Producción de kefirán a escala de laboratorio a partir de suero de leche y

gránulos de kéfir

Lab-scale process for the kefiran production from whey and kefir grains

Agroindustria, Ciencias Agropecuarias y Forestales

I. Resumen
El queso es un producto lácteo de alta demanda en todo el mundo. Durante su conversión a queso,
de 10 litros de leche se generan aproximadamente 9 litros de suero y se produce 1 kg de queso. El
suero de leche es el contaminante más importante en la industria láctea. Sin embargo, se pueden
obtener productos útiles y valiosos a partir del suero de leche. El kefirán es un exo-polisacárido
biodegradable, formado por unidades de galactosa y glucosa, en proporciones iguales. El kefirán
se puede usar como aditivo en la industria alimentaria. Ha sido producido por un consorcio de
bacterias lácticas y levaduras que viven dentro del gránulo de kéfir. Adicionalmente, al kefirán se
le atribuyen propiedades beneficiosas para la salud, por lo que ha crecido el interés en producir este
biopolímero comestible. El proceso se basa en una etapa fermentativa y una posterior etapa de
aislamiento y purificación del kefiran, empleando alcohol etílico y agua des-ionizada caliente,
respectivamente. El objetivo del presente estudio es establecer un proceso a pequeña escala que
permita la obtención del kefirán.
Palabras clave: kefirán, precipitación etanólica, proceso de producción kefirán.

II. Abstract
Cheese is a dairy product in high demand around the world. During its conversion to cheese, 10
liters of milk generate approximately 9 liters of whey and 1 kg of cheese is produced. Whey is the
most important contaminant in the dairy industry. However, very useful and valuable products can
be obtained from whey. Kefiran is a biodegradable exo-polysaccharide, formed by galactose and
glucose units, in equal proportions, and it can be used as an additive in the food industry. It has
been produced by a consortium of lactic bacteria and yeasts that live inside the kefir grains.
Additionally, the kefiran is attributed beneficial properties for health, so that interest in producing
this edible biopolymer has grown. The process is based on a fermentative stage and a subsequent
stage of isolation and purification of the kefiran, using ethyl alcohol and hot de-ionized water,
respectively. The objective of the present study is to establish a small scale process that allows
obtaining kefiran.
Keywords: kefiran, ethanol precipitation, kefiran production process.

1
 III. Introducción
Aunque todavía está por debajo del consumo per cápita de las recomendaciones de la población de
la FAO, la producción de leche en Ecuador ha estado creciendo desde hace algunos años (Requelme
& Bonifaz, 2012). En Ecuador, con una producción diaria de alrededor de 5.5 millones de litros de
leche, la región andina, marcha al frente de los niveles de producción, representando alrededor del
77% de la producción del país (Real, 2013). De ese volumen, entre un 35-40% se destina a la
producción de los diversos tipos de quesos.
Por otro lado, para producir 100 kg de queso, se utilizan aproximadamente 1000 litros de leche
fresca y se generan alrededor de 900 litros de suero de leche líquido (SL) (Pais-Chanfrau et al.,
2017). El SL es un líquido amarillento, cuyas características varían según la región, la época del
año y el forraje utilizado en la alimentación del ganado, pero cuya composición mayoritaria está
formada por un 4.5-5% (m/v) de lactosa, un 0.6-0.8% (m/v) de proteínas de suero, 0.5% (m/v) de
grasa y 8-10% (m/v) (base seca) de sales minerales (Tsakali, Petrotos, & Allessandro, 2010),
reportando valores de 60-80 y 30-50 kg/m3, para DQO y DBO5, respectivamente (Kotoupas, Rigas,
& Chalaris, 2007). Este subproducto de la industria láctea, por lo tanto, se clasifica como el efluente
más contaminante de esta industria (Marwaha & Kennedy, 1988).
Son varios los productos que se pueden obtener por fermentación del suero de leche (Grosu et al.,
2012; Pais-Chanfrau et al., 2017; Parra Huertas, 2009; Spălățelu (Vicol), 2012). Entre ellos están
los exo-polisacáridos (EPS), formados por azúcares que pueden proporcionar efectos beneficiosos
para la salud humana, clasificando muchos de ellos como sustancias prebióticas (Ruas-Madiedo,
Hugenholtz, & Zoon, 2002).
El kefiran es un EPS, soluble en agua, comestible y biodegradable, que forma parte de la estructura
del gránulo de kéfir (Frengova, Simova, Beshkova, & Simov, 2002; Kooiman, 1968; la Riviére,
Kooiman, & Schmidt, 1967; Wang, Ahmed, Feng, Li, & Song, 2008), un consorcio simbiótico de
bacterias ácido-lácticas (BAL), hongos y levaduras, que pueden transformar la leche fresca en una
bebida láctea fermentada y efervescente, con un cierto contenido de etanol, llamada kéfir, muy
popular en Europa oriental y Asia (Leite et al., 2013; Nielsen, Gürakan, & Ünlü, 2014; Seher
Arslan, 2015; Sharifi et al., 2017).
Al kefirán, como al kéfir, le han sido atribuidas propiedades beneficiosas para la salud humana,
como son, la modulación de la expresión genética y el crecimiento de la Bifidobacterium bifidum
(Serafini et al., 2014), efecto cicatrizante (Piermaria, de la Canal, & Abraham, 2008), como agente
hipotensor (Furuno & Nakanishi, 2012), efecto hipocolesterolémico (Maeda, Zhu, Omura, Suzuki,
& Kitamura, 2004; Wang et al., 2009), anti-inflamatorio (Rodrigues, Carvalho, & Schneedorf,
2005), regulador del peso corporal (Aebi et al., 2013) e inmuno-estimulador (Medrano, Racedo,
Rolny, Abraham, & Pérez, 2011). Y otros autores han reportado, algunos efectos contra diferentes
tipos de cáncer (Murofushi, Shiomi, & Aibara, 1983; Sharifi et al., 2017; Shiomi, Sasaki,
Murofushi, & Aibara, 1982). Por estas razones, ha crecido recientemente el interés para producir
el kefirán (Blandón et al., 2018; Dailin et al., 2016; Pais-Chanfrau et al., 2018).
La producción de kefirán pasa por una fase fermentativa en la que el polisacárido es sintetizado
por el L. kefiranofaciens, que cohabita con otras BAL y levaduras dentro del gránulo de kéfir, y
utilizando la lactosa, presente en el SL (Taniguchi, Nomura, Itaya, & Tanaka, 2001).
2
El aislamiento y la purificación del kefirán desde el caldo fermentativo, puede realizarse empleando
el gránulo completo del kéfir (Mitsue, Tachibana, Hara, & Fujio, 1998), el caldo fermentativo
(sobrenadante de cultivo + gránulo de kéfir) (Zajšek, Kolar, & Goršek, 2011) o solamente el
sobrenadante de cultivo, previa separación del gránulo (Dailin et al., 2016).
El kefirán puede ser precipitado mediante la adición de solventes orgánicos, como el etanol (Kazazi
et al., 2017; Taniguchi et al., 2001). Posteriormente, el kefirán precipitado puede ser lavado con
agua caliente, para eliminar las impurezas arrastradas durante la precipitación. Finalmente, el
precipitado lavado, podrá ser secado hasta obtener el kefirán, como un sólido amarillento (Dailin
et al., 2016).
El objetivo de este trabajo es establecer un proceso a escala de laboratorio que permita obtener el
kefirán a partir de suero de leche y gránulos de kéfir.

IV. Metodología
Los gránulos frescos de kéfir fueros adquiridos en el portal www.kefir.ec (Quito, Pichincha,
Ecuador) y se mantuvieron a 4°C, recambiando cada 48 h el sobrenadante líquido con leche entera
fresca.
Se utilizó suero de leche (SL) proveniente de la empresa Floralp S.A. (Ibarra, Imbabura, Ecuador),
y 46%(m/m) de SL y se suplemento con 9.6%(m/m) de solución de sales (KH2PO4 al 1% (m/v),
MgSO4 al 5% (m/v) y (NH4)2SO4 al 1% (m/v)), complementándose con 14%(m/v) de solución de
sacarosa al 88% (m/v), con el objetivo de que se obtuviera 14°Brix y pH 6.3, y con un inóculo
formado por 3.7% (m/m) de gránulos frescos de kéfir, tal y como como ha sido sugerido por otros
autores (Dailin et al., 2016; Pais-Chanfrau et al., 2018). Se cultivaron lotes de 6 erlenmeyers con
100 g cada uno en un agitador reciprocante a 100 rpm, durante 48 h, y a 23.9°C, según la condición
optima reportada previamente (Carrera Acosta, 2018).
El kefirán se determinó de acuerdo al método del fenol-ácido sulfúrico (DuBois, Gilles, Hamilton,
Rebers, & Smith, 1956), de manera similar a como lo han reportado varios autores (Dailin et al.,
2016; Pais-Chanfrau et al., 2018).
Para la precipitación etanólica se utilizó alcohol absoluto (anhidro) de Merck KGaA (Darmstadt,
Alemania) y etanol técnico comercial al 96%(v/v). A este último se le verificó su densidad
mediante un alcoholímetro de laboratorio.
Después de 48 h de cultivo, se procedió al proceso de aislamiento y purificación del kefirán a escala
de laboratorio (Figura 1).
Debido a que una parte del kefirán sintetizado pasa en forma soluble al sobrenadante de cultivo y
otra permanece asociado al propio gránulo, se evaluó tanto el caldo fermentativo homogenizado
(sobrenadante + gránulo), como el sobrenadante libre de gránulo. En el primer caso, se procede a
la homogenización vigorosa del caldo mediante el empleo de una licuadora doméstica Osterizer
por unos 10 min, antes de someter al caldo homogenizado a la inactivación térmica de las enzimas
glucolíticas, mediante el calentamiento a 85°C por 15 min. En el segundo caso, solamente se separa
el gránulo por tamizado, sometiendo igualmente al sobrenadante a calentamiento por 85°C por 15
min, con el mismo objetivo anteriormente explicado.

3
En el caso en que se emplee el sobrenadante, se procedió a la precipitación con etanol de los
polisacáridos solubles contenidos en el sobrenadante inactivado térmicamente, mediante la adición
en proporción de 50:50 con etanol absoluto o 60:40 con etanol técnico:sobrenadante, ambos
solventes a -20°C, y se incubó la mezcla a -20°C durante toda la noche, con el fin de facilitar la
precipitación.
SUERO DE LECHE SALES, AZUCARES

MEZCLADO

ESTERILIZACION
(A 110°C, 15 min)

AJUSTAR GRANULOS DE KEFIR

(DESPUES INOC. INCUBAR POR 48 h) TEMP. & pH

HOMOGENIZACION FILTRACION

HOMOGENIZADO SOBRENADANTE

INACTIVACION INACTIVACION
TERMICA TERMICA
(A 85°C, 15 min) (A 85°C, 15 min)

ETANOL
(A -4°C, 2000xg POR 45 min)
PRECIPITACION
CENTRIFUGACION
ETANOL
(MEZCLAR 50:50 / 60:40 & INCUBAR
TODA LA NOCHE A -20°C)
PRECIPITADO
RESTOS & BIOMASA ETANOL
PRECIPITACION (A -4°C, 2000xg POR 45 min)
ETANOL CENTRIFUGACION
(MEZCLAR 50:50 / 60:40 & INCUBAR
TODA LA NOCHE A -20°C)
SOBRENADANTE
PRECIPITADO

RESIDUAL ETANOLICO
(A -4°C, 2000xg POR 45 min)
CENTRIFUGACION

SOBRENADANTE
PRECIP.

RESIDUAL ETANOLICO

AGUA DESTILADA
CALIENTE

LAVADO
REDISOLVER EN AGUA
REPETIR DOS VECES

DEST. A 65°C

(A -4°C, 2000xg POR 45 min)

CENTRIFUGACION

SOBRENADANTE
PRECIP.

RESIDUAL ACUOSO

SECADO
COLOCAR EN HORNO A 70°C HASTA
ALCANZAR PESO CONSTANTE

KEFIRAN

Figura 1. Diagrama del proceso de obtención del kefirán a escala de laboratorio.

4
En el caso del homogenizado, previo a la precipitación, se centrifugó para eliminar los restos de
biomasa. Posteriormente se procedió a la precipitación etanólica de manera similar a como se
realizó para el sobrenadante.
Después de la precipitación etanólica, ambos materiales fueron centrifugados a 2000xg por 45 min
en una centrífuga refrigerada a -4°C (Sorvall ST 16 Centrifuge (ThermoFisher Scientific, Waltham,
MA, EEUU)). El precipitado obtenido, fue lavado tres veces con agua caliente, con el objetivo de
eliminar los componentes solubles arrastrados durante la precipitación. Finalmente, el precipitado
lavado, es redisuelto en una cantidad mínima de agua destilada estéril y fue secado en un horno
(Memmert 5NB-400 (Memmert GmbH + Co. KG, Schwabach, Alemania)) a 70°C hasta la
sequedad.
El rendimiento total de kefirán (en g/l) del proceso se determinó al dividir, la cantidad final de
kefirán obtenido entre el volumen inicial de sobrenadante u homogenizado tomado para realizar el
proceso de aislamiento y purificación.

I. Resultados y discusión
Para comparar los rendimientos totales de kefiran, se realizaron tres procesos independientes,
donde se compararon aquellos donde se empleaba solamente el sobrenadante de cultivo, contra
otros procesos donde se empleaba todo el caldo de cultivo y se homogenizaba el mismo,
Adicionalmente, se compararon los procesos de precipitación etanólica donde se empleó etanol
absoluto (anhidro), contra procesos donde se empleó etanol técnico al 96%(v/v) (Figura 2).

7.00

6.00
Rendimiento de Kefirán, g/l

5.53 a 5.18 a 5.00 a

4.63 a
5.00

4.00

3.00

2.00

1.00

0.00
Sobr.&EtOH Abs. Homog.&EtOH Abs. Sobr.&EtOH Tecn. Homog.&EtOH Tecn.

Figura 2. Comparación de los rendimientos de kefirán de tres procesos independientes. Las barras muestran la
desviación estándar de tres experimentos. Letras iguales denotan que no existe diferencia significativa de las medias
(n = 3; p<0.05). Leyenda: Sobr.&EtOH Abs.: Sobrenadante de cultivo y etanol absoluto (anhidro); Homog.&EtOH
Abs.: Homogenizado del caldo fermentativo y etanol absoluto (anhidro); Sobr.&EtOH Tecn.: Sobr. cultivo y etanol
técnico al 96% (v/v); Homog.&EtOH Tecn.: Homog. caldo fermentativo y etanol técnico al 96% (v/v).

5
Los resultados obtenidos muestran que no existen diferencias significativas entre las variantes en
cuanto al rendimiento de kefiran y que pueden usarse indistintamente tanto el homogenizado como
el sobrenadante de cultivo; y tanto la precipitación etanólica con etanol absoluto (anhidro), como
etanol técnico al 96% (v/v).
Sin embargo, en cuanto a la generación de los residuales, si se observó que las variantes que
empleaban el homogenizado tenían mayores valores de DQO (demanda química de oxígeno, en
kg/m3) que las que empleaban solamente el sobrenadante. Adicionalmente, los gránulos de kéfir
pueden ser reutilizados en el próximo proceso sin detrimento de los rendimientos al menos hasta
tres veces (resultados no mostrados).
Debido a que, el empleo del homogenizado conllevaría a un paso y un equipo adicional en el
proceso, lo que implica mayores costos de inversión y operación; y que, además, el empleo del
sobrenadante permitiría re-utilizar el gránulo de kéfir durante al menos tres lotes consecutivos, se
prefiere escoger la variante que emplea el sobrenadante de cultivo en lugar del homogenizado del
caldo fermentativo.
Por otro lado, debido a que los costos del etanol absoluto (anhidro) son casi diez veces superiores
al del etanol técnico al 96% (v/v), se prefiere este último como solvente para la precipitación del
kefirán.
Por lo antes expuesto, se propone un diagrama de flujo de proceso para la producción a escala
piloto o industrial como se muestra en la Figura 3.

Cámara fría
Suero de Leche -20°C por12h
Sales Gránulos de Kéfir TK
EtOH

TK
TK H2O
Almacen. Clarificador 65°C
Biorreactor
Aire caliente
Residuales Húmedo
Filtro
bomba

TK Nanofiltr.
Lavados tangencial Secado x
Inact. térmica aspersión

TK Cosecha TK Aire caliente

Concen. Seco
bomba

Kefirán

Figura 3. Propuesta de Diagrama de Flujo de Proceso para la producción del kefiran a escala piloto e industrial.

El proceso podría contar con las etapas de fermentación, filtración, inactivación térmica del
sobrenadante, precipitación con etanol técnico al 96% (v/v) e incubación por 12 h a -20°C en
cámara fría, concentración y lavado con agua caliente en un nano-filtro tangencial y secado por
aspersión (Figura 3).

II. Conclusiones
Se logró implementar un proceso de obtención de kefirán a escala de laboratorio, demostrándose
que puede emplearse para ello el sobrenadante de cultivo de un medio que contiene un 46% (m/m)
6
de suero de leche suplementado con sales minerales y 3.7% (m/m) de gránulo de kéfir como
inoculo. Los estudios demuestran que es posible reutilizar el gránulo por al menos tres lotes
consecutivos y emplear el etanol técnico al 96% (v/v) en lugar de etanol absoluto (anhidro),
significativamente más costoso. En tales condiciones se pudiera obtener un rendimiento de kefirán
≥ 5 g/l de sobrenadante de cultivo.

III. Referencias bibliográficas

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