínico) y etanol
2.2 fermentación butilén glicólica: productos finales son compuestos neutros

como el butanodiol y el etanol, produciéndose acetoína como intermediario.
La liberación de ácidos orgánicos generará un acusado descenso del pH que

podrá ser detectado añadiendo al medio un indicador de pH como el rojo de
metilo (rojo a pH 4.0).Si la fermentación que se ha llevado a cabo produce
acetoína puede ser detectada añadiendo al medio KOH y alfa-naftol que
reaccionarán con este compuesto produciendo rojo característico.
Una coloración roja, indicadora de la presencia de ácidos provenientes de la

fermentación de la glucosa, constituye un resultado positivo, una coloración
amarilla constituye una reacción negativa
FIG 3-4 la parte izquierda muestra la prueba de rojo de metilo sin inocular y
sus respectivos resultados, la parte derecha muestra los reactivos utilizados
en esta prueba.
En la izquierda se observa un tubo sin inocular, en el centro un tubo al cual se

le agregaron los reactivos y su resultado es negativo para rojo de metilo y
positivo para voges-proskauer, en el tubo de la derecha se observa un tubo el
cual una vez agregado los reactivos su resultado es positivo para rojo de
metilo pero negativo para voges-proskauer.
PRUEBA DE UREA
El indicador de pH utilizado es el rojo fenol. Esta prueba detecta la presencia

de la enzima ureasa en el metabolismo bacteriano, la cual al hidrolizar urea
forma productos amoniaco que alcalinizan el medio y se evidencia con el
cambio de color del medio desde un amarillo pálido hasta un rojo fucsia.
La ureasa es una enzima que posee muchas especies de microorganismos que

pueden hidrolizar la urea produciendo amoniaco, CO2 y agua. El amoniaco
reacciona en solución para formar carbonato de amonio. Produciendo una
alcanalización y un aumento de Ph del medio.
La prueba se realiza en agar o caldo de urea. El color inicial del medio:

amarillo anaranjado. En el medio sólido por estría el microorganismo en
estudio. En el medio líquido sembrar por emulsión. Incubar a 37 ºC por 24
horas.
Interpretación
Las bacterias que hidrolizan la urea rápidamente producen reacciones

positivas en 1-2 horas dando un color fucsia en el medio por viraje del
indicador de Ph una prueba negativa presenta un color amarillo-anaranjado en
el medio.
FIG 4-5 muestra los tubos de la prueba de urea donde se resalta positiva
(color fucsia) para Staphylococcus aureus.
En el tubo de la izquierda se observa sin inocular el medio, en el centro uno

con resultado positivo, a la derecha se observa un tubo con resultado negativo
para urea.
DESCARBOXILACION DE LA LISINA
Las enterobacterias, por fermentación de la glucosa producen ácido, el cual

hace virar el indicador a color amarillo. Si la bacteria posee una lisina
descarboxilasa, por la descarboxilación de la lisina se producirá una amina, la
cual neutralizará el ácido producido por la fermentación de la glucosa
retornando el medio a su color original violeta.
El agar hierro lisina permite determinar los microorganismos capaces de

descarboxilar la lisina, produciendo un cambio de color del púrpura de
bromocresol. Sin embargo, esta descarboxilación sólo se puede hacer en un
medio ligeramente ácido, que se consigue con la fermentación de glucosa, por
ello esta prueba está limitada a los microorganismos capaces de utilizar la
glucosa. Cuando el pH del medio baja, el indicador vira a amarillo. Al
alcalinizar el medio debido a la descarboxilación de la lisina, el indicador
(púrpura de bromocresol) vira a rojo púrpura. Los cultivos que contienen
microorganismos capaces de formar Hierro (II) Sulfuro presentan un
precipitado negro. Además pueden aparecer burbujas de gas, que pueden
incluso desplazar el medio.
A B C
FIG 6 muestra los tubos de la prueba de LIA donde podemos resaltar que
para esta prueba Staphylococcus aureus es negativo.
A tubo sin inocular

B resultado positivo
C resultado negativo (Para Staphylococcus aureus)
PRUEBA SIM (SULFURO INDOL MOTILIDAD)

FI
G
7-8-9 y 10 muestran los tubos con la prueba de SIM con sus respectivos
resultados para: sulfuro, indol y motilidad además de su color inicial,
demostrándose que esta prueba es negativa para Staphylococcus aureus.
En este medio se estudia si el microorganismo tiene o no, la presencia de

flagelos los cuales se manifiesta con un crecimiento alrededor de la punción
que se observa en forma de una sombrilla. Por lo que se dice que es motilidad
positiva, también se utiliza para comprobar si el microorganismo produce
H2S, tomando así el medio una coloración negra.
La prueba de indol se emplea para detectar la presencia de la enzima

triptofanasa en bacterias, que degrada el aminoácido triptófano a indol. Al
añadir al medio SIM el reactivo de Kovacks o de Erlich que contiene p-
dimetilaminobenzaldehído, reacciona tanto con el indol como con el triptófano
produciendo compuestos de color rojizo. Para evitar la interferencia del
triptófano, el reactivo está disuelto en alcohol isoamílico inmiscible en agua.
A diferencia del triptófano, el indol es soluble en el alcohol y sólo este
compuesto reaccionará con el aldehído produciendo el anillo coloreado
característico de esta prueba.
CITRATO DE SIMMONS
Esta prueba sirve para determinar si un organismo es capaz de utilizar citrato

como única fuente de carbono y compuestos amoniacales como única fuente
de nitrógeno en su metabolismo, provocando una alcalinización del medio.
Entre las enterobacterias estas características se dan en los siguientes géneros:
Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Citrobacter y algunas especies de
Salmonella. Sin embargo, Escherichia, Shigella, Salmonella typhi y
Salmonella paratyphi son incapaces de crecer con esos nutrientes.
Se cultiva el microorganismo en agar citrato de Simmons. Este medio contiene

citrato de sodio y fosfato de amonio como fuentes de carbono y de nitrógeno
respectivamente y azul de bromotimol como indicador de pH.
Sólo las bacterias capaces de metabolizar el citrato podrán multiplicarse en

este medio y liberarán iones amonio lo que, junto con la eliminación del
citrato (ácido), generará una fuerte basificación del medio que será aparente
por un cambio de color del indicador de pH, de verde a azul.
FIG 11-12 Y 13 se muestran los tubos con la prueba de citrato con sus
respectivos resultados, además de su color inicial resaltándose que para esta
prueba Staphylococcus aureus es negativo.
CATALASA
Se utiliza para comprobar la presencia del enzima catalasa que se encuentra el

la mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas que contienen
citocromo. La principal excepción es Streptococcus.
Originariamente, esta prueba era utilizada para diferenciar entre los siguientes
géneros:
 Streptococcus (-) de Micrococcus (+) y/o Staphylococcus (+).

 Bacillus (+) de Clostridium (-).
 Lysteria monocytogenes (+) y/o Corynebacterium (+, con las
excepciones de C.pyogenes y C.haemolyticum, ambos -) de
Erysipelothrix (-)
Una prueba de rutina de la catalasa a temperatura ambiente puede hacerse

siguiendo dos técnicas:
1. Método del portaobjetos (recomendado):
 Con el asa de siembra recoger el centro de una colonia pura de 18-24

horas y colocar sobre un portaobjetos limpio de vidrio.
 Agregar con gotero o pipeta Pasteur una gota de H2O2 al 30% sobre el
microorganismo sin mezclarlo con el cultivo.
 Observar la formación inmediata de burbujas (resultado positivo).
 Desechar el portaobjetos en un recipiente con desinfectante.
 Si se invierte el orden del método (extender la colonia sobre el agua
oxigenada) pueden producirse falsos positivos.
HIDRÓLISIS DE LA GELATINA
Esta prueba sirve para determinar la capacidad que tiene el microorganismo

para producir enzimas de tipo proteico (gelatinazas) que licuan la gelatina. La
mayoría de los polímeros son demasiado grandes para ser transportados dentro
de las células. Las bacterias excretan enzimas extracelulares que hidrolizan
esos polímeros transportando al interior de la célula en monómeros que les
sirven para crecer. La producción de proteasas es evaluada por incorporación
de una proteína (gelatina o caseína) en un medio sólido en placa. La placa se
inunda con ácido que precipita la proteína no hidrolizada.
Interpretación:
Positiva
Tubo inoculado: medio líquido
Tubo de control: el medio se mantuvo sólido
FIG 14 En la parte izquierda muestra la reacción positiva en una placa que

para Staphylococcus aureus es positiva y en la parte derecha muestra la
reacción positiva y negativa en tubo.
Negativo
Tubo inoculado: el medio se mantuvo sólido. Volver incubar durante un

tiempo adicional.
Tubo de control: el medio se mantiene sólido
FIG 15 Parte izquierda muestra la reacción negativa en una placa, parte

derecha muestra la reacción positiva y negativa en tubo.
PRUEBA DE ARGININA
Los aminóacidos al perder el grupo carboxilo se convierten en aminas lo que

incrementa el pH del medio y el indicador (púrpura del bromocresol) vira a
violeta. Las descarboxilasas son útiles en la diferenciación de enterobacterias.
Las bacterias se inoculan en medios complejos que contienen lisina, ornitina o

arginina al 1% y un indicador de pH (púrpura de bromocresol).
HIDRÓLISIS DEL ALMIDON
Los polisacáridos, como el almidón son demasiado largos para ser

transportados al interior de la célula. Los microorganismos excretan amilasas
que hidrolizan esos polímeros hasta oligosacáridos o monosacáridos que
pueden usarse como sustratos para crecer.
La hidrólisis de almidón es analizada en medios conteniendo almidón en

placa.
Después de incubar se inundan las placas con lugol que al unirse con el
almidón intacto forma un complejo púrpura.
POSITIVO NEGATIVO
HIDRÓLISIS DE LA ESCULINA
La excluyan contiene un carbohidrato unido a un compuesto aromático. Este

test se usa a menudo para distinguir especies de Streptococcus. Hay
microorganismos que hidrolizan la esculina en esculetina y glucosa, la primera
reacciona con sales de hierro originando un compuesto de color negro. Se
realiza en tubos inclinados incubados durante 48 h.
Se crecen las bacterias en un medio complejo que contiene 0,01 % de esculina

y un 0,05 de citrato férrico.
POSITIVO NEGATIVO
TSI
Medio diferencial complejo (de color rojo) compuesto por 3 azúcares: 10%
lactosa, 10% sucrosa y 1% dextrosa y un ligador que es en este caso el hierro.
La siembra se realiza tanto en la superficie del agar (aerobiosis) como en la
profundidad de éste (anaerobiosis). Medio K (alcalino) de color rojo. Medio
A (ácido) de color amarillo.
FIG 16 muestra la prueba en un tubo sin inocular con su respectivo color

inicial
K/A
Si la bacteria metaboliza sólo la glucosa: en la superficie la utilizará por vía

respiratoria, y donde la tensión de oxígeno disminuya lo suficiente, empleará
una pequeña proporción por vía fermentativa. Esto generará una pequeña
cantidad de ácidos que serán neutralizados por las aminas derivadas de la
decarboxilación oxidativa de las proteínas. Como resultado, el medio
mantendrá su color rojo en la superficie, al no haber cambiado de pH. Por el
contrario, las bacterias crecidas en la profundidad emplearán desde el primer
momento la glucosa por vía fermentativa, generando ácidos que no serán
neutralizados, provocándose un descenso del pH y el color del medio en el
fondo del tubo cambiarán a amarillo.
FIG 17 Y 18 muestra solo la fermentación de un azúcar: la glucosa por lo
cual se lee como K (alcalino)/A (acido) en la parte izquierda se muestra un
tubo con la presencia de gas.
A/A
Si la bacteria, además fermenta lactosa: los ácidos producidos modificarán
también el pH de la superficie del medio.
Las aminas no son capaces de neutralizar la cantidad de ácidos producidos

en esta fermentación, ya que la lactosa se encuentra en el medio a mayor
concentración que la glucosa.
El color del medio en la superficie cambiará a amarillo.

A/A(g)
aparición de burbujas, rotura o elevación del agar del fondo del tubo.
FIG 19 muestra como se presenta la fermentación de los tres azucares A

(acido) / A (acido) con presencia de gas resaltemos que Staphylococcus
aureus fermenta las tres azucares.
K/K
Si la bacteria es aerobia estricta (no fermentadora), el medio permanece de
color rojo. Los azúcares son respirados, degradándose completamente hasta
CO2, que se elimina y no modifica el pH.
K/A(H2S)
aparición de un precipitado de color negro en el fondo del tubo. Algunas
bacterias respiradoras anoxobiónticas son capaces de emplear el tiosulfato
sodio como aceptor final de electrones en la cadena transportadora. Este
compuesto se reduce a ácido sulfhídrico que reacciona con el hierro Fe2+
presente en el medio formando un precipitado negro de sulfuro de hierro.
Producción de gas
Si el microorganismo es aerogénico, la producción de H2 y CO2 se manifiesta

mediante la formación de una o varias burbujas o con el desprendimiento del
tubo dejando una área clara. Si el microorganismo es anaerogénico, no hay
producción de gas.
Producción de ácido sulfhídrico:
Si el microorganismo produce este acido, se manifestara por la presencia de

un precipitado negro del sulfuro de hierro, en la parte profunda del tubo.
Si el microorganismo no produce este acido, se manifestará por la ausencia de
dicho precipitado
PRUEBA DE LA REDUCCIÓN DE NITRATOS
Sirve para determinar la capacidad de un organismo de reducir el nitrato en

nitritos. Para ello, el medio manitol movilidad incorpora 1 g/l de potasio
nitrato y para revelar la presencia de nitritos después de su incubación se
añaden los reactivos A y B de Griess-Ilosvay en cantidades iguales (1ml
aprox.). Un cambio de color (rojo) dentro de los 30 seg indica prueba
completa con resultado positivo. Si no cambia de color, se agrega
directamente al tubo una pizca (unos 20mg) de polvo de cinc purísimo,
totalmente exento de nitratos o nitritos, y se observa el cambio de color
durante otros 30 seg, al cabo de los cuales se realiza la interpretación final.
Las enterobacterias son generalmente nitratos (+). Esta prueba se utiliza
principalmente para diferenciar entre sí determinadas bacterias de los géneros
Haemophylus y Neisseria.
PRUEBA DEL MANITOL
Sirve para detectar si los gérmenes son capaces de fermentar el manitol

liberando productos ácidos que serán detectados gracias al indicador rojo de
fenol que cambiará a color amarillo. Para esta prueba el medio manitol
movilidad incluye 7,5 g/l de D-Manita. Bacterias manitol (-) son, dentro de las
enterobacterias, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris y Shigella dysenteriae..
Entre las bacterias de importancia clínica, la prueba del manitol sirve para
diferenciar Staphylococcus aureus (+) de Staphylococcus epidermidis (-).
PRUEBA RIBONUCLEASA (DNasa)
Algunas bacterias como Staphylococcus aureus excretan nucleasas que

hidrolizan el DNA.
Esta prueba se realiza haciendo una estría gruesa en una placa de medio que
contenga DNA.
Se revela después de incubar con HCL 0,1 N que precipita el DNA no

hidrolizado formando zonas claras. Incubación de 18-24 horas a 37ºC
POSITIVO NEGATIVO
FIG (DNasa S. aureus cuando esta inundado con 1N HCL)

MEDIOS DE CULTIVOS
AGAR NUTRITIVO
Estos medios nutritivos son adecuados para el cultivo de bacterias exigentes y,

tras adición de sangre, fluido ascítico o suero, también sirven para el cultivo
de Estreptococos, Pneumococos, bacterias erisipeloides y otros gérmenes. Se
han utilizado así mismo para la determinación del número de gérmenes, para
su aislamiento y enriquecimiento, así como en la preparación de medios de
cultivo especiales como medios basales de alto valor.
AGAR NUTRITIVO
Co
lor
Ini
cia
l
COMPOSICIÓN (gr/Lt)
Peptona de carne 5.0

Extracto de carne 3.0
Agar – agar (Ausente en el caldo) 12.0
Color del agar: claras e incoloras hasta una tonalidad amarillenta
CALDO GIOLITTI CANTONI
http://www.bd.com/ds/technicalCenter/inserts/Giolitti_Cantoni_Broth_Base.p
df
Fundamento
En el medio de cultivo, la tripteína, el extracto de carne y el extracto de

levadura, constituyen la base nutritiva para el desarrollo de microorganismos.
El piruvato de sodio y el manitol son estimulantes del desarrollo de
estafilococos y ayudan a la detección de estos microorganismos presentes en
la muestra, aún en pequeñas cantidades. El cloruro de litio inhibe el
crecimiento de bacilos Gram negativos fermentadores de lactosa, mientras que
otras bacterias Gram positivas, son inhibidas por el telurito y la glicina.
Cubriendo la superficie del medio inoculado con una capa de agar o parafina
estéril, se evita el crecimiento de micrococos.
La Federación Internacional de Lechería (IDF) y American Public Health
Association (APHA), recomiendan el uso de este medio de cultivo para el
enriquecimiento de S. aureus en el análisis de productos lácteos.
También, fue recomendado por Mossel y col. para la detección de S. aureus
en leche en polvo y otros alimentos para niños, así como para el análisis
microbiológico de productos cárnicos y huevos deshidratados. Para la
determinación del número de gérmenes según la técnica de NMP.
Peptona de caseína 10.0

Extracto de levaduras 5.0
Cloruro de litio 5.0
D (-) manitol 20.0
Cloruro sódico 5.0
Lisina 1.2
Piruvato sódico 3.0
Aditivos: Telurito potásico 0.052
Selectivo: Cloruro de litio que inhibe los gérmenes Gram negativos y el

telúrico que inhibe los positivos.
Color del medio: claro y amarillento
Forma de actuación
El ennegrecimiento del caldo giolitti cantoni pone de manifiesto la presencia

de estafilococos, ya que el crecimiento de estos microorganismos es
favorecido por el piruvato y la glicina; es activado, sobre todo por una
concentración elevada de manitol. Los contaminantes Gram negativos son
inhibidos por el cloruro de litio y los Gram positivos son inhibidos por el
telurio.
Gracias a una cierta anaerobiosis, se logra inhibir el crecimiento de

micrococos. El crecimiento de estafilococos se pone de manifiesto por una
coloración negra debido a la reducción del telúrico a telurio.
Agar para la prueba de la DNAasa.
Este es un medio selectivo para comprobar la actividad desoxirribonucleasa.

Los microorganismos DNAasa positivos despolimerizan el DNA presente en
el medio. La actividad enzimática se revela inundando la placa con una
solución 0,1 N de HCl. Si la prueba es positiva se observan zonas
transparentes alrededor de las colonias.
Composición:
Triptosa, 20g
Acido desoxirribonucleico, 2g
Cloruro sódico, 5g
Agar, 15g
Agua destilada, 1000 ml
Preparación:
Disolver los componentes en un baño de agua caliente y ajustar el pH a 7.5.

Dispensar en tubos y autoclavar a 121 ºC durante 15 minutos.
AGAR DE SIMMONS CON CITRATO.
Medio recomendado para la diferenciación e identificación de enterobacterias

en base a la utilización de citrato como única fuente de carbono. Al medio se
le añade azul de bromotimol y agar 1.5%. Los microorganismos capaces de
utilizar el citrato crecen en el medio alcalinizándolo, virando el color desde
verde (inicial) a azul oscuro en 24-48 horas.
Composición:
Sulfato magnésico, 0.2g
Dihidrógeno fosfato de amonio, 1g
Hidrógeno fosfato de dipotasio 1g
Citrato sódico, 2g
Cloruro sódico, 5g
Agar, 15g
Azul de bromotimol, 0.08g
Agua destilada, 1000ml
Preparación:
Disolver todos los componentes en un baño de agua caliente y ajustar el pH a

7. Dispensar en tubos y autoclavar a 121 ºC durante 15 minutos. Dejar enfriar
los tubos en pendiente. Este medio indica la capacidad de las bacterias de
metabolizar el citrato como única fuente de carbono, fosfato de amonio como
única fuente de fosfato y azul de bromotimol como indicador de pH.
Únicamente las bacterias capaces de metabolizar citrato podrán multiplicarse
en este medio, al utilizar los fosfatos presentes liberan iones amonio (básicos)
que junto con la eliminación de citrato (ácido) generará una fuerte basificación
del medio que será aparente con un cambio de color del indicador de pH de
verde a azul.
PRUEBA DE MANITOL SAL PARA Staphylococcus aureus
Medio selectivo y diferencial para el aislamiento e identificación de

Staphylococcus aureus. NaCl 7,5% le proporciona lo selectivo ya que sólo
estos microorganismos osmotolerantes u osmófilos pueden multiplicarse en
él. Manitol es el único azúcar fermentado por las cepas patógenas de este
género bacteriano. La producción de ácidos proveniente de la fermentación
del manitol es detectada por el viraje del indicador de pH presente en el
medio (rojo fenol) a amarillo.
Staphylococcus epidermidis no fermenta el manitol, dará lugar a colonias

pequeñas rodeadas de un halo púrpura.
FIG Agar manitol sal con rojo de fenol

(reacción de manitol positivo colonias amarillas con zonas brillantes).
AGAR BAIRD-PARKER
Modo de la acción
Este medio contiene cloruro de litio y telurito para inhibición del

crecimiento de la flora en tanto que el piruvato y la glicocola actúan
favoreciendo selectivamente el crecimiento de Estafilococos.
Sobre el medio de cultivo, opaco por su contenido en yema de huevo, las

colonias de Estafilococos muestran dos características diagnosticas por
lipólisis y proteolisis.
Se producen halos y anillos característicos debido a la reducción del telurito

a telurio, se desarrolla una colonia negra.
La reacción con la yema de huevo y la reducción del telurito se presentan con

notable parelismo con la coagulasa positividad, y por tanto pueden utilizarse
como inducen de esta última.
Composición típica (g/litro)
➢ Peptona de caseína: 10.0 g/litro

➢ extracto de carne: 5.0 g/litro
➢ extracto de levadura: 1.0 g/litro
➢ piruvato de sodio:10.0 g/litro
➢ glicina: 12.0 g/litro
➢ cloruro de litio : 5.0 g/litro
➢ agar-agar: 15.0. g/litro
También puede ser agregado:
Emulsión de la yema de huevo, telurito 50 ml; se procede, sulfametazina 0.05

g/Lt.
Empleo e interpretación
Diluir convenientemente el material a investigar y extender. Incubación desde
24 hasta 48 horas a 37 ºC.
Aspecto de colonias microorganismos

Staphylococcus aureus Son negras, brillantes, convexas 1-5
milímetros de diámetro con un estrecho, el
borde blanco rodeadas por una zona clara 2-5
milímetros de ancho. Los anillos opacos
dentro de las zonas claras aparecen
solamente después de 48 horas de la
incubación.
Staphylococcus epidermitis Negras, lustrosas, forma irregular. Al cabo de

24 horas, presencias de zonas opacas
alrededor de las colonias.
Micrococcus Crecimiento ocasional, colonias muy
pequeñas, pardas hasta negras ausencia de
halos de clarificación.
Bacillus Pardo oscuras, mates presencia a veces de
halos de clarificación al cabo de 48 horas.
Para las colonias representativas
Agar Baird-Parker (colonias negras con precipitado claro)

AGAR KRANEP
MODO DE ACTUACION
El litio, el rodanuro potásico inhibe toda la flora Gram negativa. La actidione

(= cicloheximida) reprime a mohos y gérmenes esporulantes. El piruvato
sódico tiene efectos estimulantes del crecimiento para los Estafilococos y
activando su metabolismo, compensa el efecto de las sustancias inhibidoras.
El manitol activa selectivamente a los Estafilococos, pues es utilizado casi
exclusivamente por ellos.
La adición de yema de huevo sirve para los Estafilococos y activando su

metabolismo, compensa el efecto de las sustancias inhibidoras. El manitol
activa selectivamente a los Estafilococos, pues es utilizado casi
exclusivamente por ellos. La adición de yema de huevo sirve para la
demostración de sus componentes, lo que se reconoce por la aparición de
halos alrededor de las colonias. La reacción de la yema de huevo, como
indicadora de la posible formación de plasma coagulasa no es concluyente,
pero esta más aceptada la utilización aerobia del manitol.
Composición
➢ peptona de carne 10.0 g/Lt

➢ Piruvato sódico 8.2 g/Lt
➢ cloruro sódico 3.0 g/Lt
➢ hidrogenofosfato dipotásico 2.0 g/Lt
➢ tiocianato potasico 25.5 g/Lt
➢ cloruro de litio 5.1 g/Lt
➢ azida sódica 0.05 g/Lt
➢ actidione 0.041 g/Lt
➢ D(-) manitol 5.1 g/Lt
➢ agar- agar 13.5 g/Lt
Aditivo: emulsión de yema de huevo 100ml
Empleo e interpretación: sembrar las placas en superficie por estría

.Incubación: hasta 48 horas a 37ºC
Colonias que degrada la yema de huevo: Estafilococos
FIG. Agar Kranep (precipitado alrededor de las colonias por la degradación

de la yema de huevo)
AGAR BASE SANGRE
Modo de la acción
Este medio de cultivo representa una base nutriente rica, que proporciona las
condiciones óptimas del crecimiento para todos los microorganismos
relevantes. El valor de pH de 6.8 estabiliza los corpúsculos rojos de la sangre
y favorece la formación de las zonas claras de la hemólisis (NORTON 1932).
Fresco, desfibrinado de ovejas que la sangre es la más conveniente para
determinar formas de la hemólisis. El agar de sangre hervido (“agar del
chocolate”) es un medio de cultivo extremadamente rico y puede ser
preparado calentando después de que se haya agregado la sangre. Si se va la
base del medio de cultivo a ser utilizada sin sangre, el pH se debe, sin
embargo, ajustar a 7.2 a 7.4 puesto que la mayoría de las colonias bacterianas
aparecen algo anteriores y crecen mejores en un entorno levemente alcalino.
Incubación: 24-48 horas a 37ºC
➢ Substrato nutriente (extracto y peptonas del corazón) 20.0;
➢ cloruro de sodio 5.0:
➢ agar-agar 15.0.
FIG Agar base sangre (positivo para S. aureus hemólisis ß después de 24

horas).
Sembrar las placas en superficie.

Incubación: bajo condiciones óptimas casi siempre de 24 horas a 35°C. En
condiciones aerobias (Cl.perfringens, en anaerobiosis)
Estudio y determinación de las formas de hemólisis.
Cepas Inóculo Hemolisis

Staphylococcus aureus ß
Streptococcus pyogenes ß
Streptococcus agalactiae -
Streptococcus pneumoniae Alfa
Bacillus cereus -
Listeria monocytogenes ß
Clostridium perfringens ß
AGAR VOGEL JOHNSON
Modo de la acción
El crecimiento de bacterias acompañantes es inhibido casi totalmente por el

telurito, el cloruro de litio y una alta concentración de glicina. Los
estafilococos pueden también ser inhibidos levemente, pero esto es
compensado por la presencia del manitol y de la glicina. El manitol también
sirve como un reactivo de diferenciación mientras que es degradado a ácido
por la mayoría de los estafilococos patógenos; esta reacción es indicada por el
rojo de fenol, que cambia su color a amarillo. Los estafilococos patógenos
también reducen el telurito a telurio metálico, así se explica su color negro en
las colonias.
Composición típica (g/litro):
➢ Peptona de la caseína 10.0;

➢ extracto de levadura 5.0;
➢ fosfato di-potasico de hidrógeno 5.0 ;
➢ Manitol D (-) 10.0;
➢ cloruro de litio 5.0;
➢ glicina 10.0;
➢ rojo de fenol 0.025;
➢ agar-agar 13.0.
Empleo e interpretación:
Inocular las placas. Incubación: hasta 48 horas a una temperatura de 35°C

(aerobio).Los estafilococos patógenos crecen generalmente en el plazo de las
primeras 24 horas.
Aspecto de colonias microorganismos

Pequeñas, color negro, rodeadas de zonas Staphylococcus aureus
amarillas.
Pequeñas, negras- gris, no están rodeadas Staphylococcus epidermitis ,y
por zonas. otros
FIG S.aureus (colonias negras cambia el indicador de Ph a amarillo)
AGAR CHAPMAN
Para el aislamiento y la diferenciación de estafilococos en comestibles y de

otros materiales según CHAPMAN (1946, 1948, 1952).
Modo de la acción
Solamente los microorganismos que exhiben una alta tolerancia de la sal

pueden crecer en este medio de cultivo; éstos incluyen a colonias de
Staphylococcus, que pueden ser distinguidas en base de la degradación del
manitol, de la gelatinolisis y de la producción del pigmento. SMUCKLER y
APPLEMAN (1964) recomienda la adición del acido de sodio (65 mg/litro)
para mejorar la inhibición de la especie bacilo.
➢ Peptona de caseína 10.0

➢ extracto de levadura 2.5
➢ fosfato di-potasico de hidrógeno 5.0
➢ gelatina 30.0
➢ lactosa 2.0
➢ Manitol D (-) 10.0
➢ cloruro de sodio 75.0
➢ agar-agar 12.0
Inocular las placas separando la muestra en la superficie del medio.

Incubación: 48 horas a una temperatura de 35°C. Las colonias que forman
pigmentos son de color amarillo, incoloras de color blanco a oro.
La formación del ácido del manitol es indicada por un cambio del color a
amarillo, cuando las gotas de una solución de 0.04% azul de bromo timol se
aplican a los sitios donde se encuentran las colonias.
Las colonias individuales deben primero ser quitadas con un lazo del platino.
Según STONE (1935), la gelatinolisis es un indicador de la toxicidad y es
demostrado por el aspecto de zonas claras alrededor de las colonias cerca de
10 minutos después de aplicar gotas de una solución saturada del sulfato del
amonio o de una solución ácida el 20% sulfosalicilico.
FIG Agar CHAPMAN (Crecimiento de Staphylococcus tolerantes de sal).
AGAR AZIDA SANGRE (base)
Agar selectivo para la demostración y aislamiento de Estreptococcus y

Staphylococcus, a partir de posiciones, aguas residuales, productos
alimenticios u otros materiales objetos de investigación. Puede utilizarse con o
sin adición de sangre.
FORMA DE ACTUACIÓN
Este medio de cultivo dispone de una excelente y abundante base nutritiva,

que permite incluso el crecimiento de microorganismos exigentes, la azida
inhibe a la flora Gram negativa, en tanto que la flora Gram positiva se
desarrolla más o menos indemne. El proteus crece, por supuesto pero como
colonias definidas sin agrupación. La adición de sangre al medio de cultivo
facilita la interpretación de las formas de hemólisis.
COMPOSICIÓN gr/Lt
Triptosa 10.0
Cloruro sódico 5.0
Adicionalmente: sangre desfibrinada 50ml
EMPLEO E INTERPRETACIÓN
El material a investigar se extiende sobre la superficie del medio de cultivo.

Incubación. Hasta tres días a 37ºC. Las colonias se someten a estudios para su
identificación. Compruébense los halos de hemólisis producidos.
AGAR MOSSEL
Para el enriquecimiento selectivo de todos las Enterobacterias, a partir de

alimentos y otros materiales de investigación.
COMPOSICIÓN
D – Manitol 10.0
Cloruro de sodio 10.0
Rojo de fenol 0.025
Agar – agar 12.0
Suplemento 100ml de solución de yema de huevo (20%)
Sulfato de polimixina B (0.1%) 1ml
Selectivo: Sulfato de polimixina β

Diferencial: Manitol, yema de huevo, rojo de fenol
Color del agar: Guayaba
Forma de actuación
Bacillus cereus es manitol (-), el contenido del manitol posibilita la

separación de la biota manitol (+), que se manifiesta por viraje del rojo fenol.
La selectividad se debe a la resistencia del microorganismo a las
concentraciones de polimixina, inhibiendo la biota acompañante. B. cereus
forma Lectinasa.
Productos de degradación de lecitina (yema de huevo) se acumulan alrededor

de las colonias formando un precipitado blanco.
Colonias características:
Colonias rojas – rosadas con un halo de precipitado blanco, efecto de que es

manitol (-) y produce la lecitinaza que degrada la lecitina (presente en la yema
de huevo).
La presencia de colonias amarillas indican microorganismos manitol (+), por

lo que se produce viraje del medio esto no corresponde a B. cereus.
FIG Bacillus cereus colonias rugosas, secas de color rosado y rodeadas de

precipitado blanco medio selectivo y diferencial, permite distinguir entre
Bacillus cereus y B. subtilis
Clostridium perfringens
Son bacilos Gram positivos anaerobios, esporulados pueden estar en cadenas,

parejas o individuales, pertenecen a la Bacillaceae caracterizado por su forma
de bastón, con un tamaño promedio de 0.9 a 0.3 - 3 a 9 micras, con espora
ovales, subterminales no deformante y resistente al calor, son anaerobios
estrictos aunque pueden crecer en presencias de niveles bajos de oxigeno
pueden ser aerobios tolerantes y manejan una temperatura de crecimiento:
óptima 37ºC (mésofilo), temperatura mínima 10 a 20ºC y una temperatura
máxima de 55ºC.
Estos microorganismos son encapsulados cuando se encuentran en heridas,

inmóviles. Pero se puede desarrollar en condiciones de dióxido de carbono y
nitrógeno, potencian en la presencia de sales biliares y cloruro de sodio al 2%
y en presencia de cloruro de sodio al 5% se inhiben, su pH óptimo 5.9 pero
pueden crecer entre 5.5 – 8.0 la disponibilidad de agua requerida es de AW
0.94 limitadas sus esporas termoresistentes crecen a temperatura superior a
37ºC y aun AW mayor de 0.64. Presenta una entero toxina termolábil
(destruye a 60ºC por 10 minutos), son Quimio organotrofos (se alimenta de
sustancias químicas u orgánicas) y pueden producir una infección alimentaría.
Se encuentran distribuidos en toda la naturaleza y el tracto intestinal de
humanos y animales como el ganado vacuno y porcino, todos sanos. Se
clasifican en cinco tipos (A - E), dependiendo de la clase de toxinas que
producen.
PRUEBAS BIOQUIMICAS
Acido de la glucosa +
Ácido sulfhídrico +
Licuefacción de la gelatina +
Manosa +
Maltosa +
Lectinasa +
Proteólisis +
DNasa +
Lactosa +
Nitratos +/d
Indol -
Lipasa -
Digestión de caseína -
Manitol -
Cátalasa -
Motilidad -
Ramnosa -
Ureasa d
Almidón d
Hemólisis Doble zona

transportados al interior de la célula.
Los microorganismos excretan amilasas que hidrolizan esos polímeros hasta

oligosacáridos o monosacáridos que pueden usarse como sustratos para crecer.

placa.
Positivo Negativo
DNasa
Algunas bacterias excretan nucleasas que hidrolizan el DNA. Se hace una

estría gruesa en una placa de medio que contenga DNA.
Se revela después de incubar con HCL 0,1 N que precipita el DNA no

hidrolizado.
KLIGLER Y TSI
Se utiliza este medio en la diferenciación de enterobacterias. En el mismo

medio se pueden determinar la fermentación y utilización de los hidratos de
carbono, la producción de sulfhídrico y la producción de gas. El primer medio
(Kligler) contiene glucosa y lactosa, el segundo además contiene sacarosa.
Se preparan en tubos poco inclinados y con bastante medio, inoculándolos por
picadura en el centro del medio y realizando además una estría recta al salir
sobre la superficie inclinada del medio.
La producción de ácido de glucosa se pone de manifiesto en el fondo del tubo

por viraje del indicador a amarillo, la de la lactosa en la superficie inclinada
por viraje al mismo color, la producción de gas a partir de glucosa por
aparición de burbujas que agrietan el medio y la de sulfhídrico por la aparición
de un precipitado negro debido a las sales de hierro presentes.
Ácido de la glucosa (+)
PRODUCCION DE SULFHIDRICO
Muchas bacterias producen sulfuro de hidrógeno (sulfhídrico) a partir de

aminoácidos azufrados (cisteína o metionina) o tiosulfato.
La fermentación de sulfhídrico puede ser detectada incluyendo hierro reducido
en el medio para formar un precipitado negro de FeS.
Se inocula un medio de agar nutritivo conteniendo tiosulfato de metionina y

sulfato ferroso.
Ácido sulfhídrico (+)
HEMOLISIS DE LA SANGRE
Medio de cultivo enriquecido con la adicción de sangre. Las hemolisinas son

enzimas que lisan los hematíes. Las bacterias que producen estas enzimas
presentan un halo transparente alrededor de las colonias a consecuencia de la
lisis de los hematíes.
Se siembre por agotamiento en estría en placas de agar sangre y se incuba.
Fig. Muestra la hemólisis total de Clostridium perfringens

PRUEBA DE UREA


alcanalización y un aumento de Ph del medio. La prueba se realiza en agar o
caldo de urea. El color inicial del medio: amarillo anaranjado. En el medio
sólido por estría el microorganismo en estudio. En el medio líquido sembrar
por emulsión. Incubar a 37 ºC por 24 horas.
Interpretación

el medio.
UREASA (+) UREASA (-)

Fig. Muestra la prueba de la ureasa que da como resultado para Clostridium
perfringens +/-.
Reducción de Nitrato a Nitrito:
Algunas bacterias pueden usar nitratos como aceptor final de e- en la

respiración.
El nitrato puede ser reducido a nitrito.
Las enterobacterias y Pseudomonas son usualmente positivos.
Las bacterias se inoculan en medios conteniendo nitrato potásico. El nitrito

procedente de la reducción de células puede detectarse añadiendo alfa-
naftilamina y ácido sulfanílico produciéndose un color rosa-rojo.
Reducción de Nitrato hasta Nitrógeno gaseoso:
Se puede saber si el nitrato puede haberse reducido más que hasta nitrito
produciéndose nitrógeno gas.
Si al añadir zinc en polvo no aparece color rojo es que no queda nitrato porque
se ha reducido a gas (desnitrificación).
POSITIVO NEGATIVO
La mayoría de los polímeros son demasiado grandes para ser transportados

dentro de las células.
Las bacterias excretan enzimas extracelulares que hidrolizan esos polímeros

transportando al interior de la célula en monómeros que les sirven para crecer.
La producción de proteasas es evaluada por incorporación de una proteína

(gelatina o caseína) en un medio sólido en placa.
La placa se inunda con ácido que precipita la proteína no hidrolizada

FIG 7-8-9 y 10 muestran los tubos con la prueba de SIM con sus respectivos
demostrándose que esta prueba es positiva para Clostridium prefingers.

produciendo compuestos de color rojizo.
Para evitar la interferencia del triptófano, el reactivo está disuelto en alcohol

isoamílico inmiscible en agua. A diferencia del triptófano, el indol es soluble
en el alcohol y sólo este compuesto reaccionará con el aldehído produciendo
el anillo coloreado característico de esta prueba.
LECTINASA
Algunos microorganismos producen lecitinasa que actúa sobre la lecitina. Se

utiliza el agar yema de huevo, se inocula e incuba a 35-37°C en anaerobiosis
durante 48 h. Las colonias productoras de lecitinasa forman una zona opaca a
su alrededor.
INDOL
Uno de los test del IMVIC utilizado para diferenciar enterobacterias.

Existen bacterias que producen triptofanasa que convierte el triptófano en
indol. La bacteria se crece en medios que contienen triptófano (caldo de
triptoma). La presencia de indol se detecta añadiendo P-
dimetilaminobenzaldehído.
PROTEOLISIS
La hidrólisis de las proteínas lácticas por acción microbiana se acompaña en

general de la producción de un sabor amargo producido por algunos
polipéptidos.
Las alteraciones producidas por los microorganismos proteolíticos son:
 proteólisis ácida en la que tienen lugar simultáneamente la
proteólisis y la producción de ácido,
 proteólisis con acidez mínima e incluso con alcalinidad,
 leche “cortada“ producida por enzimas bacterianas del tipo de la
renina en una etapa inicial de la proteólisis, y proteólisis lenta
por endoenzimas
La proteólisis ácida puede estar producida por diversas especies del género
Micrococcus, algunos de los cuales se hallan en la ubre de la vaca.
Uno de los estreptococos intestinales, el S. faecalis es un organismo ácido
láctico muy proteolítico. Como los demás Enterococos es termodúrico y
capaz por tanto de producir proteólisis en la leche pasteurizada. Los
esporos de las cepas proteolíticas de algunas especies de bacillus
fermentadores de la lactosa, como el B. cereus, sobreviven a la
pasteurización, e incluso a tratamientos térmicos más drásticos,
produciendo luego proteólisis ácida.
Entre las especies de los géneros Micrococcus, Pseudomonas, proteus,
Achromobacter, Flavobacterium y Serratia hay gérmenes muy
proteolíticos Obsérvese que estas especies desarrollan a temperaturas bajas
por lo que son capaces de producir proteólisis y amargor aún en leche
refrigerada.
La proteólisis lenta carece de importancia en la leche en circunstancias
normales, pero la posee cundo las bacterias disponen de una cantidad
considerable de tiempo.
CATALASA

géneros:

Erysipelothrix (-)

2. Método del portaobjetos (recomendado )
 Con el asa de siembra recoger el centro de una colonia pura de 18-24

 Agregar con gotero o pipeta Pasteur una gota de H2O2 al 30% sobre el
 Observar la formación inmediata de burbujas (resultado positivo).
 Desechar el portaobjetos en un recipiente con desinfectante.
 Si se invierte el orden del método (extender la colonia sobre el agua

Fig. Muestra la prueba de catalasa que para Clostridium perfringens es

negativa.
MEDIOS DE CULTIVOS
SPS Sulfito – polimixina – sulfatiaxina de Clostridium perfringens en

alimentos de todo tipo.
Composición

Extracto de levadura 10.0
Citrato de hierro III 0.5
Polimixina β sulfato 0.01
Sulfadiazina sódica 0.12
Agar-agar 13.9
Selectivo: polimixina y sulfadiacina

Diferencial: sulfito y citrato férrico
Color del agar: claro y amarillento
Forma de actuación
El sulfito es reducido a sulfuro por Clostridios, reaccionando con citrato

férrico, dando una coloración negra (colonias).Otros microorganismos
reductores de sulfitos son notablemente inhibidos por la polimixina y la
sulfadiacina (sulfa-pirimidina). El pequeño contenido en sulfito permite el
crecimiento incluso de los Clostridios sensibles al, formándose suficiente
ennegrecimiento de las colonias.Colonias características: negras, sin halo
dentro del agar.
CALDO DIFERENCIAL PARA Clostridios (DRCM)
Caldo diferencial para Clostridios.
Para la enumeración de gérmenes, según la técnica de NMP, de Clostridios

totales en alimentos y otros materiales.
Composición

Almidón 1.0
D (+) glucosa 1.0
L- cloruro de cisteina 0.5
Acetato sódico 5.0
Disulfito sódico 0.4
Citrato de amino y hierro (III) 0.5
Resazurina, sal sódica 0.02
Selectivo: polimixina
Color del medio: claro parduzco
Forma de actuación:
La resazurina como indicador redox, sirve para el control de anaerobiosis. Los

Clostridios reducen el sulfito a sulfuro, que como sulfato de hierro, ennegrece
al medio de cultivo. Dado que estas bacterias forman también sulfuro, se
produce en primer lugar a liberación al material a cultivar de forma
vegetativas, mediante el correcto tratamiento previo, y luego se produce al
estudio de esporulantes anaerobios. Mediante la adicción de polimixina al
medio VRCM, se puede impedir el crecimiento de la mayoría de los gérmenes
más esporulados.
Control de calidad del medio de cultivo
Cepas de ensayo crecimiento ennegrecimiento

Escherichia coli Bueno -
Bacillus cereus Moderado -
Pseudomonas Ligero -
aeruginosa
Clostridium Bueno +
bifermentans
Clostridium bueno +
perfringens
Clostridium Bueno +
perfringens
Clo0stridium septicum bueno +
AGAR PARA ANAEROBIOS seg. BREWER
Para el cultivo de Clostridios y otros microorganismos anaerobios, según

BREWER.
FORMA DE ACTUACIÓN
Este medio de cultivo contiene una serie de sustancias reductoras que

garantizan una anaerobiosis suficiente QUASTEL y STEPHENSON,
AUBERTIN y col. El azul de metileno sirve como indicador redox cuya
decoloración es señal de anaerobiosis efectiva.
COMPOSICIÓN

Peptona de harina de soja 5.0
L – cistina 0.4
D (+) glucosa 10.0
Cloruro sódico 5.0
Tioglicolato sódico 2.0
Sulfoxilato – formaldehído sódico 1.0
Azul de metileno 0.002
Agar – agar 12.6
Sembrar al medio de cultivo por estría o por los procedimientos de fusión y

vertido en placas. Para la comprobación de formadores de esporas, elevar la
temperatura de la mezcla a 80 – 100ºC.
Incubación bajo condiciones optimas, en la atmósfera lo mas anaeróbica
posible.
AGAR SULFITO- HIERRO (BASE)
Para la demostración y enumeración de Clostridios en carnes y productos

cárnicos.
Forma de actuación
Las formas vegetativas son eliminadas mediante un breve calentamiento del

material objeto de investigación, en tanto que las esporas bacterianas
sobreviven y germinan. El sulfito presente en el medio de cultivo es reducido
a sulfuro por los elementos H2S positivos y forma con el hierro negro, el cual
tiñe de color negro las correspondientes colonias y alternativamente, de
color pardo las H2S positivas débiles. En medio anaerobio y bajo estas
condiciones, los Clostridios crecen como colonias negras.
COMPOSICIÓN (g/litro)
Peptona de caseína 15.0;

Preparación de la muestra: de acuerdo con las recomendaciones de la ISO,

homogeneizar la muestra desmenuzada se homogeniza con 9 partes de
solución diluyente estéril (peptona de caseína el 0.1%, cloruro de cisteina
0.05%, cloruro sódico 0.85%). Se distribuyen porciones de 50 ml en matraces
de 100ml y se colocan durante 1 minuto en un baño maría a 80ºC. A
continuación, se enfrían rápidamente con agua fría.
El material se extiende en capa delgada sobre la superficie de dos placas por

cada ensayo. Una de las placas se incuba en condiciones aerobias y la otra
en condiciones anaerobias, ambas a 30 ºC durante 2 días. Se deduce que
existen Clostridios mésofilos cuando:
a) solamente las placas cultivadas en condiciones anaerobias demuestran el

ennegrecimiento y
b) Sobre estas placas es negativo el ensayo de catalasa, realizado con

Bactident Catalasa.
Formación del gas: el cultivo es catalasa-positive.
Ninguna formación del gas: el cultivo es catalasa-negativa.
-
AGAR TSC
Para el aislamiento y enumeración de formas vegetativas, así como de formas

esporuladas, de Clostridium perfringens en alimentos, material clínico de
investigación y otros.
Por su formulación este medio de cultivo corresponde a las recomendaciones

de la internacional Organization for Strapdardization (ISO) (1978), a la
APHA para el análisis de alimentos y la norma DIN 10165 para el análisis de
carnes y productos cárnicos.
Forma de actuación
Una base de alto valor nutritivo ofrece a los Clostridios las mejores
posibilidades de desarrollo.
El sulfito y el hierro ejercen un marcaje en las colonias formadoras de ácido

sulfhídrico produciendo ennegrecimiento.
El Agar TSC, la cicloserina inhibe la flora acompañante y provoca al mismo

tiempo la formación de colonias mas pequeñas, produciendo
ennegrecimiento difuso y por ello perturbante alrededor de las colonias de
Clostridium perfringens.
El agar SFP contiene polimixina y Conamicina como inhibidoras selectivos

para inhibir los organismos reacompañamiento. Este medio de cultivo posee
una selectividad algo mejor que el agar TSC.
Composición (g/litro)
Triptosa 15.0
Peptona de harina de soja 5.0
Bisulfito sódico 1.0
Citrato de amonio y hierro (III) 1.0
Agar-agar 15.0
Aditivos: cicloserina 0.5, o bien polimixina 0.003, canamicina 0.012

Estos medios de cultivo se siembran por estría, en superficie. Incubación 18-

24 horas a 37ºC, en medio anaerobio. El Clostridium perfringens crece como
colonias negras. Deberán realizarse investigaciones para la identificación.
Al emplear el suplemento Fluorocult agar TSC la temperatura de incubación
es de 44ºC.
Clostridium perfringens crece en forma de colonias negras. Deberán seguir

análisis a efectos de identificación.
Cepas de ensayo crecimiento Colonias negras fluorescencia

Clostridium Bueno + +
perfringens
ATCC 10543
Clostridium Bueno + +
perfringens
ATCC 13124
Clostridium Bueno - -
tetani
Clostridium moderado/bueno - -
navyi
Escherichia coli moderado/bueno - -
ATCC 25922
Pseudomonas Ligero - -
aeruginosa
ATCC 27853
Bacillus cereus ligero - -
ATCC 11778
Clostridium perfringens, Clostridium tetany
Clostridium
perfringens, Clostridium tetany
MEDIO DE CULTIVO TIOGLICOLATO
Forma de actuación
Las sustancias reductoras, tioglicolato, proporcionan una anaerobiosis

suficiente, incluso para anaerobios exigentes. Debido a sus grupos
sulfhídricos, se inactivan los compuestos de arsénico, mercurio y de otros
metales pesados.
Los medios con tioglicolato son adecuados, por lo tanto, para la investigación
de materiales que contengan metales pesados o conservantes en cuya
composición participan dichos metales pesados. La elevada viscosidad del
medio de cultivo tioglicolato impide la penetración rápida de oxigeno. El
eventual aumento del contenido en oxigeno se pone de manifiesto por un
viraje a rojo del indicador redox Resazurina sódica.
D(+)- glucosa 5.5
L (+) císteina 0.5
Cloruro sódico 2.5
Tioglicolato sódico 0.5
Rezasurina sódica (ausente en el caldo) 0.001
Agar – agar (ausente en el caldo) 0.75
El material objeto de ensayo se siembra en profundidad en el medio de
cultivo. A continuación, puede superponerse una capa de aproximadamente
1cm de altura de parafina líquida estéril o de agar agua.
Incubación: varios días a temperatura óptima
Los gérmenes anaerobios crecen en la parte inferior del tubo de cultivo.
Cepas de ensayo Crecimiento

Staphylococcus aureus ATCC 6538-P bueno
Bacillus subtilis ATCC 6633 bueno
Clostridium sporogenes ATCC 19404 bueno
(anaerobio)
Bacteroides vulgatus ATCC 8482 bueno
(anaerobio)
Candida albicans ATCC 2091 bueno
Candida albicans ATCC 10231 bueno
Agar TSN (Agar selectivo para Clostridium perfringens MARSHAL)
Forma de actuación
El agar TSN está concebido para aprovechar la elevada tolerancia del

Clostridium perfringens frente a la neamicina, la polimixina y el sulfito, su
calidad fuertemente reductora del sulfito y su crecimiento óptimo a 46ºC . El
crecimiento de otros Clostridios reductores del sulfito y el resto de la flora
acompañante son inhibidos casi completamente. Añadiendo tioglicolato
pueden mejorase y estabilizarse las condiciones de anaerobiosis.

Sulfito sódico 1.0
Citrato de hierro (III) 0.5
Polimixina –B sulfato 0.02
Neamicina sulfato 0.05
Agar-agar 13.5
Este medio de cultivo se siembra, casi siempre por el procedimiento de

mezclado en tubos o placas de petri o, mas raramente, por extensión en
superficie. Cuando se utilizo en placas se recomienda añadir la solución de
tioglicolato anteriormente mencionada.
Incubación: anaerobiamente, en lo posible a 46ºC y no más de 8 horas.
El Clostridium perfringens forma colonias. La visualización de las placas

debe realizarse inmediatamente después de ser abiertas, ya que más tarde
palidecen las colonias a causa de la oxidación del sulfuro de hierro.
Cepas de ensayo Crecimiento Colonias negras

Clostridium perfringens bueno/muy bueno +
ATCC 10543
Clostridium perfringens bueno/muy bueno +
ATCC 13124
Clostridium tetani ATCC moderado -
19406
Clostridium novyi 1795 moderado -
Escherichia coli ATCC 25922 ningunos
Pseudomonas aeruginosa ningunos
ATCC 27853
Proteus mirabilis moderado/bueno colonias pardas
ATCC 14273
CALDO DE CARNE COCIDA
Forma de actuación
Según TAROZZI y HIBLER, las partículas o fragmentos sólidos de tejidos,

presentes en el medio de cultivo fluido, proporcionan a los microorganismos
anaerobios unas condiciones favorables para su desarrollo, gracias al efecto
reductor de los grupos SH de las proteínas musculares. Puesto que las
proteínas desnaturalizadas son de más fácil acceso, resulta ventajoso el
empleo de carne cocida.
Composición
Corazón de buey 30.0
Proteosa-peptona 20.0
D (+) glucosa 20.
Cloruro sódico 5.0
Este caldo debe ser utilizado inmediatamente después de su preparación y
enfriamiento. Si esto no fuera posible, deberá hervirse brevemente para
desalojar el oxigeno disuelto. Posteriormente evitar una reagitación.
La siembra deberá efectuarse en la zona más próxima posible a los
fragmentos de tejido. Para el cultivo de anaerobios estrictos, se recubre el
caldo con Agar – agua o con parafina.
Los Clostridios cultivadas bajo condiciones anaerobias, pueden dividirse en
dos grupos:
Sacarolitico: producen rápidamente ácido y gas sin digestión de la carne.
Proteolitico: Degradación de las proteínas hasta aminoácidos, de los cuales
precipita la tirosina como cristales filamentosos blancos.
Para el aislamiento e identificación de gérmenes es necesario hacer resiembras
en medios de cultivo sólidos, para anaerobios.
FIG: La capa de aceite mineral estéril permite que la superficie del caldo con
carne molida de corazón de vaca quede totalmente cubierta para impedir la
difusión de O2 al medio. Antes de inocular es conveniente hervir el medio
durante 10 min. para liberar el O2
Bacillus cereus
Son bacilos Gram positivos, móviles, esporulados, son menos resistentes que
la de Clostridium perfringens ya que se destruyen a 100ºC en 5 a 30 minutos,
estas pueden ser: centrales, subterminales, elípticas, pertenece a la familia
Bacillaceae. Anaerobio facultativo, mesófilo, (37ºC) pueden crecer a una
temperatura entre 5ºC – 10ºC y 48ºC a 55ºC, aunque su temperatura óptima es
de 30 a 35ºC, un AW es 0.45 y aun pH de 4.5 a 9.3. Son sensibles a la nicina y
ácido sórbico (ácido para conservas), resiste a concentraciones de sal hasta
7.5ºC , se inactiva a 65ºC por 5 minutos.
Durante se esporulación producen sustancias con actividad antibiótica y
elaboran durante la fase logarítmica una toxina termoresistente durante la
germinación de sus esporas otras termolábil que originan toxinas
termoresistente y durante la germinación de sus esporas otra termolábil que
originan dos síndrome a patologías distinta relacionadas con alimentos,
síndrome emético y el diarreico respectivamente. Es causante de intoxicación
alimentaría a través de alimentos contaminados.
Alimentos implicados
Cereales, arroz, natillas, y salsa para tallarines, cremas, leche en polvos,
productos deshidratados, especias entre otros.
PRUEBAS BIOQUIMICAS
Hidrólisis de gelatina +
Hidrólisis de almidón +
Reducción de nitritos +
Lecitinasa +
Arabinosa +
Indol -
Manitol -
Descomposición L-tirosina +
VP +
HISROLISIS DE LA CASEINA
La capacidad para hidrolizar la caseína se determinó según Collins y col.

(1989). Para ello los microorganismos se desarrollan en un medio que
contiene caseína y que consta de dos fracciones:
1. TSA (20 g en 250 mL de agua destilada).

2. Leche descremada (10 g de en 250 mL de agua destilada).
Cada fracción se esteriliza por separado. Concretamente la solución de caseína

conviene esterilizarla a 115 ºC durante 30 min. Luego se dejan enfriar hasta 45
ºC, se mezclan y se reparte el medio en placas Petri. Las cepas se siembran
mediante una estría central gruesa y la lectura de la prueba se realiza
observando la aparición de un halo transparente alrededor del crecimiento
bacteriano, cuando la bacteria es capaz de hidrolizar la caseína. El periodo de
incubación para las cepas objeto de estudio ha sido de 5 d a 15 ºC.
SIM
En el medio de SIM se mide la motilidad de las bacterias, es positiva cuando

se existe turbidez en el medio pero negativo, cuando se observa la
penetración del inóculo.
GELATINASA
Permite medir la presencia de gelatinasa. Si luego de cierto tiempo de

refrigeración, la gelatina sigue en estado líquido, es indicativo de que la
prueba resultó positiva y por tanto la bacteria tiene gelatinasa al licuar el
medio.En este caso, el B. subtilis no posee la enzima gelatinasa, y por ende,
el medio se solidificó en refrigeración.
PRUEBA DE GLUCOSA Y SALICINA


placa. Después de incubar se inundan las placas con lugol que al unirse con el
CATALASA
La catalasa es una enzima que protege a las células frente al peróxido de

hidrógeno producido en el metabolismo del oxígeno. Cataliza la formación de
agua y oxígeno a partir del peróxido de hidrógeno.
Es útil para distinguir Streptococcus (negativa) de Staphylococcus (positiva)
y Clostridium (negativa) de Bacillus (positiva
La actividad catalasa se detecta añadiendo unas gotas de peróxido de
hidrógeno (3%) sobre colonias en medio que no sea de agar sangre (daría
falsos positivos). La producción de burbujas indica la presencia del enzima.
OXIDASA
La presencia de citocromo C oxidasa en la cadena de transporte de e- puede

detectarse utilizando un aceptor de e- artificial p-fenilendiamina. Este test se
usa para diferenciar Pseudomonas (positivo) de enterobacterias (negativo)
Se utiliza como reactivo p-fenilendiamina al 1% en agua, que se coloca en un

papel de filtro, posteriormente, con un asa que no sea de hierro (daría falsos
positivos), se coge una colonia de 24 h y se extiende sobre el papel mojado. Es
positiva cuando aparece un color azul en la zona de depósito de la bacteria.
INDOL
Uno de los test del IMVIC utilizado para diferenciar enterobacterias. Existen
bacterias que producen triptofanasa que convierte el triptófano en indol
La bacteria se crece en medios que contienen triptófano (caldo de triptoma).
La presencia de indol se detecta añadiendo p-dimetilaminobenzaldehído.
MOTILIDAD
La movilidad de las bacterias es consecuencia de la presencia de flagelos. El
movimiento puede observarse en preparación en fresco con el microscopio de
contraste de fase. Para ver la movilidad se realiza una preparación en fresco
que se observa en contraste de fases.
La movilidad debe distinguirse del movimiento Browniano debido a las
corrientes en la preparación.
VOGES-PROSKAUER
Uno de los test del IMVIC para enterobacterias es el Voges Proskauer. Las
especies que llevan a cabo la fermentación a butanodiol de la glucosa
acumulan acetoína en el medio. Las bacterias se inoculan en caldo glucosa-
peptona. Las especies que llevan a cabo la fermentación butanodiólica de la
glucosa forman acetoína en el medio.
Se añade alfanaftol y creatina en medio alcalino. La acetoína se convierte en
diacetilo con la aparición de un color rojo.
POSITIVO NEGATIVO
Producción de sulfhídrico

aminoácidos azufrados (cisteína o metionina) o tiosulfato. La fermentación de
sulfhídrico puede ser detectada incluyendo hierro reducido formar un
precipitado negro de FeS. Se inocula un medio de agar nutritivo conteniendo
tiosulfato de metionina y sulfato ferroso.
NEGATIVO
REDUCCIÓN DE NITRATO A NITRITO:
Algunas bacterias pueden usar nitratos como aceptor final de e- en la

respiración. El nitrato puede ser reducido a nitrito. Las enterobacterias y
Pseudomonas son usualmente positivos.
Las bacterias se inoculan en medios conteniendo nitrato potásico. El nitrito

procedente de la reducción de células puede detectarse añadiendo alfa-
naftilamina y ácido sulfanílico produciéndose un color rosa-rojo.
REDUCCIÓN DE NITRATO HASTA NITRÓGENO GASEOSO:
Se puede saber si el nitrato puede haberse reducido más que hasta nitrito
produciéndose nitrógeno gas. Si al añadir zinc en polvo no aparece color rojo
es que no queda nitrato porque se ha reducido a gas (desnitrificación).
HEMOLISIS
Medio de cultivo enriquecido con la adicción de sangre. Las hemolisinas son
enzimas que lisan los hematíes. Las bacterias que producen estas enzimas
presentan un halo transparente alrededor de las colonias a consecuencia de la
lisis de los hematíes.
Se siembre por agotamiento en estría en placas de agar sangre y se incuba.
MEDIOS
AGAR MOSSEL
Para el enriquecimiento selectivo de todos las Enterobacterias, a partir de

alimentos y otros materiales de investigación.
COMPOSICIÓN

D – Manitol 10.0
Rojo de fenol 0.025
Agar – agar 12.0
Suplemento 100ml de solución de yema de huevo (20%)
Sulfato de polimixina B (0.1%) 1ml

Diferencial: Manitol, yema de huevo, rojo de fenol
Color del agar: Guayaba
Forma de actuación
Bacillus cereus es manitol (-), el contenido del manitol posibilita la

separación de la biota manitol (+), que se manifiesta por viraje del rojo fenol.
La selectividad se debe a la resistencia del microorganismo a las
concentraciones de polimixina, inhibiendo la biota acompañante. B. cereus
forma Lectinasa. Productos de degradación de lecitina (yema de huevo) se
acumulan alrededor de las colonias formando un precipitado blanco.
Colonias rojas – rosadas con un halo de precipitado blanco, efecto de que es
manitol (-) y produce la lecitinaza que degrada la lecitina (presente en la yema
de huevo). La presencia de colonias amarillas indican microorganismos
manitol (+), por lo que se produce viraje del medio esto no corresponde a B.
cereus.
(Bacillus cereus, Staphylococcus aureus)
ASBC AGAR SELECTIVO PARA Bacillus cereus
Para el aislamiento y enumeración de B. cereus en alimentos
COMPOSICIÓN
Peptona 1.0
Sulfato de magnesio 0.1
Fosfato de sodio hidrógeno 2.5
Fosfato hidrógeno potásico 0.25
Azul de bromo timol 0.12
Piruvato de sodio 10.0
Agar – agar 14.0
Suplemento: Polimixina β (50.000unid), emulsión de yema de huevo (20%),

25ml.
Diferencial: Manitol, yema de huevo, azul de bromotimol
Color del agar: verde debido al azul de bromotimol
Forma de actuación
La hidrólisis de la lecitina por la acción de la lecitinaza se manifiesta por el

halo que se produce alrededor de las colonias. B. cereus es manitol (-) por lo
que no se produce viraje en el medio.
Azules cremosas y con halo traslucido o blanco alrededor de las colonias.
AGAR PEPTONA- CASEÍNA DE LA DEXTROSA
Medio propuesto por WILLIAMS (1936) para la identificación y la

enumeración del bacilo especie, especialmente de las bacterias “amargas e
insípidas” (TANNER 1944), en comestibles. Este medio se conforma con las
recomendaciones del NCA (asociación nacional 1954, 1956 de los
conserveros), y el APHA (1992) para los alimentos que examinan.
Forma de actuación
Las colonias bacterianas, que metabolizan la dextrosa para formar el ácido,

hacen cambiar a púrpura el indicador de bromocresol en sus alrededores
cambian a color amarillo.

Peptona de la caseína 10.0;
D (+) glucosa 5.0
Púrpura de bromocresol 0.04;
Agar-agar12.0.
BACILLUS CEREUS SELECTIVO AGAR
Medio diagnóstico selectivo utilizado para el aislamiento y recuento de

Bacillus cereus en alimentos.
FUNDAMENTO
Bacillus cereus, ha sido implicado en toxoinfecciones alimentarías,

particularmente asociado al consumo de arroz contaminado, y también en
algunos procesos infecciosos en seres humanos y animales.
En el medio de cultivo, el contenido de peptona es bajo (0.1%), y la adición de
piruvato de sodio y emulsión de yema de huevo mejora el aislamiento y
esporulación de esta bacteria. Para verificar la utilización del manitol, se usa
un indicador de pH, azul de bromotimol. Este medio es selectivo, por el
agregado del suplemento para Bacillus cereus (código B03-606-32) con el que
se obtiene una concentración final de 100 U de Polimixina B por ml de medio.
COMPOSICIÓN gr/Lt
Fórmula (en gramos por litro)

Manitol 10.0
Sulfato de magnesio 0.1
Fosfato disódico 2.5
Fosfato monopotásico 0.25
Azul de bromotimol 0.12
Piruvato de sodio 10.0
Agar 14.0
SIEMBRA
Homogeneizar 10 g de la muestra de alimento en 90 ml de agua peptonada

0.1%. Efectuar diluciones y sembrar 0.1 ml sobre la superficie del medio de
cultivo.
INCUBACIÓN
En aerobiosis, a 35-37 ºC durante 24 horas.
Microorganismos Crecimiento
Bueno
Bacillus cereus ATCC 10876
Staphylococcus aureus ATCC Bueno
25923
Escherichia coli ATCC 25922 Inhibido
Bacillus subtilis ATCC 6633 Bueno
El diagnóstico primario se basa en la morfología y color de la colonia, en la

precipitación de la lecitina hidrolizada y en la falta de utilización del manitol
por Bacillus cereus.
Las colonias típicas de B. cereus son crenadas, filamentosas de

aproximadamente 5 mm de diámetro a las 24 horas de incubación, y tienen un
color turquesa (peacock blue) rodeado por un precipitado de hidrólisis de
yema de huevo. A las 48 horas de incubación presentan el color con centro
grisáceo.
Estos hallazgos diferencian B. cereus de B. subtilis y B. licheniformis, pero
pueden no diferenciar B. cereus de otras especies de Bacillus, tales como B.
thuringiensis, B. anthracis, B. mycoides, y en estos casos, será necesario
realizar mas ensayos para su identificación
Otros microorganismos que crecen bien en el medio son: Staphylococcus

aureus, Serratia marcescens y Proteus vulgaris, los cuales se diferencian de
B. cereus por la forma de la colonia, el color, y porque producen una reacción
de aclaramiento sobre la yema de huevo, a diferencia del precipitado que
produce B. cereus.
Bacillus megaterium y Bacillus coagulans son completamente inhibidos en

este medio de cultivo. Se recomienda la realización de un examen
microscópico para evaluar la presencia de glóbulos de lípidos en las células
vegetativas, debido a que es una prueba rápida y confirmatoria de B. cereus.
Características del medio:

Medio preparado: verde manzana
BACTERIAS COLIFORMES
Los microorganismos coliformes son los más reconocidos indicadores de

contaminación fecal. Se incluyen métodos de placa profunda, número más
probable, filtración en membrana y en métodos con Fluorocult (LMX).
Bacilos cortos Gram negativos, pertenecen a la familia Enterobacteriaceae,
las principales especies son: Escherichia coli y Enterobacteraerogenes.
Existen mas 20 especies; son aerobios o anaerobios facultativos, fermentan
lactosa con producción de gas. Entre las coliformes capaces de crecer a 44.5 –
45ºC, lo cual las diferencian de las demás coliformes.
Tienen la capacidad para crecer en sustratos muy distintos y usar energía de

hidratos de carbono y componentes orgánicos como fuente de N2, Sintetizan
la mayoría de las vitaminas que necesitan crecer en un intervalo emperatura
amplia, inferiores a 10ºC – 46ºC y producen ácido y gas a partir de azúcar.
PRUEBAS BIOQUIMICAS
Indol +
Rojo de metilo +
V/P -
Citrato -
Motilidad +
H2S -
Oxidasa -
Catalasa +
Glucosa/gas +/+
Manitol -
Sacarosa D
Nitratos +
Gelatina -
Sorbitol +
Lactosa +

FIG 7-8-9 y 10 muestran los tubos con la prueba de SIM con sus respectivos
demostrándose que esta prueba es positiva para E. coli.


produciendo compuestos de color rojizo. Para evitar la interferencia del
triptófano, el reactivo está disuelto en alcohol isoamílico inmiscible en agua.
A diferencia del triptófano, el indol es soluble en el alcohol y sólo este

compuesto reaccionará con el aldehído produciendo el anillo coloreado
característico de esta prueba.
VOGES-PROSKAUER
Uno de los test del IMVIC para enterobacterias es el Voges Proskauer. Las
especies que llevan a cabo la fermentación a butanodiol de la glucosa
acumulan acetoína en el medio. Las bacterias se inoculan en caldo glucosa-
peptona. Las especies que llevan a cabo la fermentación butanodiólica de la
glucosa forman acetoína en el medio.
Se añade alfanaftol y creatina en medio alcalino. La acetoína se convierte en
diacetilo con la aparición de un color rojo.
POSITIVO NEGATIVO
Producción de sulfhídrico

aminoácidos azufrados (cisteína o metionina) o tiosulfato. La fermentación de
sulfhídrico puede ser detectada incluyendo hierro reducido en el medio para
formar un precipitado negro de FeS. Se inocula un medio de agar nutritivo
conteniendo tiosulfato de metionina y sulfato ferroso.
NEGATIVO

CATALASA

géneros:

Erysipelothrix (-)


PRUEBA MRVP (rojo metilo Voges-Proskauer)
Las enterobacterias son anaerobios facultativos que utilizarán la glucosa en

dos fases:
el oxígeno del medio.



metilo (rojo a pH 4.0).Si la fermentación que se ha llevado a cabo produce
acetoína puede ser detectada añadiendo al medio KOH y alfa-naftol que
reaccionarán con este compuesto produciendo rojo característico.
Una coloración roja, indicadora de la presencia de ácidos provenientes de la
fermentación de la glucosa, constituye un resultado positivo, una coloración
amarilla constituye una reacción negativa
FIG 3-4 la parte izquierda muestra la prueba de rojo de metilo sin inocular y
sus respectivos resultados, la parte derecha muestra los reactivos utilizados
en esta prueba.
positivo para voges-proskauer, en el tubo de la derecha se observa un tubo el
CITRATO DE SIMMONS


respectivamente y azul de bromotimol como indicador de pH. Sólo las
bacterias capaces de metabolizar el citrato podrán multiplicarse en este medio
y liberarán iones amonio lo que, junto con la eliminación del citrato (ácido),
generará una fuerte basificación del medio que será aparente por un cambio de
color del indicador de pH, de verde a azul.
FIG muestra la prueba de citrato con su respectivo resultado, que para E.

coli es positiva.
TSI

inicial
K/A

decarboxilación oxidativa de las proteínas.
Como resultado, el medio mantendrá su color rojo en la superficie, al no haber

cambiado de pH. Por el contrario, las bacterias crecidas en la profundidad
emplearán desde el primer momento la glucosa por

Producción de gas

tubo dejando una área clara. Si el microorganismo es anaerogénico, no hay
producción de gas.
PRUEBA DEL MANITOL

enterobacterias, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris y Shigella dysenteriae.
MEDIOS DE CULTIVOS
CALDO DE BRILLA (verde brillante – bilis - lactosa)
Para el enriquecimiento selectivo y numeración de E. coli en aguas, leches,

alimentos y otros materiales mediante la determinación del titulo, a según la
técnica de NMP.
COMPOSICIÓN
Peptona 10.0
Lactosa 10.0
Bilis de buey desecada 20.0
Verde brillante 0.0133
Selectivo: Bilis y verde brillante, inhiben Gram (+)

Diferencial: Lactosa y campana de Durham
Color del caldo: verde claro (traslucido)
Forma de actuación
La bilis y el verde brillante inhiben en crecimiento de flora acompañante. La

fermentación de la lactosa con formación de gas, es un indicador de la
presencia de Escherichia coli, en las campanas. Las restantes coliformes
también crecen pero generalmente sin formación de gas (presuntivo).
AGAR EMB
Eosina – azul de metileno – Lactosa – Sacarosa

Selectivo para la demostración y aislamiento de Entero bacteriáceas
patógenas.
COMPOSICIÓN
Peptona 10.0
Hidrogeno fosfato dipotásico 2.0
Lactosa 5.0
Sacarosa 5.0
Eosina amarillenta 0.4
Agar – agar 13.5
Selectivo: Eosina amarillenta y azul de metileno

Diferencial: Lactosa y sacarosa
Indicado: Azul de metileno
Color del agar: Rojo
La lactosa y la sacarosa hace distinguir las colonias Lactosa y Sacarosa (-) es
decir Salmonella sp y Shigella sp. Las bacterias Gram (+) se inhiben por los
colorantes.
Salmonella sp Traslucidas
Lactosa (-) Sacarosa (-)
Shigella sp Traslucidas
Escherichia coli Verdes y brillantes

Lactosa (+) Sacarosa (+)
FIG Contiene sucrosa y lactosa. Utiliza como inhibidor e indicador a

eosina azul de metileno. Prueba negativa si se mantiene igual color al medio
(rojo), indicativo de la no fermentación de azúcares
Escherichia coli produce un color verde metálico a la luz reflejada, con el

centro negroazulado a la luz transmitida característico para esta prueba
positiva
CALDO FLUOROCULT
FORMA DE ACTUACIÓN
El contenido en laurel sulfato inhibe ampliamente el crecimiento de la flora

acompañante. La detección de la presencia de E. coli se efectúa mediante
fluorescencia al iluminar con luz UV. Para confirmar el ensayo se utilizan
como indicadores a formación de gas debido a la fermentación de la lactosa y
el ensayo del indol positivo.
COMPOSICION (gr/Lt)
Triptosa 25.0
Lactosa 5.0
Cloruro sódico 5.0
Laurilsulfato, sal sódica 0.1
Hidrogenofosfato dipotásico 2.75
Hidrogenofosfato potásico 2.75
L – triptófano 1.0
4 – metilbeliferil – β – D- glucorónido 0.1
El empleo y evaluación se efectúa en la forma habitual. Inocular los tubos.

Para 1ml de inoculo utilizar como mínimo 10ml de caldo e incubar a 37ºC
durante 10 – 24 horas o según los procedimientos preescritos. La fluorescencia
se provoca mediante una lámpara UV. Las colonias que muestran
fluorescencia azul claro corresponde a los de E. coli para la confirmación del
diagnostico colocar sobre el cultivo una capa de aproximadamente 5mm de
altura con reactivo de Kovac’s. Una coloración roja cereza en la capa del
reactivo de 1 a 2 minutos indica la presencia de
E .coli. El gas formado en el tubo de Durham indica la presencia de E. coli
y/u otras bacteria coliformes.
Fluorocult caldo LMX
Forma de actuación
Gracias a la modificación del caldo LMX descrito en 1989 por MANAFI y
KNEFEL se pudo aumentar claramente la conversión de sustrato. Esto, de
una sensibilidad mejorada, lleva sobretodo a una clara reducción del tiempo
de identificación, 24 horas generalmente.
Debido a la alta calidad alimenticia y al tampón de fosfatos contenido
garantiza un rápido crecimiento de coliformes. El contenido en laurilsulfato
inhibe en gran medida el crecimiento de bacterias gram positivas. La
identificación simultanea de coliformes totales y E. coli se hace posible por
la adición de del sustrato crómogeno 5- bromo-4-cloro-3-indol-β-D-1-
tiogalactopiranósido (IPTG) actúa como sustancia intensificadora en la
síntesis enzimática y aumenta el contenido de la actividad de β-D-
galactosidasa. El sustrato fluorógeno 4- metillumbeliferil- β-D glucorónido
(MUG) es escindido por la enzima β-D glucorónidasa altamente específico
para E. coli . El contenido de triptófano mejora la reacción del indol para la
confirmación adicional de E. coli y aumenta con ello la sensibilidad de
identificación en combinación con la reacción X-GAL y la reacción MUG.
COMPOSICION (gr/Lt)
Triptosa 5.0
Cloruro sódico 5.0
Sorbita 1.0
Triptófano 1.0
Hidrógenofosfato dipotásico 2.7
Dihidrógenofosfato potásico 2.o
Laurilsulfato, sal sódica 0.1
5-bromo-4cloro-3-indoli- β-D-galactopiranósido (X-GAL) 0.08
4-metilumbeliferil- β-D-glucorónido (MUG) 10.05
L-isopropil- β-D-L-tiogalactopiranósido 0.1
El empleo se rige los correspondientes métodos de investigación para agua y

alimentos.
Incubación: 24 horas, eventualmente hasta 8 horas a 35-37ºC.
E. coli la lectura de la fluorescencia tiene lugar mediante un alambra UV.
Una fluorescencia azul claro en el cultivo indica E. coli (reacción MUG).
E.coli
Salmonella enteritidis, E.coli, Citrobacter freundii, Enterobacter cloacae
AGAR CHROMOCULT
Composición
Peptona: 3gr
Cloruro sódico: 5gr
Dihidrogenofosfato potásico: 1.7g
Hidrogenofosfato dipotásico: 3.0g
Piruvato sódico: 1.0gr
Triptófano: 1.0gr
Agar – agar: 12.0gr
Laurel sulfato sódico 0.1gr
Mezcla de cromógenos 0.2gr
Forma de actuación
Gracias a la acción conjunta de peptonas selectivas, piruvato y tampón de

fosfatos, se garantiza un rápido crecimiento también de coliformes con daños
subletables. El contenido de lauril sulfato inhibe ampliamente el crecimiento
de bacteria Gram (+) sin tener influencias negativas sobre el crecimiento de
coliformes.
La identificación simultanea de coliformes totales y E.coli se hace posible
por la nueva combinación de patente solicitada de dos sustratos cromógenos.
El sustrato Salmo– GAL como x- glucoronido, las colonias se tiñen de verde-
azul oscuro y debido a ello son fáciles de diferenciar de los restantes
coliformes. Que se presentan de color rojo.
En los tubos del caldo LMX se obtuvieron colores azul (cromógeno) debido a
que la enzima de los coliformes β – D - galactosidasa reacciono con el x-Gal
(5 – bromo, 4 – cloro, 3 – indolin, β- D - galactopiranoside) dando el color
característico (verde-azulado).
En los tubos de caldo de fluorogeno llamado MUG (4 – metilumbiliferil - β- -

D glucoronido) que reacciona con la enzima característica del 94% de las
especies de Escherichia coli la β- - D – glucoronidasa dando un compuesto
fluorescente color azul a rayos U.V.
E.coli, Citrobacter freunii, Salmonella enteritidis

AGAR MAC CONKEY
Medio de cultivo utilizado en la investigación de organismos coliformes.
Fundamento
Por la presencia de las sales biliares y el cristal violeta se inhibe el crecimiento
de las bacterias Gram-positivas. Por la presencia de la lactosa, las bacterias
capaces de fermentarla acidifican el medio, cambiando el color del rojo neutro
y formando colonias rojas o rosadas, pudiendo presentar un halo turbio
correspondiente al precipitado biliar. Las bacterias lactosa-negativas dan
colonias incoloras.
Fórmula (por litro)

Lactosa. 10,0 g
Peptona 3,0 g
Sales Biliares 1,5 g
Peptona de Gelatina 17,0 g
Rojo Neutro 0,03 g
Sodio Cloruro 5,0 g
Violeta Cristal 0,001 g
Agar 13,5 g
PH final: 7, 1 ±0, 2
FIG Agar Mac Conkey: medio selectivo y diferencial (permite diferenciar a

los microorganismos que fermentan lactosa). Colonias grandes con halo y
rojas
AGAR-GELATINA DEV
Para la determinación del número total de gérmenes y para la investigación, en

aguas, de gérmenes que licuan la gelatina, según los métodos de unificación
alemanes y las disposiciones sobre las aguas potables en (1986).

Cloruro sódico 5.0
Gelatina 10.0
Agar – agar 15.0
Según los métodos de unificación alemanes el caldo se siembra por el

procedimiento de vertido en placa y se incuba durante 44 +/- 4 horas a 20 +/-
2ºC. Los cultivos se recubren con solución saturada de sulfato amònico. De
esta forma aparecen halos de aclaramiento alrededor de las colonias que licuan
la gelatina.
Salmonella sp y Shigella sp
Shigella sp
Es un género bacteriano perteneciente a la familia Enterobacteriaceae,

integrado por bacterias de forma bacilar, no esporuladas, inmóviles, pero
animados de animados de movimientos pendulares (oscilación) in situ.
Son Gram negativos, aerobios – anaerobios facultativos. Citocromo-oxidasa
negativos. Fermentan la glucosa sin producción de gas; no obstante, se han
encontrado algunos biotipos que producen gas de la glucosa. No descarboxilan
la lisina. No fermenta la lactosa. No utilizan el citrato como única fuente de
carbono. No creen en el medio cianuro potásico su actividad bioquímica es
muy reducida.
Su temperatura óptima de crecimiento es de 35ºC +/-2ºC. Crecen en medios
ordinarios y resisten la acción bacteriostática. Tienen un periodo de
incubación 7 – 656 horas.
PRUEBAS BIOQUIMICAS
Manitol +
Glucosa +
Sacarosa -
Gelatina -
H2S -
Latosa -
Lisina -
Descarboxilasa -
PRUEBA DEL MANITOL


Interpretación:
Negativo

tiempo adicional.


A B C
para esta prueba Shiguella es negativo.
A tubo sin inocular

C resultado negativo (Para Shiguella)
Salmonella sp
Bacilo Gram negativo, anaerobio, móvil mediante flagelos perítricos aunque

existen mutantes inmóviles, sus colonias presentan un diámetro de 2 a 3 mm,
no esporulado, fermenta la glucosa con formación de gas, no fermentadores de
lactosa.
Estas especies reducen los nitratos a nitritos, crecen a una temperatura óptima
de 37ºC y no resistente crecimiento a 5ºC y son destruidos a mas de
60ºC/5minutos, son considerados bacterias invasivas, pero solamente superan
la barrera mucosa y linfáticas, invadiendo el torrente sanguíneo; la productora
de fiebre lipoidea y excepcionalmente otros serotipos ocasionan un septicemia
y en los casos mas extremos el paciente entra en shock. Son sensibles a la sal,
presentan resistencia a algunos antibióticos, por su endotoxina; además
resisten alcoholes y son quimiorganótrofos.
Alimentos implicados: cárnicos y derivados, algunos productos de

charcutería, carnes de aves y derivados, huevos y ovo productos, leche y
derivados.
PRUEBAS BIOQUIMICAS
Manitol +
Nitratos +
Glucosa +
Citrato +
Sulfuro +
Lisina +
Catalasa +
V/P -
Lactosa -
Triptosa -
Ureasa -
Sacarosa -
Oxidasa -
TSI
Los cultivos típicos de Salmonella en agar TSI presentan la parte inferior del
medio amarilla (formación de ácido) y el bisel rojo (alcalino), con o sin
oscurecimiento, generalmente con formación de gas.
PRUEBA DEL MANITOL


CITRATO DE SIMMONS


respectivamente y azul de bromotimol como indicador de pH. Sólo las
bacterias capaces de metabolizar el citrato podrán multiplicarse en este medio
y liberarán iones amonio lo que, junto con la eliminación del citrato (ácido),
generará una fuerte basificación del medio que será aparente por un cambio de
color del indicador de pH, de verde a azul.
FIG muestra la prueba de citrato con su respectivo resultado, que para
Shiguella positiva.
CATALASA

géneros:

Erysipelothrix (-)


MEDIOS DE CULTIVOS
AGAR BISMUTO SULFITO (B.S)
Selectivo para el aislamiento y diferenciación de Salmonella sp a partir de

material clínico y otros clases.
COMPOSICIÓN

D (+)-glucosa 5.0
Hidrogeno fosfato disódico 4.0
Sulfato ferrosos 0.3
Indicador bismuto-sulfito 8.0
Agar – agar 15.0
Selectivo: Verde brillante y bismuto

Diferencial: sulfuro de hierro y bismuto sulfito
Color del agar: Crema
Forma de actuación
El verde brillante y el bismuto inhiben considerablemente los gérmenes de
acompañamiento. Las colonias de Salmonella sp H2S (+) presentan
ennegrecimiento debido al sulfuro de hierro. El brillo metálico alrededor de
las colonias se debe a la reducción de los iones bismuto a bismuto metálico.
Shigella sp: centro negro, borde claro, precipitado negro, brillo metálico
alrededor de las colonias.
Coliformes: pequeñas, verdes hasta pardas, a veces mucosas.

FIG colonias marrones o negras, algunas veces con brillo metálico alrededor
de la colonia (S.typhi). Algunas cepas producen colonias verdes con poco o
ningún oscurecimiento del medio.
El medio de cultivo contiene lactosa, cuya degradación a ácido se reconoce

por el viraje a amarillo del rojo de fenol que actúa como indicador de pH. En
ambiente alcalino presenta un color rojo intenso la flora acompañante Gram
positiva, así como Salmonella thypi y Shiguella resulta muy reprimidas por la
presencia de verde brillante. Para la inhibición en grupo de Proteus,
recomienda ADAM la adición de 0.2% sodio de desoxicolato, al medio de
cultivo.

Cloruro sódico 5.0
Lactosa 15.0
Rojo de fenol 0.04
Agar- agar 13.0
En medio de cultivo se siembra masivamente en superficie con material objeto

de investigación directamente, o a partir de un cultivo de enriquecimiento,
incubación de 18-24 horas a 37ºC.
Colonias Microorganismo
Rosa pálido, transparentes con halo Lactosa- Negativa: Salmonella y
rojo. ocasionalmente Proteus,
Citrobacter.
Verde- amarillenta, opacas con halo Lactosa positiva:
verde amarillento E. coli, Enterobacter, klebsiella,
con buen crecimiento. De lo
contrario notable inhibición
AGAR BPL (VERDE BRILLANTE)
Agar selectivo para la demostración y aislamiento de Salmonella en heces,

orina, carnes, leche y otros materiales objetos de investigación, según
KAUFFMANN.
FORMA DE ACTUACIÓN
El medio de cultivo contiene lactosa, cuya degradación a ácido se reconoce

por el viraje a amarillo del rojo de fenol que actúa como indicador de eh. En
medio alcalino presenta color rojo intenso. La flora acompañante Gram
positiva, así como Salmonella typhi y Shigella resulta muy reprimidos por la
presencia del verde brillante. Para la inhibición en el grupo de Proteus la
adición de 0.2% de sodio desoxicolato al medio de cultivo.
COMPOSICIÓN gr/Lt

Cloruro sódico 5.0
Lactosa 15.0
Rojo de fenol 0.04
Agar – agar 13.0
COLIONIAS MICROORGANISMOS
Rosa pálido, trasparentes con halo Lactosa – negativos:

rojo. Salmonella, ocasionalmente Proteus
y citrobacter.
Verde – amarillentas, opacas con halo Lactosa – positivo:

verde –amarillento. E. coli, Enterobacter, Klebsiella con
buen crecimiento. De lo contrario
notable inhibición.
Pequeñas, incoloras, rosadas ó fucsias, transparentes u opacas, sobre el Medio

coloreado de rosado a rojo.
AGAR DESOXICOLATO- CITRATO:
FORMA DE ACTUACIÓN
La composición de este medio de cultivo y su forma de actuar corresponde

ampliamente con las del agar Desoxicolato citrato según LEISSON. El
contenido en sacarosa posibilita, además, la diferenciación de colonias de
Salmonella, Shigella y Arizona lactosa y sacarosa negativa, frente a la flora
lactosa – negativa pero sacarosa positiva, que como por ejemplo la de Proteus
vulgaris , Serratia y otros.
Por la adición de la sacarosa el agar DCLS posee frente al agar LEISSON la
ventaja de excluir resultados falsos – positivos en la búsqueda de
Enterobacteriaceas patógenas.

Lactosa 10.0
Sacarosa 10.0
Citrato sódico 2 – hidrato 6.0
Tiósulfato de sodio 4.0
Desoxicolato sódico 3.0
Rojo neutro 0.02
Agar – agar 13.0
COLONIAS MOCROORGANISMOS
Incoloras Salmonella, Shigella (eventualmente, las

colonias de Shigella sonnei se presentan
de color rosa pálido), Morganella
Reltgerella y otros.
Incoloras con el centro Proteus mirabilis, algunas Salmonella y

negruzco otros.
Parduscas Pseudomonas
Rojas, pequeñas, planas Escherichia coli, Serratia y otros
Rosa con el centro rojo, Enterobacter, klebsiella y otros.
mucosas
Rojas, con el centro negruzco Proteus vulgaris
Pequeñas, incoloras, elevadas, opacas; algunas cepas producen colonias con el

centro negro.
AGAR S.S (SALMONELLA - SHIGELLA)
FIG Medio de cultivo selectivo para Salmonella y Shigella. Está compuesto
por sales biliares que inhiben el crecimiento de coliformes, lactosa y rojo
neutro (indicador de pH). Las colonias fermentadoras de lactosa producirán
ácidos y cambiará el color del medio a rosa. Como Shigella y Salmonella no
utilizan este azúcar forman colonias transparentes. El tiosulfato es la fuente
de azufre para la producción de ácido sulfhídrico de las bacterias sulfato-
reductoras. Este ácido reacciona con la sal de hierro y se forma sulfuro de
hierro de color negro. Las colonias de Salmonella se observan transparentes
con un precipitado negro en el centro.
Para el aislamiento de Salmonella sp, Shigella sp a partir de heces, alimentos

y otros materiales objetos de investigación.
COMPOSICIÓN
Peptona 10.0
Lactosa 10.0
Bilis de Buey desecado 8.5
Citrato sódico 10.0
Tíosulfato sódico 8.5
Rojo neutro 0.025
Selectivo: Verde brillante, Bilis de Buey, Tiosulfato de sodio y citrato
Diferencial: Tiosulafato, iones de hierro y lactosa.
Indicador: Rojo neutro
Color del agar: Claras y parduscas
El brillante y la Bilis de Buey y la elevada concentración de tiosulfato y de

citrato inhiben considerablemente la biota acompañante. Con tiosulfato y los
iones de hierro se pone en manifiesto la formación de sulfuro, para las
colonias H2S (+). Las colonias de coliformes quedan señaladas para la
degradación de lactosa y producción de ácido demostrado por el viraje del
indicador (rojo neutro).
Salmonella sp. Traslucidas y centro negro
Lactosa (-) sulfuro (+)
Shigella sp. Traslucidas sin centro negro

Lactosa (-) sulfuro (-)
Escherichia coli Rojas a rosadas sin precipitado

Lactosa (+) sulfuros (-)
AGAR V.R.B (Violeta Cristal – Rojo Neutro - Bilis)
Medio selectivo para la determinación de bacterias coliformes, inclusive la E.

coli a partir de aguas, productos lácteos, carnes, helados y otros alimentos.
COMPOSICIÓN

Cloruro sódico 5.0
Lactosa 10.0
Rojo neutro 0.03
Mezcla de sales biliares 1.5
Violeta cristal 0.002
Agar – agar 13.0
Selectivo: Cristal violeta y sales biliares

Diferencial: Lactosa
Indicador: Rojo neutro
Color del agar: Claro y rojo parduzco
El cristal violeta y sales biliares inhiben biota Gram positiva. La degradación
de lactosa a ácido se manifiesta por viraje del indicador del pH y precipitación
de sales biliares.
Colonias características
Salmonella sp traslucidas sin precipitado lactosa (-)
Shigella sp traslucidas sin precipitado lactosa (-)
E.coli rojas con precipitado lactosa (+)
AGAR Mc Conkey
Agar selectivo para el aislamiento de salmonella sp, shigella sp y bacterias

coliformes, a partir de heces, orina, alimento, aguas residuales, entre otras.
Composición

Cloruro sódico 5.0
Lactosa 10.0
Rojo neutro 0.03
Violeta cristal 0.01
Agar-agar 13.5
Selectivo: cristal violeta y sales biliares

Diferencial: lactosa
Indicador: rojo neutro
Color del agar: claros y rojo parduzco
Forma de actuación
El cristal violeta y sales biliares inhiben biota gram (+). La degradación de

lactosa se manifiesta por viraje a rojo del indicador de ph, sirve para
comprobar la degradación de dicho azúcar.
Salmonella sp traslucidas sin precipitado lactosa (-)
Shigella sp traslucidas sin precipitado lactosa (-)
E.coli rojas con precipitado lactosa (+)
FIG agar Mac Conkey: medio selectivo y diferencial (permite diferenciar a

los microorganismos que fermentan lactosa) colonias incoloras, transparente.
AGAR HEKTOEN
Agar selectivo para la demostración y aislamiento de bacterias intestinales

patógenas, inclusive shigella sp a partir de los más diversos materiales, tales
como: heces, alimentos y otros.
Composición
Peptona 15.0
Cloruro sódico 5.0
Sacarosa 14.0
Lactosa 14.0
Salicina 2.0
Bisulfato sódico 5.0
Fucsina acida 0.08
Agar-agar 13.5
Selectivo: sales biliares

Diferencial: bisulfato, sales de hierro, fucsina ácida y lactosa.
Indicador: azul de bromotimol
Color del agar: azul verdoso claro
Forma de actuación
Las colonias lactosa (-) muestra una expresiva diferencia cromática frente a
las colonias lactosa (-) por el viraje a rojo – anaranjado. La combinación de
tiosulfato y una sal de hierro dan una coloración negra de las colonias
sulfuro (+) Salmonella sp. Las sales biliares inhiben la biota acompañante.
Salmonella sp verdes con o sin precipitado negro en el centro lactosa (+)

sulfuros (-)
Shigella sp verdes, húmedas, planas y trasparentes lactosa (+) sulfuros (-)
E.coli rojas- anaranjadas con halo de precipitado lactosa (+) sulfuros (-)
AGAR XLD (xilosa –lisina-desoxicolato)
Para el aislamiento y diferenciación de enterobacterias patógenas,
especialmente de Salmonella sp y shigella sp .
Composición

Cloruro sódico 5.0
D (+) xilosa 3.5
Lactosa 7.5
Sacarosa 7.5
L (+) lisina 5.0
Tiosulfato sodio 6.8
Agar-agar 13.5
Selectivo: tíosulfato, desoxicolato de sodio y sales biliares

Diferencial: Tíosulfato, sales de hierro, Xilosa, Lisina, Lactosa.
Indicador: Rojo de fenol.
Color del agar: Rojo claro.
Forma de actuación
La degradación a acido de xilosa, lactosa y sacarosa vira el medio amarillo. El

tiosulfato y sales de hierro revelan la formación de H2S. La descarboxilación
de lisina (Producción de cadaverina) se reconoce por la presencia de un color
rojo púrpura, por aumento del pH alrededor de la colonia.
Varias de estas reacciones pueden presentarse simultáneamente o
sucesivamente, lo que puede dar lugar a diversas matices de color del
indicador de pH, o a un viraje de a Amarillo a Rojo en el transcurso de una
incubación mas prolongada. El efecto inhibidor de este medio de cultivo es
débil.
Salmonella sp Traslucidas con precipitado negro. Lactosa (-) Sulfuros (+)

Shigella sp Traslucidas en contraste con el medio. Lactosa (-) Sulfuros (-)
E. coli Amarillas, con zonas amarillas alrededor opacas, halo de precipitación.

Lactosa (+) Sulfuros (-)
AGAR RAMBACH
Medio de cultivo para diagnostico diferencial para identificación de

Salmonella sp en muestras clínicas.
Composición
Peptona 8.0
Cloruro sódico 5.0
Mezcla cromógena 1.5
Propilenglicol 10.5
Agar-agar 15.0
Selectivo: desoxicolato sódico

Diferencial: prolenglicol
Color del agar: guayaba
Forma de actuación
El desoxicolato inhibe biota gram (+). Las Salmonellas sp forman acido a

partir del propilenglicol y en combinación con el indicador de pH producen
colonias rojas características. Para diferenciar las colonias coliformes con las
de Salmonella sp hay un compuesto cromógeno, que indica la separación de
B-Galactosidasa, características para los coliformes totales.
Salmonella sp Rojas
Shigella sp Incoloro-amarillento
E. coli Verde azulado
AGAR EMB
Eosina – azul de metileno – Lactosa – Sacarosa
Selectivo para la demostración y aislamiento de Entero bacteriáceas
patógenas.
COMPOSICIÓN
Peptona 10.0
Hidrogeno fosfato dipotásico 2.0
Lactosa 5.0
Sacarosa 5.0
Eosina amarillenta 0.4
Agar – agar 13.5
Selectivo: Eosina amarillenta y azul de metileno
Diferencial: Lactosa y sacarosa
Indicado: Azul de metileno
Color del agar: Rojo
La lactosa y la sacarosa hace distinguir las colonias Lactosa y Sacarosa (-) es
decir Salmonella sp y Shigella sp. Las bacterias Gram (+) se inhiben por los
colorantes.
Salmonella sp Traslucidas
Shigella sp Traslucidas
Escherichia coli Verdes y brillantes

Lactosa (+) Sacarosa (+)
CALDO RAPPAPORT (CALDO DE ENRIQUECIMIENTO

SELECTIVO)
Para el enriquecimiento selectivo de Salmonella sp, con excepción de S.

Typhi a partir de material de investigación de origen fecal.
Composición

Cloruro sódico 8.0
Hidrogeno fosfato di potásico 0.8
Cloruro de magnesio 40.0
Verde malaquita 0.12
Selectivo: verde de malaquita, cloruro de magnesio
Diferencial: tetrationato y amarillo de metacromo
Color del caldo: azul.
Forma de actuación
El verde de malaquita y el cloruro de magnesio inhiben notablemente la biota
intestinal normal, en tanto que la mayoría de Salmonellas se multiplican sin
obstáculos. Por regla general, únicamente S. Typhi y Shigellas resultan
inhibidos también por el verde de malaquita. Por este motivo no es adecuado
este medio de cultivo para el enriquecimiento de estos agentes patógenos.
CALDO SELENITO (CALDO DE ENRIQUECIMIENTO SELECTIVO)
Para el enriquecimiento de Salmonellas a partir de heces, alimentos y otros

materiales.
Composición

L (-) cistina 0.01
Lactosa 4.0
Fosfato sódico 2.0
Hidrogenocelenito sódico 4.0
Color del caldo: claro y ligeramente amarillento
Forma de actuación
El selenito inhibe el crecimiento de bacterias coliformes y Enterococos en las

primeras 6-12 horas siguientes al inicio de la incubación. Después el efecto
inhibidor disminuye lentamente. Por el contrario Salmonella sp, Proteus sp,
Pseudomonas sp no son inhibidas.
CALDO DE ENRIQUECIMIENTO TETRATIONATE
Para el enriquecimiento selectivo de Salmonellas, a partir de diversos

materiales de investigación.
Composición

Carbonato calcico
Tiosulfato sódico 30.0
Aditivo: yoduro potásico 5.0
Yodo 6.0
Eventualmente verde brillante 0.01
Forma de actuación
El tetrationato junto con el tiosulfato excedente, inhiben a coliformes y otras
bacterias acompañantes. En cambio, todas las bacterias reductoras de
tetrationate, como por ejemplo: Salmonella sp y Proteus sp pueden
multiplicarse mas o menos sin obstáculo. El ácido procedente de la reducción
del tetrationato es neutralizado por carbonato calcio.
Las sales biliares inhiben considerablemente a todos los microorganismos de
presencia no obligatoria en el intestino. La adición del verde brillante sirve,
sobre todo para inhibir a la biota gram (+). Dado que le medio de cultivo con
verde brillante posee un efecto inhibidor muy intenso, resulta ventajoso a
veces suprimir la adición de verde brillante a fin de obtener un rendimiento
satisfactorio de Salmonellas.
Agar NUTRITIVO
Medio nutritivo universal para el cultivo de microorganismos poco exigentes.
Composición
Agar-agar 12.0
Color del medio: claro e incoloro hasta una tonalidad amarillento.
AGAR LEIFSON
Para el crecimiento de Salmonella y Shigella según LEIFSON.
FORMA DE ACTUACIÓN
Este medio de cultivo contiene concentraciones tan altas de desoxicolato y

citrato, que la flora Gram positiva queda totalmente reprimida e inhibidos más
o menos intensamente los coliformes. Las Salmonella crecen sin obstáculos;
algunas Shigella son ligeramente inhibidas
La degradación de la lactosa da lugar a una acidificación a los al rededores de
las correspondientes colonias y produce un viraje al indicador de pH rojo
neutro. Estas colonias están casi siempre rodeadas de un halo turbio de acido
desoxicólico precipitado. Las colonias de microorganismos lactosa –
negativos son incoloras. La reducción del tiosulfato a sulfuro se muestra en
forma de sulfuro de hierro negro.
COMPOSICIÓN gr/Lt

Lactosa 10.0
Citrato de amonio Y hierro (III) 1.0
Citrato sódico 6.0
Sodio desoxicolato 3.0
Rojo neutro 0.02
Agar – agar 12.0
El medio de cultivo se siembra por extensión con el material de muestra o a

partir de un cultivo de enriquecimiento.
Vibrio parahaemolytico y Vibrio cholerae
Los vibrios son agentes de infección en muchas partes del mundo. Como el
cólera y enfermedad de tipo colérico provocadas por Vibrio cholerae así como
infecciones provocadas por V. parahaemolyticus familia Bacillaceae.
Vibrio parahaemolyticus es un bacilo corto de tamaño (1.5 – 2.5 micrómetros

por 0.5 micrómetros), curvado, Gram positivo, móvil por un solo flagelo
polar. Es anaerobio facultativo y algo halófilo, ya que cuando mejor crece es
en presencia de 3 – 6 % de NaCl.
Crece en un rango de temperaturas entre 8 44ºC, siendo la óptima la de 37ºC,

otra propiedad poco corriente de este Vibrio y otros parecidos es su
preferencia por las condiciones alcalinas y algunas cepas exhiben su
crecimiento óptimo a un pH de hasta 9.0. Es termosensible y se destruye
fácilmente a temperaturas de 50ºC.
Los síntomas de la intoxicación alimentaría por V. parahaemolyticus

generalmente se presentan 10-18 horas después de ingerido al alimento
contaminado, si bien se han señalado periodos de incubación que variaban
entre 2 a 48 horas. Los síntomas principales son náuseas, vomito, dolor
bdominal y diarrea. La tasa de motilidad es baja y no se han señalado
portadores del microorganismo. Este microorganismo se encuentra
exclusivamente en ambientes marinos.
Vibrio cholerae también conocido como V. comma, es una bacilo curvado,

Gram negativo, parecido a V. parahaemolyticus. se periodo de incubación de
6-8 horas a 2-3 días y la enfermedad se caracteriza por una grave inflamación
en el tracto intestinal la que origina una carga casi continua de heces liquidas
(agua de arroz) que contiene sangre y mucosidad. Como consecuencia de esta
pérdida de líquido el enfermo se deshidrata gravemente y puede morir si no se
le suministra líquido, generalmente el cólera es una infección espasmódica
transmitida por contacto persona-persona, pero se presenta particularmente la
epidemia donde el agua se halla contaminada con efluentes cloacales. Cuando
se ha incriminado a los alimentos, generalmente se ha debido a su contacto
con el agua en la que crecieron, al consumir crudos o defectuosamente cocidos
originaran brotes de la enfermedad, también han estado implicado ensaladas,
frutas y hortalizas lavadas en aguas contaminadas.
PRUEBAS BIOQUIMICAS
V. cholerae
Lactosa -
Oxidas +
Lía +
TSI k/a
Sacarosa +
H2S -
Manitol +
Ornitina descarboxilasa +
VP
Fermentación de sacarosa +
Motilidad +
Indol +
Esculina -
Vibrio parahemolitico
Lactosa -
Oxidasa +
LIA +
TSI k/a
Sacarosa -
H2S -
Manitol -
Ornitina descarboxilasa +
VP -
Fermentación de sacarosa -
Motilidad +
Indol +
Esculina -

nitritos.
Para ello, el medio manitol movilidad incorpora 1 g/l de potasio nitrato y para
revelar la presencia de nitritos después de su incubación se añaden los
reactivos A y B de Griess-Ilosvay en cantidades iguales (1ml aprox.).
Un cambio de color (rojo) dentro de los 30 seg indica prueba completa con
resultado positivo.
Si no cambia de color, se agrega directamente al tubo una pizca (unos 20mg)

de polvo de cinc purísimo, totalmente exento de nitratos o nitritos, y se
observa el cambio de color durante otros 30 seg, al cabo de los cuales se
realiza la interpretación final.

OXIDASA
Esta sirve para demostrar la presencia de la enzima Citocromo oxidasa en
preparaciones de de microorganismos.
Interpretación de resultados:
Positiva: el color de la tira vira a azul debido ala oxidación del compuesto
adicionado por el azul de indofenol.
Negativa: el color de la tira de papel no vira.
CATALASA
Sirve para comprobar la presencia de la enzima catalasa en preparaciones de
microorganismos.
Interpretación:
Positiva: formación inmediata de burbujas bien visible (desprendiendo de
O2).
Negativa: no hay formación de burbuja (no hay producción de O2)

A B C
para esta prueba Vibrio positivo..
A tubo sin inocular

C resultado negativo (Para Shiguella)
TSI

inicial
K/A

decarboxilación oxidativa de las proteínas. Como resultado, el medio
mantendrá su color rojo en la superficie, al no haber cambiado de pH. Por el
contrario, las bacterias crecidas en la profundidad emplearán desde el primer
momento la glucosa por vía fermentativa, generando ácidos que no serán



MEDIOS DE CULTIVOS
TCBS (Tiosulfato – Citrato – Bilis - Sacarosa)
Para el aislamiento y cultivo selectivo de V.cholerae y otros Vibrios

enteropatógenos.
COMPOSICION

Citrato sódico 10.0
Bilis de Buey desecado 5.0
Colato sódico 3.0
Sacarosa 20.0
Cloruro sódico 10.0
Citrato de hierro (III) 10.0
Azul de timol 0.04
Agar – agar 14.0
Selectivo: Tiosulfato, citrato. pH alcalino (8.6) inhibe Gram negativas. Bilis y

colato inhiben Gram positivas.
Diferencial: sacarosa
Color del agar: Verde azulado
Indicador azul timol: coloración azulosa
Azul de bromocresol: coloración verdosa
Las elevadas concentraciones de tiosulfato y citrato, así como el medio

fuertemente alcalino, inhiben notablemente a las Entero bacteriáceas. Las Bilis
de Buey y el colato inhiben sobre todo a los Enterococos. Solamente algunas
cepas de Proteus sp sacarosa- positiva pueden formar colonias amarillas
semejantes a los vibriones. El indicador mixto azul de timol-azul de
bromotimol presenta un claro viraje a amarillo por la formación de ácido,
incluso en medio fuertemente alcalino.
Indicador: vira de azul verdoso a amarillo para sacarosa.
Vibrio cholerae: planas, de 2 a 3 mm de diámetro, amarillas

Vibrio parahaemolyticus: pequeñas con centro verde-azulado
AGAR DCLS (Agar-desoxicolato-citrato-lactosa-sacarosa)
Agar selectivo para el aislamiento y diferenciación de Enterobacteriáceas

patógenas y vibriones patógenos
Forma de actuación
La composición de este medio y su forma de actuar corresponden

ampliamente con las de agar- desoxicolato citrato según LEIFSON. El
contenido en sacarosa posibilita además, la diferenciación en colonias de
Salmonellas Shigella y Arizona lactosa y sacarosa-negativa, frente a la flora
lactosa-positiva, como por ejemplo, las de Proteus vulgaris, Serratia y otros.
Por la adición de sacarosa, el agar DCLS posee frente al agar LEIFSON la
ventaja de excluir resultados falsos positivos en la búsqueda de
Enterobacteriáceas patógenas.
Composición (g/Lt)

Lactosa 10.0
Sacarosa 10.0
Citrato sódico 2-hidrato 6.0
Tiosulfato de sodio 4.0
Rojo neutro 0.02
Agar – agar 13.0
Sembrar en superficies en placas previamente secadas. Incubación de 24 a

37ºC.
COLONIAS MICROORGANSIMOS
incoloras Salmonella, Shigella, Morganella,
Reltgerella, y otros.
Incoloras con centro negruzco Proteus mirabilis, algunas

Salmonella y otros.
Parduscas Pseudomonas
Rojas, pequeñas, planas Escherichia coli, Serratia y otros.
Rosa, con el centro rojo, pequeñas, Enterobacter, klebsiella y otros.
mucosas.
Rojas, con el centro negruzco Proteus vulgaris
AGAR SANGRE
Para la realización de hemocultivos
COMPOSICIÓN
Sustrato nutritivo
Extracto de corazón y peptona
Cloruro sódico
Agar – agar
Su abundante base nutritiva ofrece condiciones óptimas de crecimiento a todos

los organismos presentes. El valor de el pH de 6.8; es especialmente favorable
para la conservación de los eritrocitos y para la formación de halos
hemolíticos claros para la determinación de las formas de las hemólisis.
Listeria sp
Son bacilos Gram positivos, móvil, no esporulado, anaerobio facultativo. Este

microorganismo es ubicuo y esta bien difundido en el medio ambiente donde
puede sobrevivir durante largo tiempo. Esta característica puede ser debido a
numerosos factores, quizás el más importante es su capacidad para
multiplicarse relativamente rápidos a temperaturas de refrigeración (el limite
inferior de crecimiento es aproximadamente de 0ºC). Este microorganismo
también sobrevive a la congelación y deshidratación y es menos sensible al
tratamiento térmico que Salmonella sp o Campylobacter sp. Todavía se
discute la cuestión de la termo resistencia, especialmente en la pasteurización
de la leche. Debe recordarse que la pasterización no es un método de
esterilización, si no un modo de destruir ciertos microorganismos patógenos y
alterantes. La mayoría de los estudios han concluido que aunque los valores –
D (tiempo requerido para lograr una reducción decimal en el numero de
viables en unas condiciones dadas) son mayores que los presentan la mayoría
de las bacterias productoras de intoxicaciones alimentarías mas comunes, la
combinación temperatura/tiempo adoptada rutinariamente en la pasterización
HTST (temperatura alta durante tiempo corto), que es insuficiente para
inactivar Listeria monocytogenes cuando se halla en altos recuentos en la
muestra. Sien embargo es poco probable encontrar tales recuentos en la
practica, ya que son pocos los animales de una explotación lechera que
excretarían dicho microorganismo y además estos se diluirían intensamente al
llegar a la central. Además de cierta tolerancia a las condiciones ácidas, resiste
presiones osmóticas relativamente elevadas, como ilustra su capacidad de
crecer en un 10% de NaCl. Se halla en heces animales y humanas (aunque
existe una variación considerable en las proporciones de aislamiento), y por
consiguiente también en las aguas residuales; también se le ha aislado en el
suelo, en los fangos, en las aguas superficiales, en la vegetación y en el
ensilado.
Alimentos implicados:
carne cruda de vacuno, carne cruda de cerdo, salchichas frescas de cerdo,
carne de pollo, leche cruda, leche pasteurizad, quesos no pasteurizados, quesos
pasteurizados, helados, productos de origen marino congelados, ensaladas pre-
envasadas, verduras frescas (ensalada), patatas.
PRUEBAS BIOQUIMICAS
Hidrólisis de caseína -
Hidrólisis de gelatina -
Hidrólisis de esculina +
Hidrólisis de hipulata +
Urea -
Oxidasa -
Rojo de metilo ++
Voges proskauer -
Citrato -
Indol -
Nitrato +
Glucosa +
Maltosa +
Salicina +
Motilidad +
Amigdalina +
Celabiosa +
Manosa +
H2S -
Xilosa -
Manitol -
Lactosa + sin gas
Arabinosa +

POSITIVO NEGATIVO

Interpretación:
Positiva
FIG 14 En la parte izquierda muestra la reacción positiva en una placa que

para Staphylococcus aureus es positiva y en la parte derecha muestra la
reacción positiva y negativa en tubo.
Negativo

tiempo adicional.



PRUEBA DE UREA

La prueba se realiza en agar o caldo de urea. El color inicial del medio:

amarillo anaranjado. En el medio sólido por estría el microorganismo en
estudio. En el medio líquido sembrar por emulsión. Incubar a 37 ºC por 24
horas.
Interpretación

el medio.
PRUEBA DEL MANITOL

MEDIOS DE CULTIVOS
AGAR PALCAM agar selectivo para Listeria sp
Es un medio selectivo y diferencial para el aislamiento de Listeria sp en

muestras de origen clínico y biológico casi como en alimentos y muestras de
origen ambiental fuertemente contaminados.
COMPOSICION
Peptona 23.0
Almidón 1.0
Cloruro sódico 5.0
Agar – agar 13.0 (agar Columba); D (-)
Manitol 13.0
Esculina 0.8
Glucosa 0.5
Cloruro de litio 15.0
Rojo de fenol 0.08
Selectivo: Cloruro de litio, ceftaziadina, polimixina B y clorhidrato de

acrilflavina.
Diferencial: Esculina, iones de hierro, Manitol

Indicador: Rojo de fenol
Color del agar: Rojizo
La hidrólisis de la esculina forma escletina que se une con compuestos de
hierro del medio formando un complejo verde – negro.
Verde oliva con halos negros alrededor a razón de hidrólisis de la esculina.
OXFORD
Agar selectivo para Listeria sp
Agar selectivo para el aislamiento e identificación de Listeria monocytogenes
COMPOSICIÓN
Peptona 500ml
Cloruro de sodio
Agar – agar (Agar columbia) 19.05
Esculina 0.5
Cloruro de litio 705
Selectivo: el cloruro de litio, acriflavina, sulfato de calistina, cefotetano,

cicloexamida, fosfomicida.
Diferencial: esculina
Listeria monocytogenes disgrega la esculina presente en el medio de cultivo

dando esculetina conformación iones de hierro (III), que producen compuestos
negros que tiñen de negro las colonias.
El cloruro de litio, acriflavina, sulfato de cefotetano, cicloexamida,
fosfomicida, estos compuestos inhiben la biota acompañante e indeseable.
AGAR SANGRE
Para la realización de hemocultivos
Composición
Sustrato nutritivo (extracto de corazón y peptona)

Cloruro sódico
Agar- agar
Aditivo: sangre 50-80 ml
Su abundante base nutritiva ofrece condiciones óptimas de crecimiento a todos

los organismos presentes. El valor de ph de 6.8; es especialmente favorable
para la conservación de los eritrocitos y para la formación de halos
hemolíticos claros para la determinación de las formas de hemólisis.
AGAR CASO
Medio de cultivo universal para microorganismos poco exigentes.

Este medio tiene los componentes necesarios para proporcionarle al
microorganismo condiciones óptimas para su crecimiento.
Peptona de Caseína 15.0 g

Peptona de soymeal 5.0 g
NaCl 5.0 g
Agar 15.0 g
Agua destilada 1000.0 ml
Enterococcus y Streptococcus spp
Los géneros Streptococcus y Enterococcus están formados por bacterias

esféricas u ovoides que crecen en pares o cadenas de longitud variable. La
mayoría son anaerobios facultativos, existiendo algunas especies anaerobios
obligados. Son Gram positivos, no formadores de esporos, catalasas negativas,
inmóviles y tienen complejos y variables requerimientos nutricionales.
La infección estreptocóccica es una de las más frecuentes, siendo algunos de
los cuadros más importantes relacionados con el género: amigdalitis aguda,
otitis media, sinusitis, neumonía, meningitis, infección del tracto urinario,
abdominal o cutánea.
Las infecciones más frecuentemente asociadas con el género Enterococcus
son endocarditis, las infecciones urinarias y la colonización/sobreinfección de
enfermos que reciben tratamiento con antimicrobianos, especialmente
cefalosporinas.
Enterococcus sp y Streptococcus sp
Bilis – esculina +
sorbitol +
Manitol +
Lactosa +
Almidón -
Catalasa -
Tipo de hemolisis Alfa, beta y gamma
PRUEBA DEL MANITOL

TIPOS DE HEMOLISIS
CATALASA

géneros:

Erysipelothrix (-)




placa.
POSITIVO NEGATIVO


POSITIVO NEGATIVO
AGAR KF
Forma de actuación
La maltosa y la lactosa se utilizan por la mayoría de los Enterococos, con

formación de ácido y por lo tanto favorecen su crecimiento en tanto que las
especies indeseables de gérmenes resultan ampliamente inhibidas por la azida
sódica, la formación de ácido se pone de manifiesto por el viraje a amarillo
del indicador púrpura de bromocresol. Los Enterococos reducen el TTC
dando una formación y aparecen por lo tanto, como colonias rojas.
Composición g/Lt
Proteosa- peptona 10,0
Extracto de levadura 10,0
Cloruro sódico 5,0
Glicerofosfato sódico 10,0
Maltosa 20,0
Lactosa 1,0
Azida sódica 0,4
Púrpura de bromocresol 0,15
Agar-agar 15,0
Aditivo: 2, 3, 5 trifeniltetrazoliocloruto 0,1
Se recomienda la técnica de fijación por membrana, si se supone que el

número es pequeño, o bién el método de enumeración en placa, si se calcula
que el número y conteo es grande el filtro de membranas sembrado, se coloca
sobre la superficie del agar.
Incubación de 48 horas a 37ºC

COLONIAS MICROORGANISMOS
Siempre buen crecimiento Enterococcus,(Str.Faecalis,
colonias rojas con halo Str.zymogenes),
amarillo Str.mitis,Str.bovinis,Str.equinus,Str.
Salivarius y otros.
Casi siempre crecimiento Lactiplantarum, pesionococcus, cerevisiae
escaso sin viraje de color y otros
CALDO-TRIPTOSA
Para el enriquecimiento, y cultivo Estreptococos, Pneumococos,

Meningococos, Listerias, Pasteurellas y otros microorganismos patógenos.
Los medios de cultivo con triptosa han sido recomendados también por
HAUSLER y KOONTZ (1970) en los Diagnostic Procedures.
Forma de actuación
La adición de Violeta cristal sirve para la inhibición de la flora gram-positiva

(HAUSLER y KOONTZ 1970).Aislamiento de Listeria monocytogenes a
partir de cerebro (GRAY y col. 1948). Preparación de un Agar selectivo para
Listeria por adición de telurito potásico (GRAY y col. 1950). El Agar Triptosa
también constituye una excelente base para la preparación de Agar Sangre.
Triptosa 20,0;
D (+)-glucosa 1,0;
Cloruro sódico 5,0;
Tiamina dicloruro 0,005.
El preenriquecimiento con Caldo triptosa debe llevarse a cabo solamente si se

espera un pequeño número de bacterias patógenas. La incubación de
microorganismos anaerobios debe efectuarse en cada caso hasta 5 días a 35º C
en una atmósfera con el 10% de dióxido de carbono. Para el cultivo de otros
microorganismos se utilizan Agar triptosa o Caldo-triptosa. Las incubaciones
han de realizarse en lo posible bajo condiciones óptimas. El Caldo-triptosa-
citrato puede utilizarse para la preparación de hemocultivos. 2 a 5 ml de
sangre del paciente, fresco, se mezclan con 20 ml de Caldo.
Apariencia de las Colonias
Microorganismos:
De color rosa pálido, opacas, de superficie rugosa, grandes. Estreptococos.

Cepas de ensayo Crecimiento
Streptococcus pyogenes Bueno/muy bueno
Streptococcus pneumoniae Bueno/muy bueno
Pasteurella multocida moderado/bueno
Listeria monocytogenes Bueno/muy bueno
Shigella flexneri Bueno/muy bueno
Escherichia coli Bueno/muy bueno
PRUEBA DE CAMP PARA Streptococcus beta hemolíticos
Los estreptococos del grupo B (S. agalactiae) producen una proteína

difusible y termoestable (factor CAMP) que aumenta la beta-hemólisis de
Staphylococcus aureus.
S. aureus (sembrado desde la parte superior hasta la parte inferior de la placa)

produce esfingomielinasa C que se puede unir a las membranas de
Los eritrocitos. Cuando son expuestas al factor CAMP del grupo B, las
células sufren hemólisis.
PRUEBA DE BILIS ESCULINA PARA Streptococcus gamma-
hemolíticos
Los Enterococos crecen en presencia de NaCl 6,5%, toleran las sales biliares
y pueden hidrolizar la esculina. Estas propiedades se pueden usar para
distinguir los Enterococos de otros cocos Gram (+) catalasa negativos.
En la prueba positiva, el tubo torna de color chocolate oscuro, característico
al desdoblar la bilis esculina. Enterococcus faecalis es la antigua categoría
taxonómica para Streptococcus faecalis.
ANTIBIOGRAMA CON OPTOQUINA PARA Streptococcus alfa-
hemolíticos
Permite diferenciar Streptococcus pneumoniae que es sensible a optoquina

(etilhidroxicupreína, Taxo P) de otras especies de Streptococcus alfa-
hemolíticos, en especial del grupo Viridans que son resistentes.
ANTIBIOGRAMA CON BACITRACINA PARA Streptococcus beta-
hemolíticos
AGAR AZIDA SANGRE (base)
Agar selectivo para la demostración y aislamiento de Estreptococcus y

Staphylococcus, a partir de posiciones, aguas residuales, productos
alimenticios u otros materiales objetos de investigación. Puede utilizarse con o
sin adición de sangre.
FORMA DE ACTUACIÓN
Este medio de cultivo dispone de una excelente y abundante base nutritiva,

que permite incluso el crecimiento de microorganismos exigentes, la azida
inhibe a la flora Gram negativa, en tanto que la flora Gram positiva se
desarrolla más o menos indemne. El proteus crece, por supuesto pero como
colonias definidas sin agrupación. La adición de sangre al medio de cultivo
facilita la interpretación de las formas de hemólisis.
COMPOSICIÓN gr/Lt
Triptosa 10.0
Cloruro sódico 5.0
El material a investigar se extiende sobre la superficie del medio de cultivo.

Incubación. Hasta tres días a 37ºC. Las colonias se someten a estudios para su
identificación. Compruébense los halos de hemólisis producidos.
FUNDAMENTO DE LAS TÉCNICAS Y PRUEBAS BIOQUÍMICAS,
UTILIZADAS.
PRUEBAS BIOQUIMICAS
Conjunto de reacciones basadas en el metabolismo de los microorganismos.

Entre otros aspectos se analiza la acción de la bacteria sobre los hidratos de
carbono (que fuente de carbono utilizan, en que condiciones, como lo utiliza,
que productos se obtienen), la liberación de exoenzimas, metabolitos y toxinas
al medio de cultivo; además de la motilidad entre otros.
A partir del conocimiento del metabolismo. Las pruebas bioquímicas nos
permiten determinar el género y la especie de la bacteria en estudio.
Esta identificación debe hacerse a partir de un cultivo puro y fresco (18-24
horas). A demás se debe tener en cuenta que las características metabólicas de
los microorganismos pueden variar en función de distintos factores; de manera
que para realizar una caracterización confiable es necesario realizar las
pruebas en condiciones estandarizadas (en cuanto al inoculo, reactivo,
Incubación, y el tiempo de lectura) y utilizar mas de una prueba en cada caso.

La elección de las mismas se hará en base ala familia en estudio, lo cual ira
determinado en curso del aislamiento.
Algunas pruebas bioquímicas más utilizadas:
OXIDASA
Esta sirve para demostrar la presencia de la enzima Citocromo oxidasa en
preparaciones de de microorganismos.
Interpretación de resultados:
Positiva: el color de la tira vira a azul debido ala oxidación del compuesto
adicionado por el azul de indofenol.
Negativa: el color de la tira de papel no vira.
CATALASA
Sirve para comprobar la presencia de la enzima catalasa en preparaciones de
microorganismos.
Interpretación:
Positiva: formación inmediata de burbujas bien visible (desprendiendo de
O2).
Negativa: no hay formación de burbuja (no hay producción de O2)
LICUEFACCIÓN DE LA GELATINA
para producir enzimas de tipo proteico (gelatinazas) que licuan la gelatina.
Interpretación:
Positiva
Negativo
Tubo inoculado: el medio se mantuvo sólido. Volver
incubar durante un tiempo adicional.
REDUCCIÓN DE NITRATOS
Permite determinar la capacidad de un organismo de reducir el nitrato en

nitritos o en nitrógeno libre.
Interpretación:
Fase I
Positiva: color rosado a rojo intenso por que el nitrato ha sido reducido a
nitrito por el organismo.
Negativa: no se observa cambio de color.
Fase II
Positiva: no se observa cambio de color por la ausencia de nitrato en el
medio, esto indica que el microorganismo redujo el nitrato a nitrito y luego
redujo nuevamente el nitrito.
Negativo: color rosado a rojo intenso, por presencia de nitrato que no ha sido
reducido por el microorganismo. El zinc redujo el nitrato a nitrito.
KLIGLIER
Permite determinar la capacidad de un microorganismo de metabolizar, un
hidrato de carbono especifico incorporado al medio de crecimiento básico así
como la producción de gas y acido sulfhídrico.
Interpretación:
La utilización de hidrato de carbono implica la liberación al medio de
productos ácidos, capaces de ser detectados por un indicador de pH. Si el
microorganismo es incapaz de utilizar el hidrato de carbono, consume las
peptonas del medio liberando, productos que alcalinizan el medio.
Al interpretar analizar los siguientes aspectos.
Utilización del hidrato de carbono:
Si el microorganismo en estudio solo fermenta la glucosa

Superficie: reacción alcalina, color rojo.
Profundidad: reacción ácida, color amarillo.
Si el microorganismo es capaz de fermentar tanto la glucosa como la lactosa

Superficie: reacción alcalina, color rojo
Profundidad: si el microorganismo es aerobio no se observa crecimiento, ni
cambio de color, si el microorganismo es facultativo, reacción alcalina, color
rojo.
Si el microorganismo no es capaz de fermentar la glucosa pero si de oxidarla

Superficie: reacción ácida a tiempos cortos, y luego alcalina, color rojo
Profundidad: no se observa crecimiento ni cambio de color
Producción de gas

tubo dejando una área clara.
Si el microorganismo es anaerogenico, no hay producción de gas.
Producción de ácido sulfhídrico:
Si el microorganismo produce este acido, se manifestara por la presencia de

un precipitado negro del sulfuro de hierro, en la parte profunda del tubo.
Si el microorganismo no produce este acido, se manifestará por la ausencia de
dicho precipitado.
TSI
profundidad de éste (anaerobiosis).
Medio K (alcalino) de color rojo. Medio A (ácido) de color amarillo.
K/A
decarboxilación oxidativa de las proteínas.
Como resultado, el medio mantendrá su color rojo en la superficie, al no
haber cambiado de pH. Por el contrario, las bacterias crecidas en la
profundidad emplearán desde el primer momento la glucosa por vía
fermentativa, generando ácidos que no serán neutralizados, provocándose un
descenso del pH y el color del medio en el fondo del tubo cambiarán a
amarillo.
A/A
Si la bacteria, además fermenta lactosa: los ácidos producidos modificarán
también el pH de la superficie del medio. Las aminas no son capaces de
neutralizar la cantidad de ácidos producidos en esta fermentación, ya que la
lactosa se encuentra en el medio a mayor concentración que la glucosa. El
color del medio en la superficie cambiará a amarillo.
K/K
Si la bacteria es aerobia estricta (no fermentadora), el medio permanece de
color rojo. Los azúcares son respirados, degradándose completamente hasta
CO2, que se elimina y no modifica el pH.
A/A(g)
aparición de burbujas, rotura o elevación del agar del fondo del tubo.
K/A(H2S)
aparición de un precipitado de color negro en el fondo del tubo. Algunas
bacterias respiradoras anoxobiónticas son capaces de emplear el tiosulfato
sódio como aceptor final de electrones en la cadena transportadora. Este
compuesto se reduce a ácido sulfhídrico que reacciona con el hierro Fe2+
presente en el medio formando un precipitado negro de sulfuro de hierro.
Permite investigar la presencia en el microorganismo en estudio, de una
enzima capaz de hidrolizar el almidón.
Positiva: halos de degradación (marrones o transparentes) alrededor de las

colonias sobre el fondo azul.
Negativa: ausencia de halos; coloración azul alrededor de las colonias

(presencia de complejo Yodo-Almidón)
LIA
Determinar la capacidad de un microorganismo para descarboxilar la lisina.
Interpretación:
Positivo: el medio vira a un violeta mas intenso
Negativo: el medio permanece igual
IMVIC
Son cuatro pruebas (Indol, RM, V/P, CITRATO)
INDOL
Mide la capacidad del microorganismo de producir indol a partir de una
molécula de triptófano.
Interpretación
Positiva: un anillo cereza en la superficie del medio en la capa alcohólica
(corresponde a la fermentación del compuesto quinonico coloreado derivado
del indol)
Negativa: no aparece el anillo (no hay indol en el medio)
INVESTIGACION DE LA PRODUCCION DE ACETIL METIL

CARBINOL (V/P) Y ÁCIDOS (RM)
Con estas dos pruebas se estudia el tipo de fermentación (butelinglicolica o

acido mixta) realiza el microorganismo en estudio.
RM: Sirve para comprobar la capacidad de que tiene un organismo para

producir y mantener establecidos productos terminales ácidos de la
fermentación (acido-mixta) de la glucosa.
Interpretación:
RM
Positivo: el cultivo es lo suficientemente acido como para permitir que el
reactivo rojo de metilo mantenga un color rojo definido (pH= 4.4), en la
superficie del medio.
Negativo: color amarillo (pH= 6) en la superficie del medio.
V/P:
A través de esta se comprueba la capacidad de un microorganismo para formar
un producto final neutro, el acetilcarbinol (acetoina) a partir de la
fermentación (butilenglicolica) de la glucosa.
Interpretación:
V/P:
Positivo: color rojo-rosado en la superficie del medio (presencia acetoina)
Negativo: sin cambio de color (amarillo) en superficie del medio.
CITRATO
Se usa para determinar la capacidad del microorganismo para utilizar el citrato
como única fuente de carbono.
Interpretación:
Positiva: hay crecimiento (turbidez)+ cambio del medio de verde a azul
oscuro.
Negativo: ausencia de crecimiento. + o vira el medio, (verde).
PRUEBA DE HEMOLISINAS
La hemólisis es un fenómeno que se observa cuando algunas cepas se
siembran en Agar Sangra causadas por enzimas llamadas hemolisinas. La
hemólisis puede ser alfa o beta o no presentarse (hemólisis gama).
Alfa hemólisis: Producen una hemólisis incompleta (una hemólisis parcial)

sobre el agar sangra, observándose una coloración de verde a marrón por la
salida de los iones potasio de los glóbulos rojos.
Beta hemólisis:
Producen una destrucción completa de los glóbulos rojos (hemólisis total);
mostrando una zona clara que rodea la colonia con un diámetro de dos a
cuatro veces el tamaño de la colonia.
Gama hemolíticos:
No presentan hemólisis alrededor de las colonias.
PRUEBA DE CAMP
Su nombre se origina de las iniciales de Chrestie, Atkins y Munch-Peterson,

quienes informaron el fenómeno observado por primera vez en 1994.
El factor de CAMP, es un factor extracelular producidos por los Streptococcus
del grupo B, que aumenta la actividad hemolítica de la beta lisina
estafilocócica del S. aureus. Esto lleva a observar un aumento de la actividad
hemolítica cuando en cultivo se encuentra presentes estas dos especies,
básicamente es la demostración de del sinergismo de dos hemolisinas:
Staphylococcus aureus y otra la beta hemolisina producida por Streptococcus
spp, en estudio, para ello, se siembra una línea sobre la superficie de una caja
de agar sangre una cepa de Staphylococcus aureus y perpendicular a ella y
(sin tocarla) se siembra en línea continua el Streptococcus sp en estudio, se
incuba por 24 horas a 37ºC; el fenómeno CAMP, consiste en una zona en
forma de flecha de una clara hemólisis beta, el cual se observa mejor en
sangre de carnero y debe realizarse en ambiente aerobio, ya que otros
Streptococcus sp pueden dar reacciones positivas en ausencia de oxigeno.
PRUEBA DE COAGULASA
La coagulasa es una enzima con actividad semejante a la protombina capaz de

trasformar el fibrinógeno en fibrina, provocando la formación de coagulo
visible en un sistema analítico adecuado.
Cuando una suspensión de bacterias productoras de coagulasa se mezclan en
partes iguales con una pequeña cantidad de o plasmas de tubo de ensayo, se
forma un coagulo visible como consecuencia de la utilización de los factores
de coagulación de manera similar a cuando se añade trombina.
El 100% de las cepas de S. aureus tienen la capacidad de producir esta
enzima que coagula el plasma humano y el de algunos mamíferos.
Se han descrito dos formas de coagulasa: coagulasa unida a la pared
bacteriana y coagulasa libre.
INTERPRETACIÓN:
La inmediata formación de grumos indica la presencia de la enzima

coagulasa.
Causas de error: la presencia debe leerse antes de 24 horas, porque hay
algunas cepas de S. aureus que producen fibrinolisinas que pueden destruir el
coagulo formado.
PRUEBA DE UREASA

La prueba se realiza en agar o caldo de urea.
El color inicial del medio: amarillo anaranjado.
En el medio sólido por estría el microorganismo en estudio. En el medio
líquido sembrar por emulsión. Incubar a 37 ºC por 24 horas.
Interpretación
el medio.
En el tubo de la izquierda se observa sin inocular el medio, en el centro uno
con resultado negativo, ala derecha se observa un tubo con resultado positivo
para urea.
PRUEBA DE DNasa
Microorganismos productores de desoxiribononucleasa hidrolizan el DNasa

presente en el medio de cultivo, característica que ayuda ala identificación de
microorganismos.
Técnicas
02Sembrar a partir de un cultivo joven realizando un cuadrado de los
organismos a prueba según la grafica incubar por 18 -24 horas a 37 ºC.
Interpretación
A las 24 horas adicionar 1ml de ACDI clorhídrico 1N, en medio ácido el DNA
se precipita, por lo tanto si presenta hidrólisis del DNA contenido en el medio
este se observara como un halo claro alrededor del crecimiento.
Reporte el Dnasa positivo o negativo según presente zona clara alrededor del
crecimiento.
CATALASA
La catalasa es una enzima que protege a las células frente al peróxido de

hidrógeno producido en el metabolismo del oxígeno. Cataliza la formación de
agua y oxígeno a partir del peróxido de hidrógeno. Es útil para distinguir
Streptococcus (negativa) de Staphylococcus (positiva) y Clostridium
(negativa) de Bacillus (positiva).
La actividad catalasa se detecta añadiendo unas gotas de peróxido de
hidrógeno (3%) sobre colonias en medio que no sea de agar sangre (daría
falsos positivos). La producción de burbujas indica la presencia del enzima.
Medio MRVP (rojo metilo Voges-Proskauer)
Las enterobacterias son anaerobios facultativos que utilizarán la glucosa en 2

fases:
el oxígeno del medio




metilo (rojo
Si la fermentación que se ha llevado a cabo produce acetoína puede ser

detectada añadiendo al medio KOH y alfa-naftol que reaccionarán con este
compuesto produciendo rojo característico.
positivo para voges-proskauer, en e tubo de la derecha se observa un tubo el
Prueba SIM (sulfuro indol motilidad)

dimetilaminobenzaldehído, reacciona tanto con el indol como con el
triptófano produciendo compuestos de color rojizo. Para evitar la
interferencia del triptófano, el reactivo está disuelto en alcohol isoamílico
inmiscible en agua. A diferencia del triptófano, el indol es soluble en el
alcohol y sólo este compuesto reaccionará con el aldehído produciendo el
anillo coloreado característico de esta prueba.
LIA

glucosa. Cuando el pH del medio aja, el indicador vira a amarillo. Al
En el tubo de la izquierda se muestra un tubo sin inocular y el cual seria una
prueba negativa para lisina, en el tubo de la derecha se muestra un tubo con
resultado positivo.
Medio con citrato de Simmons
Este medio indica la capacidad de las bacterias de metabolizar el citrato.

Contiene citrato como única fuente de carbono, fosfato de amonio como
única fuente de fosfato y azul de bromotimol como indicador de pH.
Únicamente las bacterias capaces de metabolizar citrato podrán multiplicarse
en este medio, al utilizar los fosfatos presentes liberan iones amonio (básicos)
que junto con la eliminación de citrato (ácido) generará una fuerte
basificación del medio que será aparente con un cambio de color del
indicador de pH de verde a azul.
AGAR
La palabra "agar" proviene etimológicamente de la lengua Malaya y viene a

representar el alga roja del género Euchema. El agar es una sustancia colodial
seca que se extrae de diferentes especies de algas rojas particularmente de la
clase Gellidium, Gracilaria, Pterocladia y Anthopeltis. Dependiendo de la
calidad y de sus aplicaciones el agar se divide en dos tipos: industrial y
bacteriológico. El incremento de uso de agar para aplicaciones industriales
como comidas (carnes y vegetales enlatadas, dulces, pasteles, helados, etc) ha
sido enorme debido a sus propiedades como agente dispersador, estabilizante,
espesante y agente gelificante. Debido a sus numerosas ventajas el agar
sustituye a la pectina. Ya que es una gelatina de origen animal porque tiene
aproximadamente ocho veces más de poder gelificante que la gelatina animal.
PEPTONAS
El término "peptona" se emplea para definir un producto soluble en agua que

se obtiene por hidrólisis particularmente de una proteína o varias proteínas.
Este material contiene una mezcla de aminoácidos libres, péptidos y proteosas
que se mantienen en la solución después de calentarlas a 100º C. La presencia
de metales alcalinos o fosfatos puede causar la precipitación de la peptona a
un pH neutral. Por ésta razón las peptonas producidas a un pH neutro se deben
de utilizar para las fórmulas de los medios. Existe una gran variedad de
peptonas dependiendo de los requisitos de crecimiento de los organismos para
ciertos aminoácidos y péptidos. En general las proteínas empleadas en la
producción de peptonas son de dos tipos, proteínas animales (caseína,
gelatina, carne) y proteínas vegetales (soy yo). Las peptonas se obtienen a
través de varios tipos de procesos de digestión como ácido, alcalino y
enzimático. La hidrólisis rompe todas las proteínas y péptidos y produce sólo
aminoácidos libres. Al mismo tiempo destruye algunos aminoácidos
importantes como triptófano. Las peptonas pueden ser usadas para las
bacterias como fuente de energía permitiendo la producción de proteínas de
H2S, indol, aminos, etc. En la preparación de medios de cultivo uno debe
emplear el tipo de peptona que proporciona las características adecuadas para
la prueba. Por ejemplo en la prueba de indol se debe emplear una peptona rica
en triptonal (peptona de caseína). Es importante recordar que aparte de los
aminoácidos presentes las peptonas contienen otros constituyentes que pueden
estimular el crecimiento de ácidos nucleicos, minerales, vitaminas y
ocasionalmente carbohidratos como es el caso de la peptona de soy yo.
MEDIO DE CUTIVO
Definición de medio de cultivo: substrato óptimo para el mantenimiento y

crecimiento de microorganismos en el laboratorio. El medio variará
dependiendo del tipo de microorganismo.
Componentes de los medios de cultivo:
 Agua
 Extracto de levadura: fuente rica en vitaminas B; también contiene
nitrógeno orgánico y compuestos de carbono.
Peptonas: es el producto que resulta de la digestión de materiales proteicos.

Constituye una fuente principal de nitrógeno orgánico; contiene también
algunas vitaminas, y a veces carbohidratos
 Distinguimos dos tipos, dependiendo del tipo de digestión que hayan

sufrido: Hidrólisis química (ácida o alcalina) Hidrólisis enzimática.
 Infusiones y extractos: contienen las sustancias solubles en agua de
tejidos animales (carbohidratos, compuestos orgánicos nitrogenados,
vitaminas solubles en agua y sales). Mientras que un caldo se obtiene
por ebullición de los tejidos, una infusión implica un "colado" del
líquido obtenido. Un extracto es un concentrado de un caldo.
 Agentes solidificantes: permiten solidificar un medio previamente
líquido. Pueden ser de:
 agar-agar (a partir de 10-14 g/l es un medio de cultivo sólido; para
valores inferiores, medios semisólidos).
 gel de sílice
 geles
BIBLIOGRAFIA
 http://www.iib.unsam.edu.ar/IIB-
INTECH/html/docencia/Microbiologia/aislamiento.pdf
 Manual De La Merk
 www.telmeds.org.com


Manual de Medios de Cultivo

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GENERALIDADES DE LAS BACTERIAS Y MEDIOS UTILIZADOS

Uno de los sistemas más importantes para la identificación de

Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial

La mayoría de las bacterias patógenas requieren nutrientes complejos

El agar es un elemento solidificante muy empleado para la

La Gelatina es otro agente solidificante pero se emplea mucho

En los diferentes medios de cultivo se encuentran numerosos

CONDICIONESS GENERALES PARA EL CULTIVO DE

El desarrollo adecuado de los microorganismos en un medio de cultivo se ve

Disponibilidad de nutrientes adecuados

Un medio de cultivo adecuado para la investigación microbiológica ha de

Todas estas sustancias se suministraban originalmente en forma de infusiones

Actualmente, la forma más extendida de aportar estas sustancias a los medios

Ciertas bacterias tienen necesidades nutritivas específicas por lo que se añade

Muy a menudo se añaden al medio de cultivo ciertos colorantes, bien como

Consistencia adecuada del medio

Partiendo de un medio líquido podemos modificar su consistencia añadiendo

Los medios solidificados con gelatina tienen el gran inconveniente de que

Actualmente los medios sólidos son de uso universal, por su versatilidad y

Presencia (o ausencia) de oxígeno y otros gases

Gran cantidad de bacterias pueden crecer en una atmósfera con tensión de

Condiciones adecuadas de humedad

Un nivel mínimo de humedad, tanto en el medio como en la atmósfera, es

La mayoría de los microorganismos crecen mucho mejor en la oscuridad que

La concentración de iones hidrógeno es muy importante para el crecimiento de

Los microorganismos mesófilos crecen de forma óptima a temperaturas entre

Esterilidad del medio

Son cocos Gram positivos, aunque en cultivos viejos y células fagocitadas,

Las cepas perteneciente al fagogrupo II, en general son causante de las

La coagulasa es un enzima capaz de desnaturalizar la fibrina del plasma. La

Las enterobacterias son anaerobios facultativos que utilizarán la glucosa en

2. Metabolismo anaeróbico (fermentación) que puede ser de 2 tipos

2.2 fermentación butilén glicólica: productos finales son compuestos neutros

La liberación de ácidos orgánicos generará un acusado descenso del pH que

Una coloración roja, indicadora de la presencia de ácidos provenientes de la

En la izquierda se observa un tubo sin inocular, en el centro un tubo al cual se

El indicador de pH utilizado es el rojo fenol. Esta prueba detecta la presencia

La ureasa es una enzima que posee muchas especies de microorganismos que

La prueba se realiza en agar o caldo de urea. El color inicial del medio:

Las bacterias que hidrolizan la urea rápidamente producen reacciones

En el tubo de la izquierda se observa sin inocular el medio, en el centro uno

Las enterobacterias, por fermentación de la glucosa producen ácido, el cual

El agar hierro lisina permite determinar los microorganismos capaces de

A tubo sin inocular

PRUEBA SIM (SULFURO INDOL MOTILIDAD)

En este medio se estudia si el microorganismo tiene o no, la presencia de

La prueba de indol se emplea para detectar la presencia de la enzima

Esta prueba sirve para determinar si un organismo es capaz de utilizar citrato

Se cultiva el microorganismo en agar citrato de Simmons. Este medio contiene

Sólo las bacterias capaces de metabolizar el citrato podrán multiplicarse en

Se utiliza para comprobar la presencia del enzima catalasa que se encuentra el

 Streptococcus (-) de Micrococcus (+) y/o Staphylococcus (+).

Una prueba de rutina de la catalasa a temperatura ambiente puede hacerse

1. Método del portaobjetos (recomendado):

 Con el asa de siembra recoger el centro de una colonia pura de 18-24

Esta prueba sirve para determinar la capacidad que tiene el microorganismo

FIG 14 En la parte izquierda muestra la reacción positiva en una placa que

Tubo inoculado: el medio se mantuvo sólido. Volver incubar durante un

FIG 15 Parte izquierda muestra la reacción negativa en una placa, parte

Los aminóacidos al perder el grupo carboxilo se convierten en aminas lo que

Las bacterias se inoculan en medios complejos que contienen lisina, ornitina o

Los polisacáridos, como el almidón son demasiado largos para ser

La hidrólisis de almidón es analizada en medios conteniendo almidón en

La excluyan contiene un carbohidrato unido a un compuesto aromático. Este