CURS 8

BACILUL DIFTERIC. BACILUL TUBERCULOS.

Corynebacterium
Definitie
Genul Corynebacterim include mai multe specii de bacili Gram pozitivi (poate fixa colorantul
neregulat si pot avea incluziuni de polimetafosfat), uşor incurbati, maciucati, aşezati în V. L mici
grămezi neregulate, sau în palisade, nesporulati, necapsulari, imobili, aerobi, facultativ anaerobi,
catalazo pozitivi.
In ultimii ani, studiile taxonomice au redefinit genul Corynebacterium mentinând numai 23 de
specii.
Speciile pot fi separate în trei grupe distincte după habitat şi patogenitate:
- Corynebacterii patogene pentru om şi animal,
- Corynebacterii patogene pentru plante,
-Corycebacterii nepotogene.
Dintre Corynebacteriile patogene pentru om, grupul Corynebacterium diphtheriae reuneşte trei
specii:
● C. diphtheriae cu 4 biotipuri (gravis, mitis, intermedius şi belfanti ),
● C. ulcerans,
● C. pseudotuberculosis.
C. diphtheriae are capacitatea de a elabora exotoxină în urma conversiei genetice.

● Corynebacterium diphtheriae este agentul cauzal al difteriei.

Difteria este o boală infecţioasă gravă, care în forma ei caracteristică se manifestă printr-
o leziune la poarta de intrare, cel mai frecvent la nivelul amigdalelor, unde produce un exudat
fibrinos, aderent: "falsa membrană" de culoare gri-maronie (diphthera = membrană).
Ea se formează local sau se extinde acoperind faringele, obstructionand arborele traheo-
bronşic producand crup laringian care poate provoca asfixie mecanică.
La adăpostul falsei membrane, bacilii îşi continuă multiplicarea şi sinteza de toxină.
Tulpinile lizogene (infectate cu bacteriofag tox+) sintetizează toxina eliberată extracelular
şi difuzată în organism pe cale sanguină şi limfatică produce leziuni importante la nivel cardiac
(miocardită), nervos (demielinizare), renal (necroză tubulară), suprarenalism, muscular şi
hepatic.

Diagnosticul de laborator este bacteriologic.Este un diagnostic de mare urgentă.

* Habitat
B. difteric se izolează de la bolnavi, din "falsa membrnnă”, de pe mucoasa nazală, oculară,
vulvară etc.
Poate infecta unele leziuni cutanate, poate fi identificat în ulceraţiile profunde ale pielii,
reprezentand difteria cutanată.
B. difteric poate fi izolat din gîtul sau nasul purtătorilor sănătoşi unde poate persista timp
indelungat, mai poate fi izolat de la animale (cai, caini, maimuţe) purtătoare sau bolnave.

* Caractere morfologice, tinctoriale

Cultivat pe medii elective, sunt bacili Gram pozitivi, la limită, cu dimensiuni de 3-8/0,5 µm, uşor
incurbati, măciucati, pleomorfi, aşezaţi în unghiuri ascuţite (V, L)sau cu aspect de litere

1
chinezeşti.
Prezintă o colorabilitate inegală din cauza granulelor de polifosfati care apar evidente în special
prin coloratia metacromatică (corpusculii Babeş-Ernst) sau după decolorare prelungită în
coloratii Gram.

* Caractere de cultură
B. difteric este un germen aerob facultativ anaerob care se dezvoltă la 37 0 C, la un pH de 7,4 -
7,6, creşte bine pe mediul electiv Löffler (ser coagulat de bou, glucozat 1%).
Izolarea din produse patologice se face pe geloză sânge şi pe medii selective Tinsdale, Gundel-
Tietz (care contine:geloză-sange-cisteină-telurit de K).
Pe mediul Tinsdale (care contine geloză-ser-cistină-telurit - thiosulfat),
C, diphtheriae produce după 24-48 h de incubare la 37°C, colonii mici negre cenuşii inconjurate
de un halou brun (datorită H2S care rezulta din metabolism şi reactionează cu sărurile de telur).
B. pseudodifterici cresc sub forma de colonii negre, fără hafou brun,
C. ulcerans produce un halou foarte intens.
Pe mediul Gundel-Tietz în functie de aspectul coloniilor pot fi diferentiate trei tipuri biochimice
(biotipuri) de C. diphtheriae: gravis, mitis şi intermedius , având proprietatea de a reduce teluritul
de potasiu în telur metalic, de culoare neagră.
După incubare 48 h la 37°C şi apoi 2-3 zile la temperatura laboratorului:
- tipul gravis produce colonii negre, mari, cu suprafata granulată cu aspect de margareta (margini
crenelate, centru ridicat şi striuri radiale);
- tipul mitis produce colonii mai mici, negre, cu margini regulate:
- tipul intermedius colonii negre cu aspecte intermediare între primele două: talie mai mare,
suprafată granulară, centrul uşor mamelonat, margini regulate, transparente.
Pe geloză-sânge bacilii difterici produc colonii rotunde, friabile, cu suprafata uşor granulara, de
culoare albă-gri perle.
Pe mediul Löffler bacilii difterici produc colonii albe, care seamănă cu picăturile de spermantet
(substantă grasă cu aspect de ceară).

* Caractere biochimice şi de metabolism

Pentru crestere, bacilul difteric are nevoie si de factori de crestere (vitamine, aminoacizi) care se
găsesc în serul si sângele introdus in aceste medii.
Tulpinile toxigene elaborează o exotoxină, specifică, de natură proteică, responsabilă de
simptomele de toxiinfectie difterica.
Bacilul difteric produce cistinaza care descompune cistina cu formare de hidrogen sulfurat, dar
nu hidrolizează ureea (ureazo-negativ).
Bacilul difteric, indiferent de biotip, fermentează constant glucoza, maltoza si levuloza si nu
fermentează zaharoza si manita.
Tipul gravis fermentează: dextrina, amidon, glicogenul.
Tipul mitis nu fermentează nici un polizaharid;
Tipul intermedius fermentează, uneori tardiv, numai dextrina.

* Rezistentă la agenti fizici, chimici şi biologici.

Bacilii difterici sunt rezistenti la uscăciune, sensibil la antisepticele uzuale il distrug în cateva
minute.
Este sensibil la: eritromicină, penicilină, bacteriofagi specifici.

2
* Caractere antigenice
Au fost descrise antigene somatice (la nivelul peretelui bacterian), dar nu s-a realizat o schemă
antigenică de identificare, exotoxina este puternic antigenică si este comună tuturor tulpinilor de
C. diphtheriae.
Filtratul de cultură reprezintă toxina brută, coresupunde actiunii combinate a formolului si
căldurii se detoxifică, transformându-se în anatoxină, produs dotat cu calităti antigenice dar lipsit
de orice urma de toxicitate.

* Imunitatea
Este preponderent antitoxica, se obtine dupa trecerea prin boala sau dupa vaccinarea profilactică
cu antitoxina difterica.

* Diagnosticul de laborator este bacteriologic

Se recolteaza produse patologice atat de la bolnavi cat si de la purtatori si se face prin izolarea,
identificarea germenului precum si stabilirea caracterului toxigen al tulpinii.
Recoltarea se face din exudate cu tampoane sterile dimineata pe nemancate, înainte de a face
tratament cu antibiotic.
De la bolnavii sau suspectii de angina difterica se recolteaza trei tampoane din secretia
faringo-amigdaliana si un tampon nazal.
De la cazurile suspecte de difterie cu alte localizari se recolteaza un tampon din secretia
faringo-amigdaliana, un tampon din secretia nazala si un tampon din leziunea cutanata sau
mucoasa suspectata.
De la contactii din focare de difterie sau de la purtatori sanatosi se recolteaza un tampon
cu exudat nazal si un tampon cu secretie faringo-amigdaliana.

* Diagnosticul bacteriologic
La bolnavi:
- tamponul nr. l (din cele trei) va servi pentru efectuarea frotiurilor colorate: Gram, albastru de
metilen, Del Vecchio-pentru evidentierea granulatiilor metocromatice, în solutie apoasa de
albastru de metilen 10% se adauga 0,1% hidrat de K (KOH,);
- tamponul nr. 2 se va însamanta pe mediile solide: Tinsdale, Gundel-Tietz, geloză-sânge,
Löffler;
- tamponul nr. 3 este incubat 16-18 h la 370 C în mediul de îmbogaţire O.S.T. (ou-ser-telurit),
după timpul de incubare se fac treceri pe mediile solide de mai sus.
Tampoanele din celelalte secretii (nazale, oculare, din plagi etc) se îmbogătesc în mediul
O.S.T. şi dupa incubare in conditiile descrise se vor trece pe mediile solide corespunzătoare.
După incubarea pe medii solide, 24-48 h, se vor face repicări una sau două colonii
reprezentative pe un tub cu mediu Löffler, sau în sectoare cu mediu geloză sange si frotiuri din
toate aceste medii si colorate Gram si Del Vecchio, pentru stabilirea caracterelor morfologice
microscopice.
Apoi se fac însământari din mediul Löffler pentru punerea în evidentă a caracterelor
biochimice (fermentarea zaharurilor în mediul Hiss cu indicator Andrade proba cistinazei H 2S,
proba ureazei in mediul cu uree, Blake-Cristensen).
Toxigeneza in vitro se face prin testul de precipitare in gel E.O.F. (Elek, Ouchterlony,
Frobisher), sau in vivo prin inoculare s.c. in cobai, a culturii , după 24-48 h, cobaii mor cu

3
evidentierea semnelor de intoxicatie difterica.

● Genul MYCOBACTERIUM
* Caractere generale
Germenii din acest gen apartin familiei Mycobacteriaceae.
Această familie cuprinde mai multe specii, fiind aproape toate saprofite cu exceptia speciilor:
Mycobacterium tuberculosis si Mycobocterium leprae.
In anul 1882 Robert Koch descoperă bacilul tuberculozei tot in acelasi an Paul Ehrlich
descoperă acido-rezistenta bacilului tuberculozei.
In anul 1884 Robert Koch obtine cultura baciluli tuberculozei pe ser coagulat.
In 1891 tot R. Koch semnaleaza fenomenul Koch si tuberculina. A. Calmette si C. Guërin
in perioada 1908-1921 au cultivat prin treceri la 21 zile, în bulion cartof glicerinat si biliat o
tulpină de Mycobocterium bovis virulentă izolată din lapte.
In urma acestor treceri s-a obtinut o tulpina fără patogenitate, dar capabilă să determine
rezistenta faţă de infecţia tuberculoasă, caracterele morfologice,tinctoriale, nutritionale, de
cultură au rămas cele iniţiale.
Această tulpină (tulpina BCG - bacilul Calmette şi Guerin) a fost utilizată ca vaccin împotriva
tuberculozei începând din 1921, în 1927 se organizează laboratoare de producţie a vaccinului
BCG in 26 de tări , inclusiv în România.

* Clasificare:
1. Micobacterii care nu se dezvoltă pe medii de cultură si sunt strict patogene pentru om si
ammale, sunt două specii:
- Mycobacterium leprae (agentul Armauer Hansen, descoperit in 1873) este agentul etiologic al
leprei umane;
- Mycobacterium leproemurium, agentul etiobgic al leprei şobolanilor.
2. Micobacterii care se dezvoltă lent (saptămâni) pe medii de cultura si sunt patogene pentru om
şi animale homeoterme (care isi pastrează temperatura constantă a corpului):
- M. tuberculosis, agentul etiologic al tuberculozei umane dar si cel al câinelui şi pisicii:
- M. bovis produce tuberculoza la bovine, dar şi la om; ,
- M. africanum patogen pentru om:
- M. muris care determină leziuni cazeoase ganglionare şi subcutanate la unele rozătoare.
3. Micobacterii care se dezvolta lent (săptămâni) sau rapid (zile) pe medii de cultură, unele din
micobacterii sunt saprofite, iar altele sunt patogene sau conditionat patogene.

În raport cu pigmentatia coloniilor şi ritmul de creştere micobacteriile se împart în:

Grupa I - Micobacterii fotocromogene:
- culturile se dezvoltă la 37oC în întuneric nu sunt pigmentate, dacă sunt expuse 30-60 min. la
lumina zilei sau la o sursă de 30 W aşezată la o distantă de 50 cm şi apoi răman în întuneric 12-
24 ore;
- culturile se pigmentează în galben sau portocaliu. Din această grupă face parte M. tuberculosis.

4
Grupa II - Micobacteriile scotocromogene, se dezvoltă la 370 C atât la întuneric cat şi la
lumină, culturile sunt pigmentate în galben-potocaliu (M. sarofulaceum).
Grupa III - Micobacteriile necromogene: M. avium.
Grupa IV - Micobateriile cu creştere rapidă ("rapid growers"), coloniile care apar după cateva
zile sub formă "S' sau "R" In 37°C, cromogenitatea este variabilă sunt conditionat patogene la
om sau animale.

* Habitat
Bacilul tuberculos manifestă un parazitism strict, el este prezent în leziunile omului sau
animalelor bolnave de tuberculoză, poate fi găsit în praful din încăperile în care a fost răspândită
sputa baciliferă sau pe obiectele contaminate de bolnav.

* Caractere morfologice şi tinctoriale

Sunt bacili subtiri cu lungimea de 3-10 µm şi lătime de 0,1-0,2 µm, uneori ramificati, drepti sau
uşor curbati sub formn literelor: X, Y, Z, cu granulatii puse în evidentă prin coloraţii speciale,
imobili, nesporulati, necapsulati.

Structura peretelui este formată din:

• Lipide , care sunt in cantitate mare (intre 20-45 % din greutatea uscată a bacteriei) sub formă
de: - fosfolipide - cardiolipina:
- acizi micolici;
- glicolipide - cord-factorul;
- peptidoglicolipidele - ceara D, aceasta în cantitate mai crescuta la tulpinile virulente
(la celelalte bacterii lipidele sunt de 3-10%).
• Proteine (tuberculoproteinele), tuberculina brută, cca. 1%, care ofera antigenicitate.
• Polizaharidele care se leaga de lipidele si proteinele din perete.

* Rezistentă
Bacilii rezistă luni sau ani în praf, sunt sensibili la actiunea radiatiilor solare şi UV, sunt sensibili
la actiunea antibioticelor: streptomicină, HIN, acidul para-amino salicilic, etambutol, rifampicină
(sinerdol), dar pot câştiga uşor rezistentă.

* Caractere de cultură
Spre deosebire de micobacteriile saprofite care se dezvoltă uşor şi rapid pe mediile de cultură
simple, micobacteriile patogene se dezvoltă lent pe medii speciale.
Adăugarea glicerinei în mediile de cultură favorizează dezvoltarea bacilului tuberculos uman, în
timp ce tipul bovin este partial inhibat.
Pe mediile lichide micobacteriile formează un văl subtire, care se îngroaşă, se cutează, se
fragmentenză şi cade la fundul recipientului, iar la suprafaţă se va forma un alt văl.
Bacilii tuberculoşi de tip uman fac un văl mai gros decât cel bovin şi alcalinizează la început
mediul, apoi îl acidifică progresiv.
Cel bovin alcalinizează mediul la început, dar ulterior nu-l mai acidifică.

Pe mediile solide, care sunt mediile tip Löwenstein-Jensen (L-J), sau tip Ogawa, sunt medii
selective contin:

5
- săruri mirerale,
- asparagină sau acid glutamic,
- amidon,
- gălbenus de ou,
- glicerina si verde malahit.
Amestecul final se repartizează în tuburi de 18/180 si se coaguleaza în pozitie inclinată la 90° C.
Temperatura optima de dezvoltare a bacilului tuberculos este de 37°C timp de 30-60 zile, bacilul
este aerob, de aceea se însămantează pe mediul solid înclinat, dar o cantitate de 10 % C02,
favorizeaza cresterea.
Coloniile micobacteriene apar tarziu, după prima săptămână abia se vede o mică formatiune.
Numai după 30-40 zile ajunge o colonie caracteristică de aspect verucos (conopidiform) de tip
„R", aceasta este creştere eugonică a coloniilor rugoase.
Prezenta coloniilor mici de tip „S" este o creştere disgonică şi este caracteristică pentru
Mycobacterrum bovis.

* Caractere biochimice
Sunt germeni aerobi, au enzima catalază, se dezvolta un pH usor acid, tipul hominis este singurul
care produce acid nicotinic.

* Caractere de patogenitate
Virulenta micobocteriilor este data de existenta unel substante “cord-foctor”, care rezista la
actiunea enzimelor lizozomale, care lipseste la micobacteriile avirulente.
De asemenea au capacitatea de a se multiplica intracelular (intramacrofogic).
Produc în organismul afectat si fenomene de intoxicatie, care este un factor agravant.

* Diagnosticul de laborator este un : diagnostic bacteriologic

Se bazează prin punerea în evidentă a bacilului Koch în produsele patologice, în acest scop se
folosesc 3 metode: -examenul direct,
-cultivarea şi
-inocularea la cobai.

* Diagnostic bacteriologic
Recoltaren produselor patologice se face în recipiente sterile cu capac ce se pot închide ermetic.
În tuberculoza pleuro-pulmonară se recoltează: spută, aspirat bronşic sau cavitar, lichid de
spalatura bronşică, piese de exereză chirurgicală, lichid de spălătură gastrică, fecale, piese
necroptice, lichid pleural.
În tuberculoza uro-genitala: urină, sange menstrual, biopsie de endometru, piese de exereză
chirurgicală.
În tuberculoza ganglionară: material din biopsie sau punctie.
În tuberculoza ostio-articulară: lichid articular, ,puroi din abcese reci, fragmente osoase.
In meningita tuberculoasă:lichid cefalorahidian.
Cel mai folositor produs este sputa, pentru că tuberculoza pulmonară este forma cea mai
frecventă.

6
Tehnica de prelevare a sputei:
- trebuie să se facă în recipiente sterile de unica folosintă, trebuie să se facă înainte de începerea
tratamentului medicamentos.
- se recoltează dimineata la sculare o cantitate de 5-10 ml, se va repeta in 3-4 zile, se poate păstra
la 4°C cu adaos de carbonat de sodiu pulvis, 50 mg la 5 ml spută: sau fosfat trisodic (2-4 ml din
sol 15% ).
- se vor respecta regulile de asepsie a personalului care asistă sau transportă probele.
Aspectul sputei: este purulentă, nu se va lucra sputa mucoasă, care de cele mai multe ori este
salivă.
Examenul microscopic direct se efectuează pe frotiuri colorate după metoda Ziehl-Neelsen, se
examinează cu obiectivul cu imersie, prezenta este dată prin apariţia de bacili roşii pe un fond
albastru.
• Când numărul de germeni este redus, frotiul se face după omogenzarea si concentrarea
produsului patologic.
• Omogenizarea se face într-un balon de 250 ml, cu fund plat,peste sputa se adauga o cantitate
egală sau de 2-3 ori mai mare de NaOH 0,5%, la 60o C, 30 min.
• Concentrarea prin flotare, se obtine prin adăugare de apa distilată (AD) pâna la jumătatea
balonului; 2 ml de xilol sau neofalina. Se agito energic 10 min, se adaugă AD până la jumatatea
gâtului balonului, se lasă în repaus 30 min, timp în care se formează un inel cremos in care au
fost concentrati bacilii tuberculosi din produs.
• Stratul cremos este aspirat într-o pipeta Pasteur prevazuta cu o para de cauciuc, sau un pipetor
automat. Pe 2-3 lame degresate, care sunt asezate pe o platina încâlzita sau pe un geam deasupra
băii, se depun succesiv, picături din materialul cremos, pana cand acesta se epuizează, apoi
frotiul va fi uscat, fixat la flacară si colorat Ziehl-Neelsen.
• Se va examina la microscop cu imersie şi se va face o apreciere cantitativa:
- 0 bacili/ 300 câmpuri microscopice = absentă b.a.a. r;
- 1-3 bacili/ 300 câmpuri = prezenta b.a.a.r se solicită repetare;
- 4-9 bacili/100 = prezenta b.a.a.r (+),
- 10-100 /100 = prezenta b.a.a.r (++),
- peste 100 bacili/100 câmpuri mic = prezenta b.a.a.r (+++).
• Concentratia micobacteriilor tuberculozei în spută este totdeauna în raport direct cu
dimensiunea şi intensitate leziunii.
• Alte bacterii AAR posibil de întâlnit în frotiuri se deosebesc morfologic: nocardiile şi
actinomicetele sunt filamentoase, cu ramificaţii şi extremităii îngroşate.
• Apoi produsul patologic se va însămânia pe mediile de cultură amintite.
• Controlul creşterii pe mediile de cultură se face prin frotiuri colorate Ziehl-Neelsen.

Inocularea la cobai
• Se practică în functie de posibilităti, în formele de tuberculoză extrapulmonară.
• Se folosesc cobai sănătoşi de 300-400 g. Prelevatul patologic se injectează 1-2 ml sub cutan pe
fata interna a coapsei, animalele se urmăresc zilnic timp de 90 zile.
• La fiecare 15 zile animalele se vor cantării şi examina clinic, local, general.
• Infectia tuberculoasă la cobai se manifesta prin: scădere în greutate, producerea unui nodul care
apoi se ulcerează (şancru), la locul inoculării şi adenopatie satelită.
• Pentru stabilirea sacrificării cobaiului se va face reactia la tuberculină, care se face într-o zonă
nepigmentată , se injectează i.d., 0,1 ml din solutie 1/10 de tubercuină bruta

7
• O escară în centrul unui halou inflamator persistent, observabilă la 24-48 h reprezintă o reactie
pozitivă.
• După sacrificarea animalului, de regulă după 5-6 săptămâni de la inoculare se constată: şancru
la locul de inoculare, hipertrofia (inclusiv cazeificarea ganglionilor limfatici, inghinali,
presacrati, mezenterici), leziuni tuberculoase caracteristice (tuberculi-zone cazeoase întinse) în
splină, ficat, şi plămâni.
• Se vor face frotiuri colorate adecvat şi se vor face însământări pe mediul Löwenstein-Jensen.