EXAMEN DE PRACTICAS:

1. NORMAS DE BIOSEGURIDAD:

medidas y protocolos que son aplicados en múltiples procedimientos realizados en investigaciones

científicas y trabajos docentes con el objetivo de contribuir a la prevención de riesgos o
infecciones derivadas de la exposición a agentes potencialmente infecciosos o con cargas
significativas de riesgo biológico, químico y/ físicos, como por ejemplo el manejo de residuos
especiales, almacenamiento de reactivos y uso de barreras protectoras entre otros:

2. ESTERILIZACION CALOR HUMEDO:

Esterilización por ebullición: utilizando agua en ebullición. No elimina las esporas. Se coloca el
material a esterilizar en agua hirviendo (100ºC) por15 – 35 minutos.

Esterilización por vapor fluente: Thyndalización) consiste en un calentamiento por vapor de agua
discontinuo a 80 – 100ºC, refrigerado después, por tres veces con intervalos de 24 hs. Elimina
gérmenes y esporas sirve para esterilizar medios que se descomponen por el calor a a 80 – 100ºC,
como carbohidratos, gelatina, leche, suero, etc., suprime la hidrólisis por calentamiento.

Esterilización por vapor de agua a presión: (Autoclave) es el método ideal para el campo
bacteriológico. Se basa en el que el vapor de agua a presión es más caliente que el agua en
ebullición o el vapor libre. Cuanta más alta es la presión del vapor mayor es la temperatura
resultante. El vapor penetra por ósmosis provocando la coagulación del protoplasma en las
bacterias y esporas. Las condiciones de esterilización son: 121ºC a 15 lb., de presión por pulgada
cuadrada por el tiempo de 15 min.

3. COLORACION GRAM FUNDAMENTO:

El cristal violeta actúa como un colorante primario, que se une a la pared celular bacteriana luego
de un tratamiento con una solución débil de yodo (mordiente). Algunas bacterias debido a su
naturaleza química de sus paredes celulares poseen la capacidad de retener el cristal violeta, aun
luego del tratamiento con un decolorante orgánico, tal como una mezcla de alcohol y acetona.
Tales bacterias se denominan Gram positivas. Las bacterias Gram negativas debido a su mayor
contenido lipídico en su pared celular, pierden la coloración primaria del cristal violeta cuando son
tratadas con el decolorante. El colorante secundario o de contraste utilizado es la safranina. Las
bacterias Gram negativas que han perdido el cristal violeta, aparecen rojas o rosadas al
microscopio, habiendo fijado la safranina como contracolor a sus paredes celulares. Las bacterias
aparecen de color azul, aunque el grado de absorción del colorante por los diferentes
microorganismos es variable, y algunas estructuras como las esporas absorben el colorante con
dificultad son así fácilmente diferenciables.

4. MENCIONE 3 BACTERIAS GRAM POSITIVAS Y GRAM NEGATIVAS:

GRAM +: Staphylococcus aureus. Streptococcus pneumoniae, Bacillus antracis

GRAM -: Escherichia coli, Salmonella typhi, Neisseria meningitidis

5. MEDIOS SELECTIVOS:
Estimulan el desarrollo y crecimiento de una especie microbiana, inhibiendo el desarrollo de otras
morfológicamente semejantes. Mediante la adición de ciertas sustancias como colorantes, sales
bEstos medios presentan el medio base, además llevan un substrato más indicadores y de manera
especial inhibidores, que pueden ser sales, colorantes, antibacterianos tipo antibióticos. A medida
que sean más complejos o lleven inhibidores más selectivos, pasan a la categoría de poco,
mediano y altamente selectivos; así entre los poco selectivos tenemos; Agar Mac-Conkey, Agar
EMB, ENDO Agar, Agar Brolacin en ellos desarrollan todas las enterobacterias, Enterococos,
Pseudomonas, Alcalígenes, Candidas. Entre los medios selectivos SS Agar; en este medio
desarrollan todas las enterobacterias pero desarrollan mejor y rápidamente las Salmonellas y
Shigellas. Entre los altamente selectivos, que son más específicos, desarrollan pocas especies
bacterianas, así en el Agar Chapman, Manitol Salado desarrollan las Micrococáceas; en el sulfito
bismuto Agar, desarrollan Salmonellas, específicamente S. typhi; Agar verde brillante es propio
para Salmonellas.iliares:

6. MEDIOS DIFERENCIALES:

Son aquellos medios que llevan un medio corriente, caldo o Agar nutritivo, al que se le ha añadido
un substrato conocido, además lleva indicador de pH; aquí se estudiarán desdoblamiento de
substratos por acción de enzimas bacterianas es decir el metabolismo microbiano. Así tenemos;
TSI, SIM, LIA, Urea, Citrato de Sinmons, Caldo MR-VP; que sirven para pruebas específicas.

7. METODOS DE SIEMBRA Y PARA QUE SIRVE CADA UNO:

Para hacer un aislamiento.

Para hacer un transplante.

a) Siembra por agotamiento o por estrías:

b) Siembra por difusión.

c) Siembra por diseminación.

8. METABOLISMO BACTERIANO:

1. TSI: medio de cultivo sólido que sirve para la identificación inicial de los bacilos Gram negativos.
No fermentadores de los 3 azucares: K/K significa bisel alcalino / fondo alcalino o neutro. No
fermentadores de lactosa y sacarosa, pero sí de glucosa: K/A significa bisel alcalino y taco ácido.
Fermentadores de glucosa, lactosa y sacarosa: A/A significa bisel ácido/ fondo ácido. Tiosulfato de
sodio y sulfato ferroso de amonio (producción de sulfuro de hidrógeno): (precipitado negro
claramente visible). La producción de H2S se reporta como positiva (+) o negativa (-).

a. A/A gas ++ SH2

b. K/A

2. LIA: prueba bioquímica utilizada para la identificación de bacterias de la familia

Enterobacteriaceae. Consiste en demostrar la presencia de la enzima lisina descarboxilasa, capaz
de reaccionar con el grupo carboxilo del aminoácido L-lisina. K/A + (-). Esto significa: K: Bisel
alcalino (color morado), A: Fondo ácido (amarillo), es decir, reacción de descarboxilación negativa
y desaminación negativa. +: Producción de sulfuro de hidrógeno Y (-): Sin gas.

a. K/K

3. SIM: especialmente diseñado para ayudar a la identificación de algunas bacterias,

principalmente de la familia Enterobacteriaceae. Está compuesto por tripteína, peptona, sulfato
de hierro, sulfato de amonio, tiosulfato de sodio y agar. Ejecuta la producción de sulfuro de
hidrógeno (H2S), la formación de indol y la motilidad. Una prueba positiva se pondrá en evidencia
cuando se observe turbidez.

a. +++

4. CS: prueba bioquímica de identificación de microorganismos, especialmente de bacilos Gram

negativos. Es el indicador de pH, amarillo cuando es menor a 6 y azul cuando es mayor de 7.6. Si el
medio queda del color original (verde) y no hay crecimiento visible, la prueba es negativa, pero si
el medio cambia a color azul, indica la presencia de productos alcalinos, lo cual indica que dicho
macroorganismo a sido capaz de utilizar el citrato. que es detectado por el indicador de pH. En
este caso la prueba es positiva.

CITRATO SE SIMONS POSITIVO:

9. CARACTERISTICAS CULTURALES DE LAS COLONIAS:

Cantidad: Anotar el número o con los términos: poco, regular, abundante; la cantidad de colonias
presentes.
Tamaño: Expresar el diámetro de cada colonia en milímetros.
Forma: Irregular, circular, ameboide, medusoide, etc.
Borde: Solo apreciar los flancos de la colonia, los cuales pueden ser: neto o liso, granular, dentado,
rizoide, festoneado, etc.
Superficie: Lisa, granulada, brillante, rugosa, fascinada (en lazo) quebradiza, etc.
Elevación: Plana, convexa, elevada, cónica, embonada, semiplano, semiconvexa, convexa
pulvinada, etc.
Consistencia: Se refiere a la textura aparente o aspecto físico como es: la sequedad, la humedad,
semi-sequedad, mucosidad, viscosa, friable (se disgrega al tocarla).
Densidad: (con luz a través de la colonia) opaca, transparente, translucida.
Color: Blanca, crema, brillante, mate u opaca, grisácea, marrón, verdosa, rojiza, negra, etc.
Olor: No destapara a cada momento la placa; para percibir el olor debe mantenerse cerrada

10. COLIFORMES TOTALES Y COLIFORMES FECALES:

Los coliformes totales son las Enterobacteriaceae lactosa-positivas y constituyen un grupo de

bacterias que se definen más por las pruebas usadas para su aislamiento que por criterios
taxonómicos. Pertenecen a la familia Enterobacteriaceae y se caracterizan por su capacidad para
fermentar la lactosa con producción de ácido y gas, más o menos rápidamente, en un periodo de
48 horas y con una temperatura de incubación comprendida entre 30-37ºC.
Son bacilos gramnegativos, aerobios y anaerobios facultativos, no esporulados. Del grupo
<<coliforme>> forman parte varios géneros: Escherichia, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter, etc.
Se encuentran en el intestino del hombre y de los animales, pero también en otros ambientes:
agua, suelo, plantas, cáscara de huevo, etc.

Una elevada proporción de los coliformes que existen el los sistemas de distribución no se debe a
un fallo en el tratamiento en la planta, sino a un recrecimiento de las bacterias en las
conducciones. Dado que es dificil distinguir entre recrecimiento de coliformes y nuevas
contaminaciones, se admite que todas las apariciones de coliformes son nuevas contaminaciones,
mientras no se demuestre lo contrario.

Dentro del grupo de los coliformes totales existe un subgrupo que es el de los Coliformes fecales.
Los coliformes fecales son coliformes totales que además fermentan la lactosa con producción de
ácido y gas en 24-48 horas a temperaturas comprendidas entre 44 y 45ºC en presencia de sales
biliares. Los coliformes fecales comprenden principalmente Escherichia coli y algunas cepas de
Enterobacter y Klebsiella.

Su origen es principalmente fecal y por esos se consideran índices de contaminación fecal. Pero el
verdadero índice de contaminación fecal es Escherichia coli tipo I ya que su origen fecal es seguro.
Desde el punto de vista metodológico Escherichia coli es el Coliforme ás es positivo a la prueba del
Indol.

11. TEMA LIBRE, DESCRIBA LO QUE MAS LE HA GUSTADO DEL CURSO FUNDAMENTO

MEDIOS DE CULTIVO

I. INTRODUCCIÓN:

Las bacterias necesitan una serie de compuestos para su desarrollo y crecimiento (fuentes de
carbono, nitrógeno, elementos minerales y factores favorables para su crecimiento).

Los medios de cultivo son sustratos o soluciones de nutrientes en los que crecen y se multiplican
los microorganismos en el laboratorio con el objeto de aislar las diferentes especies bacterianas,
proceder a su identificación y llevar a cabo una serie de estudios complementarios.

II. OBJETIVOS:

Preparar medios de cultivo líquidos y sólidos.

Realizar diferentes formas de preparación e identificación de los medios de cultivo.

Plaqueo y reparto de los medios de cultivo.

III. FUNDAMENTO TEÓRICO:

Constituyentes de los medios de cultivo bacteriológico:

o Fuentes de energía: carbono, nitrógeno.

o Sale minerales: azufre y fósforo.

o Iones metálicos: sodio, potasio, magnesio. A concentraciones más bajas. Zinc, manganeso,
cobre, cobalto, molibdeno.

o Factores de crecimiento: cierto tipo de aminoácidos ejemplo cistina, sangre suero , extracto de
levadura.

o Factores de arranque: sustancias que permiten ala bacteria salir de fase latente y comenzar con
la fase de crecimiento exponencial ejemplo algún ion que estimula el crecimiento.

o Factores inhibidores: sirve para inhibir el crecimiento de determinadas especies bacterianas no

deseadas ejemplo de colorantes de anilina (Ej. Verde brillante o eosina), metales pesados
(bismuto) sustancias químicas (azidas, citrato, selenito). Agentes anti microbianos (por Ej.
Neomicina, colistina, vancomisina, cloranfenicol).

Fuentes de carbono

Están ligados a metabolismo energético, corresponde a los azucares en forma de monosacáridos y

disacáridos: glucosa, lactosa, sacarosa, otras bacterias utilizan azucares mas complejo para
obtener energía como almidones. Existen bacterias capaces de utilizar sustancias mas sencillas
como el acido acético, citrato de sodio.

Fuentes de nitrógeno

Es una fuente menos energética que la fuente de carbono es necesario para el metabolismo
microbiano produciendo energía, tenemos a las proteínas, polipéptidos y aminoácidos. Peptonas:
corresponde péptidos y polipéptidos.

La caseína es la peptona sometida la proceso de digestión debido a la digestión acido utilizada en

muchos medios de cultivo, sobre todo en forma de peptona tripsica de caseína.

CONDICIONES PARA UN MEDIO DE CULTIVO:

Temperatura óptima:

La temperatura es una de los factores ambientales que afectan el crecimiento y la supervivencia

microbiana.

Se debe mantener la temperatura apropiada según la especie bacteriana:

Bacterias psicrófilas: cuando crecen a temperaturas menores de 20º C

Bacterias mesófilas: crecen a temperaturas entre 18ºC y 45ºC

Bacterias termófilas crecen a temperaturas mayores de 45ºC

Las bacterias patógenas para el hombre crecen a temperaturas óptimas de 37ºC

Presión osmótica:

Se suele trabajar a condiciones isotónicas (300miliosmoles) aunque existen bacterias que pueden
crecer a condiciones algo superiores.
Las bacterias pueden mantenerse vivas y crecer en medios muy acuosos e hipotónicos; este hecho
es debido a su pared rígida que permite que el agua no penetre en la bacteria y este se rompa.

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Otro caso en bacterias halógenas su crecimiento se produce especialmente a concentraciones muy

altas de cloruro de sodio, Staphylococcus es capaz de crecer a7.5%ClNa, Enterococcus a 6.5% de
ClNa. Las bacterias no suelen tolerar las grandes concentraciones salinas de allí que la salazón es
un buen método de conservación.

Presencia y ausencia de oxigeno:

Los microorganismos varían en sus necesidades o tolerancia al oxígeno. Aerobios: son capaces de
crecer en presencia de oxígeno, microaerófilos: necesitan menor proporción de oxígeno.
Anaerobios: crecen con absoluta o relativa ausencia de oxígeno. Anaerobios obligados solo se
desarrollan en ausencia de oxígeno y anaerobios facultativos crecen en aerobiosis y en
anaerobiosis.

pH

Existen sustancias que van a establecer el pH del medio a estas se conocen como tapones o
buffers. Proporcionan al medio un pH adecuado y establece que facilita el crecimiento bacteriano.
El pH óptimo en la mayoría de casos es cercano a la neutralidad, aunque existen bacterias que
pueden crecer al pH muy bajo próximo a 0 los Thiobacilos, otros pH alcalino pH 8 Proteos, pH 9
Vibrio.

En los medios de cultivo pueden aparecer variaciones de pH como consecuencia del metabolismo
que se produce en la degradación de los nutriente y fermentación glucocida (acidificación del
medio), degradación proteica se alcaniliza el medio por sales de amoniaco.

CLASIFICACION:

POR SU ORIGEN:

a) Naturales: donde no hay mucha modificación: por ej. Leche, papa, etc.

b) Artificiales o sintéticos: Donde ha habido transformación por medios mecánicos o químicos; por
ej.la mayoría de medios comerciales como agar nutritivo, Agar MacConkey.

POR SU CONSISTENCIA

a) Líquidos: son soluciones acuosas también denominas caldos por ej. caldo nutritivo, caldo BHI,
leche, caldo suero.

b) Sólidos: son los medios líquidos a los que se les ha añadido ciertas sustancias como Agar-agar,
gelatina, silicatos solo con el objeto de endurecerlos; por Ej., agar nutritivo, agar sangre, agar
sabouraud, etc.

c) Semisólidos: son los medios que se hallan en un estado entre los dos primeros, sirven para
estudios de motilidad (flagelo), transporte y semianaerobiosis ej. El medio de SIM.

POR SU OBJETIVO
a) Medios de transporte: son aquellos medios que permiten mantener a los microorganismos
viables con una baja multiplicación y conservarse en buen estado; son mucho mejores si son
semisólidos; por Ej. Cary- Blair, caldo Hajna, Stuard, etc.

b) Medios de enriquecimiento: sirven para multiplicar bacterias antes de su siembra, pueden o no

llevar inhibidores por Ej. Caldo Selenito para Salmonella typhi, Caldo Tetrationato para Salmonellas
en general, Caldo Lactosado, etc.

c) Medios enriquecidos o mejorados: constituidos por un medio base corriente, al que se le añade
sustancias ricas en proteínas, aminoácidos o sustratos de mayor valor nutritivo. Sirve para aislar y
cultivar microorganismos de mas exigencias en nutrientes: por Ej agar Sangre donde además se
aprecian hemólisis; suelo coagulado, para la producción de toxina diftérica.

d) Medios de aislamiento: pueden ser:

o No selectivos: corrientes y mejorados.

o Selectivos: poco selectivos, medianamente selectivos y altamente selectivos.

o Especiales.

MEDIOS DE AISLAMIENTO:

a) Medios de aislamiento no selectivos: medios mejorados

Son aquellos medios que, como su nombre dice, sirven para aislar o cultivar bacterias, donde la
mayoría de ellas desarrollan porque no llevan inhibidores, y pueden ser: medios básicos como
agar nutritivo que llevan sustancias que tienen un valor nutritivo; mejorados como agar sangre

b) Medios de aislamiento selectivos: o de diagnostico

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Estimulan el desarrollo y crecimiento de una especie microbiana, inhibiendo el desarrollo de otras

morfológicamente semejantes. Mediante la adición de ciertas sustancias como colorantes, sales
biliares

Estos medios presentan el medio base, además llevan un substrato más indicadores y de manera
especial inhibidores, que pueden ser sales, colorantes, antibacterianos tipo antibióticos. A medida
que sean más complejos o lleven inhibidores más selectivos, pasan a la categoría de poco,
mediano y altamente selectivos; así entre los poco selectivos tenemos; Agar Mac-Conkey, Agar
EMB, ENDO Agar, Agar Brolacin en ellos desarrollan todas las enterobacterias, Enterococos,
Pseudomonas, Alcalígenes, Candidas. Entre los medios selectivos SS Agar; en este medio
desarrollan todas las enterobacterias pero desarrollan mejor y rápidamente las Salmonellas y
Shigellas. Entre los altamente selectivos, que son más específicos, desarrollan pocas especies
bacterianas, así en el Agar Chapman, Manitol Salado desarrollan las Micrococáceas; en el sulfito
bismuto Agar, desarrollan Salmonellas, específicamente S. typhi; Agar verde brillante es propio
para Salmonellas.

c) Medios de aislamientos específicos:

Éstos medios son generalmente altamente enriquecidos por el medio Bordet-Gengou, que es para
Bordetella, que contiene además del medio básico: papa, glicerina y antibióticos; el medio de
Lowwestein que es para el Mycobacterium tuberculosis éste medio a además del medio básico
lleva huevo, glicerina e inhibidor de verde de malaquita; en éste tipo de medio los inhibidores
tienen relativa importancia, pues su especificidad está en función a su riqueza, otro Ej. Es el Agar
Saboraud, para hongos.

d) Medios diferenciales o bioquímicos:

Son aquellos medios que llevan un medio corriente, caldo o Agar nutritivo, al que se le ha añadido
un substrato conocido, además lleva indicador de pH; aquí se estudiarán desdoblamiento de
substratos por acción de enzimas bacterianas es decir el metabolismo microbiano. Así tenemos;
TSI, SIM, LIA, Urea, Citrato de Sinmons, Caldo MR-VP; que sirven para pruebas específicas.