Ruptura y Disrupción celular

Utilización de las reglas de oro de la purificación

REGLA 1 “Elegir procesos de separación basados en diferentes

propiedades físicas, químicas o bioquímicas”

REGLA 2 “Separar las impurezas más abundantes primero”

Es importante eliminar el agua en las primeras etapas del proceso. Tratar de

reducir el material de trabajo hasta un 90% del volumen inicial

REGLA 3 “Seleccionar un proceso que permita aprovechar al máximo las

diferencias entre las propiedades fisicoquímicas del producto y los contaminantes.

- Se deben conocer las propiedades del producto y de las principales impurezas

REGLA 4 “Realizar las separaciones más caras y difíciles al final”

KEEP IT SIMPLE!
Ruptura y Disrupción celular
Ruptura y Disrupción celular
1.Separación
.Separación celular: Costos de los procesos de centrifugación son
más dependientes del tamaño de las partículas que los procesos de
separación con membranas

Filtración por
membrana más
Total separation costs económica

Centrifugación
más economica

Se pierde de 1 al 5% del material

Centrifugación
(part > 2 u)
Average particle size (units)
Ruptura y Disrupción celular
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 DISRUPCIÓN EN GRAN ESCALA

Mecánica No mecánica

Molino de bolillas
Homogeinizador QUIMICA

FISICA Antibioticos ENZIMATICA

Agentes Enzimas liticas
Descompresion quelantes
Shock osmotico Caotropos
Termolisis Detergentes
Solventes
Hidroxido
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• Métodos Químicos
Tratamiento con Alcali
Ventajas: Económico y fácilmente escalable.
Desventajas: El producto debe ser estable a las
condiciones sometidas.

Caso Proteínas Recombinantes

No quedan células viables

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Solventes Orgánicos
Fundamentos de su uso: ¿ Extracción de algún componente
lipídico de las membranas?
Ventajas: Económicos, escalables. Ciertos solventes actúan sin
que queden microorganismos viables.
Desventajas: El producto de interés puede ser sensible a la acción
del solvente.
El manejo de grandes volúmenes de solventes requiere una
infraestructura adecuada tanto para el proceso de ruptura como
para su descarte y/o reutilización.
El solvente más utilizado es el TOLUENO.
Solventes miscibles con agua (ETOH, Acetona) pueden liberar
proteínas del espacio periplásmico.
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Detergente- Permeabilización de la Pared Celular

Fundamento: Solubilización de componentes proteicos de las
membranas. Desestabilización.
Ventajas: Permeabilización, no se liberan grandes cantidades de
componentes intracelulares (ácidos nucleicos, proteínas, etc).
Desventaja: Costosos. Muy difíciles de eliminar. El producto
puede verse afectado por su acción.
Ejemplos: Triton X-100, Tween, etc.
Pueden utilizarse en forma conjunta con Agentes Caotrópicos
(Guanidina-HCl, UREA). Estos actúan también por solubilización
de componentes proteicos de las membranas. Peligro:
Desnaturalización. Deben ser eliminados en las etapas siguientes
(ejemplo, por UF)
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• Métodos Biológicos
Lisis enzimática
Fundamento: Enzima o conjunto de enzimas que actúan
clivando uniones específicas de los componentes de la pared
celular.
Ejemplo: Lisozima (hidroliza uniones β-1,4- glicosídicas).
Bacterias Gram -: Membrana externa impide el ataque
enzimático. Agregado de agentes quelantes (EDTA) las
vuelven susceptibles.
Ventajas: Eligiendo correctamente el sistema de enzimas no se
vería afectada la actividad del producto.
Desventaja: Liberación de ácidos nucleicos (DNAasa y
posterior activación). Costoso. Contamino el producto con otra
proteína que después debe ser eliminada y es irrecuperable.
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• Métodos Físicos- Mecánicos

Molino Húmedo
Ruptura y Disrupción celular
 Ruptura y Disrupción celular

Molino Húmedo
Ecuación que rige el proceso:
Ln (Rm/Rm-R) = k.t
RM : determinada experimentalmente y definida por una
metodología adecuada
Método CONTINUO
Variables que lo afectan: Velocidad del agitador, velocidad
de ingreso de la suspensión a la cámara de agitación,
geometría de la cámara, tamaño de las partículas
abrasivas, concentración celular, densidad de partículas,
diseño del agitador.
A tener en cuenta: generación de altas temperaturas por la
fricción.
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• Métodos Físicos Mecánicos

Homogeneizador de alta presión
Diseño de la Válvulo de Impacto
Homogeinizador de laboratorio(Niro Soavi)

• 170 ml/minuto
• 1500 bar
Homogeinizador escala industrial
Ruptura y Disrupción celular
 Ruptura y Disrupción celular

Ecuación que rige el proceso:

Ln (Rm/Rm-R) = k. N. Pa

N- número de pasajes
A- coeficiente que depende del microorganismo y
su historia.
Método NO CONTINUO.
Variables que lo afectan: Presión, diseño de las
válvulas y anillos de impacto, temperatura, etc. NO
DEPENDE DE LA CONCENTRACIÓN.
Hay sistemas que operan a presiones mayores a
las 1000 bar lo que implica importantes aumentos
de la TEMPERATURA (alrededor de 2.5 ºC cada
100 bar) que pueden afectar la estabilidad del
producto.
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Conclusiones
La técnica más recomendada para alta escala son los homogeinizadores
- Homogeinización: - suspensiones celulares 15-20% (peso seco)
- concentración celular no afecta la eficiencia
- es necesario refrigerar (4-5ºC)
- Modelos más grandes 6,000 L/h (levaduras y bacterias)
-Molinos de perlas
pequeñas perlas de vidrio (0.3-0.4mm φ)
- diferentes diseños de agitadores
- concentración de células afecta la eficiencia
concentración óptima ∼ 30-60% peso húmedo
modelos mas grandes 2000 L/h
-Ruptura química o enzimática
limitado a baja escala (Lysozyme, Triton, otras)
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Conclusión:
Para cada sistema (proteína-microorganismo) hay que
evaluar cuál es el método adecuado que permita “liberar”
el mayor contenido del producto sin que se vea afectada
su “actividad”.