Guia de Practicas Microbiologia Farmacéutica

UNIVERSIDAD ALAS PERUANAS
FILIAL AREQUIPA
FACULTAD DE MEDICINA HUMANA Y CIENCIAS DE
LA SALUD
ESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y
BIOQUÍMICA
GUÍA DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA
FARMACÉUTICA
MG. YANET BERTHA ROJAS AZCUE
AREQUIPA – 2019
PRÁCTICA N° 01-A
MEDIOS DE CULTIVO
INTRODUCCIÓN
Un medio de cultivo es aquella solución que contiene los nutrientes

necesarios para recuperar, multiplicar, aislar e identificar los
microorganismos bajo las condiciones favorables de temperatura y
pH.
1 OBJETIVOS
 Conocer la preparación de medios de cultivo, así como las
condiciones óptimas para su crecimiento
 Identificar y describir los medios de cultivo más utilizados en
microbiología.
 Realizar diferentes métodos de siembra de microorganismos
2 FUNDAMENTO TEÓRICO
La adecuada preparación de los medios de cultivo es de gran

importancia sin embargo se ve afectada por una serie de factores:
 Disponibilidad de nutrientes adecuados: Un medio de cultivo adecuado
para la investigación microbiológica ha de contener como mínimo,
carbono, nitrógeno, azufre, fósforo y sales inorgánicas. En muchos
casos serán necesarias ciertas vitaminas y otras sustancias inductoras
del crecimiento. Todas estas sustancias se suministraban
originalmente en forma de infusiones de carne, extractos de carne o
extractos de levadura. Sin embargo, la preparación de estas sustancias
para su aplicación a los medios de cultivo provocaba la pérdida de los
factores nutritivos lábiles. Actualmente, la forma más extendida de
aportar estas sustancias a los medios es utilizar peptona que, además,
representa una fuente fácilmente asequible de nitrógeno y carbón ya
que la mayoría de los microorganismos, que no suelen utilizar
directamente las proteínas naturales, tienen capacidad de atacar los
aminoácidos y compuestos más simples de nitrógeno presentes en la
peptona. Ciertas bacterias tienen necesidades nutritivas específicas
por lo que se añaden sustancias como suero, sangre, etc. Igualmente
pueden ser necesarios ciertos carbohidratos y sales minerales como
las de calcio, magnesio, manganeso, sodio o potasio y sustancias
promotoras del crecimiento, generalmente de naturaleza vitamínica.
Muy a menudo se añaden al medio de cultivo ciertos colorantes, bien
como indicadores de ciertas actividades metabólicas o bien por sus
capacidades de actuar como inhibidores selectivos de ciertos
microorganismos.
 Consistencia adecuada del medio: Partiendo de un medio líquido
podemos modificar su consistencia añadiendo productos como
albúmina, gelatina o agar, con lo que obtendríamos medios en estado
semisólido o sólido. Los medios solidificados con gelatina tienen el gran
inconveniente de que muchos microorganismos no se desarrollan
adecuadamente a temperaturas inferiores al punto de fusión de este
solidificante y de que otros tienen la capacidad de licuarla. Actualmente
los medios sólidos son de uso universal, por su versatilidad y
comodidad, pero hay también gran cantidad de medios líquidos cuyo
uso está ampliamente extendido en el laboratorio.
 Presencia (o ausencia) de oxígeno y otros gases: Gran cantidad de
bacterias pueden crecer en una atmósfera con tensión de oxígeno
normal. Algunas pueden obtener el oxígeno directamente de variados
sustratos. Pero los microorganismos anaerobios estrictos sólo se
desarrollarán adecuadamente en una atmósfera sin oxígeno ambiental.
En un punto intermedio, los microorganismos microaerófilos crecen
mejor en condiciones atmosféricas parcialmente anaerobias (tensión
de oxígeno muy reducida), mientras los anaerobios facultativos tienen
un metabolismo capaz de adaptarse a cualquiera de las citadas
condiciones.
 Condiciones adecuadas de humedad: Un nivel mínimo de humedad,
tanto en el medio como en la atmósfera, es imprescindible para un buen
desarrollo de las células vegetativas microbianas en los cultivos. Hay
que prever el mantenimiento de estas condiciones mínimas en las
estufas de cultivo a 35-37 ºC cuando sea necesario que mantenga la
humedad necesaria para el crecimiento de los cultivos y evitar así que
se deseque el medio.
 Luz ambiental: La mayoría de los microorganismos crecen mucho
mejor en la oscuridad que en presencia de luz solar. Hay excepciones
evidentes como sería el caso de los microorganismos fotosintéticos.
 pH: La concentración de iones hidrógeno es muy importante para el
crecimiento de los microorganismos. La mayoría de ellos se desarrollan
mejor en medios con un pH neutro, aunque los hay que requieren
medios más o menos ácidos. No se debe olvidar que la presencia de
ácidos o bases en cantidades que no impiden el crecimiento bacteriano
pueden sin embargo inhibirlo o incluso alterar sus procesos
metabólicos normales.
 Temperatura: Los microorganismos mesófilos crecen de forma óptima
a temperaturas entre 15 y 43 ºC. Otros como los psicrófilos crecen a 0º
C y los temófilos a 80º C o incluso a temperaturas superiores
(hipertemófilos). En líneas generales, los patógenos humanos crecen
en rangos de temperatura mucho más reducidos, alrededor de 37º C,
y los saprófitos desarrollan en rangos más amplios.
 Esterilidad del medio: Todos los medios de cultivo han de estar
perfectamente estériles: - para evitar la aparición de formas de vida que
puedan alterar, enmascarar o incluso impedir el crecimiento microbiano
normal del o de los especímenes inoculados en dichos medios. - para
que el resultado obtenido sea el correspondiente al nivel de
contaminación de la muestra a analizar.
Clasificación:
a) Según su consistencia (estado físico):
Los medios de cultivo pueden ser líquidos, sólidos o semisólidos.
 Medios líquidos: Como se presentan en ese estado son llamados
también caldos.
 Medios sólidos: Se preparan a través de medios líquidos
agregándoles un agente gelificante. Los más utilizados con la
gelatina y el agar. La gelatina es una proteína animal obtenida de
los huesos. Tiene la limitación de que es hidrolizada por muchas
bacterias y porque su punto de fusión es bajo. El agar agar es un
polímero de azúcares obtenido de algas marinas. Es una molécula
insoluble en agua fría pero soluble en agua caliente. Una solución
de 1,5 % forma un gel firme entre 32 y 39 °C.
 Medios semisólidos: Se preparan a partir de los medios líquidos
agregándoles un agente solidificante en una proporción menor que
para preparar medios sólidos. Uno de sus principales usos es para
la investigación de la movilidad de los microorganismos. Poseen
0,15 % de agar.
b) Según su utilización:
Los medios de cultivo pueden clasificarse en medios comunes, medios de
enriquecimiento, selectivos, diferenciales, de identificación, de
conservación y de transporte.
 Medios comunes: Son aquellos que poseen los componentes
mínimos para que pueda producirse el crecimiento de
microorganismos que no necesiten requerimientos especiales. El
más conocido es el agar nutritivo o agar común, resultante de la
adición de agar al caldo nutritivo.
 Medios de enriquecimiento: Son aquellos que, además de las
sustancias nutritivas normales, incorporan una serie de factores
indispensables para el crecimiento de microorganismos exigentes o
fastidiosos. Este enriquecimiento se hace por agregado de por
ejemplo: sangre, leche, bilis, huevo, et.
 Medios selectivos: Son aquellos utilizados para favorecer el
crecimiento de ciertas bacterias inhibiendo el desarrollo de otras, ya
que poseen una sustancia inhibitoria. Ejemplo: el agar Mac Conkey
posee sales biliares y cristal violeta que inhiben las bacterias gram
positivas.
 Medios diferenciales: Se utilizan para poner en evidencia
características bioquímicas que ayuden a diferenciar géneros o
especies. Contienen compuestos químicos o indicadores sobre los
que determinados microorganismos adquieren coloraciones
específicas o reaccionan de una manera determinada. Ejemplo: el
agar EMB tiene eosina y azul de metileno que nos permite
diferenciar Escherichia coli la cual forma colonias verdes (con brillo
metálico a la luz reflejada), de otras enterobacterias que forman
colonias de color rosa salmón.
 Medios de identificación: Son aquellos que se utilizan para poner en
evidencia alguna cualidad bioquímica que nos permite reconocer la
identidad de un microorganismo. Ejemplo: el Agar Kligler que
permite determinar la capacidad de un microorganismo de atacar
un hidrato de carbono específico, con producción o no de gas, junto
con la posible producción de ácido sulfhídrico.
 Medios de conservación: Se utilizan para conservar una cepa
microbiana.
 Medios de transporte: Se usan por ejemplo para el transporte de
muestras clínicas e hisopos que fueron utilizados en el control de
superficies que no pueden sembrarse inmediatamente. Ejemplo:
medio Cary Blair el cual es especialmente útil para la búsqueda de
Vibrio spp. a partir de muestras rectales.
c) Según su composición:
Los medios de cultivo pueden ser complejos o indefinidos, sintéticos o
definidos, o semisintéticos:
 Medios complejos o indefinidos: Son aquellos cuya composición
química exacta se desconoce ya que son el producto de realizar
infusiones y extractos de materiales naturales complejos. Son
medios muy ricos nutricionalmente aunque indefinidos
químicamente. Ejemplo: digeridos de extracto de carne o
extracto de levadura.
 Medios sintéticos o definidos: Son aquellos que contienen en su
composición exclusivamente sustancias químicas conocidas y
disueltas en agua en proporciones determinadas, resultando un
medio de composición perfectamente definida.
 Medios semisintéticos: Es una mezcla de los medios anteriores.
Llevan algunas sustancias químicas cuya naturaleza y cantidad
conocemos, junto con sustancias de naturaleza y composición
indefinidas.
d) Según su origen:
Los medios de cultivo pueden clasificarse en naturales, sintéticos o
semisintéticos
 Naturales: Son los preparados a partir de sustancias naturales
de origen animal o vegetal. Ejemplo: extracto de tejidos o
infusiones cuya composición química no se conoce
exactamente.
 Sintéticos: Son los que contienen una composición química cuali
y cuantitativamente definida. Se utilizan para obtener resultados
reproducibles.
 Semisintéticos: Son los medios sintéticos a los cuales se les
agregan factores de crecimiento bajo una forma de extracto
orgánico complejo, como por ejemplo extracto de levadura.

3 MATERIALES, INSTRUMENTOS, REACTIVOS
4 PROCEDIMIENTO
4.1. PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO
 Los medios de cultivo comercialmente disponibles se presentan
como polvos deshidratados, estériles y deben ser conservados
en sus frascos originales con la tapa fuertemente ajustada.
 Antes de preparar cualquier medio se debe leer cuidadosamente
el rótulo del envase y fijarse la fecha de vencimiento.
 Deben prepararse empleando material de vidrio limpio y seco.
 Se calcula la cantidad de polvo, de acuerdo a las instrucciones
del rótulo del envase y el volumen total que se desee preparar.
 Se pesa sobre papel de aluminio y se vuelca en el recipiente en
el que será preparado (debe ser un recipiente graduado, caso
contrario se medirá el volumen de líquido en otro recipiente
auxiliar limpio y graduado).
 Se le va agregando el agua destilada y se agita vigorosamente
hasta obtener una suspensión o solución (si es caldo)
homogénea. Los caldos suelen dar soluciones transparentes
que no necesitan calentamiento ni ninguna otra manipulación
antes de ser llevados a la autoclave.
 Las soluciones con agar sin embargo, requieren calentamiento
casi hasta ebullición con agitación constante y a fuego suave (o
a Baño María o microondas) para lograr su solubilización
completa. Se debe observar con cuidado la solución durante el
calentamiento ya que una vez que aparecieron las primeras
burbujas tiende a desbordar por ebullición.
 Luego los medios se dosifican teniendo en cuenta el uso que se
les dará. Los tubos que contengan estas soluciones que serán
esterilizadas en autoclave deben contener sólo dos terceras
partes de su volumen total ocupado por el líquido para evitar
desbordes.
 Así preparadas las soluciones deben esterilizarse en autoclave
(15 minutos a 121 ºC).
 Una vez retirados del autoclave, los medios deben dejarse
enfriar y conservarse así refrigerados.
 Si van a ser utilizados en el momento se colocarán en un baño
de agua a 55 ºC para que se enfríen antes de verterlos sobre las
placas. Si sobre la superficie de una placa recién preparada
aparecieran burbujas, éstas pueden eliminarse al pasar
rápidamente la llama del mechero de Bunsen sobre la superficie
del agar.
 Para homogeneizar el medio agitar tomando el envase desde el
cuello del erlenmeyer, evitar las varillas de vidrio.
4.2. MÉTODOS DE SIEMBRA
Sembrar: Es el acto de colocar el material bacteriológico en el medio
de cultivo para promover su crecimiento y desarrollo, y subsiguiente
multiplicación.
Existen diferentes tipos de siembra de acuerdo al medio utilizado y los
requerimientos del microorganismo a estudiar.
Medios sólidos:
 Siembra por inmersión: se coloca el inóculo en una placa o caja de Petri
y sobre el mismo se vierte el medio de cultivo previamente fundido.
Este método se utiliza para microorganismos aerobios.
 Siembra en doble capa: se procede de la misma manera que por
inmersión. Una vez solidificado el medio se vierte una cantidad extra
de medio necesaria para cubrir la capa anterior (generalmente 10 ml.
aprox.). Este método se utiliza para microorganismos anaerobios
facultativos y microaerofílicos.
 Siembra en superficie: se vierte sobre una placa de Petri el medio de
cultivo fundido, se deja solidificar y se coloca sobre la superficie el
inóculo. Con ayuda de una espátula de Drigalsky se extiende el inóculo
hasta su absorción total por el medio de cultivo. Este tipo de siembra
se recomienda para microorganismos aerobios estrictos.
 Siembra en estría: se vierte sobre una placa de Petri el medio de cultivo
fundido y se deja solidificar. Existen distintas técnicas para la siembra
en estrías, el objeto es obtener colonias aisladas
Técnica A Consiste en cargar el asa con la muestra y hacer estrías
paralelas en la cuarta parte de la superficie de la placa, se quema el
asa, se enfría, se gira la placa a 90° y se vuelve a estriar tocando 3 o 4
veces el área sembrada inicialmente y cubriendo otro cuarto de la
placa. Por último, sin quemar el asa, se estría el resto de la superficie
sin sembrar.
Técnica B Con el asa cargada se hacen 3 o 4

estrías; se quema el asa, se hacen 3 o 4 estrías
perpendiculares a las anteriores, se quema el
asa y se repite el procedimiento hasta
agotar la superficie de la placa.
 Siembra en agar en tubo inclinado o bisel:

en este caso se colocan 5 ml de medio de cultivo fundido y
estéril, se inclina el tubo y se deja enfriar.
El inóculo se siembra, con ayuda de asa, de la siguiente manera:
a) En profundidad con asa de punta: se pica con el asa el cultivo a
sembrar y se introduce mediante punción en el medio contenido en la
parte inferior del tubo.
b) En superficie con asa de aro:

se pica con el ansa el
cultivo a sembrar y se esparce el mismo sobre la superficie en bisel en
forma de zigzag
5 CONCLUSIONES
6 RECOMENDACIONES
7 BIBLIOGRAFÍA
CUESTIONARIO
1.- Haga los cálculos para preparar 100 ml de los siguientes medios de cultivo:
- Manitol salado - Agar sangre - EMB
Indicar en cada caso para que tipo de microorganismo está indicado, el
fundamento del medio de cultivo y condiciones de preparación.
2.- Haga un cuadro mencionando 15 microorganismos de importancia clínica
indicando los medios de cultivo apropiados y la interpretación de los
resultados.
3. ¿En qué momento se esteriliza un medio de cultivo y por qué?
4. ¿Cuál es el medio de cultivo elegido para el aislamiento de Staphylococcus
aureus? Diga la composición y clasifíquelo de acuerdo a su origen,
composición y consistencia.
5. ¿Todos los medios de cultivo se autoclavan? Mencione 3 ejemplos en caso
contrario, indicar las condiciones.
PRÁCTICA N° 01-B
RECONOCIMIENTO E IDENTIFICACIÓN FAMILIA MICROCOCCACEAE
I OBJETIVOS
 Realizar pruebas de identificación de la familia Micrococcaceae
 Reconocer características microscópicas, y pruebas de
identificación del género Staphylococcus.
II FUNDAMENTO TEÓRICO
La Familia Micrococcaceae comprende cocos Gram positivos, no
exigentes, catalasa positivos, con agrupación en racimos, aerobios o
anaerobios facultativos. De los tres géneros que la integran,
Micrococcus, Planococcus y Staphylococcus, este último es el único de
importancia médica. Se caracteriza por ser aerobio anaerobio
facultativo, capaz de fermentar la glucosa en anaerobiosis; poseer
ácidos teicoicos en su pared, y ser sensible a la enzima lisostafina.
Dentro del género Staphylococcus se conocen más de 20 especies, de
las cuales S. aureus es la más importante. Otras especies como S.
epidermidis y S. saprophyticus son actualmente reconocidas como
capaces de actuar como patógenos bajo determinadas circunstancias.
En la actualidad el género Staphylococcus y, en especial, la especie
tipo S. aureus tiene una alta incidencia como agente de infección, tanto
en la comunidad como a nivel hospitalario. Es la primera como agente
de infecciones, desde superficiales como el forúnculo, a profundas
como osteomielitis, neumonía y endocarditis aguda. A nivel nosocomial
se destaca como primer agente de infección de heridas operatorias y
de prótesis. Asimismo, S. aureus es capaz de causar cuadros
TOXICOS por producción de potentes exotoxinas tales como
intoxicación alimentaria, síndrome de piel escaldada y shock tóxico.
Además cabe destacar la gran capacidad de adaptación y
supervivencia de esta bacteria, su aumento progresivo de resistencia a
los antimicrobianos, en especial en el medio hospitalario, que plantea
serios problemas epidemiológicos y terapéuticos.
El diagnóstico microbiológico de una infección por Staphylococcus
aureus no plantea mayores problemas dada la naturaleza poco
exigente del agente y su acción enzimática característica. En el
precedente caso, dos son los lugares de donde se aísla el germen: en
primer lugar, del foco infeccioso, mediante estudio del pus, extraído con
jeringa o hisopo En 2º lugar, luego de la etapa de diseminación, de la
sangre del paciente, mediante la técnica del hemocultivo. En el primer
caso, el cultivo se hará sembrando directamente la muestra clínica
(pus) en una placa de medio sólido; en el segundo la muestra (sangre)
se enriquecerá previamente en un medio líquido en frasco de
hemocultivo, y a las 24 horas se sembrará 0,5 cc de este medio en una
placa. En ambos casos se observará el desarrollo de colonias con las
características de forma, consistencia, color, olor y hemólisis propios
del estafilococo. Un Gram de las colonias confirma que se trata de
cocos Gram positivos en racimo. El test de catalasa servirá para
ubicarlo dentro de la familia Micrococcaceae; y una prueba de
coagulasa hará diagnóstico de especie de Staphylococcus aureus con
mucha aproximación. Para su confirmación definitiva, deberá hacerse
la prueba de coagulasa lenta en tubo y/o la de producción de DNAsa o
termonucleasa, lo que demora otras 24 horas. Actualmente hay
disponibles tests de aglutinación de partículas de látex cubiertas de IgG
que diagnostican con mucha especificidad S. aureus en base a la
propiedad de la Proteína A de esta bacteria de aglutinar la IgG .
III MATERIALES, REACTIVOS, INSTRUMENTOS
IV PROCEDIMIENTO
1. PRUEBA DE LA CATALASA
Objetivo: Separar la Familia. Micrococacceae (catalasa +) de los
Géneros Streptococcus y Enterococcus (catalasa -).
Fundamento: La enzima catalasa descompone el peróxido de
hidrógeno (H2O2) en agua y oxígeno bajo la fórmula
2 H2O2 2 H2O + O2.
De esta manera las bacterias se protegen del efecto tóxico del H2O2,
que es un producto final del metabolismo aerobio de los azúcares.
Procedimiento: Se coloca una gota de H2O2 al 3% sobre un
portaobjetos y luego se transfiere una porción de colonia sobre el H 2O2
realizándose una emulsión. En lo posible debe tomarse la colonia a
partir de un medio sin sangre ya que los eritrocitos tienen actividad de
catalasa y pueden falsear los resultados. Esta prueba también puede
realizarse en un aislamiento en tubo, simplemente colocando unas
gotas de H2O2 dentro del mismo.
Interpretación de resultados: El desprendimiento de burbujas se
considera una prueba positiva. Dentro de la Familia. Micrococacceae
existen 4 géneros, el de mayor importancia clínica es el Género
Staphylococcus. Dentro del G.Staphylococcus existen 3 especies de
importancia clínica: S.aureus, S.saprophyticus y S.epidermidis. Estas
se diferencias según las pruebas bioquímicas.
2. PRUEBA DE LA COAGULASA
Objetivo: Permite separar S.aureus, que posee coagulasa, de las otras
especies de estafilococos que genéricamente se denominan coagulasa
negativos.
Fundamento: S.aureus posee dos tipos de coagulasa:
a. Una endocoagulasa o coagulasa ligada o "clumping factor" que está
unida a la pared celular. Esta actúa directamente sobre el
fibrinógeno provocando la formación de coágulos o grumos cuando
se mezcla una suspensión bacteriana con plasma citratado (test en
lámina).
b. Una exocoagulasa o coagulasa libre que actúa mediante la
activación de un factor (CRF), formándose un complejo coagulasa-
CRF, el cual reacciona con el fibrinógeno produciéndose un coágulo
de fibrina (test en tubo).
3. PRESENCIA DE DESOXIRRIBONUCLEASA (DNAsa)
Objetivo: Permite diferenciar S.aureus que es la única especie dentro
del Género Staphylococcus que posee DNAsa de las otras especies.
Fundamento: Se basa en la presencia de la enzima termoestable
DNAsa que es capaz de clivar los enlaces fosfodiester internos de la
molécula de DNA. Se utiliza un medio sólido que contiene verde de
metilo el cual se combina con DNA altamente polimerizado. Cuan-do la
combinación no ocurre, por acción de la enzima DNAsa, se produce
una decoloración del medio. Procedimiento: Se siembra una colonia de
estafilococo en forma de moneda en una placa de medio sólido que
contiene DNA y verde de metilo. Se incuba 18 horas a 35º.
Interpretación de resultados: La formación de un halo transparente
alrededor de la siembra indica presencia de DNAsa.
4. SUSCEPTIBILIDAD A LA NOVOBIOCINA
Objetivo: Separar S.saprophyticus (resistente a la novobiocina) de los
demás estafilococos coagulasa negativos.
Fundamento: Varias especies del Género Staphylococcus son
resistentes a la novobiocina (disco de 5 µg).
Procedimiento: Se siembra una placa de agar sangre con un hisopo
embebido en una suspensión de la cepa a estudiar. Luego se aplica el
disco de novobiocina y se incuba a 35º por 18 horas. Interpretación de
resultados: Un halo de inhibición de crecimiento menor o igual a 16mm
corresponde a S.saprophyticus. Un halo de inhibición mayor de 16mm
corresponde a otros estafilococos coagulasa negativos.
5. SIEMBRA EN AGAR MANITOL SALADO
Sembrar en placas con Manitol salado, que es un medio de cultivo
selectivo y diferencial utilizado para el aislamiento y diferenciación de
Staphylococcus a partir de diversas muestras.
Fundamento: El agar sal manitol contiene peptonas y extractos de
carne bovina, que suministran los nutrientes esenciales. Una
concentración de cloruro sódico de 7,5% tiene como resultado una
inhibición parcial o completa de los organismos bacterianos diferentes
de los estafilococos. La fermentación de manitol, indicada por el cambio
del indicador de rojo fenol, facilita la diferenciación de la especie de
estafilococos. Los estafilococos positivos a la coagulasa (por ejemplo,
Staphylococcus aureus) producen colonias de color amarillo y un medio
circundante de color amarillo, mientras que los estafilococos negativos
a la coagulasa producen colonias de color rojo y no producen cambio
de color en el indicador de rojo fenol.
V CONCLUSIONES
VI RECOMENDACIONES
VII BIBLIOGRAFÍA
CUESTIONARIO
1.- Elaborar un esquema indicando los resultados de las pruebas de
identificación de Staphylococcus aureus, Staphylococcus saprophyticus y
Staphylococcus epidermidis.
2.- ¿Qué discos de antibiogramas se utilizan para identificar Staphylococcus?
PRÁCTICA N° 02
RECONOCIMIENTO E IDENTIFICACIÓN FAMILIA

STREPTOCOCCACEAE
I OBJETIVOS
 Realizar pruebas de identificación de la familia

Streptococcaceae.
identificación del género Streptococcus.
El género Streptococcus es un grupo muy heterogéneo, formado por
bacterias de forma redondeada, grampositivas, con tendencia a formar
cadenas o parejas, que se hallan ampliamente distribuidas en la
naturaleza. Hay especies que son importantes patógenos para el ser
humano, pero la mayoría son comensales, miembros de la microbiota
normal humana de piel y mucosas.
En cuanto a los requerimientos nutricionales el Género Streptococcus
es exigente y por lo tanto debe ser cultivado en medios ricos que le
aporten los nutrientes necesarios, por ejemplo, agar sangre ovina.
Dentro de las pruebas bioquímicas para la identificación, la primera,
luego de determinar que se trata de un coco Gram positivo, es la prueba
de la catalasa. Luego de determinar que se trata de un coco Gram
positivo catalasa negativo, debemos proceder a observar el efecto que
tiene la cepa sobre el agar sangre (hemólisis). Así podemos clasificar
este grupo de gérmenes en: ß hemolíticos: son aquellos que producen
una hemólisis total de los glóbulos rojos, observándose como un halo
transparente alrededor de las colonias. α hemolíticos: son aquellos que
producen hemólisis parcial, la cual se observa como un halo con
tonalidad verdosa alrededor de las colonias. Gamma hemolíticos: son
aquellos que no producen hemólisis sobre el agar sangre.

IV PROCEDIMIENTO
a) SENSIBILIDAD A LA BACITRACINA
Objetivo: Separar el Streptococcus pyogenes de los demás
estreptococos beta hemolíticos.
Fundamento: Streptococcus pyogenes es sensible a bajas
concentraciones de Bacitracina (discos conteniendo 0,04U).
También existe un 5% de cepas de S. agalactiae que son sensibles
a la Bacitracina.
Procedimiento: Se realiza sembrando un gran inóculo, tomado con
asa bacteriológica de un cultivo puro, que se estría sobre una placa
de agar sangre en varias direcciones intentando obtener un cultivo
confluente. Luego se coloca el disco de Bacitracina y se incuba 18-
24 horas a 37º.
Interpretación de resultados: La aparición de cualquier diámetro de
halo de inhibición de crecimiento alrededor del disco se considera
prueba positiva.
b) HIDROLISIS DEL PYR
c) Prueba de CAMP
d) Bilis esculina
e) Sensibilidad a la optoquina
V CONCLUSIONES
VI RECOMENDACIONES
VII BIBLIOGRAFÍA
CUESTIONARIO
1.- Esquematizar los diferentes tipos de hemólisis de los Streptococcus.
¿Cómo los diferenciamos?
2.- En qué consiste la sensibilidad a la bacitracina y las optoquina?
3.- Diagrame y explique la prueba de CAMP
4.- En qué consiste la prueba PYR?
5.- Realice un esquema para la identificación de Streptococcus
PRÁCTICA N° 03
RECONOCIMIENTO E IDENTIFICACIÓN FAMILIA NEISSERIACEAE
I OBJETIVOS
 Realizar pruebas de identificación de la familia Neisseriacae.
identificación de la familia Neisseriaceae.
El género Neisseria comprende dos especies patógenas para el hombre;
siendo éste el único reservorio conocido: N. meningitidis y N. gonorrhoeae.
Otras especies de Neisseria no patógenas, se encuentran habitualmente
formando parte de la flora normal de la orofaringe.
La familia Neisseriaceae comprende varios géneros: Neisseria, Moraxella,
Acinetobacter y otros. Branhamella catarrhalis (estrictamente Moraxella
catarrhalis), inicialmente incluido en esta familia ha sido actualmente
reclasificado como un subgénero de Moraxella. Las técnicas de identificación
de este germen son similares a las de la familia Neisseriaceae. Su crecimiento
en medios simples a temperatura de 22ºC, su incapacidad de fermentar
hidratos de Carbono y la producción de una desoxirribonucleasa permiten su
identificación. Un gran porcentaje de cepas producen ß-lactamasas. Este
germen que sido implicado en los últimos años como agente de diversas
enfermedades infecciosas, entre ellas otitis media en niños, exacerbación de
bronquitis crónica y neumonía, sobre todo en pacientes con enfermedad
respiratoria subyacente.
El género Acinetobacter está compuesto por bacterias cocoides o cocobacilos
Gram negativos, oxidasa negativos no exigentes. Forman colonias lisas,
blancas o grisáceas a veces hemolíticas, similares a las de las
enterobacterias. Los miembros de este género habitan en el agua y el suelo,
también formando parte de la flora normal humana de la piel. Estos sitios
suelen ser el reservorio de la bacteria en hospitales y causar brotes, en los
que el germen se comporta como oportunista. Las puertas de entrada al
organismo son en general tubos endotraqueales, sondas, catéteres y otros
cuerpos extraños. Suelen presentar resistencia a múltiples antibióticos.
Las bacterias del género Neisseria son cocos Gram negativos, inmóviles que
se agrupan en pares en diplococos, cuya forma se ha comparado a granos de
café. El citoplasma y la ultraestructura son muy similares en N. meningitidis y
N. gonorrhoeae y comparten 80% de sus secuencias de bases del ADN.
Aunque son Gram negativas, contienen endotoxinas, y tienen
ultraestructuralmente una pared celular típica de las bacterias Gram negativas
se parecen a los cocos piógenos en su patogenicidad y su sensibilidad
intrínseca a la Penicilina. Ambas especies pueden colonizar las mucosas sin
causar síntomas. La enfermedad causada por N. gonorrhoeae es, en general,
localizada, y muy raramente diseminada; en cambio N. meningitidis produce
enfermedad grave, diseminada, muchas veces fatal. Esto podría deberse a
que N. meningitidis presenta una cápsula polisacarídica bien definida. Ambas
especies poseen fimbrias o pili, las cuales han sido relacionadas con la
virulencia.
METABOLISMO
Son aerobios, y las especies patógenas son exigentes desde el punto de vista
de sus requerimientos nutricionales (agar sangre o agar chocolate), de
temperatura (crecen a 37º pero no a 22º) y atmosféricos (atmósfera con 5 a 7
% de CO2). Son oxidasa positivos. Estos requerimientos de cultivo, así como
el patrón de fermentación de distintos azúcares (en especial glucosa, maltosa,
sacarosa, lactosa y fructosa) se utilizan para diferenciar las distintas especies
de Neisserias.
Las reacciones de fermentación de azúcares se realizan en medio semisólido
CTA (agar cisteína tripticasa) con 1% de cada carbohidrato; produciéndose
sólo pequeñas cantidades de metabolitos ácidos en las reacciones positivas.
DIAGNOSTICO MICROBIOLÓGICO Frente a un cuadro clínico compatible
con meningitis se deberá realizar una punción lumbar para obtener datos de
la composición citoquímica del líquido cefalorraquídeo y para estudio
microbiológico. Debe recordarse la labilidad de los gérmenes que causan
meningitis y transportar la muestra de inmediato al laboratorio. Una vez en el
laboratorio de bacteriología, el LCR será sometido a examen directo, cultivo y
detección de antígenos capsulares de los distintos agentes de meningitis. El
examen directo con coloración de Gram es sencillo y rápido. Permite una
orientación inicial de la terapéutica siempre y cuando lo realice un técnico
experimentado. El cultivo se realizara en agar sangre, agar chocolate y
medios de enriquecimiento; deben recordarse los requerimientos de
atmósfera del germen. A las colonias sospechosas se les realiza coloración
de Gram, prueba de oxidasa y propiedades bioquímicas. El laboratorio puede
además realizar la determinación del serogrupo mediante antisueros
específicos. Las cepas pueden conservarse congeladas a -70º C para
estudios posteriores.
SUSCEPTIBILIDAD A LOS ANTIBIÓTICOS
La Penicilina continúa siendo el tratamiento de elección para la meningitis
meningocóccica. Esta droga es bactericida y atraviesa la barrera
hematoencefálica. En el momento actual no parece ser necesario realizar
estudios de susceptibilidad en forma rutinaria ya que son sensibles a la
Penicilina. Se han descrito raros casos de cepas con alteraciones a nivel de
las proteínas fijadoras de Penicilina (PBP) que hacen aumentar la
concentración inhibitoria mínima a la droga. PROFILAXIS Los sujetos que han
estado en contacto con el paciente deben ser sometidos a quimioprofilaxis
para evitar casos secundarios. Esta se realiza con Rifampicina por períodos
cortos ya que esta droga es efectiva en eliminar el estado de portador.
Vacunas: Se dispone de vacunas para los serogrupos A y C que han sido
utilizadas en caso de epidemias en diversos países, incluso el nuestro. En
Estados Unidos existen vacunas tetravalentes anti A, C, Y y W135. En general
son poco eficaces en menores de 2 años. Se estima que esto podría mejorar
si se obtienen vacunas conjugadas con proteínas. La vacuna para prevenir la
enfermedad por el serogrupo B continúa siendo un problema ya que el
polisacárido capsular es poco inmunógeno y este es el serogrupo que causa
la mayor parte de los casos en países desarrollados. Los investigadores han
orientado su atención a otros antígenos como las proteínas de membrana
externa para estimular la inmunidad. Se han desarrollado diversas vacunas
basadas en estos antígenos de N. meningitidis grupo B pero no se han
logrado, a la fecha, niveles de eficacia que permitan recomendar su uso.
PRUEBAS DE DIAGNÓSTICO
 Productos patológicos: Sangre (meningococcemia) LCR (meningitis), y
exudado nasofaríngeo (encuestas de portadores). Se puede obtener
material por punción de las petequias para frotis y cultivo. El suero
puede utilizarse en pruebas sexológicas.
 Examen microscópico: En las extensiones coloreadas de sedimento del
LCR o del material aspirado de las petequias pueden observarse
diplococos gramnegativos arriñonados dentro de los leucocitos
polimorfonucleares.
 Cultivo: Las muestras de productos patológicos deben ser sembrados
inmediatamente en placas de agar chocolate o en el medio de Thayer
- Martin e incubadas a 37C en una atmósfera que contenga de 5 a 10 %
de CO2 (método de la vela), durante 24 a 48 horas. El medio de Thayer
- Martin favorece el crecimiento de meningococos y gonococos al
inhibir el de muchas otras bacterias, incluyendo las neisserias no
patógenas. Este medio de cultivo contiene vancomicina (contra los
gérmenes gramnegativos), colimicin (contra los gramnegativos),
y nistatina (contra las levaduras).
 Prueba de la oxidasa: Cuando el crecimiento en los medios de cultivos
se rocía con una solución de clorhidrato de dimetilparafenilendiamina,
las colonias de meningococos (y demás neisserias) se ennegrecen
rápidamente, por acción de la indofenoloxidasa, que poseen estos
microorganismos, sobre el reactivo.
 Pruebas de fermentaciones de azúcares: El meningococo ataca a la
glucosa y a la maltosa, pero no a la sacarosa; lo que permite si
identificación de especie.
 Determinación de grupos serológicos: Se lleva a cabo por pruebas de
aglutinación en lámina con sueros específicos.
 Pruebas serológicas: Se puede determinar la presencia de anticuerpos
a los polisacáridos meningocócicos en el suero del paciente, mediante
las pruebas de hemaglutinación, por la aglutinación de partículas
de látex o por su actividad bactericida.
PRÁCTICA N° 04
RECONOCIMIENTO E IDENTIFICACIÓN FAMILIA

ENTEROBACTARIACEAE
I OBJETIVOS
Enterobacteriacae.
identificación de la familia enterobacteriaceae.
FAMILIA ENTEROBACTERIACEAE
Esta familia comprende un número muy variado de géneros y especies
bacterianos cuyo hábitat natural es el tubo digestivo del hombre y los
animales. No todos los bacilos Gram negativos que tienen este hábitat
forman parte de la familia Enterobacteriaceae. Se los encuentra en el
suelo, agua, frutas, vegetales y otras plantas, y en los animales, desde
los insectos al hombre. La familia está definida por un conjunto de
características fenotípicas (bioquímicas, fisiológicas e inmunológicas) a
las que se han agregado posteriormente otros elementos establecidos
por técnicas de hibridación de ácidos nucleicos que miden distancias
evolutivas y han definido mejor la interrelación de todos los
microorganismos integrantes de la familia. Son bacilos Gram negativos
rectos, con un diámetro de 0.3 a 1.5 micras. Si son móviles, presentan
flagelos perítricos. No forman esporos. Desarrollan en presencia o en
ausencia de oxígeno (aerobios-anaerobios facultativos). Desarrollan
rápidamente en medios simples, no siendo exigentes desde el punto de
vista nutricional. Algunos desarrollan en glucosa como única fuente de
carbono, mientras otros requieren el agregado de vitaminas o minerales
en el medio de cultivo. Son quimioorganotrofos, poseen metabolismo
fermentativo y respiratorio. Son catalasa positivos y oxidasa negativos;
reducen los nitratos a nitritos. El contenido de Guanina + Citosina del
DNA total es de 38 a 60 moles %. En los medios de cultivo forman
colonias lisas, convexas y circulares de bordes definidos. Algunas
especies desarrollan colonias más mucoides que otras (por ejemplo
Klebsiella).
CARACTERES BIOQUÍMICOS
Los bacilos Gram negativos que integran esta familia pueden
identificarse por medio de la expresión fenotípica de algunos caracteres
genéticos. Los métodos utilizados tienen como principio:
• La investigación de la fermentación de azucares o alcoholes en un
medio peptonado con el agregado de un indicador de pH para detectar
la producción de metabolitos ácidos.
• La investigación de la utilización de un substrato como única fuente
de C.
• La investigación de producción de ciertas enzimas sobre substratos
generadores de color.
• La investigación de la producción de un metabolito, producto final
característico de una vía metabólica.
• La investigación de la aptitud de desarrollar en presencia de un
inhibidor.
La identificación de las diferentes especies de enterobacterias se
realiza estudiando la actividad metabólica del microorganismo sobre los
diversos sustratos (carbohidratos, proteínas, etc.), en la práctica se
estudian las especies de mayor importancia médica.
IV PROCEDIMIENTO
Observar el desarrollo bacteriano en las placas de Agar Mc. Conkey,
colonias rojas que corresponden a bacterias que han metabolizado la
lactosa debido al indicador de pH ácido (rojo neutro). Las colonias
incoloras son bacterias que no han metabolizado la lactosa, se
consideran como sospechosas de ser patógenas (Salmonella-
Shiguella).
• Al observar el desarrollo en la placa de SS, medio más selectivo para
las bacterias patógenas, también se puede observar colonias rojas e
incoloras
• En este medio también puede observarse colonias negras de
bacterias productoras de H2S dentro de las cuales están la Salmonella
y Proteus. El medio SS se diferencia del Mc. Conkey porque contiene
verde brillante y tiosulfato de sodio.
IDENTIFICACIÓN BIOQUÍMICA:
• El reconocimiento de las diversas especies de Enterobacterias se
realiza observando las reacciones metabólicas, por los cambios del
color del medio sobre los sustratos contenidos en dichos medios
diferenciales.
• En el medio TSI se observa el metabolismo fermentivo de los
carbohidratos, (Glucosa, Sacarosa y Lactosa). Cuando metabolizada la
glucosa hay viraje de color amarillo en el fondo del tubo por
metabolismo en ausencia de oxígeno. Todas las enterobacterias
metabolizan la glucosa.
• Cuando metaboliza otros carbohidratos el viraje es en todo el tubo
porque la concentración de lactosa y sacarosa es mayor.
• La producción de H2S toma un color negro que es variado, a veces
toma un color negro en todo el tubo por lo que se considera además la
glucosa positiva. La LIA se observa el metabolismo de la lisina que
permanece de color violeta y no metabolizada la lisina, cuando cambia
de color el fondo (amarillo), también hay producción de H2S en este
tubo por lo que se forma un precipitado negro.
• El citrato en el tubo es de color verde cuando la bacteria utiliza el
carbono como fuente de energía el medio vira al alcalino y toma un
color azul.
V CONCLUSIONES
VI RECOMENDACIONES
VII BIBLIOGRAFÍA
 MANUAL DE MICROBIOLOGÍA CLÍNICA DE LA ASOCIACIÓN

ARGENTINA DE MICROBIOLOGÍA VOLUMEN I Bacterias de
Importancia Clínica
 www.higiene.edu.uy/cefa/.../TapadeTemasdeBacteriologiayVirologiam
edicaed2006.p.
CUESTIONARIO
1.- Reportar los resultados de reconocimiento de las enterobacterias
estudiadas.
2.- Elaborar un cuadro comparativo con las diferentes pruebas bioqúimicas
para enterobacterias.
PRÁCTICA N° 05
TOMA DE MUESTRAS FAMILIA BACILLACEAE Y BRUCELLACEAE
I OBJETIVOS
 Realizar pruebas de identificación de la familia Bacillaceae
 Realizar pruebas de identificación de la familia Brucellaceae.
GÉNERO BACILLUS
Microscopía: se observan bacilos Gram positivos grandes (1 por 3 a
10 µm) de extremos rectos, aislados, en pares o cadenas con tinción
de Gram. Se observan áreas claras sin teñir que corresponden a
endosporas, ovoides, de posición subterminal, que no deforman el
soma bacteriano. Pueden teñirse con técnicas de coloración especiales
como el verde de Malaquita. La endospora solo se observa a partir de
cultivos viejos o mediante técnicas que provoquen la esporulación, no
a partir de muestras clínicas. Lo opuesto sucede con la expresión de la
cápsula, que se pierde al ser cultivada en medios artificiales.
Macroscopía: para su observación deben ser cultivados en medios
ricos y simples tales como agar sangre, agar chocolate y agar nutriente.
Su morfología es variable según la especie:
• B. anthracis: colonias grandes, grises, opacas, chatas, de bordes
irregulares que remedan una cabeza de medusa. Son no hemolíticos.
• B. cereus: colonias grandes, blancogrisáceas, opacas,
betahemolíticas.
• B. subtilis: colonias grandes, chatas, con pigmento naranja, pueden
ser beta hemolíticas.
Para su cultivo a partir de muestras clínicas con contaminantes pueden
realizarse técnicas que eliminan las formas de vida vegetativa y solo
permiten la sobrevida de esporas; estas técnicas son shock de calor o
shock de alcohol. También se utilizan medios selectivos como el PLET
para B. anthracis.
Es un desafío para el microbiólogo diferenciar B. anthracis de las
muchas especies no patógenas que se encuentran en el ambiente
como contaminantes. Las pruebas más comúnmente realizadas son las
que se observan en el diagrama que se muestra abajo: lecitinasa,
movilidad, susceptibilidad a la penicilina, y otras como indol, nitratos,
citrato, voges proskauer, etc.; además de la observación de la
macroscopía y microscopía, bastante características de cada especie
en particular. También se pueden utilizar técnicas de biología molecular
como análisis de los fragmentos de restricción o métodos
inmunológicos para detección de las toxinas.
GÉNERO BRUCELLA
El Género Brucella está formado por un reducido número de bacterias
Gram negativas, estrechamente relacionadas entre sí. Son pequeñas
(0.4 a 0.8 x 0.4 a 2.5 μ), aerobios sin cápsula, ni espora, que se
presentan aisladas o en pequeños grupos; de desarrollo óptimo a 370C
y pH 6.6 a 6.8. Se han clasificado seis especies, algunas de las cuales
presentan biotipos, los que se diferencian por características
específicas, metabólicas, bioquímicas y serológicas. A B. abortus se le
reconocen 9 biotipos; a B. melitensis 3 biotipos, y B. suis, 4 biotipos. B.
ovis, B. canis y B. neotomae no tienen biotipos específicos.
B. ovis y B. abortus requieren para su desarrollo, de una atmósfera con
CO2 mayor que la del aire normal, sin embargo, para B. abortus es sólo
un requisito para su aislamiento y primeros pasos, pues se adapta
posteriormente a la atmósfera normal.
El aislamiento se puede realizar por inoculación, preferentemente en
cobayos, en saco vitelino de huevos embrionados o en medios de
cultivo especiales mejorados. En este último caso, B. ovis requiere
además de suero sanguíneo. En caso de contaminación, éstos medios
de cultivo se hacen selectivos adicionándoles fungistáticos y
antibióticos, además de violeta de etilo.
Normalmente las especies B. ovis y B. canis, al aislamiento son
rugosas, en tanto que las otras especies son lisas. Todas las especies
pueden presentar disociación de colonias, con lo cual cambian también
sus características antigénicas. Las colonias pueden ser lisas (S),
rugosas (R) o mucoides (M), diferenciables por diversos métodos de
laboratorio.
Algunas especies producen H2S, lo que permite diferenciarlas de
acuerdo a la cantidad y número de días de producción. Es posible
distinguir también, diferente velocidad de actividad ureásica entre las
especies.
Se ha utilizado frecuentemente comó método diferencial, la acción
inhibitoria sobre el desarrollo, de algunos colorantes de anilina,
preferentemente tionina y fucsina básica.
Para el diagnóstico directo, las muestras de elección variarán según la
especie afectada y el curso de la enfermedad. Preferentemente se
utiliza:
a) leche de todos los cuartos;
b) exudado vaginal postaborto;
c) sangre para hemocultivo, con o sin citrato de Na.;
d) membrana fetal o contenido estomacal, pulmón, bazo y meconio del
feto abortado;
e) de animal sacrificado: tejidos del sistema retículo endotelial, como
ganglios supramamarios, retrofaríngeos e ilíacos, bazo; ubre y útero
grávido o puerperal;
f) en el hombre: médula ósea, secreciones, sangre y líquido sinovial.
Las muestras de tejido pueden ser sometidas a técnicas de tinción
identificatorias como Ziehl Nielsen modificado, que permite observar la
brucela color rojo sobre fondo azul o la tinción de Koster modificada en
que se aprecian rojo naranja con fondo azul.
La tipificación ordinaria de brucelas por los requerimientos de C02,
inhibición del desarrollo frente a colorantes, producción de H2S y la
actividad ureásica, puede ser complementada por estudios de
reducción de nitratos, acción de la eritromicina, del dietilditiocarbonato,
sensibilidad frente a fagos específicos y pruebas metabólicas sobre
aminoácidos e hidratos de carbono.
Las brucelas son sensibles a antisépticos, a la pasteurización, a
antibióticos como tetraciclinas, cloramfenicol, neomicina, streptomicina
y sulfonamidas. Son resistentes a penicilinas. Se encuentran viables en
leche refrigerada hasta 10 días, en mantequilla refrigerada por 4 meses
y en carnes saladas por 45 días. En el medio exterior también son
altamente resistentes, especialmente en fecas, cama de paja, y
productos de abortos. El sol directo las destruye rápidamente.
Las especies presentan diferentes grados de virulencia, los que se
pueden determinar por inoculación en cobayos o por su actividad
catalásica, aunque la interpretación de estos ensayos sea discutida.
Junto al cobayo, el ratón y el mono son las especies más sensibles
a Brucella.
IV PROCEDIMIENTO
Se realizará la determinación de Bacillus cereus con el Agar Selectivo
Bacillus Cereus.
 Suspender 40 gramos del polvo en 950 mL de agua purificada
dejar reposar 5 a 10 minutos.
 Calentar con agitación frecuente y hervir durante 1 minuto hasta
completar disolución.
 Esterilizar en autoclave a 121°C por 15 minutos.
 Enfriar a 50 °C y asépticamente agregar 50 mL de emulsión
yema de huevo (sin telurito)
 Homogenizar y distribuir en placas Petri
 La siembra es directa estriando la superficie del medio de cultivo.
 Si se trabaja con muestras de alimentos y se debe hacer
recuento microbiano:
 Homogenizar 10 g de la muestra en 90 mL de agua
peptonada 0.1 %. Si es necesario efectuar diluciones.
 Inocular una alícuota determinada (0.1 mL) sobre la
superficie del medio de cultivo y esparcirla en toda la
superficie.
 Incubar en aerobiosis a 35 – 37 °C durante 24 a 48 horas.
V CONCLUSIONES
VI RECOMENDACIONES
VII BIBLIOGRAFÍA
 www.higiene.edu.uy/cefa/.../TapadeTemasdeBacteriologiayVirologiam
edicaed2006.p.
CUESTIONARIO
1.- Interpretar los resultados de la prueba
2.- Describir la fórmula y el fundamento del agar selectivo Bacillus
cereus.
PRÁCTICA N° 06
TOMA DE MUESTRAS FAMILIA PSEUDOMONACEAE Y
VIBRIONACEAE
I OBJETIVOS
Pseudomonaceae.
 Realizar pruebas de identificación de la familia Vibrionaceae.
FAMILIA PSEUDOMONACEAE
Características generales
Los miembros de éste género son:
• Bacilos gramnegativos rectos o ligeramente curvados que se
disponen típicamente en parejas
• Aerobios y anaerobios facultativos. La presencia de citocromo oxidasa
se emplea para distinguirla de las Enterobacteriaceae.
• Oxidasa positivos
• Catalasa positivos
Habitan en el suelo, en aguas estancadas, forman parte de la flora
nativa del intestino de varias especies animales, son de vida libre, se
encuentran en material orgánico en descomposición.
Algunas especies son patógenos de plantas, otras pueden producir
infecciones en animales y sólo unas pocas especies se han encontrado
en infecciones humanas.
Pigmentos hidrosolubles: Pioacina (azul); Pioverdina (verde);
Piorrubina (rojo); Piomelanina (negro)
La mayoría son móviles por un flagelo polar o un mechón de 2 a 3
flagelos.Poseen fimbrias y pilis
Algunas especies forman una delgada microcápsula compuesta por
polisacáridos, no forman esporas.
Son mesófilas (30 – 37°C), aunque pueden desarrollarse a
temperaturas relativamente bajas (hasta 4°C).
No tiene requerimientos nutricionales exigentes, NO fermentan los
azúcares.
LA FAMILIA VIBRIONACEAE
Agrupa diferentes géneros de bacilos Gram negativos con un hábitat
primario acuático. Se los encuentra en el mar en aguas frescas y en
relación con animales acuáticos. Diversas especies son patógenas
para el hombre, peces, así como otros vertebrados e invertebrados.
Aunque la Familia fue definida inicialmente en un intento de agrupar
especies oxidasa positivas y móviles por flagelos polares para
diferenciarlas de los integrantes de la Familia Enterobacteriaceae, se
vio que todos estos microorganismos comparten atributos distintivos
que sugieren un origen evolutivo común. Son bacilos Gram negativos,
rectos o curvos. Móviles por flagelos polares. No forman esporos.
Quimioorganotrofos, desarrollan en medios simples, son anaerobios
facultativos, capaces de tener un metabolismo fermentativo o
respiratorio. La mayoría oxidasas positivo. La mayoría de las especies
requiere 2-3% de NaCl o agua marina para desarrollar.
Los géneros que forman esta familia son: Vibrio, Photobacterium,
Aeromonas y Plesiomonas, teniendo importancia médica especies de
los géneros Vibrio, Aeromonas y Plesiomonas.
Vibrio cholerae Es el agente del Cólera. Es una enfermedad epidémica
grave que ha matado millones de personas y continúa siendo un
importante problema de Salud en todo el mundo. Conocida desde la
antigüedad, permanece endémica en las regiones del delta del Ganges
y en el Sudeste Asiático. A partir del comienzo del siglo XIX la
enfermedad se ha expandido en todo el mundo en ondas sucesivas,
junto a grandes movimientos poblacionales. La historia moderna del
Cólera comienza en 1817 con la primera de las 7 pandemias. El
continente americano estuvo libre de Cólera desde el comienzo del
siglo XX, la última epidemia en Uruguay fue en 1895. Luego de cada
introducción todas duraban unos años y parecían haber desaparecido.
En 1950 sólo había Cólera en Asia.
Vibrio cholerae es un bacilo Gram negativo, curvo, con forma de coma.
Desarrolla bien en medios simples. Aunque su desarrollo está
estimulado por la presencia de Na+, esta especie a diferencia de las
otras especies del género, desarrolla en medios sin el agregado de
NaCl. Vibrio cholerae tolera condiciones de alcalinidad y es capaz de
desarrollar a pH 10. Estas propiedades se utilizan para aislar el germen
de las muestras clínicas, de alimentos o del agua. Las cepas
epidémicas de Vibrio cholerae se dividen en 2 biotipos: clásico y eltor.
IV PROCEDIMIENTO
RECONOCIMIENTO DE Pseudomonas
Preparar los medios de cultivo donde crece Pseudomonas spp. ya que
sus requerimientos nutricionales no son exigentes, por lo que crece en
casi todos los medios de cultivos, exceptuando aquellos que sean
selectivos para alguna especie en particular o que contengan
antibióticos o sustancias que inhiban el crecimiento.
Su cultivo bacteriano se da en caldos o agares:
*Medio de cultivo base agar con Soya-Tripcaseína
*Caldo Nutritivo.
*Agar Cetrimida,
*Medio de cultivo base agar con sangre.
Preparar agar cetrimide de la siguiente manera
 Suspender 45,3 gramos del polvo en un litro de agua purificada.
 Agregar 10 mL de glicerina
 Dejar reposar por 5 minutos y calentar agitando frecuentemente,
hervir por un minuto hasta disolución total.
 Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos.
- Sembrar en superficie por inoculación directa de la muestra
estriando a partir de un caldo de enriquecimiento.
- Incubar en aerobiosos a 35 – 37 °C.
- Observar el crecimiento microbiano las características de las
colonias y la producción de pigmentos.
- La presencia de un color verde azulado corresponde a la producción
de piocianina, mientras que un color verde corresponde a
producción de pioverdina y un color rosa claro, rojizo o marrón
oscuro corresponde a la producción de piorrubina.
- Examinar las placas bajo luz ultravioleta, ya que la producción de
fluoresceína se observa de color amarillo, verdoso brillante que
difunde en el agar a partir del crecimiento microbiano.
RECONOCIMIENTO DE Vibrio cholerae
- Se debe obtener la muestra de heces en el período agudo de la
enfermedad, y transportarse en medio Cary Blair antes de iniciar el
tratamiento con antimicrobianos. Con un hisopo estéril, se recoge
una pequeña cantidad de una evacuación espontánea reciente,
seleccionando las partes mucosas o sanguinolentas. En caso de no
poder obtener esta muestra, se hace un hisopado rectal. Si la
muestra puede ser procesada dentro de las dos horas de la
extracción se debe depositar en un recipiente estéril. Las muestras
que no se pueden procesar dentro de las dos horas, se deben
colocar en medio de transporte. Como medio de transporte se usa
Cary–Blair, que tiene la ventaja de ser estable hasta 18 meses
después de su preparación, cuando las condiciones de
almacenamiento son correctas. En este medio de transporte se
puede conservar la muestra hasta 5 días, siempre en refrigeración.
- Preparar el Agar (TCBS) Tiosulfato citraro bilis sacarosa, que es un
medio selectivo y diferencial para el aislamiento y cultivo de:
- Vibrio cholerae
- Vibrio parahemolyticus
- Vibrio vulnificus
A partir de heces aguas y alimentos.El cual es de color verde azulado,
con pH 8.6 +- 0.2.
- Se realiza la siembra en estría con el inóculo.
- Se incuba en aerobiosis a 35 – 37 °C durante 18 a 24 horas.
- Observar las características de las colonias.
- Microorganismos fermentadores de sacarosa son de color amarillo.
- Microorganismos no fermentadores de sacarosa, del color del
medio con centro verde.
V CONCLUSIONES
VI RECOMENDACIONES
VII BIBLIOGRAFÍA
 http://higiene.edu.uy/cefa/Libro2002/Cap%2022.pdf
 Murray, P (2009). Microbiología Médica. 6ta ed. GEA consultoría
editorial. Barcelona.• Romero Cabello, Raúl. Microbiología y
parasitología humana: bases etiológicas de las enfermedades
infecciosas y parasitarias. 3a ed. México: Editorial Médica
Panamericana, 2007.
 Koneman. Diagnóstico microbiológico: texto y atlas color. 3ª ed.
Argentina: Editorial Médica Panamericana, 1992
CUESTIONARIO
1.- ¿Cómo se puede demostrar mediante pruebas bioquímicas a
bacterias gram negativas no fermentadoras?
2.- ¿Cuáles serían los resultados positivos de Pseudomonas en agar
Cetrimide?
3.- Mencione los factores de virulencia de Pseudomonas aeruginosa
PRÁCTICA N° 07
TOMA DE MUESTRAS FAMILIA MICOBACTERIACEAE
I OBJETIVOS
Micobacteriaceae.
El género Mycobacterium está integrado por bacilos largos de 3 a 5µm
de longitud o curvos en forma de maza, inmóviles, no esporulados, con
abundantes gránulos citoplasmáticos, que poseen una resistencia
mayor a la tinción por los colorantes comunes, pero una vez teñidos
son resistentes a la decoloración con una mezcla de alcohol ácido.
Desde el punto de vista de los requerimientos atmosféricos algunos son
aerobios y otros microaerófilos. En cuanto a la velocidad de crecimiento
algunas especies son de crecimiento rápido y otras lento. Se destaca
en su estructura una gran riqueza en lípidos (20-60%). El contenido de
bases de guanina más citosina en la molécula de ADN es de 62 a 70
moles %. El género comprende 50 especies, entre ellas patógenos
primarios, oportunistas y saprofitas.
Las mycobacterias son agentes de enfermedades infecciosas que han
acompañado al hombre a lo largo de su historia. Mycobacterium
tuberculosis y Mycobacterium leprae son los agentes etiológicos más
frecuentes de las dos enfermedades más conocidas de este género.
Poco tiempo después que Roberto Koch descubriera M. tuberculosis
en 1882, fueron identificadas otras mycobacterias, constituyendo el
grupo de las mycobacterias atípica.
MICOBACTERIUM TUBERCULOSIS
Mycobacterium tuberculosis pertenece a la familia Mycobacteriaceae.
Junto con M. africanum, M. bovis y M. microti constituyen el complejo
de bacterias causantes de la tuberculosis (TB).
Son bacilos Gram positivo, ácido-alcohol resistentes, con tamaño entre
0.2-0.7 x 1-10 micras (µm), ligeramente curvados, aerobios estrictos,
inmóviles, no formadores de esporas ni cápsulas y de crecimiento
lento. M. tuberculosis es el agente causante de la tuberculosis humana
más frecuente.
Tuberculosis pulmonar:
Es una enfermedad que normalmente afecta a los pulmones.
Inicialmente suele pasar inadvertida, apareciendo los primeros
síntomas a las pocas semanas. Los síntomas son: fatiga, fiebre,
sudoración (sobre todo nocturna), expectoraciones (a veces
sanguinolentas) y dolor torácico.
MICOBACTERIUM LEPRAE
Es un bacilo ácido-alcohol resistente de la familia Mycobacteriaceae.
Es un patógeno intracelular obligado con un tiempo de generación de
14 días. M. leprae crece de forma óptima a 27-30 C y no se puede
cultivar in vitro. En seres humanos, el período de incubación de la lepra
es de 3 meses-20 años (media 3-5 años). La rara ocurrencia de lepra
en lactantes con tan sólo 3 meses de edad, sugiere que la transmisión
puede producirse in útero o que en determinadas situaciones son
posibles períodos de incubación muy cortos.
IV PROCEDIMIENTO
TÉCNICA ZIEHL-NEELSEN
Se trata de una coloración diferencial basada en la capacidad de las
mycobacterias de incorporar colorantes y luego retenerlos ante la
acción de una mezcla de alcohol y ácido, lo que es conocido como
ácido-alcohol resistencia. Las particulares características de la pared
de las mycobacterias parece ser responsable de esta propiedad,
pudiendo formar complejos ácido estables, cuando se exponen a
colorantes aniónicos, con los lípidos de la pared, especialmente los
ácidos micólicos, o también constituyendo complejos fucsina-ARN. Con
un frotis seco y fijado se recorren los siguientes pasos:
Se debe lavar con agua corriente a baja presión entre paso y paso.
Después se seca y se observa con lente de inmersión. Las
mycobacterias se ven rosadas sobre un fondo de leucocitos, fibrina y
escasa flora asociada, coloreados de azul. La observación debe
recorrer unos 200 campos microscópicos y se informa según el
siguiente criterio semicuantitativo:
Las muestras remitidas para su estudio al laboratorio de micobacterias

se pueden dividir en dos grupos:
1. Muestras procedentes de lugares estériles, como líquidos
cefalorraquídeos, pleurales, peritoneales, pericárdicos y biopsias de
tejidos. Éstas pueden sembrarse directamente en los medios de cultivo.
Si el volumen es grande pueden requerir una concentración previa.
2. Muestras procedentes de lugares en los que existe flora comensal
(esputos, orinas etc.) que se multiplica más rápido que las
micobacterias, por lo que puede impedir el crecimiento de las
micobacterias. Este tipo de muestras debe ser sometido a un proceso
de homogeneización (descontaminación y posterior neutralización-
concentración).
Como hay gran variedad de medios, permite a cada laboratorio elegir
los que mejor se adapten sus necesidades y a la población atendida.
Existen 2 grupos de medios de cultivo: sólidos y líquidos. En
condiciones normales, los cultivos deben incubarse a 35-37 °C e
incubarse durante 6-8 semanas. Se acepta como control de calidad de
buen funcionamiento de un laboratorio una contaminación entre el 3-
5% de los cultivos en medio sólido. Un rango menor indicaría una
descontaminación demasiado severa y un rango superior al 5% sería
debido a una descontaminación suave. No existe consenso en cuanto
a posibles rangos de contaminación en los distintos medios líquidos
utilizados en la actualidad.
V CONCLUSIONES
VI RECOMENDACIONES
VII BIBLIOGRAFÍA
 Murray, P (2009). Microbiología Médica. 6ta ed. GEA consultoría
editorial. Barcelona.• Romero Cabello, Raúl. Microbiología y
parasitología humana: bases etiológicas de las enfermedades
infecciosas y parasitarias. 3a ed. México: Editorial Médica
Panamericana, 2007.
 Koneman. Diagnóstico microbiológico: texto y atlas color. 3ª ed.
Argentina: Editorial Médica Panamericana, 1992
 http://www.fcq.uach.mx/phocadownload/DOCENCIA/MATERIAL-DE-
ESTUDIO/micobacterias/biologia/biologia_de_las_micobacterias.html
 https://www.ecured.cu/Mycobacterium_leprae
CUESTIONARIO
1.- ¿Qué otros tipos de tinciones existen para micobacterias?
Descríbalas brevemente.
2.- ¿Cuáles son las características macroscópicas de las colonias de
Micobacterium tuberculosis en medio Lowenstein – Jensen?
3.- ¿El Micobacterium leprae tiene algún medio de cultivo específico?
Si es afirmativa la respuesta mencione sus componentes, si no es así
indique por qué?
3.- Grafique micobacterias con tinción de Ziehl Neelsen.
PRÁCTICA N° 08
TOMA DE MUESTRAS DE HONGOS
I OBJETIVOS
 Realizar pruebas de identificación de hongos de importancia
médica y alimentaria.
HONGOS
Grupo de organismos eucariotas entre los que se encuentran
los mohos, las levaduras y las setas. Se clasifican en un reino distinto
al de las plantas, animales y bacterias. Esta diferenciación se debe,
entre otras cosas, a que poseen paredes celulares compuestas
por quitina, a diferencia de las plantas, que contienen celulosa.
Actualmente se consideran como un grupo heterogéneo, polifilético,
formado por organismos pertenecientes por lo menos a tres líneas
evolutivas independientes.
El análisis de la calidad de los alimentos incluye la determinación de
los hongos que se encuentran en los alimentos, cuando se degradan.
Los hongos pertenecen al grupo de eucariota en este están las
levaduras, mohos y setas.
Los hongos deuteromicotos con los conidios y conidioforos no tienen
ningún tipo de protección.
El taló de un hongo está formado por hifas (son filamentos cilíndricos
constituidos, generalmente están ramificadas) y estas estás están
divididas por septas. Y el conjunto de hifas se le llama micelio.
La reproducción asexual de los hongos tiene a lugar en las esporas,
que se encuentran en las extremidades de las hifas. Estas esporas
tienen una estructura como las uvas.
Las esporas asexuales de los hongos se pueden formar de varios tipos;
 Clamidiòporas
 Conidiosporas
HONGOS PATÓGENOS PARA EL HOMBRE

Factor de
Agente Enfermedad Efecto
virulencia
“rodlets”
Aspergillus sp. Aspergilosis Inhibición de la fagocitosis
(hidrofobinas)
Alentan el movimiento ciliar y
Aspergilosis
Aspergillus sp. Gliotoxina lesionan el epitelio de vías
pulmonar
respiratorias altas.
Dermatofitos Tiñas Queratinasas Destrucción del estrato córneo
Dermatofitos Ides Toxinas Hipersensibilidad
Inhibición de respuesta inmune
(impide migración de células de la
Cryptococcus Criptococosis Cápsula
inmunidad y propiedades
antifagocíticas)
Producción Anti-oxidante, resistencia a
Cryptococcus Criptococosis
de melanina anfotericina B
Esporotricosis Producción Inhibe la fagocitosis por
Sporothrix spp.
linfangítica de melanina macrófagos.
Degradan los cuerpos cetónicos
Ceto- presentes en sangre, favoreciendo
Mucorales Mucormicosis
reductasa el crecimiento y diseminación del
hongo.
Inhibición de la tirosinasa y de la
producción de melanina
Pitiriasis versicolor Ácidos conllevando una menor protección
Malassezia spp.
hipocrómica dicarboxílicos contra los rayos UV y el
establecimiento de agentes
microbianos dañinos.
Destrucción de los ácidos grasos
Dermatitis
Malassezia spp. Fosfolipasas esenciales en la piel causando
seborréica
sequedad
Destruyen las fibras elásticas de los
Coccidioides spp. Coccidioidiomicosis Elastasas
tejidos.
Medios de cultivo utilizados para hongos:
AGAR AGUA: Es un medio pobre en el cual el micelio crece en forma muy
rala. Es especialmente usado para hacer aislamientos de punta de hifa. De
acuerdo a la consistencia que se quiera dar al medio, se puede hacer con
mayor o menor cantidad de agar.
Agar 10 g
Agua destilada 1 litro.
PAPA DEXTROSA AGAR (PDA): Es un medio muy usado que sirve para
aislar todo tipo de hongos. Beauveria, Paecilomyces, Lecanicillium
(Verticillium) y Metarhizium, los más importantes hongos parásitos de
insectos, al igual que los parásitos de plantas y los hongos saprofitos crecen
muy bien y esporulan en este medio. Cuando se aíslan hongos a partir de
insectos colectados del suelo, es recomendable acidificar el medio con ácido
láctico al 25%. Se agregan 3 ó 4 gotas sobre el agar solidificado de la placa
con el objeto de evitar el desarrollo de bacterias. Con los mismos ingredientes,
excluyendo el agar, se obtiene el medio líquido de Papa Dextrosa (PD), muy
utilizado para la preparación del inóculo en forma masiva.
Papa sin pelar 200 g
Dextrosa 10 g
Agar 18 g
Agua destilada 1 litro
Lavar las papas, cortarlas y hacerlas hervir en un litro de agua destilada por
20 minutos, colar y disolver en el líquido la dextrosa y el agar. Esterilizar en
autoclave durante 15 minutos a 15 libras de presión.
FITOLEVADURA: Este medio se usa para aislar hongos a partir de animales.
Los hongos aislados de insectos crecen exuberantemente con micelio bien
algodonoso y buena producción de esporas.
Dextrosa 20 g
Extracto de levadura 5 g
Peptona 5 g
Agar 18 g
Agua destilada 1 litro
SABOURAUD: Es un medio de cultivo muy utilizado para aislar hongos de
animales. Sirve para el aislamiento y mantenimiento de hongos en tubo
inclinado. Debido a su composición, los hongos crecen exuberantemente y
esporulan bien. Es el medio estándar para observar la morfología típica de los
hongos, pero no es el medio ideal de crecimiento o para estudiar la
esporulación.
Dextrosa 20 g
Peptona 10 g
Agar 18 g
Agua destilada 1000 ml.
La temperatura óptima para el crecimiento y desarrollo de los hongos se
encuentra entre los 25 y 30ºC, y puede llegar a los 40 y 45 ºC, sin embargo
hay excepciones con especies que crecen a 0 ºC y 55 ºC sin ningún
problema.
IV PROCEDIMIENTO
TINCIÓN CON AZUL DE LACTOFENOL
FUNDAMENTO
La tinción de Azul de lactofenol se emplea para observar hongos.
Es una tinción simple (un sólo colorante) y como tal está basada en la
afinidad del colorante por componentes de las células, en este caso por
las estructuras fúngicas.
El azul de lactofenol tiene tres características que lo hacen especial
para observar dichas estructuras en los hongos del tipo moho
obtenidos en los cultivos por aislamiento:
 El fenol destruye la flora acompañante (algunas veces en los cultivos,
juntos a los hongos pueden crecer colonias de bacterias)
 El ácido láctico conserva las estructuras fúngicas al crear, por decirlo
de algún modo, una película que las protege provocado por un cambio
de gradiente osmótico entre el interior y el exterior de dicha estructura.
 El azul de algodón tiene la capacidad de adherirse a las hifas y conidios
de los hongos microscópicos
PROCEDIMIENTO
 Se coloca una gota de agua salina fisiológica encima del
portaobjetos.
 Con una asa esterilizada se pica un trocito de hongo de la
muestra alimentaria podrida y se expanden por encima de la
gota de agua salina fisiológica, hasta que no se seque. O sino
se deja al aire libre para que el portaobjetos se seque.
 Después de que se seque la muestra, se coge una gota de azul
de lactofenol con una aguja estéril y se añade encima de la
muestra. Es aconsejable esperar un par de minutos, después de
introducir el reactivo.
 Se cubre la muestra con el cubreobjetos y esta preparación ya
está lista para poder ser observado en el microscopio óptico.
Hay que intentar que no queden burbujas de aire en la
preparación, ya que sino lo que se observará mayoritariamente
serán las burbujas.
V CONCLUSIONES
VI RECOMENDACIONES
VII BIBLIOGRAFÍA
 http://www.facmed.unam.mx/deptos/microbiologia/micologia/ge
neralidades.html
 http://paratecnicosdelaboratorio.blogspot.com/2014/10/tincion-
azul-de-lactofenol-o-azul.html
CUESTIONARIO
1.- Indique en cada caso el hongo que observó y grafíquelo.
2.- En nuestra localidad, ¿Cuáles son los hongos patógenos con mayor
prevalencia?
3.- ¿Qué produce el Trichophyton rubrum, el Epidermophyton
floccosum y el Trichophyto interdigitale?
PRÁCTICA N° 09
CONTROL MICROBIOLÓGICO DE AMBIENTES
I OBJETIVOS
 Identificar la importancia de los ambientes para el desarrollo de las prácticas.
La limpieza y la desinfección son procedimientos de gran importancia, ya que
permiten controlar la presencia de microorganismos sobre las superficies. La
desinfección es un proceso que implica la destrucción de microorganismos
perjudiciales (formas vegetativas), a través del uso de sustancias químicas o
agentes físicos aplicados sobre superficies inertes. La limpieza debe ser un
paso previo a la desinfección ya que con este proceso, además de eliminar
muchas sustancias que pueden servir como nutrientes para los
microorganismos, se eliminan sustancias que pueden impedir que las
soluciones desinfectantes actúen eficientemente. En el Laboratorio de
Microbiología estos procesos deben realizarse de rutina, ya que el trabajar
con microorganismos exige que se tomen medidas para evitar la
contaminación del ambiente, del material de trabajo y del personal. Es por ello
que se debe conocer y controlar la calidad microbiológica del aire y de las
superficies de trabajo posterior a estos procesos, ya que los microorganismos
podrían ser fuente de contaminación para el material con el que estamos
trabajando. La evaluación de la calidad microbiológica del ambiente nos indica
la cantidad de microorganismos que están presentes en un área determinada.
Los microorganismos generalmente no están flotando en el aire sino que se
encuentran sobre partículas inertes, por ejemplo polvo, gotas de agua, etc.
que le sirven como medio de transporte, las cuales pueden depositarse sobre
las superficies; es por ello que mientras más limpia es un área, menor será el
número de microorganismos presentes en el aire de la misma. Las personas
también son una fuente de contaminación, ya que liberan gran cantidad de
partículas al moverse, toser, estornudar, por exfoliación de la piel, etc. Algunas
de estas partículas llevan microorganismos que podrían contaminar el
material con el que estamos trabajando; en este sentido los antisépticos,
deben ser usados por el personal para descontaminar la piel y los tejidos
expuestos antes de entrar a las áreas.
El control microbiológico de los ambientes de los laboratorios de microbiología
pueden hacerse en los siguientes lugares:
 CONTROL MICROBIOLÓGICO DEL AIRE
El método utilizado es el de sedimentación en placas de agar, que consiste
en exponer placas con un medio nutritivo sólido al ambiente durante un
periodo determinado, incubar las placas y hacer el recuento de las colonias
obtenidas. Con este método se detectan los microorganismos que caen
sobre la superficie de la placa, lo cual simula lo que ocurre normalmente
cuando estamos trabajando en el laboratorio. Como las condiciones
ambientales influyen en la sedimentación de los microorganismos es
necesario que, cuando se realiza este método, las placas se expongan
siempre en el mismo lugar y bajo las mismas condiciones para poder
comparar los resultados obtenidos.
 CONTROL MICROBIOLÓGICO DE SUPERFICIES
El control microbiológico de superficie nos proporciona información
sobre la cantidad de microorganismos presentes sobre una superficie,
la cual puede ser un equipo, mesón, ropa, etc. Esta evaluación
generalmente se hace utilizando:
- Método del Hisopo Se recomienda para tomar muestras de
superficies irregulares. Se debe definir el área donde se va a tomar
la muestra, se calcula el número de ufc/área.
- U.F.C.: unidades formadoras de colonias
- Criterio microbiológico: Es la aceptabilidad sanitaria de una
superficie o ambiente, basada en la ausencia, presencia o en un
límite permisible de microorganismos del ámbito muestreado.
LIMITES PERMISIBLES:
AREA RECUENTO UFC
Cabinas de flujo laminar <1
Cuarto de siembra <1
Cuarto de repique <1
Incubadoras ≤1
Preparación de medios de cultivo ≤15
Nevera de muestras ≤1
Nevera de reactivos <1
Cuarto de incubadoras ≤1
PRÁCTICA N° 10
CONTROL MICROBIOLÓGICO DEL AGUA
I OBJETIVOS
 Realizar el análisis microbiológico de agua.(de mar, pozo, agua
potable)
El análisis microbiológico de agua busca determinar la calidad de la
misma, la cual se define como el conjunto de caracteres biológicos que
deben satisfacerse, con el fin de que el agua sea segura para su uso
final, entre los cuales están: agua potable, agua embotellada, agua
para uso agrícola, agua de piscinas, agua para usos recreativos, entre
otras.
La microbiología de aguas se basa en identificar si hay presencia de
microorganismos indicadores de calidad tales como: Coliformes
Totales, Coliformes Fecales, Escherichia coli, Pseudomonas
aeruginosa, y recuento de Aerobios Mesófilos, de tal manera que
basados en la normatividad vigente, se pueda dar un concepto de
aceptabilidad.
III PROCEDIMIENTO
A. Bacterias aerobias totales.
Para el recuento de aerobios totales, se sembrarán 0,1 ml en 2 placas con
agar nutritivo y se incubarán a 22ºC y a 37ºC.
B. Coliformes totales, E.coli, enterococos, Clostridium perfringes y

Pseudomonas.
Fracciones de 100 ml de cada muestra de agua se filtrarán a través de

un filtro de membrana de 0,45 micras de tamaño de poro y se sembrará el
filtro en placas conteniendo:
1. Agar McConkey para la determinación de bacterias coliformes

totales (colonias rojas).
2. Agar Levine para el recuento de E. coli (colonias verde metálico).
3. Agar KAA para el recuento de enterococos (colonias rodeadas de halos
negros).
4. Agar Perfringes para el recuento de Clostridium perfringes (colonias
negras).
5. Agar Cetrimide para el recuento de Pseudomonas (colonias verdes)
6. Agar MSA para el recuento de Staphylococcus aureus (colonias
amarillas)
La determinación de microorganismos en una muestra de agua

mediante la técnica de filtración por membrana (ver video) se realiza en
muchos laboratorios, ya que permite discriminar las aguas aptas y no aptas
para el consumo desde el punto de vista bacteriológico de manera más rápida,
económica y sencilla que mediante la utilización de la técnica del número más
probable. Se puede utilizar en el análisis de aguas con bajos niveles de
contaminación. Se filtra un volumen conocido de agua (p.e. 100 ml) a través
de una membrana estéril de 0.45 mm. Esta membrana se coloca en una placa
de medio selectivo (diferente según el tipo de microorganismo a detectar) y se
incuba normalmente 24 hr. a 37ºC.
C. Hongos filamentosos y levaduras.
La determinación de hongos filamentosos y levaduras se realizará

sembrando en medio Sabouraud con cloranfenicol, bien por la técnica de
filtración (cuando se sospeche la presencia de un número reducido de
hongos), o bien haciendo diluciones del homogeneizado y sembrando
alícuotas de cada una de ellas (cuando se sospeche que existe un elevado
número).
BIBLIOGRAFÍA
https://sites.google.com/a/goumh.umh.es/practicas-de-
microbiologia/indice/analisis-microbiologico-del-agua
PRÁCTICA N° 11
SEMINARIO DIDÁCTICO: INGENIERÍA GENÉTICA – CLONACIÓN DE

GENES
OBJETIVOS
 Conocer la definición de ingeniería genética y la obtención de
productos de los organismos genéticamente modificados.
 Identificar enfermedades humanas poseen un origen genético y
la aplicación de la terapia génica.
FUNDAMENTO TEÓRICO
Cuando los científicos comprendieron la estructura de los genes y cómo
la información que portaban se traducía en funciones o características,
comenzaron a buscar la forma de aislarlos, analizarlos, modificarlos y
hasta de transferirlos de un organismo a otro para conferirle una nueva
característica. Justamente, de eso se trata la ingeniería genética, un
conjunto de metodologías que permite transferir genes de un
organismo a otro. Como consecuencia, la ingeniería genética sirve para
clonar fragmentos de ADN y para expresar genes (producir las
proteínas para las cuales estos genes codifican) en organismos
diferentes al de origen. Así, es posible no sólo obtener las proteínas
recombinantes de interés sino también mejorar cultivos y animales.
Hasta el momento se ha utilizado la ingeniería genética para producir,
por ejemplo:
Vacunas, como la de la hepatitis B
Fármacos, como la insulina y la hormona del crecimiento humano
Enzimas para disolver manchas, como las que se usan en los
detergentes en polvo.
Enzimas para la industria alimenticia, como las empleadas en la
elaboración del queso y en la obtención de jugos de fruta.
Plantas resistentes a enfermedades y herbicidas.
El desarrollo de la ingeniería genética (también llamada metodología del
ADN recombinante) fue posible gracias al descubrimiento de las enzimas
de restricción y de los plásmidos. Las enzimas de restricción reconocen
secuencias determinadas en el ADN. De esta manera, conociendo la
secuencia de un fragmento de ADN es posible aislarlo del genoma original
para insertarlo en otra molécula de ADN. Hay muchas enzimas de
restricción obtenidas a partir de bacterias y que sirven como herramientas
para la ingeniería genética. Las enzimas de restricción reconocen
secuencias de 4, 6 o más bases y cortan generando extremos romos o
extremos cohesivos. Estos extremos, generados en diferentes moléculas
de ADN, pueden sellarse con la enzima ADN ligasa y generar así una
molécula de ADN nueva, denominada recombinante.
En cuanto a la aplicación de la ingeniería genética bacteriana se muestran a
continuación casos puntuales:
a) El Centro Nacional de Biotecnología de España, en el 2017
presentó un trabajo sobre la ingeniería de bacterias E. coli para
aplicaciones biomédicas, incluyendo la selección y producción
de anticuerpos recombinantes de pequeño tamaño en bacterias
y el diseño de bacterias para su uso in vivo en diagnóstico y
terapia. Estudiaron los sistemas de secreción de proteínas que
se encuentran en cepas patogénicas de E. coli y los modificaron
mediante ingeniería para convertirlos en nanomáquinas que
puedan ser útiles en la selección y expresión de proteínas de
interés terapéutico en cepas no patógenas de E. coli.
b) Científicos de la Universidad de Buenos Aires obtuvieron
plástico con bacterias modificadas, este material es
biodegradable y lo obtienen a partir de desechos del biodiésel;
ofrece múltiples ventajas ecológicas. El Departamento de
Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y
Naturales (FCEyN) de la UBA e investigadora del Conicet,
institución que patentó el hallazgo, y lo describen de la siguiente
manera: “En el proceso utilizamos como materia prima el
glicerol, un residuo de la elaboración del biodiésel que
contamina el medio ambiente gracias a la optimización de las
estrategias de cultivo, los investigadores produjeron, mediante
técnicas de ingeniería genética, mutaciones en el gen arcA, que
es responsable del metabolismo aeróbico en la bacteria
Escherichia coli : “Obtuvimos una cepa con una mutación que le
otorga muy alta capacidad respiratoria y, por lo tanto, le permite
crecer en condiciones de microaireación”, consigna la doctora
Julia Pettinari, investigadora del Conicet, y también autora del
trabajo. “Prácticamente, para hacer crecer al microorganismo no
utilizamos más que un pequeño burbujeo de aire, y cien veces
menos agitación que en condiciones aeróbicas”, explica
Méndez. La cepa en cuestión no sólo produjo una buena
cantidad de PHA, sino que, además, utiliza como fuente de
carbono el glicerol, un residuo de la industria del biodiésel que
se está convirtiendo en un contaminante del medioambiente.
Los resultados de estos trabajos han sido recientemente
aceptados para su publicación en el Journal of Molecular
Microbiology and Biotechnology. Mientras continúan haciendo
modificaciones al proceso para optimizar el rendimiento de PHA,
el equipo de investigadores ya imagina el momento en que
pueda llevarlo a escala. Esto no sólo sería provechoso para el
medio ambiente, sino que además conllevaría un doble beneficio
para las empresas productoras de biodiésel: se le daría valor
económico a un desecho, y se evitarían los costos de su
procesamiento previo a la liberación al ambiente.
CLONACIÓN DE GENES
Biológicamente un clon es un conjunto de individuos idénticos desde el punto
de vista genético, esto debido a que provienen de un mismo elemento
precursor (moléculas, células, tejidos, órganos u organismos pluricelulares
completos, entre otros). Cada componente del clon contendrá la misma
información genética que el elemento de partida. Así, la clonación genética
consiste en la producción de copias idénticas de un gen o un fragmento de
DNA, célula u organismo.
La clonación genética es una tecnología utilizada ampliamente por la
ingeniería genética, la genómica, proteómica y biología molecular, con fines
diversos como el aislamiento, amplificación, hibridación y secuenciación de
ácidos nucleicos.
¿Qué sentido tiene hacer muchas copias de una secuencia de ADN en un
plásmido? En algunos casos, necesitamos muchas copias de ADN para
realizar experimentos o construir nuevos plásmidos. En otros casos, el
fragmento de ADN codifica una proteína útil y las bacterias se utilizan como
"fábricas" para producir la proteína. Por ejemplo, el gen de la insulina humana
se expresa en bacterias E. coli para producir la insulina que usan los
diabéticos.
La clonación de ADN se utiliza para muchos propósitos. Como ejemplo,
veamos cómo la clonación de ADN se puede utilizar para sintetizar una
proteína (como la insulina humana) en bacterias. Los pasos básicos son:
1. Abrir el plásmido y "pegar" el gen dentro. Este proceso depende de
enzimas de restricción (que cortan el ADN) y de ADN ligasa (que une
el ADN).
2. Insertar el plásmido en las bacterias. Se usa selección con antibióticos
para identificar las bacterias que incorporaron el plásmido.
3. Cultivar bacterias portadoras de plásmido en gran cantidad y usarlas
como "fábricas" para producir la proteína. Recolectar la proteína de las
bacterias y purificarla.
Revisemos con más detalle cada paso.
1. Cortar y pegar el ADN
¿Cómo pueden unirse fragmentos de ADN de diferentes fuentes? Un método
habitual utiliza dos tipos de enzimas: enzimas de restricción y ADN ligasa.
Una enzima de la restricción es una enzima que reconoce una secuencia
blanco específica y corta el ADN en dos en ese lugar o en un sitio cercano. Al
cortar, muchas enzimas de restricción producen extremos de cadena sencilla
cortos que sobresalen. Si dos moléculas tienen extremos sobresalientes que
se empatan, pueden complementar sus bases y unirse. Sin embargo, no se
combinan para formar una molécula de ADN completa hasta que la ADN
ligasa las une sellando los espacios en el esqueleto del ADN.
 El plásmido, que solo tiene un sitio de corte.

 El fragmento del gen blanco, que tiene un sitio de corte cerca de cada
extremo.
Luego, combinamos los fragmentos con ADN ligasa, la cual los une para
formar un plásmido recombinante que contenga el gen.
Diagrama que representa la digestión con enzimas de restricción y la ligación
en un esquema simplificado.
Empezamos con un plásmido bacteriano circular y un gen blanco. En ambos
extremos del gen blanco hay sitios de restricción, secuencias de ADN
reconocidas por una enzima de restricción particular. En el plásmido, también
hay un sitio de restricción reconocido por esa misma enzima, justo después
de un promotor que dirigirá su expresión en bacterias.
El plásmido y el gen blanco (por separado) se digieren con la enzima de
restricción. Los fragmentos se purifican y se combinan. Ambos tienen
"extremos cohesivos", o salientes de ADN de cadena sencilla, por lo que
pueden pegarse.
La enzima ADN ligasa une los fragmentos con extremos complementarios
para formar una única molécula completa de ADN. Esto produce un plásmido
recombinante que contiene el gen blanco.
2. Transformación y selección bacteriana
Mediante el proceso llamado transformación pueden introducirse plásmidos
y otros tipos de ADN en bacterias, como la inofensiva E. coli que se usa en
los laboratorios. Durante la transformación, células bacterianas preparadas
especialmente se someten a un choque (como alta temperatura) que las
anima a incorporar ADN extraño.
El ADN producido en la ligación (que puede ser una mezcla de plásmidos

deseados, plásmidos de productos secundarios y fragmentos de ADN lineal)
se agrega a las bacterias. Las bacterias se someten a un golpe de calor, que
mejora la eficacia con la que el ADN entra durante la transformación. Sin
embargo, solo una pequeña minoría de las bacterias incorporará con éxito un
plásmido.
Típicamente, los plásmidos contienen un gen de resistencia a
antibióticos que permite a las bacterias sobrevivir en presencia de un
antibiótico específico. Así, las bacterias que incorporan el plásmido
pueden seleccionarse en placas de medio de cultivo que contenga el
antibiótico. Las bacterias sin plásmido morirán, mientras que las bacterias que
contienen plásmido pueden vivir y reproducirse. Cada bacteria sobreviviente
dará lugar a un pequeño grupo con forma de punto, o colonia, de bacterias
idénticas que contienen el mismo plásmido.
Panel de la izquierda: diagrama de un plásmido que contiene un gen de

resistencia a antibióticos.
Panel de la derecha: todas las bacterias de la transformación se colocan en
una placa con antibióticos. Las bacterias sin plásmido mueren a causa del
antibiótico. Cada bacteria que tenga plásmido forma una colonia, un grupo de
bacterias clonales que contienen el mismo plásmido. Una colonia típica se ve
como un punto pequeño y blanquecino del tamaño de una cabeza de alfiler.
No necesariamente todas las colonias contendrán el plásmido adecuado. Eso
es porque, durante una ligación, los fragmentos de ADN no siempre se
"pegan" exactamente como queremos. Por el contrario, debemos recolectar
ADN de varias colonias y ver si cada una contiene el plásmido correcto. Se
usan métodos como la digestión con enzimas de restricción y la PCR para
revisar los plásmidos.
3. Producción de proteínas
Una vez que hemos encontrado una colonia de bacterias con el plásmido
adecuado, podemos hacer crecer un gran cultivo de bacterias que contengan
el plásmido. Luego le damos a las bacterias una señal química que les ordena
producir la proteína blanco.
Las bacterias sirven como "fábricas" miniatura que producen grandes
cantidades de proteína. Por ejemplo, si nuestro plásmido contuviera el gen de
la insulina humana, las bacterias comenzarían a transcribir el gen y traducir el
ARNm para producir muchas moléculas de la proteína de la insulina humana.
La colonia elegida crece en un cultivo grande (en un matraz de 1 litro, por
ejemplo). Se induce la expresión del gen contenido en el plásmido en las
bacterias de ese cultivo, con lo que el gen blanco se transcribe en ARNm y el
ARNm se traduce en proteína. La proteína codificada por el gen se acumula
dentro de las bacterias.
Una vez que se ha producido la proteína, las células bacterianas pueden
romperse para liberarla. Hay muchas otras proteínas y macromoléculas
flotando en las bacterias además de la proteína blanco (la insulina en nuestro
ejemplo). Debido a esto, la proteína blanco debe ser purificada o separada
del resto del contenido de las células con técnicas bioquímicas. La proteína
purificada puede utilizarse en experimentos o, en el caso de la insulina,
administrarse a pacientes.
USOS DE LA CLONACIÓN DE ADN
Las moléculas de ADN construidas mediante técnicas de clonación se utilizan
para muchos fines en la biología molecular, así:
 Productos biofarmacéuticos. La clonación de ADN puede utilizarse
para producir proteínas humanas con aplicaciones biomédicas, como
la insulina mencionada anteriormente. Otros ejemplos de proteínas
recombinantes incluyen la hormona del crecimiento humana, que se
administra a pacientes que son incapaces de sintetizarla, y el activador
tisular del plasminógeno (tPA), que se utiliza para tratar infartos y
prevenir coágulos sanguíneos. Proteínas recombinantes como estas
suelen producirse en bacterias.
 Terapia génica. En algunas transtornos genéticos, los pacientes
carecen de la forma funcional de un gen en particular. La terapia génica
intenta proporcionar una copia normal del gen a las células del cuerpo
del paciente. Por ejemplo, la clonación de ADN se utilizó para construir
plásmidos que contuvieran una versión normal del gen que falla en la
fibrosis quística. Cuando se suministraban los plásmidos a los
pulmones de pacientes con fibrosis quística, la función pulmonar se
deterioraba más lentamente.
 Análisis genético. En laboratorios de básica investigación, los
biólogos suelen usar la clonación de ADN para crear versiones
recombinantes artificiales de genes que les ayudan a entender cómo
funcionan los genes normales de un organismo.
ACTIVIDAD 1: En base a la información brindada realice un resumen.
ACTIVIDAD 2: Analice el video mostrado y saque las conclusiones del caso.
BIBLIOGRAFIA
TERMINOLOGÍA BÁSICA EN GENÉTICA
 Kb Un KILOBASE (KB) es 1000 bases de ADN, mientras que un

MEGABASE (Mb) es 1.000.000 bases.
 CROMOSOMA CIRCULAR - La ADN se arregla en un círculo que es
cerrado es sobre-rollado negativamente que permite a tener en cuenta
la naturaleza compacta de muchos genomas bacterianos.
 CROMOSOMA LINEAR - un cromosoma no cerrado, que tiene
repeticiones invertidos en los extremos, similar a los telómeros en
cromosomas eucariótica.
 PLASMIDO- la ADN adicional. Se réplica independientemente del
cromosoma, y regula su propia replicación.
 MEGAPLASMIDO - un plásmido muy grande que se extiende de
tamaño a partir de 100 a 1700 KB.
 GEN: Unidad de la herencia que se encuentra en el cromosoma,
correspondiente a una secuencia de nucleótidos de la molécula de
ADN que desempeña una función específica, como codificar.
 GENOMA: Juego completo de cromosomas con sus respectivos
genes.
 GENOTIPO: Constitución genética de un organismo o célula. Puede
estar referido a un solo rasgo o al total de los rasgos del individuo.
 FENOTIPO: Propiedades observables del individuo debido al genotipo
y al ambiente.
 ALELO: Uno de los dos genes para un rasgo determinado, que tiene
una ubicación específica en cada cromosoma homólogo.
 LOCUS: Ubicación del gen en un cromosoma. Para un locus puede
haber varios alelos posibles.(Plural: LOCI)
 CARIOTIPO: Conjunto de cromosomas que caracterizan a una especie
determinada clasificados por su morfología y tamaño.
 CLONACION: Producción asexual de una línea de células, organismos
o segmentos de ADN genéticamente idénticas al original.
 CLON: Individuo obtenido por clonación. Es común en ciertas plantas,
bacterias y parásitos animales. Se produce por división directa de la
célula o la producción de una yema, tubérculo o gajo. Actualmente se
experimenta en animales superiores (incluso el hombre) la división
asexual de los embriones en su primera etapa de células no
diferenciadas (mórula) para la obtención de gemelos idénticos. Los
clones son genéticamente iguales, no existe variación. Son copias
idénticas del individuo que les dio origen, o sea que si el individuo es
heterocígota u homocigota, los descendientes también serán igual al
padre.
 HISTONAS: Proteínas acomplejadas con DNA nuclear. Ricas en
aminoácidos básicos como lisina y arginina y participan en el
enrollamiento del DNA para formar los nucleosomas.
 ADN: ADN es el ácido desoxirribonucleico responsable de contener
toda la información genética de un individuo o ser vivo, información que
es única e irrepetible en cada ser ya que la combinación de elementos
se construye de manera única
 Un INTRÓN es una parte del gen que no codifica ningún aminoácido.
En las células vegetales y animales, la mayoría de las secuencias que
codifican para los genes están partidas por uno o más intrones. Las
zonas de la secuencia del gen que se expresan en las proteínas se
llaman exones porque se expresan, mientras que aquellas que no lo
hacen se denominan intrones por encontrarse entre los exones.
 Un EXÓN es la porción de gen que codifica aminoácidos. En las células
de plantas y animales, la mayoría de las secuencias de genes son
alternadas por una o más secuencias de ADN llamadas intrones. Las
partes de la secuencia de genes que contienen la información para
producir las proteínas se llaman exones, ya que se expresan, mientras
que las partes de la secuencia del gen que no codifican se llaman
intrones, porque están en medio o interfieren con los exones.
 TRANSPOSONES Un transposón o elemento genético
transponible es una secuencia de ADN que puede moverse de manera
autosuficiente a diferentes partes del genoma de una célula, un
fenómeno conocido como transposición. En este proceso, se pueden
causar mutaciones y cambio en la cantidad de ADN del genoma.
Anteriormente fueron conocidos como "genes saltarines" y son
ejemplos de elementos genéticos móviles.
PRÁCTICA N° 12
MICROORGANISMOS DE IMPORTANCIA INDUSTRIAL
OBJETIVOS
 Relacionar la importancia de los principales grupos microbianos
en la industria farmacéutica y alimentaria.
FUNDAMENTO TEÓRICO
La contaminación microbiana de los productos farmacéuticos y cosméticos ha
sido extensamente estudiada tanto a nivel nacional como internacional. Los
productos para administración parenteral y de uso ocular deben ser estériles.
Existen otras formas farmacéuticas no obligatoriamente estériles que se usan
por vía oral, tópica, nasal, vaginal, etc, fabricadas con ingredientes que
pueden ser substratos adecuados para los microorganismos.
Las preparaciones farmacéuticas y los cosméticos pueden contaminarse con
hongos filamentosos, levaduras y bacterias. Las materias primas naturales, el
equipamiento, el agua, los operadores, el aire, y el material de empaque
pueden ser fuentes de contaminación de los productos farmacéuticos y
cosméticos. La U.S. Food and Drug Administration (FDA) reconoce tres
categorías de microorganismos: patógenos, oportunistas y objetables: - - -
Patógenos son aquellos microorganismos o toxinas responsables de enfermar
o infectar al hombre (Salmonella sp, Escherichia coli, Pseudomonas
aeruginosa, Staphylococcus aureus, Candida albicans, Clostridium spp, etc).
Se consideran oportunistas a aquellos microorganismos que producen
enfermedad en pacientes inmunocomprometidos. Y son objetables aquellos
microorganismos que pueden inactivar drogas activas y/o deteriorar el
producto provocando una posible falta de eficacia de los productos
farmacéuticos y seguridad en cosméticos.
Un medicamento o un cosmético se consideran contaminados si contiene
microorganismos patogénicos, oportunistas, objetables o metabolitos
microbianos tóxicos, o si presentan deterioro físico o químico. Los
microorganismos con requerimientos nutricionales simples tienden a estar
presentes en alto número, mayor de 106 ufc/g o ml, a pesar de que el producto
no muestre signos visibles de contaminación. La dosis infectiva de los
microorganismos no sólo varía entre las especies sino también entre los
individuos. Los síntomas y consecuencias de las infecciones por
medicamentos o cosméticos contaminados son diversos. Las reacciones
clínicas, varían desde una infección local de heridas, infecciones
gastrointestinales por productos orales contaminadas en el caso de productos
no estériles, a infecciones sistémicas serias por productos inyectables
contaminados. Sólo unas pocas materias primas empleadas para la
fabricación de productos farmacéuticos son estériles. Controles ambientales,
del agua, de las materias primas, de limpieza de equipos y áreas, buenas
prácticas de higiene del personal son vitales para minimizar el tipo y número
de microorganismos presentes.
En la representación se puede apreciar las fuentes de contaminación más
frecuentes de productos de uso y consumo humano:
Muchos microorganismos pueden llegar a producir toxinas constituyendo un
riesgo sanitario especialmente en formas farmacéuticas orales (Bacillus
cereus, Staphylococcus aureus y hongos filamentosos) o pueden provocar el
deterioro de un producto cosmético o de un medicamento como consecuencia
de su crecimiento alterando sus características organolépticas. Otros
microorganismos patógenos pueden producir distintas enfermedades en los
usuarios dependiendo del grado de contaminación y de la susceptibilidad del
consumidor. En general los grupos etarios más sensibles son los lactantes,
niños y ancianos.
BIBLIOGRAFÍA
https://www.aam.org.ar/descarga-archivos/manual-microbiologia-aplicada.pdf
PRÁCTICA N° 14
SEMINARIO DIDÁCTICO: ENZIMAS MICROBIANAS
OBJETIVOS
 Conocer los microorganismos productores de enzimas más
importantes utilizados en la industria.
FUNDAMENTO TEÓRICO
Las enzimas son proteínas que actúan como aceleradores de las
reacciones químicas, de síntesis y degradación de compuestos, éstas
se encuentran en todos los seres vivos y son piezas esenciales en su
funcionamiento. Éstas tienen muchas aplicaciones en diversos tipos de
industrias, entre las que se destaca la alimenticia, por ejemplo en la
obtención de yogurt, o la producción de cerveza o de vino, ya que el
proceso de fermentación se debe a las enzimas presentes en los
microorganismos que intervienen en su producción. Sin embargo, para
mejorar los procesos de producción, pueden utilizarse enzimas
aisladas, sin incluir a los microorganismos que las producen. Desde
hace unas décadas se dispone de enzimas relativamente puras
extraídas industrialmente de bacterias, hongos, plantas y animales, con
una gran variedad de actividades, pero hoy en día se han desarrollado
más fuentes para la producción de enzimas que permiten su aplicación
en diversos procesos, lo cual ha originado un área interdisciplinaria
llamada ingeniería enzimática, como nuevo enfoque de la
biotecnología.
En la actualidad se ha logrado obtener enzimas más puras, con varias
ventajas: acción más específica en su función catalítica; actividad
predecible y controlable, uso de concentraciones más elevadas del
sustrato.
Aplicaciones en Salud
Estas aplicaciones se basan en el fenómeno general de que las células
enfermas pierden una parte de sus enzimas que ocasionalmente van a
parar a la sangre, provocando la elevación de la actividad enzimática
del suero, dependiendo de la gravedad de la enfermedad.
Las enzimas se usan como reactivos para control y seguimiento
de enfermedades y para la observación de la respuesta de los
pacientes en terapia. Por ejemplo para el análisis del colesterol
del suero se usa la enzima colesterol oxidasa, que se obtiene a
partir de Pseudomonas fluorescens, que al ser suministrado un
inductor, el enzima se acumula en forma intra- y extracelular y
se purifica.
Diagnóstico enfermedades, como ocurre con ELISA.
Las técnicas enzimáticas también se utilizan en la detección de
drogas, análisis de antibióticos, detección de antígenos o
anticuerpos o en la detección de enzimas y metabolitos en los
fluidos intracelulares y son usualmente más rápidas, especificas
y económicas que otras pruebas.
El uso de enzimas microbianas en la cuantificación de drogas
quimioterapéuticas toxicas en el suero, como en el análisis
colorimétrico.
En el tratamiento de enfermedades, por ejemplo, las enzimas
tripsina o colagenasa, que se usan para eliminar los tejidos
muertos de heridas, quemaduras, etc, para acelerar el
crecimiento de nuevos tejidos e injertos de piel e inhibir el
crecimiento de organismos contaminantes.
Actividad antitumoral, como la enzima pterin-desaminasa
desamina la pterina, el ácido pteroico y el ácido fólico.
Antiinflamatorio, como la enzima superóxido dismutasa.
Aplicaciones en la industria
En la fabricación de jarabes de maltosa, que se usa en mermeladas y
en pastelería por su resistencia a la aparición de color, por no ser
absorbente y no cristalizar tan fácilmente como los jarabes de glucosa;
también se usa en la cervecería y panadería porque su contenido de
azúcar fermentable es alto y se mantiene estable durante el
almacenamiento, por ejemplo, se usan enzimas como la pulalanasa.
Refinado de azúcar, para ello se usa la rafinosa que se obtiene del
moho Mortierella vinacea raffinosutilizer o laa- amilasa producida por B.
licheniformis.
La hidrólisis enzimática de celulosa a glucosa, a través de la celulasa,
obtenida del Trichoderma viride, que sirve como endulzante, como
fuente de energía o para transformarla en productos valiosos como el
etanol. Las aplicaciones comerciales son como auxiliar de alimentos
vegetales y degradador de desechos domésticos.
Fermentación alcohólica, recientemente se han añadido enzimas
bacterianas para suplementar enzimas endógenas asociadas con el
almidón, para disminuir la viscosidad del almidón; en la elaboración de
cerveza se usan enzimas para el remojo y acondicionamiento,
degradando el almidón de la cebada y dando lugar al mosto de cerveza,
formando azúcares fermentables y dextrinas límites que no fermentan
y permanecen en la cerveza aumentando su valor calórico; también
hacen que resista la refrigeración, alargue su vida útil y para filtrar la
levadura.
Panadería, las enzimas catalizan el abultado y maduración del pan,
aumentado su volumen; la harina se suplementa con enzimas como la
a-amilasa y la proteasa, para elevar la velocidad de fermentación y
reducir la viscosidad, mejorando el volumen y textura del producto y
generando azúcares que mejoran el sabor y la calidad.
En la industria láctea, en la hidrólisis de la lactosa en glucosa y
galactosa, para que pueda ser consumida por personas con
intolerancia a la lactosa; para evitar la pérdida de nutrientes en el suero
del queso, éstos problemas se pueden eliminar o reducir con la
hidrólisis enzimática de la lactosa por medio de la enzima galactosidasa
inmovilizada, obtenida principalmente de Saccharomyces lactis y
Escherichia coli. Para el cuajo de la leche se emplean enzimas
provenientes de Mucor pusillus. También algunas enzimas producen
un olor y sabor que identifica el producto, y aceleran la maduración del
queso, como el Bacillus spp y lipasas para generar aromas agradables
en productos como la mantequilla.
Aminoácidos, para suplementar los alimentos, enzimas como la
aminoácido acilasa ayudan a su apropiada producción; la enzima
aspartasa del E. coli ayuda en el proceso de producción de ácido
aspártico.
Antioxidantes; la oxidación de productos genera la pérdida de valor
nutritivo y calidad y formación de toxinas, para solucionarlo, algunas
enzimas con propiedades antioxidantes son: la glucosa oxidasa, la
superóxido dismutasa, la catalasa la glutatión peroxidasa y la colesterol
oxidasa.
Detergentes; dado que la proteasa derivada de Bacillus subtillis, tolera
un medio alcalino, se emplea para hidrolizar los residuos alimentarios
que contienen proteínas y almidón.
Industria textil, para elevar la resistencia en el tejido, se usa almidón
adhesivo y para el tratamiento del cuero, se emplea la tripsina
pancreática que solubiliza las grasas y gomas y mejora la absorción del
agua. También se usan proteasas para evitar la degradación de
elastinas y queratinas y la desnaturalización del colágeno.
ACTIVIDAD 1: En base a la información brindada realice un resumen.
ACTIVIDAD 2: Realice una investigación e indique un mínimo de 10
enzimas y su utilización en la industria.
ACTIVIDAD 2: Analice el video mostrado y saque las conclusiones del
caso.
BIBLIOGRAFÍA
 http://sgpwe.izt.uam.mx/files/users/uami/favela/Microbiologia_Industria
l_Libro.pdf
 http://arbor.revistas.csic.es/index.php/arbor/article/view/1957/2287

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