Universidad Nacional de Colombia, López Velandia Paulina, Torres G Edward Alejandro. Extracción DNA.

Informe de Extracción e Identificación del ADN Commented [1]: nota lab: 4,1

Eukaryota a partir de Thymus (Bos P. Taurus)

Velandia López, Paulina, Torres Guzmán, Edward A.
{pvelandial, edatorresgu}@unal.edu.co
Universidad Nacional de Colombia

 Por ejemplo, en matrices biológicas, uno de las

Resumen—El Acido desoxirribonucleico (DNA) eukarya,
el cual fue extraído e identificado, a través de un proceso de lisis
celular, donde la matriz biológica, proviene de la preparación
de una glándula linfática de bovino (Bos P. Taurus), al agregar
a este último, diferentes reactivos, que permitan la aparición de
cromatina libre en la solución. La cual podrá ser aislada y
analizada por una espectrofotometría Ultra violeta (UV-VIS),
para la determinación de pureza e identificación de los posibles
contaminantes.
Índice de Términos— Bos P.Taurus, DNA, Extracción,
Identificación, Thymus.
1. INTRODUCCIÓN
EL entendimiento de los fenómenos que ocurren, y
las repercusiones que este trae, las cuales afectan en
alguna medida a la humanidad, es el pilar de la
investigación, ya que gracias a ello es posible
conocer mejor el valor, la magnitud de las variables
y las propiedades de la estructura que se está
analizando. Estas técnicas de análisis diferencial el
cual puede ser de carácter cualitativo y/o
cuantitativos, donde este último me brinda
información numérica medible de alguna propiedad
particular.
Es decir, para partir del estudio de un sistema, se
debe analizar todos los fenómenos que intervienen en
este, pero para lograr dicho objetivo, se debe
desarrollar un método el cual permita conocer el
origen de dicho suceso y las variables que
intervienen. Aunque existen múltiples formas de
realizar un análisis diferencial, el desarrollo del
algoritmo estará estrechamente relacionado con el
origen de la matriz.
recomendaciones para iniciar un análisis completo,
es el de realizar un estudio a nivel microscópico y a
partir de este, generar el análisis macroscópico del
sistema. Pero en muchas situaciones el análisis a una
escala muy pequeña se vuelve bastante tedioso,
además que puede contener otras sustancias y
estructuras que no sean de interés, para la solución
de ello surge la necesidad de la extracción de dicho
compuesto, para poder ser analizado, identificado y
cuantificado de manera más optima. Por ejemplo, el
caso del estudio del DNA, a nivel celular este se
encuentra en el núcleo, por ende, para su estudio se
requiere la extracción del núcleo.
Para ello existen múltiples métodos, pero en general
para una correcta extracción se parte de 5 pasos: Lisis Commented [2]: cuidado con los errores de digitación
celular mediante enzimas o detergentes, eliminación
de proteínas, eliminación del ácido ribonucleico
(ARN), extracción de proteínas y por último
extracción del DNA.
Para la determinación de la efectividad del proceso,
puede ser calculado mediante un método analítico o
bien usando una relación de porcentaje de
recuperación, además de una observación detenida Commented [3]: redactar de forma impersonal
de cada resultado en cada proceso unitario.
2. MATERIALES Y MÉTODOS
2.1. MATERIALES
2.1.1. Equipos: Los equipos usados fueron
 Centrifugadora (no se asegura una correcta
eficiencia de esta)
 Balanza
 Varilla de Vidrio
 Espectrofotómetro
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2.1.2. Reactivos: A continuación, se mencionan los gran tamaño en el fondo del tubo de centrifuga. (ver
reactivos principales figura 1, 2)

Thymus (Bos P. Taurus) Buffer TW 3.3. La Recuperación

Buffer 2xSSC NaCl 2.5, 4 SDC 4% Durante la separación se apreció una separación de
EDTA Etanol fases bastamente adecuada, con una aparente capa
bastante delgada de proteínas de interferencia.
Durante la recuperación en la solución se observa
2.2. ECUACIONES un hilo de transparencia alta, sin presencia de
turbidez. (ver figura 3, 4)
𝐴260 [1]
𝐴260−280 =
𝐴280
𝐴260 [2] Commented [4]: cuáles ecuaciones, dónde estan?
𝐴260−230 =
𝐴230 3.4. Espectrometría UV-VIS
Los valores obtenidos pueden verse en la Tabla 1
Donde Ai= Absorbancia a una longitud de onda i
Tabla 2. Resultados (UV-VIS)
Muestra A A R DNA
R Concentraci
(260,00n (280,00N (260/230)
m) M)
(260/23 ón (μg/ml)
Commented [7]: por qué hay dos valores diferentes para el
2.3. MÉTODOS 0)
mismo parámetro
2.3.1. Extracción de DNA: Se realizaron dos 1 0.3089 0.0403 9.166 0.946 15.07
muestras, cada una compuesta de una solución de 10g 2 1.0713 0.39985 53,35
(desnaturaliza Commented [5]: 1 gr
de Thymus (bovinae), buffer 1xSSC, se hace una da)
centrifugación a (1000rpm), se agrega EDTA 3 (Muestra 2 0.2476 0.3874 - 11.97
orginal)
(estabilizador), y sal NaCl, en proporción a los dos
gramos de thymus en la muestra y ser agitado.
Constante.
2.3.2. Recuperación DNA: se inicia con una
4. ANÁLISIS DE RESULTADOS
centrifugación, una vez lograda la separación y Para la correcta interpretación de los resultados
recuperación de la fase orgánicas, se realiza la obtenidos al aplicar el método analítico de (UV-
eliminación de proteínas (interferencia),
VIS), se debe partir desde el estudio de la matriz
posteriormente lavado con etanol y recuperación por
medio mecánico. original de la cual fue extraída.
Es decir, se analizará las variables que influyeron en
loas 3 etapas del experimento.
2.3.3. Espectrofotometría: Se prepara una Al iniciar la extracción del DNA, se debe analizar
solución con 2XSSC, en tres muestras dos contenían
primero la matriz de origen, en este caso se partió del
el extracto de DNA de thymus y un blanco, los cuales
son sometidos a una a longitud de onda de estudio de una célula somática animal, la cual fue
(280,260,230) extraída de una glándula linfática de un no nato,
llamada Thymus de un espécimen joven bovino (Bos
3. RESULTADOS P. Taurus), es decir, se sabe por teoría que en esta
muestra era de esperarse células tales como: Células
3.1. Resultados Obtenidos: nodrizas, linfocitos, células reticulares epitelial
Al momento de realizar los cálculos obtenidos medular, célula reticular epitelial cortical, célula
mediante de cada valor de absorbancia:
dendrítica interdigitante. Por lo que se espera que la Commented [8]: cita bibliográfica
Tabla 1. Resultados
muestra recuperada de DNA, tendrá una rica
Variable Resultado Commented [6]: a qué variable corresponde cada valor
𝐴260−280 7.66501 concentración en la solución, la cual va ser
𝐴260−230 0.965011 proporcionada por varias estructuras. Para iniciar el
𝐴260−280 7.94293 proceso de extracción, se debe partir del
𝐴260−230 rompimiento de la membrana celular, es decir
provocar una lisis celular, bien sea mediante enzimas
3.2. La Extracción
o detergente. Para ello se usa las soluciones buffer
Se observa una solución de aspecto lechoso, con (1xSSC) que fueron escogidas ya que, al estabilizar
bastante turbidez. Se pueden observar grumos de el pH, permite que los fosfolípidos que se encuentran
en la membrana celular, formen complejos con las
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proteínas integrales, para así degradar dicha capa, al
ajustar el valor del pH en la solución se asegura que
las fuerzas intermoleculares, que permiten el
movimiento estabilizador (flip flop), quede
restringido evitando que esta pueda auto repararse.
Así dejando expuesto a la solución el citoplasma y el
núcleo celular, en un caldo de solución con proteínas
(presentes en el citosol), ARN entre otros
contaminantes además contenido de los organelos de
membrana que también fueron degradados en el
anterior paso.
Por lo anterior, realizar un estudio en este estado de
a la solución, no seria viable, por el gran número de
interferencias, por ende, se debe primero eliminar los
contaminantes anteriormente mencionados, para
ellos deben ser identificados y eliminarlos en
distintos procesos.
Para empezar, se identifican dos principales fuentes:
proteínas y ARN, las proteínas podrán ser
eliminadas, esto se permite gracias a la
centrifugación, al ser un proceso
termodinámicamente no favorable, afectara la
interacciones intermoleculares, además de permitir
la transferencia de masa, entre fases por la adición de
un solvente orgánico, el cual va a anular el momento
dipolar entre las cargas parciales de los aminoácidos,
por ende la formación de puentes de hidrogeno no se
verá favorecida, aumentando la afinidad de la
estructura proteica a la fase orgánica. En este caso se
uso el buffer el contenía un fenol, ya que este grupo
funcional, al contener un anillo aromático que
estabiliza el compuesto, y un momento dipolar fuerte
gracias al oxigeno es capaz de formar los complejos
con el resto de proteínas y oligopéptidos presentes.
Para la eliminación del ARN y la extracción de las
proteínas que corresponden al tercer y cuarto paso
para una extracción de DNA, se da gracias al uso de
compuestos orgánicos, los cuales son escogidos
mediante datos teóricos y pruebas de solubilidad, ya
que lo que se desea es que solo quede en solución, la
sustancia que se desea aislar. El resto de sustancias
mediante la formación de enlaces iónicos, se
aumenta su peso molecular y en el caso de las
proteínas igual que se menciono anteriormente,
formara complejos con un área superficial mayor y
por ende una densidad e impedimento estérico lo que
permite ser retirado de manera mecánica.
Una vez se concluyó la eliminación y la extracción,
es posible proceder con la precipitación del DNA de
3
alto peso molecular, para ello se usa etanol, ya que lo
que se desea obtener en forma de precipitado es la
cromatina libre, la cual corresponde a un nivel de
enrollamiento del DNA, para su obtención, se debe
usar un medio mecánico al ser enrollado en un
agitador de vidrio, donde la calidad, cantidad y
pureza de este se vera reflejada en el aspecto como
su transparencia, visibilidad y color.
Pero como se mencionó anteriormente, los
parámetros para la identificación de propiedades y
características anteriormente usados son poco
precisos, por ende, para una determinación mas
precisa, se requiere el uso de un equipo analítico,
además de un algoritmo matemático, el cual permita
mediante el uso de una ecuación matemática
correlacionar los resultados obtenidos y poder
obtener información necesaria para la culminación
del experimento.
Aunque existen múltiples equipos, capaces de
desarrollar dicha función de manera óptima, se usara
una espectrofotometría, ya que, al proporcionar
energía a las moléculas por medio de una longitud de
onda específica, es capaz de medir la absorbancia de
la molécula con la que el haz de luz choca, es decir
puede proporcionar información necesaria.
En el caso del DNA, para proceder con el anterior
método analítico, primero la muestra debe ser
preparada al ser disuelta y luego medida.
Para el caso del thymus se obtuvo un valor del
coeficiente de las absorbancias de 7.9423, pero para
la comparación del valor anterior, es necesario
definir un fenómeno el cual es llamado
hipercromicidad o efecto hipercrómico, el cual
ocurre cuando se aumenta el valor de la absorbancia
al desnaturalizar la muestra, es decir al provocar la
lisis de los puentes de hidrogeno, se da la separación
de las cadenas aumentando la absorción del fotón de
luz, por consiguiente, el valor suministrado por el
equipo será mucho mayor que el de muestra no
desnaturalizada, esto se puede ver al comparar los
valores de la muestra 2 y 3 (Tabla 2).
Para concluir si existe una contaminación, se debe
analizar el valor obtenido del cociente, y se evaluado
mediante datos teóricos, se sabe que si este es mayor
de 2.1 existe una abundancia de proteínas de
interferencia. O bien, como se explico anteriormente,
si se provoco el rompimiento de la cadena principal,
o una desnaturalización por aplicar medios Commented [9]: muy buena la discusión pero faltan las
energéticos demasiado abundantes, se pudo dar el citas de las fuentes consuoltadas
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fenómeno hipercrómico, lo cual explicaría por que el

valor que se obtuvo esta en ese orden de magnitud.

5. CONCLUSIONES

 El estado final del DNA es crucial, en los

valores obtenidos mediante la
espectrofotometria, ya que, si se produce un
rompimiento de la cadena, esta se puede
fragmentar bajando la calidad de la extracción Figura 2. Precipitado de Cromatina
final.
 La absorbancia obtenida, esta sujeta a 6.2.2. RECUPERACION DNA
múltiples variables que la pueden afectar, como
el efecto crómico, por lo que al momento de su
análisis estas deben tenerse en cuenta.

6. ANEXOS
6.1.Unidades y Abreviaciones

Tabla 3. Abreviaciones
Símbolo Significado
nm Nanómetro
rpm Revoluciones por minuto Figura 3. Cromatina libre
DNA Acido desoxirribonucleico
UV-VIS Espectrofotometría a Ultra
violeta
ARN Ácido ribonucleico
EDTA Ethylenediaminetetraacetic
acid
mg Miligramos
ml Mililitros
NaCl Cloruro de Sodio

6.2.Imágenes
Figura 4. Eliminación Proteinas
6.2.1. Extracción del DNA
7. Blibliografía

[1]. MANUAL DE TÉCNICAS BÁSICAS DE BIOLOGÍA

MOLECULAR BY JORGE EDUARDO ZAVALA CASTRO
[2]. MANUAL DE EMBRIOLOGÍA Y ANATOMÍA GENERAL BY
VICTOR SMITH AGREDA, VÍCTOR SMITH AGREDA
[3]. ANÁLISIS DE ELEMENTOS-TRAZA POR
ESPECTROFOTOMETRÍA DE ABSORCIÓN MOLECULAR
EDITED BY UNIVERSIDAD DE SEVILLA Commented [10]: los labs deben llevar al menos 6 refs
[4]. GENES, VOLUME 1 BY BENJAMIN LEWIN bibliográficas

Figura 1. Extraccion Thymus