Manual de Prácticas de Laboratorio de Bioquímica

INSTITUTO TECNOLÓGICO SUPERIOR DE
SANTIAGO PAPASQUIARO
Ingeniería Ambiental
MANUAL DE PRÁCTICAS PROPUESTO PARA:

Bioquímica
Elaboró: M.C. Joel Díaz Martínez
Agosto 2019
ÍNDICE GENERAL
Contenido Página
Presentación ............................................................................................................ I
Ubicación dentro del mapa curricular ...................................................................... II
Las reacciones Químicas en Bioquímica ................................................................ 1

Espectrofotometría y Ley de Beer-Lambert ............................................................. 4
Determinación del contenido de proteína soluble................................................... 9
Determinación del punto isoeléctrico de una proteína .......................................... 13
Determinación de parámetros de cinética enzimática ........................................... 18
Efecto de la temperatura en la velocidad de reacción .......................................... 24
Determinación de carbohidratos totales ................................................................ 30
Aislamiento y cuantificación de glucógeno ............................................................ 34
Extracción y cuantificación de lípidos .................................................................... 38
Extracción y determinación de pigmentos fotosintéticos ....................................... 43
Normas Generales de Seguridad e Higiene ........................................................... III

Medidas Generales en Caso de Accidente ............................................................ VI
Manual de Prácticas de Laboratorio de BIOQUÍMICA
PRESENTACIÓN
Este manual está estructurado como material didáctico de apoyo para
actividades de laboratorio de estudiantes que cursan la asignatura de Bioquímica,

de la carrera de Ingeniería Ambiental del Instituto Tecnológico Superior de
Santiago Papasquiaro. El contenido del manual también podrá ser utilizado por
estudiantes en carreras afines y en cursos afines con las adecuaciones que cada
actividad de aprendizaje requiera para coadyuvar en su formación disciplinaria.
M.C. Joel Díaz Martínez Página I

UBICACIÓN DENTRO DEL MAPA CURRICULAR
M.C. Joel Díaz Martínez Página II

PRÁCTICA #1
LAS REACCIONES QUÍMICAS EN BIOQUÍMICA
Objetivo
Observar el desprendimiento o la absorción de calor del ambiente en las
reacciones químicas endotérmicas y exotérmicas.
Introducción
La primera Ley de la Termodinámica establece que si un sistema es sometido a
una transformación cíclica, el trabajo producido en el ambiente es igual al calor
que fluye desde el ambiente. La entalpía es una propiedad que depende de la
temperatura y de la presión. Ya que la mayoría de los experimentos se realizan a
temperatura y presión constante, es conveniente determinar valores de entalpía en
vez de valores de energía interna. Este calor se denomina calor de reacción y es
el calor tomado del ambiente en la transformación de reactantes a T y P dadas en
productos a igual T y P. Si el sistema se encuentra más caliente después de la
reacción, debe fluir calor hacia el entorno para que el sistema recupere su
temperatura inicial. En este caso se dice que la reacción es exotérmica. Por otra
parte, si el sistema se encuentra más frío después de la reacción, debe fluir calor
desde el ambiente para restablecer la temperatura inicial. En este caso la reacción
es endotérmica.
Material y reactivos:
5 Vaso de precipitado de 100 mL K2Cr2O7
1 Termómetro NaOH
Hielo H2SO4
Metodología
A) Tipos de reacciones:
1. Coloque 50 mL de agua en un vaso de precipitado. Mida la temperatura del
agua, con el mismo termómetro mida la temperatura ambiental y anote en
M.C. Joel Díaz Martínez Página 1

bitácora. Agregue al agua 5 mL de H2SO4 concentrado, mida la temperatura cada

5 min durante 30 min.
2. Coloque 50 mL de agua en un vaso de precipitado, y al igual que en el

experimento anterior, mida su temperatura. Agregue 3 g de NaOH al agua y mida
la temperatura cada 5 min durante 30 min.
3. Coloque 5 g de K2Cr2O7 en 50 mL de agua caliente. Disuelva, deje enfriar

colocando en un baño de hielo, y agregue lentamente 5 mL de H2SO4
concentrado.
B) Tipos de procesos
1. Coloque hielo en un vaso de precipitado y mida su temperatura. Determine la
temperatura cada 15 min durante 2 h.
2. Coloque 100 ml de agua en un vaso de precipitado. Mida su temperatura inicial.

Caliente el agua a 80°C y mida su temperatura cada 5 minutos. Deje reposar 1 h.
Resultados
1. Tabla con el cambio en las temperaturas para reacciones y procesos.
Conclusiones
Con base al cuestionario, los objetivos y sus resultados, analice y concluya de
manera individual.
Cuestionario
1. ¿Cuál es la diferencia entre calor y temperatura?
2. Los organismos vivos se clasifican en poiquilotermos y homeotermos. ¿Cuál es

la razón de esta clasificación? Dé ejemplos.

3. Indique de sus observaciones en la vida diaria, cuáles experiencias podría

presentar de procesos exo o endotérmicos.
Generación de residuos
Los residuos generados después de finalizar la práctica se deberán identificar si
son peligrosos, para ello se debe verificar en los listados o con el Código de
Peligrosidad de los Residuos (CPR) del diagrama de flujo de la NOM-052-
SEMARNAT-2005, los cuáles serán depositados en frascos rotulados. Los cultivos
microbianos se deberán separar en espacio para RPBI de acuerdo a la NOM-087-
ECOL-1995 para realizar descontaminación de acuerdo a la Instrucción de Trabajo
y se deberá llenar la bitácora de residuos peligrosos FTA-IMP-06-05. Se
determinara la incompatibilidad entre 2 o más residuos peligrosos con la NOM-
054-SEMARNAT-1993 para ser colocados en estante de almacén de tránsito del
laboratorio de Ingeniería en Industrias Alimentarias. Los residuos no considerados
peligrosos se neutralizaran conforme a la Instrucción de trabajo, los ácidos serán
neutralizados con NaOH al 0.1 N y las bases con HCl al 0.1 N y podrán ser
vertidos al drenaje.
Bibliografía
D. Voet, JG Voet, CW Pratt. (2007). “Fundamentos de Bioquímica”. Editorial
Médica Panamericana. 2ª Ed.Bioquímica, Madrid.
Lehninger A, Nelson DL, Cox M (1997). “Principles of Biochemistry”, Worth

Publishers, 2º edición.

PRÁCTICA #2
ESPECTROFOTOMETRÍA Y LEY DE BEER-LAMBERT
Objetivo
Evaluar la absorbencia de una proteína en solución con base al fundamento de la
Ley de Beer-Lambert, para elaborar una curva de calibración precisa, con
organización y disciplina.
Introducción
Los métodos ópticos de análisis pueden utilizares para determinar en forma
precisa la concentración de sustancias disueltas, dentro de estos la
espectrofotometría es una de las técnicas más comunes en análisis bioquímicos.
Un espectrofotómetro mide cuanta luz absorbe una solución, dicha absorción se
puede usar para medir la concentración de los solutos. La mayoría de los solutos
absorben luz a una determinada longitud de onda, y entre más concentrado es el
soluto mas es la luz que se absorbe. El fenómeno es de naturaleza exponencial y
depende de la concentración del material absorbente de la luz, del espesor de la
capa de solución interpuesta en el trayecto del haz luminoso y de la longitud de
onda de la luz empleada en la determinación. Generalmente la longitud de onda
de la luz y el espesor de la capa que atraviesa, se mantienen constantes y la
intensidad de luz transmitida (I), se compara con la que transmite el solvente puro
(Io). La ley que relaciona la cantidad de luz transmitida por una solución con la
concentración del soluto que absorbe luz es la ley de Beer-Lambert la cual se
expresa de la siguiente forma:
A = log Io/I =- log T=  b C
Dónde:
A: Absorbencia, magnitud adimensional,
Io: Intensidad de la luz incidente,
I: Intensidad de la luz trasmitida,
T: Transmitancia, I/Io,
: Coeficiente de extinción molar, en M-1 cm-1,

b: longitud que atraviesa el haz de luz , en cm,

C: Concentración del soluto, en moles/litro (M).
La ley de Beer-Lambert establece que la absorbencia es proporcional a la

concentración de las especies absorbentes. Dicha ley se cumple en un intervalo
definido de concentraciones (0.01 M), en el cual es válido obtener una regresión
lineal significativa de absorbencia vs concentración, denominada curva de
calibración. Para determinar la concentración desconocida de una solución se
mide su absorbancia y luego se calcula la concentración correspondiente
mediante el uso de la ecuación de la curva de calibración. Las desviaciones
aparentes de esta ley en soluciones más concentradas pueden atribuirse a
cambios en las propiedades de las especies absorbentes de la solución. Conforme
una solución se vuelve más concentrada, las moléculas de soluto interactúan entre
sí debido a su proximidad, modificando sus propiedades de absorber la luz. De
ello resulta que la gráfica de absorbencia en función de la concentración pierde su
linealidad.
Hay tres aplicaciones fundamentales de esta técnica en determinaciones

bioquímicas:
1) Si se conoce el coeficiente de extinción molar de un compuesto a una longitud
de onda específica, es factible el determinar la concentración de dicho compuesto
mediante la medición de su absorbencia, como puede ser la cuantificación de
bajas concentraciones de compuestos como nucleótidos (2-4 mg).
2) El curso de una reacción puede ser determinada mediante la medición o
aparición de compuestos que absorban luz. El dinucleótido NADH absorbe
fuertemente a 340 nm en tanto que su forma oxidada (NAD +) no presenta
absorbencia a esta longitud de onda, lo cual permite dar seguimiento a su
producción o gasto en una reacción.
3) Se pueden identificar ciertos compuestos mediante la determinación del
espectro de absorción en que presentan en el intervalo visible o ultravioleta, como
es el caso de pigmentos como las clorofilas.

Materiales y reactivos
Tubos de ensayo, pipetas graduadas 5 mL, vaso de precipitado, termómetro,
celdas para espectrofotómetro, gradilla, piseta. Agitador de tubos, plancha de
calentamiento, espectrofotómetro. Solución estándar de albúmina (10 mg · mL-1),
reactivo de Biuret.
Metodología
1. Medir 1 mL de la solución de albúmina y colocar en un tubo de ensayo.
2. Adicionar 4 mL de reactivo de Biuret y mezclar.
3. Calentar la solución en baño de agua a 37°C por 10 minutos.
4. Medir la absorbencia en función de la longitud de onda entre 400 y 600 nm.
5. Determinar la longitud de onda óptima para efectuar la cuantificación de la
proteína a partir de los valores de absorbencia vs longitud de onda.
6. Elaborar una curva de calibración Tabla 1 mediante cinco distintas
concentraciones de albúmina, obtenidas por medio de diluciones sucesivas de la
solución de estándar de albúmina. Ajustar la absorbencia del aparato a cero con
un blanco que contenga únicamente agua y solución de Biuret.
7. Medir la absorbencia de una solución de concentración desconocida.
Tabla 1. Curva de calibración de albúmina.

Tubo de mL albúmina mL H2O mL Biuret [albúmina] λ
ensayo (10 mg · mL-1)
Blanco 0 6 4
1 5 1 4
2 4 2 4
3 3 3 4
4 2 4 4
5 1 5 4
Solución problema 6 mL 4

Resultados
 Gráfica, ecuación y coeficiente correlación de la regresión lineal de los valores
de absorbencia vs concentración de las soluciones de albúmina analizadas.
 Contenido de proteína soluble en solución de concentración desconocida.
Conclusiones
manera individual.
Cuestionario
1. ¿A qué se le llama absorbancia?
2. Defina transmitancia
3. Definir que es la espectrofotometría y en que se basa
4. Definir que es la espectroscopia y cuál es su fundamento
5. Mencione los principales componentes de un espectrofotómetro


Bibliografía
Holtzhauer, M., 2006. Basic Methods for the Biochemical Lab. 5th edition.
Chapter 1: Quantitative Methods. Springer-Verlag, Berlin, p. 1-21.
Jacques-Silva, M.C., Rocha, J.B.T., 2000. Protein measurement at PRÁCTICAl

classes for students of pharmacy: a student-centered approach.
Biochemistry and Molecular Biology Education 28, 327-329.
Prats, M., 1989. Tools in spectrophotometry and differential spectrophotometry.

Biochemical Education 17(3), 151-153.
Roca, P., Oliver, J., Rodríguez, A.M., 2003. Bioquímica Técnicas y Métodos. Ed.
Hélice, Madrid, pp. 70-84.

PRÁCTICA # 3
DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE PROTEÍNA SOLUBLE
Objetivo
Analizar el contenido de proteína soluble del tejido de un organismo mediante un
método espectrofotométrico.
Introducción
La cuantificación de proteínas es una de las determinaciones más comunes que
se efectúan en estudios bioquímicos, es un paso importante para el manejo de
muestras en las cuales se requiere el aislamiento y la caracterización de
proteínas. El determinar el contenido proteico de una muestra es un requisito
común previo al uso de métodos de separación, análisis cromatográficos,
electroforesis, inmunoquímica, entre otros. Cuando se requiere determinar la
concentración de proteínas de una muestra una de las primeras cuestiones a
considerar es la selección de un método analítico adecuado. La elección entre los
ensayos de proteínas disponibles por lo general se hace en base a considerar la
compatibilidad del procedimiento con las muestras a evaluar. El objetivo es
seleccionar un método que requiera menos manipulación o tratamiento previo de
las muestras y evitar la presencia de sustancias que puedan interferir en la
determinación.
Todas las proteínas están conformadas por aminoácidos unidos mediante enlaces
peptídicos los cuales se originan por la interacción entre los grupos amino terminal
y el carboxilo contiguos. En general se presentan 20 aminoácidos formando parte
de las proteínas. Una reacción del enlace peptídico de tripéptidos, polipéptidos y
proteínas con iones de Cu+2 en un medio alcalino y en presencia de tartrato de
sodio da como producto un complejo de quelación colorido el cual absorbe a 540
nm, mediante esta reacción denominada de biuret se pueden cuantificar péptidos
y proteínas. El ion cúprico forma un complejo coordinado con los pares de
electrones no compartidos del nitrógeno que forma parte de 4 enlaces peptídicos,

la intensidad del color es proporcional al total de enlaces peptídicos que participan

en la reacción.
La reacción de biuret es la base de un método colorimétrico simple y rápido para

determinar cuantitativamente el contenido de proteína soluble de una muestra. El
método es aplicable para determinar proteína en el intervalo de 1 a 160 mg/mL.
Compuestos como lípidos, hemoglobina, EDTA y sales de amonio pueden
interferir en el desarrollo de la reacción.
Figura 1. Complejo de biuret
Tubos de ensaye, espátula, homogeneizador manual, pipetas graduadas 5 mL,
pipetero, vaso precipitado, termómetro, celdas para espectrofotómetro, gradilla,
piseta. Centrifuga, agitador de tubos, plancha de calentamiento,
espectrofotómetro. Buffer salino (NaCl 0.15M, citrato de sodio 0.015M, pH 7),
reactivo de Biuret (3.75 g CuSO4.5H2O + 1.51 g NaKC4H4O6.4H2O + 7.50 g NaOH
en 250 mL de agua destilada).
Metodología
1. Separar 2 tejidos (hígado y corazón) de un organismo (pollo, res, ternero y
pescado) y colocar cada muestra de en un vaso de precipitado en hielo.

2. Cortar cada tejido en trozos pequeños y pesar en una proporción de 0.2 g por mL
de buffer salino que se utilizará para su homogeneización.
3. Homogeneizar cada uno de los tejidos mediante el uso de un homogeneizador
manual de tubo con embolo en un baño de hielo.
4. Centrifugar el homogenizado a 3000 rpm por 5 minutos y separar el sobrenadante.
5. Por duplicado, mezclar 0.2 mL del sobrenadante por tejido con 0.8 mL de agua
destilada, adicionar 4.5 mL de reactivo de Biuret y agitar.
6. Calentar la solución en baño de agua a 37 C por 10 minutos.
7. Enfriar la solución y leer la absorbencia a 540 nm.
8. Determinar el contenido de proteína soluble a partir de los valores de absorbencia
y la ecuación de la curva de calibración de albúmina elaborada en la práctica No 1.
Resultados
 Nombre común y científico de los organismos analizados.
 Contenidos de proteína soluble en mg por g de tejido analizado.
Conclusiones
manera individual.
Cuestionario
1. Defina la biomolécula proteína
2. La estructura de un aminoácido está formado por:
3. ¿Qué quiere decir que los aminoácidos poseen un carácter anfótero?
4. La estructura secundaria de una proteína es:

Bibliografía
Janairo, G., Sy, M.L., Yap, L., Llanos-Lazaro, N., Robles, J. 2011. Determination
of the sensitivity range of Biuret test for undergraduate biochemistry
experiments. e-Journal of Science & Technology 5, 77-83.
Krohn, R.I., 2001. The colorimetric detection and quantitation of total protein.
Current Protocols in Food Analytical Chemistry B1.1.10-B1.1.13.
Roca, P., Oliver, J., Rodríguez, A.M., 2003. Bioquímica Técnicas y Métodos. Ed.
Hélice, Madrid, pp. 156-157.

PRÁCTICA #4
DETERMINACIÓN DEL PUNTO ISOELÉCTRICO DE UNA PROTEÍNA
Objetivo
Evaluar el punto isoeléctrico de una proteína mediante variación de pH del medio
en el cual esta disuelta, para relacionar este parámetro con las propiedades
iónicas de la estructura.
Introducción
Aun cuando en la formación de la unión peptídica de los grupos carboxílicos y
aminos de los aminoácidos no generan en enlace con carga, es común que
queden libres algunos de estos grupos, ya sea en los extremos de las cadenas
polipeptídicas, o en las cadenas laterales de los aminoácidos ácidos y básicos. La
disociación de los grupos ionizables que están presentes en las proteínas, así
como la de los grupos ionizables de los aminoácidos individuales, está
determinada por el pH del medio en el cual se encuentra la proteína. A pH de 7.0 o
en valores cercanos a este, los cuales son comunes en la mayoría de las células,
los grupos carboxilo de los ácidos aspártico y glutámico se encuentran en sus
formas básicas con carga negativa, mientras que los aminoácidos lisina y arginina
están presentes en su formas ácidas con carga positiva. La contribución de los
grupos sulfhidrilo de la cisteína, y fenólico de la tirosina es mínima; por ejemplo la
tirosina presenta solo una disociación del 0.1% del grupo fenólico. La carga total
de la proteína depende del pH de la solución y del número relativo de cada
aminoácido en la molécula. Cuando el pH de la solución es tal que la carga de
neta de la molécula proteica es cero, la cual se presenta cuando el número total
de cargas positivas y negativas son iguales, se le denomina punto isoeléctrico o
pH isoeléctrico de la proteína (pI). Los valores de pI de la mayoría de las proteínas
son menores a 7, aunque se presentan valores desde 1.1 para la pepsina hasta 12
en portaminas. Una proteína ácida con pI bajo tendrá carga negativa a pH neutro,
mientras que una proteína básica con un pI alto tendrá carga positiva a pH de 7.
En general el punto isoeléctrico de una proteína es también el pH en el cual es

menos soluble y más fácilmente precipita, esto se atribuye a que probable

atracción entre grupos de carga opuesta de moléculas vecinas, ya que el número
de cargas opuestas será el máximo en el punto isoeléctrico. La capacidad de
variar la carga de una molécula proteica mediante el cambio del pH del medio en
el cual se encuentra puede utilizarse para purificar y caracterizar proteínas
mediante métodos como electroforesis o cromatografía de intercambio iónico.
Nombre de la proteína pI
Ovoalbúmina 4.5
Seroalbúmina (humana) 4.9
Ureasa (Canavalis ensiformes) 5.0
Β-lactoalbúmina (cabra) 5.2
g-Globulina 6.6
Hemoglobina (Humana) 6.8
Mioglobina (corazón de equino) 7.0
Quimitripsinógeno (Bovino) 9.6
Citocromo c (corazón de Bovino 10.6
Lisozima 11.0
Fuente: http://depa.fquim.unam.mx/proteinas/
Tubos de ensayo, pipetas graduadas de 1, 5 y 10 mL, pipetero, vaso precipitado,
gradilla, piseta. Potenciómetro. Solución de caseína 5% en acetato de sodio 0.1N,
ácido acético 0.01, 0.1 y 1N, solución buffer pH 4 y 7.
Metodología
1. Preparar una serie de tubos de acuerdo a la siguiente tabla:

Tubo
Reactivo mL
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Caseína 5% en acetato de sodio 0.1 N 1 1 1 1 1 1 1 1 1
Agua destilada 8.4 7.8 8.8 8.5 8.0 7.0 5.0 1.0 7.4
CH3-COOH 0.01 N 0.6 1.2 - - - - - - -
CH3-COOH 0.1 N - - 0.2 0.5 1.0 2.0 4.0 8.0 -
CH3-COOH 1 N - - - - - - - - 1.6

2) Agitar los tubos y observar la presencia o ausencia de turbidez en la mezcla

después de 15 y 30 minutos.
3) Tabular los resultados e indicar el grado de precipitación con los siguientes
valores:
0 = ningún cambio.
1+ = turbidez.
2+ = notable turbidez.
3+ = precipitación.
4+ = marcada precipitación.
5+ = abundante precipitación.
4) Determinar el pH de cada tubo mediante el uso de un potenciómetro.
5) Elaborar una gráfica con el grado de precipitación en las ordenadas y el pH en
las abscisas. El punto isoeléctrico aproximado corresponde al pH del tubo donde
se presentó la máxima precipitación
Resultados
• pH experimental en cada tubo de reacción
• pH teórico en cada tubo de reacción de acuerdo a la ecuación de Hendersson-
Hasselbach.
• Punto isoeléctrico de la proteína analizada.
Conclusiones
manera individual.
Cuestionario
1. Usando la ecuación de Henderson–Hasselbalch, calcular el pKa de cada
grupo ionizable titulado.
2. ¿Coincide con el pKa reportado en los libros?
3. ¿Cómo se podría confirmar la identidad del aminoácido?

4. Dibujar la curva que se esperaría en la titulación del ácido aspártico y la que

se esperaría en la titulación de la lisina, señalando las especies predominantes en
cada región.
Bibliografía
Ayala-Lopera, S.A., 2007. Manual de Laboratorio de Bioquímica. Universidad de
Antioquia, Facultad de Ciencias Agrarias, Escuela de Producción Pecuaria.
Medellín, Colombia, pp. 11-12.
Harris, D.C., 2007. Análisis Químico Cuantitativo. 6ª ed., Editorial Reverté,

Barcelona, p. 217-219.
Instituto Politécnico Nacional, 2013. Manual de Laboratorio de Bioquímica

Médica I. Escuela Superior de Medicina, Departamento de Formación
Básica Disciplinaria. Academia de Bioquímica Médica I. Propiedades de
proteínas: Determinación del punto isoeléctrico de la caseína. México, p.
18.

Morris, J., G. 1975. Fisicoquímica para Biólogos. 2ª ed., Editorial Reverté,

Barcelona, pp. 163-165.

PRÁCTICA # 5
DETERMINACIÓN DE PARÁMETROS DE CINÉTICA ENZIMÁTICA
Objetivo
Investigar la cinética enzimática de una hidrolasa mediante el modelo de
Michaelis-Menten, para evaluar sus parámetros cinéticos y contrastar con los
establecidos en la literatura.
Introducción
El término cinética enzimática implica el estudio de la velocidad de una reacción
catalizada por una enzima y los efectos que pueden tener factores como los
inhibidores. Uno de los principales estudios que se realizan en una enzima es
medir el efecto en la velocidad de la reacción cuando se modifican las
concentraciones del sustrato y se mantienen constantes la concentración de
enzima, el pH, la fuerza iónica del medio, la temperatura, entre otros. Se evalúa la
influencia de estos factores en la reacción catalizada por enzimas con la finalidad
de determinar los intermediarios en una reacción y el papel que juegan en la
reacción enzimática, es decir, para predecir mecanismos de reacción. Es esencial
entender estos mecanismos para desarrollar nuevas herramientas moleculares,
por ejemplo, para combatir enfermedades en las que se conoce a la enzima que la
produce. También es usual medir la actividad enzimática con diferentes sustratos
para entender su especificidad o bien, medir la actividad de la enzima de
diferentes tejidos u organismos para entender cómo las diferencias en actividad
están relacionadas con la función y/o la fisiología del organismo del que proceden.
El modelo clásico de Michaelis-Menten para explicar la cinética enzimática
considera la unión de una enzima (E) con un sustrato (S) para formar un complejo
enzima-sustrato (ES), el cual puede generar el producto (P) más la enzima (E) o
disociarse para dar la enzima y el sustrato.

Las reacciones catalizadas por enzimas, generalmente presentan una

dependencia hiperbólica de la velocidad respecto a la concentración de sustrato,
distinguiéndose 3 componentes en la curva. En la primera parte, a bajas
concentraciones de sustrato, la velocidad es proporcional a la concentración de
sustrato, de tal manera que si se duplica la concentración de sustrato, se duplica
la velocidad (reacción de primer orden). La segunda parte de la curva, a
concentraciones intermedias de sustrato, la velocidad se incrementa menos que
en la primera parte con el incremento de la concentración, iniciando alrededor de
la ½ de la Vmax. La última parte de la curva, a altas concentraciones de sustrato,
la velocidad es independiente de la concentración de sustrato (reacción de orden
cero), así la velocidad alcanzada es cercana a la máxima.
Figura 1. Representación de la cinética de Michaelis-Menten.
La ecuación de Michaelis- Menten expresa la relación matemática de la hipérbola

cuadrática que existe entre las variables:
En la ecuación de Michaelis-Menten hay dos variables que son la velocidad (v) y la

concentración de sustrato [S]. La Km y la Vmax son constantes. La Km es llamada
la constante de Michaelis-Menten. El valor de Km de una enzima para un sustrato
específico es la concentración del sustrato a la cual la velocidad de la reacción es
la mitad de la velocidad máxima. La Vmax es la velocidad teórica máxima de la

reacción catalizada por la enzima. A concentraciones muy altas de sustrato el

valor de la velocidad se aproxima al de la velocidad máxima de la reacción, pero
nunca se llega a ésta. Los valores de Km y Vmax son característicos de una
enzima, y se conocen como parámetros cinéticos de la enzima. Aunque son
constantes, dependen de las condiciones en las que se lleva a cabo la reacción, la
enzima es una proteína cuya estructura y carga eléctrica se modifican cuando los
componentes de la solución cambian.
Una manera para obtener los valores de Km y Vmax de una enzima es graficando
los valores de velocidad contra la concentración de sustrato. Este método tiene la
desventaja de que se grafica una curva y no una línea recta, por lo que la
interpolación es difícil. Otra manera para obtener los valores de Km y Vmax es la
de utilizar expresiones matemáticas que producen una línea recta como la de
Lineaweaver-Burk, también denominada de dobles recíprocos, la cual se utiliza
frecuentemente:
Figura 5. Representación de Lineaweaver-Burk de la cinética de Michaelis-Menten.
Material y equipo
Matraces Erlenmeyer 50 mL, pipetas graduadas de 1, 10 y 5 mL, pipeteros, vasos
de precipitado 500 mL, bureta 25 mL, pinzas para bureta, soporte universal,
piseta. Baño de temperatura controlada. Urea 0.01 M, solución de ureasa (2.5
mg/mL), CuCl2 2%, HCl 0.01M, solución de fenolftaleína 1%.

Metodología
1) Preparar una serie de matraces de acuerdo a lo establecido en la siguiente
tabla:
Urea 0.01 M Agua
Matraz
(mL) (mL)
1 0 24
2 5 19
3 10 14
4 12.5 11.5
5 15 9
6 17.5 6.5
7 20 4
8 22.5 1.5
9 24 0
2) Colocar los matraces en un baño de agua a 40 C y esperar que alcancen la

temperatura del mismo.
3) Añadir 1 ml de la solución de ureasa a cada matraz y esperar que transcurra la
reacción enzimática durante 20 minutos.
4) Adicionar 1 ml de CuCl2 al 2% a cada matraz y agitar vigorosamente para
suspender la actividad de la enzima.
5) Titular el contenido de cada matraz con HCl 0.01N y fenolftaleína como
indicador, hasta el vire de rosa a incoloro.
Resultados
 Velocidad de reacción enzimática en mEq de NH3/minuto.
 Gráfica de Michaelis-Menten.
 Gráfica de Lineweaver-Burk.
 Valores de Km y Vmax de la enzima.

Conclusiones
manera individual.
Cuestionario
1.- ¿Qué es un azúcar reductor?
2.- ¿La sacarosa es un azúcar reductor?
3.- ¿Qué metodología utilizaría para obtener el Km del par invertasa-sacarosa?

Proponga un experimento propio.
4. Describa las enzimas amilolíticas, α-amilasa, β-amilasa y amiloglucosidasa,

modo de acción de cada una de ellas, principales productos que se obtienen con
cada una de ellas. Describa un proceso industrial en el cuál se utilizan estas
enzimas.
5. Describa tres enzimas proteolíticas, fuentes de obtención y principales

aplicaciones

Bibliografía
Fromm, H.J., Hargrove, M.S., 2012. Essentials of Biochemistry. Springer,
Heidelberg. Chapter 5: Enzyme Kinetics, p. 81-122.
Sorensen, R., Novak, N., 1996. The use of Michaelis-Menten kinetics in cell
biology and physiology teaching laboratories. Biochemical Education 24(1),
26-28.
Bezerra, R.M.F., Dias, A.A., 2007. Utilization of integrated Michaelis-Menten

equation to determine kinetic constants. Biochemistry and Molecular Biology
Education 35 (2), 145–150.

PRÁCTICA # 6
EFECTO DE LA TEMPERATURA EN LA VELOCIDAD DE REACCIÓN
Objetivo
Analizar el efecto de la temperatura en una reacción enzimática a través de la
velocidad de hidrólisis del sustrato, para evaluar el funcionamiento óptimo de la
enzima bajo estudio.
Introducción
La actividad enzimática es afectada por la temperatura del medio en el cual
ocurre. Los puentes de hidrógeno y fuerzas de van der Walls, que participan en la
estabilización de las estructuras terciaria y cuaternaria de las proteínas, son muy
sensibles a incrementos en la temperatura, ya que aumenta el movimiento de las
cadenas de aminoácidos y de los grupos laterales y, por lo tanto la fuerza y las
colisiones entre las enzimas y la moléculas que las rodean. El aumento de las
colisiones entre las moléculas de la enzima y el sustrato favorece, por el contacto,
las reacciones que estas catalizan. Sin embargo a temperaturas muy elevadas, las
colisiones son capaces de romper los puentes de hidrógeno y las fuerzas de van
der Walls que son relativamente débiles, a medida que esto ocurre el arreglo
tridimensional de la enzima se modifica y se pierde su estructura funcional. Los
cambios característicos que se producen con el incremento de temperatura en la
actividad enzimática se muestran en siguiente la figura 2.
Figura 2. Temperatura óptima de reacción

La temperatura en la cual la actividad catalítica es máxima se le denomina

temperatura óptima. Por encima de esta temperatura se presenta la pérdida de
actividad catalítica debida a desnaturalización térmica, lo cual da como resultado
una disminución de la actividad enzimática hasta cesar. Es común que entre los 0
°C y 40 °C se observe un aumento de la actividad enzimática, intervalo en el cual
ocurren cambios mínimos en la estructura de la enzima. Se postula que en una
reacción química por cada incremento de 10 °C aumenta la velocidad reacción al
doble, lo cual en la reacción enzimática tiene un efecto de la frecuencia de los
choques entre las moléculas del sustrato y de la enzima. Si la temperatura
aumenta por encima de los 40 °C las colisiones se incrementan y se inicia el
rompimiento de enlaces. A los 55 °C la actividad enzimática empieza a disminuir,
hasta que cerca de los 70 °C su actividad es cercana a cero como resultado de
que desnaturaliza la proteína. La mayoría de la enzimas presentan una actividad
óptima entre los 40 y 50 °C; sin embargo, algunos organismos poseen enzimas
cuya actividad se da a temperaturas bajas, como es el caso de la lactato-
deshidrogenasa de pez del antártico Trematomus bernacchii cuya actividad
máxima se observa a temperaturas muy por debajo de las enzimas homologas, de
organismos que viven en ambientes más cálidos. Así mismo, organismos
extremófilos como la bacteria termófila Thermus aquaticus presenta la enzima la
ADN polimerasa con una temperatura óptima de funcionamiento alrededor de los
75 °C.
Tubos de ensayo, pipetas graduadas de 1, 5 mL, pipetero, vasos de precipitado
125 mL, gradilla, piseta. Planchas de calentamiento. Amilasa (0.02%), almidón (8
mg/mL), glucosa (0.02 M), buffer de fosfatos 0.02 M pH 7 (disolver 0.806 g de
NaCl, 0.022 de KCl, 0.115 g de Na2HPO4 y 0.025 g de KH2PO4 y aforar con agua
destilada a 100 mL ajustar el pH a 7 con 1 M de HCl o 10 M de NaOH según sea
necesario) , reactivo de ácido 3,5-dinitrosalicílico (disolver 1 g en 20 mL de NaOH
2 M, mezclar con 50 mL de NaKC4H4O6.4H2O 2.13 M y aforar con agua destilada
a 100 mL).

Metodología
I) Ensayo enzimático.
1) Preparar y correr una serie de tubos de acuerdo a lo establecido en la Tabla 1,
mezclar perfectamente al añadir cada reactivo.
2) El tubo 1 será el testigo negativo por lo que antes de añadir la enzima, se
adicionara 1 mL de ácido 3,5-dinitrosalicílico como inhibidor enzimático.
Tabla 1. Procedimiento de ensayo enzimático.

Tubo
Solución (mL)
1 2 3 4 5 6 7
Sustrato (almidón) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
Solución reguladora de fosfatos 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5
Agua destilada 3 3 3 3 3 3 3
Preincubar 5 minutos a: 20 °C 0 °C 20 °C 40 °C 50 °C 60 °C 90 °C
Ácido 3-5-dinitrosalicílico 1 - - - - - -
Enzima (α-amilasa) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
Incubar 15 minutos a: 20 °C 0 °C 20 °C 40 °C 50 °C 60 °C 90 °C
Ácido 3-5-dinitrosalicílico - 1 1 1 1 1 1
Baño de agua a ebullición por 10 minutos y enfriar en hielo
3) Al término del calentamiento en el baño de agua a ebullición, enfriar los tubos y

leer su absorbencia a 540 nm, utilizar el tubo 1 como blanco para ajustar el cero.
4) En caso de que las lecturas presenten valores altos de absorbencia se puede
diluir la mezcla final de reacción, en una proporción de 1 mL de solución con 5 mL
de agua destilada, para proceder a leer los valores por tubo. El contenido de
glucosa liberada en cada tubo de reacción se determinará mediante el uso de una
curva de calibración de glucosa.
II) Curva de calibración de glucosa

1) Preparar una serie de 11 tubos de acuerdo a la Tabla 2.

Tabla 2. Curva de calibración de glucosa.

Solución (mL) Blanco 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Glucosa 0.02 M 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Solución reguladora de fosfatos 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0
Ácido 3-5-dinitrosalicílico 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
2) Calentar los tubos en baño de agua a ebullición por 10 minutos.

3) Enfriar los tubos y leer su absorbencia a 540 nm, utilizar el tubo del blanco para
ajustar el cero.
Resultados
 Gráfica, ecuación y coeficiente correlación de la curva de calibración de
glucosa.
 Grafica de concentración de glucosa generada en función de la temperatura
enzimática de reacción.
 Temperatura optima de la enzima bajo estudio.
Conclusiones
manera individual.
Cuestionario
1. ¿Factores que afectan las reacciones enzimáticas?
2. ¿Explique por qué las enzimas presentan una temperatura de máxima actividad
catalítica?
3. ¿Qué efecto puede provocar en la estructura de una enzima un aumento o

disminución del pH del medio?

4. Las enzimas deben presentar un cierto grado de hidratación para ser activas, al
disminuir, la actividad enzimática disminuye. Explique por qué.
Bibliografía
Daniel, R.M., Danson, M.J., Eisenthal, R., Lee, C.K., Peterson, M.E., 2008. The
effect of temperature on enzyme activity: new insights and their implications.
Extremophiles 12 (1), 51-59.
Daniel, R.M., Peterson, M.E, Danson, M.J., Price, N.C., Kelly, S.M., Monk, C.R.,
Weinberg, C.S., Oudshoorn, M.L., Lee,C.K., 2010. The molecular basis of
the effect of temperature on enzyme activity. Biochemical Journal 425, 353–
360.
Instituto Politécnico Nacional, 2013. Manual de Laboratorio de Bioquímica

Médica I. Escuela Superior de Medicina, Departamento de Formación

Básica Disciplinaria. Academia de Bioquímica Médica I. Cinética enzimática.

México, pp. 30-31, 56.
Somero, G.N., 2004. Adaptation of enzymes to temperature: searching for basic

‘‘strategies”. Comparative Biochemistry and Physiology, Part B 139, 321–
333.

PRÁCTICA # 7
DETERMINACIÓN DE CARBOHIDRATOS TOTALES
Objetivo
Evaluar el contenido de carbohidratos totales en una muestra biológica, para
evaluar sus parámetros cinéticos y contrastar con los establecidos en la literatura.
Introducción
Los carbohidratos o sacáridos son compuestos de gran importancia para los seres
vivos, los cuales son muy abundantes en la naturaleza. Las unidades básicas de
los carbohidratos son los monosacáridos, los cuales no hidrolizables en unidades
más pequeñas. La glucosa es el monosacárido, aldohexosa, es el combustible
principal para la mayoría de los organismos. Los oligosacáridos contienen de dos
a diez unidades de monosacáridos unidas covalentemente. Por su parte, los
polisacáridos están constituidos por gran número de unidades de monosacáridos
unidos covalentemente, los cuales pueden alcanzar pesos moleculares de hasta
106 daltons. Los polisacáridos desempeñan dos funciones biológicas principales:
almacenar energía metabólica y aportar elementos estructurales a la célula.
Monosacáridos como la glucosa y sus derivados, son piezas fundamentales en

muchas rutas metabólicas esenciales para la obtención de energía. La glucosa
actúa en el organismo como combustible energético de uso inmediato, mientras
polisacáridos y grasas son biomoléculas de reserva que deben ser catabolizadas
antes de su aprovechamiento como fuentes de energía. Los carbohidratos están
ampliamente en organismos vegetales y animales con funciones metabólicas y
estructurales. En los vegetales la glucosa es sintetizada por fotosíntesis a partir de
CO2 y agua, y es almacenada como almidón o convertida en celulosa para formar
parte de la pared celular. Los animales obtienen sus carbohidratos principalmente
de fuentes vegetales, una forma de acumularlos es como glucógeno, pero en
casos de deficiencia pueden sintetizar algunos como la glucosa a partir de fuentes
de carbono derivadas de lípidos y proteínas.

Es frecuente que durante la transformación o el aislamiento de los carbohidratos

se requiere el cuantificar la cantidad total del producto obtenido. Un método para
cuantificar el contenido de carbohidratos totales, el cual incluye a los reductores y
no reductores, es mediante su reacción con un ácido fuerte y a alta temperatura,
bajo estas condiciones ocurre una deshidratación simple y la catálisis ácida da
como productos como furfural e hidroximetilfurfural que se reaccionan con
compuestos como el fenol para producir compuestos coloridos.
El método es simple, rápido, sensible a bajas concentraciones de carbohidratos

(10 µg · mL-1) y genera resultados con una buena precisión (± 2%). Los reactivos
son de bajo costo, el color producido es estable y la determinación no presenta
interferencia con proteínas. Ya que la intensidad del color que se genera como
producto final de la reacción varía de acuerdo al tipo carbohidrato, se debe
seleccionar el estándar adecuado para una cuantificación precisa. La proporción
de ácido sulfúrico, como fuente de calor, deberá ser la apropiada para favorecer
que la reacción se complete.
Material y reactivos
Tubos de ensayo con tapón, pipetas graduadas de 1 y 5 mL, pipetero, gradilla,
piseta, celdas para espectrofotómetro, termómetro, vaso de precipitado 125 mL.
Baño de temperatura controlada, espectrofotómetro. Fenol acuoso 5%, ácido
sulfúrico concentrado.

Procedimiento
1) Preparar una solución acuosa de la muestra, el contenido de los carbohidratos
deberá estar en el intervalo de sensibilidad del método (10-100μg · mL-1).
2) En tubos de ensaye etiquetados colocar 0.5 mL de la solución de la muestra.
3) Adicionar a cada tubo 0.5 mL de solución de fenol al 5%, mezclar
perfectamente, enseguida adicionar cuidadosamente 2.5 mL de ácido sulfúrico
concentrado y homogeneizar.
4) Calentar los tubos en baño de agua a 90 C por 15 minutos.
5) Enfriar los tubos a temperatura ambiente y determinar la respectiva absorbencia
a 490 nm, ajustar el equipo con un blanco preparado de la misma manera
reemplazando la muestra con agua.
6) Calcular la cantidad de carbohidratos presentes en la muestra a partir de una
curva patrón preparada con el carbohidrato de interés en el intervalo del método
(10-100 μg de glucosa · mL-1), tratada de la misma manera que el problema.
Resultados
• Gráfica, ecuación y coeficiente correlación de la curva de calibración de glucosa.
• Contenido de carbohidratos totales en la muestra analizada.
Conclusiones
manera individual.
Cuestionario
1. ¿Qué son los monosacáridos?
2. ¿mencione algunos de los monosacáridos?
3. ¿Qué son los monosacáridos epímeros?
4. ¿Qué es un enlace hemiacetalico?

5. ¿Cómo debe estar formado el enlace glucosídico de un disacárido reductor y

cuando no es reductor?
Bibliografía
Fournier, E., 2001. Colorimetric quantification of carbohydrates. Current Protocols
in Food Analytical Chemistry E1.1.1-E1.1.3.
Masuoka, T., Minami, A., Iwasaki, N., Majima, T., Nishimura, S.I., Lee, Y.C.,
2005. Carbohydrate analysis by a phenol-sulfuric acid method in microplate
format. Analytical Biochemistry 339, 69-72.

PRÁCTICA # 8
AISLAMIENTO Y CUANTIFICACIÓN DE GLUCÓGENO
Objetivo
Determinar el contenido de glucógeno en tejidos animal, para estimar su
capacidad de almacenamiento y relacionar con su función metabólica.
Introducción
Los seres vivos almacenan glúcidos en forma de polisacáridos, que sirven como
materiales de reserva. En los vegetales superiores se acumulan principalmente
como almidón, en los animales se presentan en forma de glucógeno. El glucógeno
es una biomolécula que está conformada por unidades de glucosa unidas por
enlaces glucosídicos α(1-4) con ramificaciones mediante enlaces α(1-6).
Figura 3. Biomolécula de glucógeno
El glicógeno es la reserva principal de carbohidratos en los organismos animales.

El depósito principal de glicógeno son el hígado (de 2 a 5%) y los músculos (de
0.5 a 2%), en los cuales esta acumulado hasta en un 60% de su contenido en el
organismo. En situación de inanición, el glucógeno es la primera reserva que se
moviliza para mantener la glucemia, al menos durante las primeras horas. El
metabolismo del glucógeno está asociado al nivel de la glucosa sanguínea,
durante una buena alimentación se presenta su síntesis o gluconeogénesis, en
condiciones de ayuno ocurre su degradación o glucogenólisis El glucógeno del
músculo esquelético tiene como finalidad suministrar glucosa para que sea

degradada oxidativa y se pueda obtener ATP para la actividad muscular. En

contraste, el glucógeno hepático sirve como fuente de glucosa para los tejidos
extra hepáticos, incluido el músculo esquelético, ante un descenso de la glucemia.
Una vez agotado el suministro de glucosa vía glucogenólisis y para cubrir
requerimientos tejidos del organismo la ruta para síntesis de glucosa es a través
de la gluconeogénesis, la cual procede a partir de sustancias distintas a los
carbohidratos, tales como aminoácidos y lactato glicerol. La extracción del
glucógeno de tejidos, como el hígado, se realiza mediante un proceso de
homogenización y ruptura celular, así como la extracción y la eliminación de las
proteínas para evitar interferencias en el análisis posterior del polisacárido.
Material y reactivos
Espátula, homogeneizador manual, tubos de ensaye, pipetas volumétricas de 1 y
5 mL, pipeteros, tubos de centrifuga, celdas para espectrofotómetro. Balanza
analítica, baño de temperatura controlada, centrifuga, espectrofotómetro. KOH
acuoso al 30%, etanol, K2SO4 al 10%, fenol 5%, H2SO4 concentrado.
Procedimiento
1) A partir de peces recién sacrificados obtener muestras de hígado y
musculo, enseguida pesar por duplicado 1.0 g de hígado y 2 g de músculo.
2) Homogeneizar las muestras de tejidos con 5 mL de KOH al 30%.
3) Calentar los homogenizados en un baño de agua a ebullición por 15
minutos, agitar ocasionalmente.
4) Centrifugar los homogenados a 3000 rpm por 5 minutos, separar la capa de
cada sobrenadante y colocarla en tubo de ensaye.
5) Tomar 0.1 ml del sobrenadante y añadir 3 mL de etanol y 0.1 ml de K2SO4
al 10%, agitar.
6) Reposar los tubos con la mezcla en baño de hielo por 5 minutos.
7) Centrifugar los tubos 5 minutos a 3000 rpm, desechar el sobrenadante y
separar el glucógeno precipitado.
8) Solubilizar el precipitado en 3 mL de agua.

9) Colocar en dos tubos de ensaye alícuotas de 0.5 mL de la solución de

glucógeno, adicionar a cada tubo 0.5 mL de solución de fenol al 5%, mezclar
perfectamente, enseguida adicionar cuidadosamente 2.5 mL de ácido sulfúrico
concentrado y homogeneizar.
10) Calentar los tubos en baño de agua a 90 C por 15 minutos
11) Enfriar los tubos a temperatura ambiente y determinar la respectiva
absorbencia 490 nm, ajustar el equipo con un blanco preparado de la misma
manera reemplazando la muestra con agua destilada.
12) Calcular la cantidad de carbohidratos presentes en la muestra a partir de
una curva patrón preparada con glucógeno en el intervalo de sensibilidad del
método colorimétrico.
Resultados
 Gráfica, ecuación y coeficiente correlación de la curva de calibración de
glucógeno.
 Contenido de glucógeno (mg/g) en los tejidos analizados.
Conclusiones
manera individual.
Cuestionario
1. ¿Cuál es la función de la degradación de glucógeno en el hígado?
2. ¿Qué enzimas son requeridas para romper las ramificaciones α-1-6-glicosidicas

en el glucógeno?
3. ¿Tejidos mayoritarios que almacenan el glucógeno?
4. ¿En qué consiste la glucogénesis y glucogenólisis?

Bibliografía
Moraes, G., Choudhuri, J. V., Souza, R. H. S., Neto, C. S., 2004. Metabolic
effects of exercise in the golden fish Salminus maxillosus "dourado"
(Valenciennes, 1849). Brazilian Journal of Biology 64(3B), 655-660.
Ojea, J., Martínez, D., Novoa, S., Pazos, A. J., Abad, M., 2002. Contenido y
distribución de glucógeno en relación con el ciclo gametogénico de
Ruditapes decussatus (L., 1758) en una población natural de las lagunas de
Baldaio (Galicia, noroeste de España). Boletín Instituto Español de
Oceanografía 18 (1-4), 307-313.

PRÁCTICA # 9
EXTRACCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE LÍPIDOS
Objetivo
Extraer y cuantificar el contenido de lípidos en tejidos de un organismo, para
evaluar su relación con la función metabólica.
Introducción
A diferencia de otras biomoléculas los lípidos son un grupo heterogéneo que no
posee un grupo funcional característico. Los lípidos son sustancias presentes en
tejidos animales y vegetales que comparten la propiedad de ser solubles en
solventes orgánicos no polares, como benceno, hexano y cloroformo, éter, con
escasa o nula solubilidad en agua. Como consecuencia de ello, el término lípido
abarca a un gran número de compuestos orgánicos con estructuras muy diversas;
no obstante, poseen algo en común, la parte principal de su estructura es de
naturaleza hidrocarbonada y ésta es la razón de su carácter hidrófobo.
En general los lípidos pueden ser clasificados de acuerdo a sus propiedades en

dos grupos: No polares o lípidos neutros, los cuales comprenden triacilglicéridos,
diacilglicéridos, ceras, esteroles, terpenos; polares integrados por fosfolípidos y
glucolípidos. Los lípidos son una fuente muy importante de energía metabólica los
cuales aportan 9.5 kcal/g, en contraste con carbohidratos y proteínas, que generan
4.1 y 5.6 kcal/g, respectivamente. Los triacilglicéridos son los lípidos más
abundantes en la naturaleza, en tanto que los fosfolípidos son constituyentes
principales de membranas celulares.
Triacilglicérido Fosfolípido
R1, R2, R3: ácidos grasos; X: hidrógeno o radical (p.ej. etanolamina, colina, serina, glicerol, mio-inositol)

Los lípidos pueden ser utilizados por los organismos animales como una fuente de
energía, a través del metabolismo oxidativo de ácidos grasos, de igual forma
puede aportar ácidos grasos esenciales. Por presentar un estado de oxidación
más reducido con relación a carbohidratos o proteínas proporcionan mayor
energía al oxidarse. Los lípidos son componentes de reserva y estructurales de las
células, aportan ácidos grasos insaturados para el mantenimiento e integridad de
membranas celulares, participan el transporte de lipídico (v. gr. fosfolípidos, actúan
como agentes emulsificantes) y son precursores de hormonas (p. ej. el ácido
araquidónico, 20:4n-6, es precursor de prostaglandinas).
En animales marinos los lípidos muestran importancia en la boyancia, debido a su

baja densidad y al volumen que ocupan sin requerir osmoregulación,
mantenimiento de estructura corporal (v. gr. la presencia de ácidos grasos de la
serie n-3 permite retener la fluidez de la membrana celular a bajas temperaturas) y
en osmoregulación (integran un espacio osmóticamente inactivo que no requiere
gasto de energía). Los lípidos son requeridos como fuente de energía y en el
aporte de lípidos polares necesarios en la formación de membranas celulares.
Este carácter dual es reflejado en la compartamentalización de los lípidos
corporales en tejido adiposo, integrado fundamentalmente por triglicéridos, y
lípidos de membranas celulares compuestos por lípidos polares y colesterol.
Un procedimiento para la determinación de lípidos a partir de muestras animales o

vegetales se basa en la digestión de la muestra en ácido concentrado que
hidroliza y disuelve componentes proteicos, en tanto que los lípidos que se
separan puede ser extraídos mediante el uso de solventes orgánicos no polares,
como una mezcla de éter etílico-éter de petróleo.
Espátula, pipetas graduadas de 5 y 10 mL, termómetro, pipetas Pasteur, vaso de
precipitado de 5 mL, desecadoras. Balanza analítica, baño de temperatura

controlada, centrifuga, plancha de calentamiento, estufa de convección. HCl 6M,

metanol, éter de petróleo, NaCl 30%.
Metodología
1. Pesar 1 g de una muestra picada de un tejido o alimento y colocarla en un
tubo de ensayo con tapón, adicionar 5 mL HCl 6M y 5 mL de metanol, mezclar y
tapar los tubos. Efectuar la determinación por triplicado.
2. Calentar en baño de agua a 70 C por 30 minutos.
3. Enfriar el digerido a temperatura ambiente y adicionar 10 mL de éter de
petróleo, agitar, añadir 5 ml de NaCl 30%, reposar y centrifugar la mezcla (3000
rpm, 10 min.) para separar la capa orgánica con el extracto lipídico.
4. Remover con pipeta Pasteur la capa de éter con el extracto lipídico y
colocarla en un tubo de ensayo limpio y seco.
5. Medir un volumen conocido (5 mL) de la solución del extracto y colocarlo en
un vaso de precipitado o vial de 10 mL a peso constante, evaporar el solvente a 60
C en la campana de extracción. Colocar el recipiente + extracto de lípidos en
estufa de convección a 60 C hasta peso constante, enfriar en desecador y pesar
los lípidos.
% Lípidos = (Peso del extracto /peso de muestra*) x 100
6. * Peso de muestra correspondiente al volumen evaporado del extracto.
Resultados
 Contenido de lípidos (g/100 g) en los tejidos analizados.
 Contenido de lípidos que se reportan en la literatura para el tipo de muestra
analizada.
Conclusiones
manera individual.

Cuestionario
1. ¿Qué rutas puede seguir el acil graso que se forma en el citosol?
2. ¿Nombre de la ruta metabólica que da lugar a la síntesis del colesterol?
3. ¿Función del ácido pantotenico?
4. ¿Ejemplo de un esterol presente en plantas?
Bibliografía
Robinson, J.E., Singh, R., Kays, S.E., 2008. Evaluation of an automated

hydrolysis and extraction method for quantification of total fat, lipid classes
and trans fat in cereal products. Food Chemistry 107, 1144–1150.

Serwata, R.D., 2007. Nutritional evaluation of rendered animal by- products and
blends as suitable partial alternatives for fish meal in diets for rainbow trout
(Oncorhynchus mykiss). Thesis MPhil, University of Stirling, Stirling,
Scotland. Chapter 2: General materials and methods. 2.9.1. Determination
of total lipid, p. 59.

PRÁCTICA # 10
EXTRACCIÓN Y DETERMINACIÓN DE PIGMENTOS FOTOSINTÉTICOS
Objetivo
Analizar el tipo y contenido de pigmentos fotosintéticos presentes en un vegetal,
para estimar la relación con funciones metabólicas del organismo de estudio.
Introducción
Los pigmentos fotosintéticos (clorofilas, carotenoides, etc.) son fundamentales
para transformar la energía lumínica en energía química, por medio de la
fotosíntesis. En plantas superiores se encuentra, en su mayoría, la clorofila a
(PM=893.4) y en menor proporción la clorofila b (PM=907.4). La relación entre
ambas depende de las condiciones ambientales y de crecimiento. Una relación
(a/b) de 3-4 se espera en plantas que han crecido bajo altas intensidades de luz y
una relación de 2.5-3 se espera en plantas que han crecido con poca luz (sombra).
La diferencia entre las distintas clorofilas existentes (se conocen al menos siete
tipos) se encuentran en los sustituyentes que presentan; la clorofila a (verde
azulada) presenta un grupo metilo (-CH3) en el carbono 3, y la clorofila b (verde
amarillenta) contiene un grupo aldehído (-CHO) en la misma posición.
Figura 6. Estructura de la clorofila a y b

Los carotenoides, por su parte, pueden dividirse en dos grupos: (a) Carotenoides
sin oxígeno como los -carotenos; (b) Carotenoides que contienen oxígeno,
denominados xantofilas. Entre las xantofilas se encuentran la violaxantina,
anteraxantina, zeaxantina, entre otras.
Figura 8. Estructura de un β-caroteno
Los pigmentos vegetales en base a su solubilidad pueden dividirse en dos grandes

grupos: a) Solubles en agua: antocianinas y antoxantinas, que se encuentran en el
jugo vacuolar; b) Solubles en solventes orgánicos: clorofilas "a" y "b" y
carotenoides (rojo, naranja y amarillo), que se encuentran en las granas y
tilacoides de los cloroplastos. Son los responsables de la captación de la energía
luminosa en el proceso de la fotosíntesis. Las clorofilas poseen unas estructura
porfirínica, formada por cuatro anillos pirólicos con un átomo de magnesio en su
centro, un anillo de ciclopentanona y un éster de fitol unido a uno de los anillos de
pirrol que provee a la molécula de una cola lipófila.
Existen plantas que contienen solamente clorofila a, como las algas azules, las
diatomeas, las algas rojas y las pardas. Sin embargo muchas de ellas contienen
en los plastidios, pigmentos adicionales tales como otras clorofilas (c, d, e),
fucoxantinas (amarillo pardo) y ficocianina (azulado), que comunican sus
respectivos colores a las algas. Las clorofilas tienen típicamente dos picos de
absorción en el espectro visible, uno en el entorno de la luz azul (400-500 nm), y
otro en la zona roja del espectro (600-700 nm); sin embargo reflejan la parte media
del espectro, correspondiente al color verde (500-600 nm). Esta característica
origina que las clorofilas presenten un color verde, el cual se asocia con
organismos o tejidos que contienen cloroplastos activos en sus células.

Figura 9. Espectro de absorción de la clorofila a y b
Materiales y métodos:
Espátula, mortero, pipetas graduadas de 5 y 10 mL, tubos de ensaye con tapón,
pipetas Pasteur, placa de vidrio, micropipetas, cuba cromatográfica, regla. Balanza
analítica, centrifuga, estufa de convección. Mezcla de cloroformo-metanol-ácido
clorhídrico (20:10:0.1 v/v), HCl 1N, cloroformo, silica gel, mezcla de cloroformo-
metanol-ácido acético-H2O (50:37.5:3.5:2 v/v), cristales de yodo.
Metodología
1) Pesar 1 gramo de un vegetal fresco y macerar en un mortero con arena
calcinada hasta obtener una pasta homogénea.
2) Añadir 15 mL de acetona y mezclar al abrigo de la luz durante 5 minutos,
enseguida filtrar a través de papel filtro para remover sólidos de la solución con
pigmentos.
3) Centrifugar el filtrado a 3000 rpm durante 5 min para separar los restos de
arena y partículas en suspensión.
4) Medir el volumen del sobrenadante, tomar 1 mL en un tubo de ensayo y diluir
con 4 mL de acetona.
5) Medir el espectro de absorbancia de la solución en el intervalo de 380 a 700
nm.
6) Estimar el contenido de clorofila a, b y total en el tejido midiendo la absorbencia
(A) 645 y 663 nm y mediante el uso de las siguiente ecuaciónes:
Clorofila a (µg · mg-1) = (12.72 * A663) – (2.58* A645)

Clorofila b (µg · mg-1) = (22.87 * A645) – (4.67* A663)
Clorofila Total (a+b) (µg · mg-1) = (8.02 * A663) – (20.20* A645)
Resultados
 Espectro de absorción del extracto con pigmentos del vegetal.
 Tipo de pigmentos identificados en la muestra analizada.
 Contenido de clorofila a por g de peso fresco del vegetal.
Conclusiones
manera individual.
Cuestionario
1.- ¿Qué es un pigmento?
2.- ¿Menciona los diferentes tipos de pigmentos en las plantas?
3.- ¿Qué función cumplen los pigmentos en las plantas?

Bibliografía
Hagerthey, S.E., Louda, J.W., Mongkronsri, P., 2006. Evaluation of pigment
extraction methods and a recommended protocol for periphyton chlorophyll
a determination and chemotaxonomic assessment. Journal of Phycology
42, 1125-1136.
Schagerl, M., Künzl ,G., 2007. Chlorophyll a extraction from freshwater algae – a
reevaluation. Biologia 62(3), 270-275.
Vicente, E., De Hoyos, C., Sánchez, P., Cambra, J., 2005. Protocolos para el
muestreo y análisis para fitoplancton. Ministerio de Medio Ambiente,
Confederación Hidrográfica del Ebro, Zaragoza, pp. 25-27.


NORMAS GENERALES DE SEGURIDAD E HIGIENE
1. El uso de bata es obligatorio.

2. Antes de empezar el trabajo en el laboratorio tienes que familiarizarte con los
elementos de seguridad disponibles.
3. Es necesario localizar las salidas principales y de emergencia por si se diese el
caso de una evacuación por fuego o por cualquier otro incidente, así como
conocer la localización exacta de extintores, duchas de seguridad y duchas de
ojos.
4. Es obligatorio usar gafas de seguridad siempre que se requiera en el
laboratorio.
5. No usar lentes de contacto en el laboratorio, ya que en caso de accidente las
salpicaduras de productos químicos o sus vapores pueden pasar detrás de las
lentes y provocar lesiones en los ojos antes de poder retirar las lentes. En estos
casos es recomendable el uso de gafas graduadas o de gafas de seguridad
cerradas.
6. Sí un producto químico te salpica los ojos, utiliza inmediatamente una ducha de
ojos y lava completamente el ojo afectado durante 15 minutos sin interrupción.
Actúa siempre con urgencia, en menos de 10 segundos. No dirijas una corriente
de alta presión de agua de un grifo directamente al ojo porque podrías lesionarlo.
Informa al encargado del laboratorio de lo que ha sucedido y si es necesario pide
asistencia médica.
7. El uso de bata (preferentemente de algodón) es obligatorio, ya que por mucho
cuidado que se tenga al trabajar, las salpicaduras de productos químicos son
inevitables.
8. Así mismo se recomienda llevar zapatos cerrados y no sandalias.
9. No comer ni beber en el laboratorio, ya que hay la posibilidad de que los
alimentos o bebidas se hayan contaminado con productos químicos.
10. Los recipientes del laboratorio nunca deben utilizarse para el consumo y
conservación de alimentos y bebidas; tampoco las neveras u otras instalaciones
destinadas al empleo en los laboratorios.
M.C. Joel Díaz Martínez Página III

11. Lavarse siempre las manos después de hacer cualquier análisis y antes de
salir del laboratorio.
12. Procure quitarse la bata hasta que salga del laboratorio.
13. Está prohibido fumar en el laboratorio por razones higiénicas y de seguridad.
14. No inhales, pruebes o huelas productos químicos si no estás debidamente
informado.
15. Cerrar herméticamente los frascos de productos químicos después de
utilizarlos.
16. Para pipetear los líquidos utilice siempre una bombilla pipeteadora, no
absorber directamente con la boca.
17. Cuando caliente tubos de ensaye hágalo siempre en la parte superior del
líquido y con agitación suave, nunca por el fondo del tubo, y debe estar inclinado y
no apuntar hacia ninguna persona.
18. No deben transportarse innecesariamente los reactivos de un sitio para otro
del laboratorio. Sí tuviese que hacerlo, tenga cuidado con las botellas, las cuales
deben ser siempre transportadas cogiéndolas por el fondo, nunca por la boca de la
botella.
19. El área de trabajo tiene que mantenerse siempre limpia y ordenada, sin libros,
abrigos, bolsas, productos químicos vertidos.
20. La conducta en el laboratorio debe ser seria, sin bromas, sin correr, jugar,
empujar, gritar, etc.
21. No se puede hacer ningún experimento no autorizado.
22. No utilices nunca un equipo o aparato sin conocer perfectamente su
funcionamiento.
23. No utilices material de cristal en mal estado ya que aumenta el riesgo de
accidentes.
24. El material y los aparatos utilizados tienen que dejarse siempre limpios y en
perfecto estado de uso.
25. Todos los productos químicos tienen que ser manejados con mucho cuidado
de acuerdo con las Hojas de Seguridad de cada una de las sustancias.
M.C. Joel Díaz Martínez Página IV

26. No inhales los vapores de productos químicos y trabaja siempre en vitrinas

extractoras, especialmente cuando manipules productos tóxicos, irritantes,
corrosivos o lacrimógenos.
M.C. Joel Díaz Martínez Página V

MEDIDAS GENERALES EN CASO DE ACCIDENTE
Plan general de emergencia
 Dar la alarma.
 Ponerse a salvo.
 Ayudar a las personas.
 Luchar contra el fuego.
 Avisar al responsable del departamento.
 Evacuación del edificio en caso necesario.
 Avisar a ambulancias, bomberos.
Fuego en el laboratorio
 Evacuar el laboratorio, por pequeño que sea el fuego, por la salida principal o
por la salida de emergencia, sí la principal está bloqueada.
 Avisar a todos los compañeros de trabajo sin que se extienda el pánico y
conservando siempre la calma.
 Sí el fuego es pequeño y localizado, apagarlo utilizando un extintor adecuado,
arena cubriendo el fuego con un recipiente de tamaño adecuado que lo
ahogue.
 Retirar los productos químicos inflamables que estén cerca del fuego. No
utilices nunca agua para extinguir un fuego provocado por la inflamación de un
disolvente.
 Para fuegos grandes aislar el fuego, utilizar los extintores adecuados, sí el
fuego no se puede controlar rápidamente accionar la alarma de fuego, avisar al
servicio de extinción de incendios y evacuar el edificio.
Fuego en el cuerpo
 Sí se te incendia la ropa, pide inmediatamente ayuda.

 Estírate en el suelo y rueda sobre ti mismo para apagar las llamas.
 No corras ni intentes llegar a la ducha de seguridad si no es que está muy
cerca de ti.
 Es tu responsabilidad ayudar a alguien que se está quemando, cúbrele con
una manta anti-fuego, condúcele hasta la ducha de seguridad, si está cerca,
hazle rodar por el suelo, no utilices nunca un extintor sobre una persona.
M.C. Joel Díaz Martínez Página VI

 Una vez apagado el fuego, mantén a la persona tendida, procurando que no

coja frío y proporciónale asistencia médica.
Quemaduras
 Las pequeñas quemaduras producidas por material caliente, baños, placas,

etc., se tratarán lavando la zona afectada con agua fría durante 10-15 minutos.
 Las quemaduras más graves requieren atención médica inmediata.
 No utilices cremas y pomadas grasas en las quemaduras graves.
Cortes
 Los cortes producidos por la rotura de material de cristal son un riesgo común
en el laboratorio.
 Las cortadas se tienen que lavar bien, con abundante agua corriente, durante
10 minutos como mínimo.
 Sí la cortada es pequeña y deja de sangrar en poco tiempo, lávala con agua y
jabón y tápala con una venda.
 Sí la cortada es grande y no deja de sangrar, requiere de asistencia médica
inmediata.
Derrame de productos químicos sobre la piel
 Los productos químicos que se hayan vertido sobre la piel han de ser lavados
inmediatamente con agua corriente abundantemente, como mínimo durante 15
minutos.
 Las duchas de seguridad instaladas en los laboratorios serán utilizadas en
aquellos casos en que la zona afectada del cuerpo sea grande y no sea
suficiente el lavado en una pila.
 Es necesario sacar toda la ropa contaminada de la persona afectada lo antes
posible mientras esté bajo la ducha.
 Recuerda que la rapidez en el lavado es muy importante para reducir la
gravedad y la extensión de la herida.
 Proporcionar asistencia médica a la persona afectada.
M.C. Joel Díaz Martínez Página VII

Corrosiones en la piel por ácidos y álcalis
 Cuando ocurre una corrosión por ácidos, corta lo más rápidamente posible la
ropa, lave con agua abundantemente la zona afectada, neutralice la acidez con
bicarbonato de sodio durante 15-20 minutos, sacar el exceso de pasta
formada, seca y cubra la parte afectada con linimento óleo-calcáreo o parecido.
 Cuando se produce una corrosión por álcalis, lave la zona afectada
abundantemente con agua corriente y aclárala con una disolución de ácido
acético al 1%, seca y cubre la zona afectada con una pomada de ácido tánico.
Corrosiones en los ojos
 En este caso el tiempo es esencial (menos de 10 segundos), cuanto antes se

lave el ojo, menos grave será el daño producido.
 Lava los dos ojos con agua corriente abundantemente durante 15 minutos
como mínimo en una ducha de ojos, y, si no hay, con un frasco de lavar los
ojos.
 Es necesario mantener los ojos abiertos con la ayuda de los dedos para
facilitar el lavado debajo de los párpados.
 Es necesario recibir asistencia médica, por pequeña que parezca la lesión.
Ingestión de productos químicos
 Antes de cualquier actuación pide asistencia médica.
Sí el paciente está inconsciente, ponerlo en posición lateral de seguridad, con la

cabeza de lado, y estirarle la lengua hacia fuera.
M.C. Joel Díaz Martínez Página VIII

Manual de Prácticas de Laboratorio de Bioquímica

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INSTITUTO TECNOLÓGICO SUPERIOR DE

MANUAL DE PRÁCTICAS PROPUESTO PARA:

Elaboró: M.C. Joel Díaz Martínez

Las reacciones Químicas en Bioquímica ................................................................ 1

Normas Generales de Seguridad e Higiene ........................................................... III

Este manual está estructurado como material didáctico de apoyo para

actividades de laboratorio de estudiantes que cursan la asignatura de Bioquímica,

M.C. Joel Díaz Martínez Página I

UBICACIÓN DENTRO DEL MAPA CURRICULAR

M.C. Joel Díaz Martínez Página II

M.C. Joel Díaz Martínez Página 1

bitácora. Agregue al agua 5 mL de H2SO4 concentrado, mida la temperatura cada

2. Coloque 50 mL de agua en un vaso de precipitado, y al igual que en el

3. Coloque 5 g de K2Cr2O7 en 50 mL de agua caliente. Disuelva, deje enfriar

2. Coloque 100 ml de agua en un vaso de precipitado. Mida su temperatura inicial.

2. Los organismos vivos se clasiﬁcan en poiquilotermos y homeotermos. ¿Cuál es

M.C. Joel Díaz Martínez Página 2

3. Indique de sus observaciones en la vida diaria, cuáles experiencias podría

Lehninger A, Nelson DL, Cox M (1997). “Principles of Biochemistry”, Worth

M.C. Joel Díaz Martínez Página 3

M.C. Joel Díaz Martínez Página 4

b: longitud que atraviesa el haz de luz , en cm,

La ley de Beer-Lambert establece que la absorbencia es proporcional a la

Hay tres aplicaciones fundamentales de esta técnica en determinaciones

M.C. Joel Díaz Martínez Página 5

Tabla 1. Curva de calibración de albúmina.

M.C. Joel Díaz Martínez Página 6

 Contenido de proteína soluble en solución de concentración desconocida.

3. Definir que es la espectrofotometría y en que se basa

4. Definir que es la espectroscopia y cuál es su fundamento

5. Mencione los principales componentes de un espectrofotómetro

M.C. Joel Díaz Martínez Página 7

laboratorio de Ingeniería en Industrias Alimentarias. Los residuos no considerados

Jacques-Silva, M.C., Rocha, J.B.T., 2000. Protein measurement at PRÁCTICAl

Prats, M., 1989. Tools in spectrophotometry and differential spectrophotometry.

M.C. Joel Díaz Martínez Página 8

M.C. Joel Díaz Martínez Página 9

la intensidad del color es proporcional al total de enlaces peptídicos que participan

La reacción de biuret es la base de un método colorimétrico simple y rápido para

Figura 1. Complejo de biuret

M.C. Joel Díaz Martínez Página 10

2. La estructura de un aminoácido está formado por:

3. ¿Qué quiere decir que los aminoácidos poseen un carácter anfótero?

4. La estructura secundaria de una proteína es:

M.C. Joel Díaz Martínez Página 11

M.C. Joel Díaz Martínez Página 12

M.C. Joel Díaz Martínez Página 13

menos soluble y más fácilmente precipita, esto se atribuye a que probable

1. Preparar una serie de tubos de acuerdo a la siguiente tabla:

M.C. Joel Díaz Martínez Página 14

2) Agitar los tubos y observar la presencia o ausencia de turbidez en la mezcla

2. ¿Coincide con el pKa reportado en los libros?

3. ¿Cómo se podría confirmar la identidad del aminoácido?

M.C. Joel Díaz Martínez Página 15

4. Dibujar la curva que se esperaría en la titulación del ácido aspártico y la que

Harris, D.C., 2007. Análisis Químico Cuantitativo. 6ª ed., Editorial Reverté,

Instituto Politécnico Nacional, 2013. Manual de Laboratorio de Bioquímica

M.C. Joel Díaz Martínez Página 16

Morris, J., G. 1975. Fisicoquímica para Biólogos. 2ª ed., Editorial Reverté,

M.C. Joel Díaz Martínez Página 17

M.C. Joel Díaz Martínez Página 18

Las reacciones catalizadas por enzimas, generalmente presentan una

Figura 1. Representación de la cinética de Michaelis-Menten.