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I. INTRODUCCION
II. OBJETIVOS.
III. METODOLOGIA
3.1 Método de Conteo Directo en Placa
A. Según la FDA
Equipos y materiales
Medios y reactivos
Medio Baird-Parker
Caldo infusión cerebro corazón (BHI)
PRUEBAS CONFIRMATIVAS
i. Prueba de coagulasa
Agregar 0.5 ml del plasma reconstituido de coagulasa con EDTA (B-4, arriba)
al caldo BHI y mezclar. Incubar a 35°C y examine periódicamente cada 6 h y
verificar la formación del coágulo. La aparición de un coágulo firme y
completo en el lugar de inclinación del tubo, se considera como reacción
positiva para S. aureus. La coagulación parcial, o resultados 2+ y 3+, se
deben de volver a realizar. Pruebe los cultivos positivos y negativos
simultáneamente con cultivos que se desconozca su reacción. Realizar la
coloración Gram a los tubos positivos y observar al microscopio.
PRUEBAS AUXILIARES
Producción de + - -
Termonucleasa
Sensibilidad a + + -
Glucosa + + +
Manitol + - -
Confirmación de colonias:
A. MATERIAL BIOLÓGICO:
Queso
B. MATERIAL DE LABORATORIO:
Incubadora
Tubos de ensayo
Gradilla
Placas petri
Bombillas
Hisopos de algodón u otro material equivalente, largo aproximado
de 12 cm.
Guantes descartables de primer uso
Protector de cabello.
Mascarillas descartables.
Plumón marcador indeleble (para vidrio).
A. MATERIAL Y APARATOS
1. Placas de Petri, de vidrio (100 x 15mm) 6 de plástico (90 x
15mm).
2. Pipetas bacteriológicas de 1 ml con subdivisiones de 0.1 ml o
inferiores.
3. Baño de agua o estufa de aire para templar y mantener el medio
a 44-46°C.
4. Estufa de incubación, 35-37°C.
5. Cabina de flujo laminar o estufa de desecación para secar la
superficie del medio sólido contenido en las placas.
6. Varillas de vidrio en forma de bastón de hockey, pulidas al fuego
o alambres doblados, para disminuir el inóculo, cuyas medidas
sean aproximadamente: 3.5 mm de diámetro y 20 cm de longitud,
dobladas en ángulo recto a 3 cm de un extremo.
7. Agar de Baird-Parker (Medio 6).
8. Agar de Baird-Parker, modificación de Holbrook (Medio 7) Este
medio puede emplearse en lugar del señalado en el punto 7.
B. TÉCNICA
1. Preparar las muestras de alimento con la dilución de los
homogeneizados de alimentos.
2. Añadir el agar de Baird-Parker a las placas (15ml a cada una),
dejar solidificar y secar las superficies en la cabina de flujo
laminar o en la estufa. Cuando se emplea la modificación del
medio de Baird-Parker propuesta por Holbrook hay que añadir
piruvato sódico al medio contenido en las placas antes de
proceder a secar las superficies.
3. Transferir 0.1 ml del homogeneizado y de sus diluciones a la
superficie del medio contenido en placas independientes y
extender el inóculo con ayuda de las varillas de vidrio o de los
alambres hasta que sea absorbido por el medio. Para cada
dilución deben prepararse placas por duplicado.
4. Incubar las placas en posición invertida a 35-37°C durante 30 y
48 horas.
5. Pasadas las primeras 30 horas de incubación, elegir las placas
que contengan entre 20 y 200 colonias aisladas y contar todas
las colonias negras y brillantes de margen estrecho y blanco
rodeadas de áreas claras que se extienden en el medio opaco.
La probabilidad de que estas colonias correspondan a S. aureus
es muy elevada.
6. Marcar la posición de estas colonias e incubar las placas otras 18
horas.
7. Una vez finalizado el segundo periodo de incubación (48 horas),
contar todas las colonias que presenten el aspecto mencionado y
también aquellas cuyo color sea negro brillante con o sin margen
estrecho blanco y que no presenten el área de aclaramiento.
Llevar a cabo la prueba de la coagulasa con un número
significativo de colonias sospechosas de corresponder a S.
aureus (no menos de cinco)
8. Con ciertas partidas de yema de huevo, las colonias de algunas
cepas de S. aureus pueden estar rodeadas de una zona opaca a
las 30 horas de incubación, pero un número mayor de cepas
puede mostrar este aspecto a las 48 horas. Contar estas colonias
a las 48 horas y someterlas, o a un número adecuado de ellas
(no menos de cinco) si son muchas, a la prueba de la coagulasa.
C. RESULTADOS ESPERADOS
El aspecto de las colonias típicas de Staphylococcus aureus sobre
agar Baird-Parker es el siguiente:
Redondas, de bordes lisos, convexas, de 2-3 mm de diámetro,
húmedas, brillantes, negras, con un borde blanco fino, rodeadas de
una zona opaca y de un halo claro de 2-5 mm.
b. COLONIAS ATIPICAS
Las colonias que no presentan ese color negro brillante o que no
tienen alrededor un halo claro de lipolisis son consideradas atípicas
y desechadas.
N = C x D x 10
Dónde:
N= Unidades formadoras de colonia por gramo de muestra (UFC/g o
UFC/mL).
C= Media del número de colonias en las dos placas.
D= Factor o inverso de la dilución.
A. RECUENTO DE COLONIAS
Dilución 10-1
Dilución 10-2
Dilución 10-3
B. PRUEBA DE COAGULASA :
C. RECUENTO
.
V. BIBLIOGRAFIA: