Técnicas derivadas de FISH

Sondas de pintado cromosómico total

WCP probes

Conjunto de sondas que hibrida un cromosoma completo

destacándolo del resto del cariotipo

•Identificación de un par cromosómico específico

•Detección de aberraciones/reordenamientos estructurales
•Estudio de translocaciones WCP crom 4
•Reciprocidad
•Número de cromosomas involucrados
•Identificación de los cromosomas involucrados

Desventaja
En una reacción de FISH corriente no podrían utilizarse más de 7 u 8
WCP’s de diferentes colores debido a la poca disponibilidad de fluorocromos
 Técnicas derivadas de FISH

Multi Color Spectral Karyotyping

(Schröck & col. 1996)

OBJETIVO

Identificación simultánea de todos los cromosomas

del cariotipo.
 Técnicas derivadas de FISH

Multi Color Spectral Karyotyping

FUNDAMENTO

Cada WCP está marcado con una mezcla

de dos o mas fluorocromos en distintas proporciones.
De esta forma, las señales emitidas por cada fluorocromo
se mezclan y generan un color diferente.
 Técnicas derivadas de FISH

Multi Color Spectral Karyotyping

Sonda WCP para cromosoma 7 marcada con:

Fluorocromo Fluorocromo Cromosoma 7

verde rojo color NARANJA

Para este mismo ejemplo

distintas proporciones de fluorocromos rojo y verde

generan diferentes tonos de naranja.
 Técnicas derivadas de FISH

Multi Color Spectral Karyotyping

CHROMOSOME FRed AQUA GREEN GOLD RED

1 X
2 X
Sonda 1 2 3 4 5 6 etc. 3 X
4 X X
FR x x x 5 X X
6 X
red x x x 7 X
8 X X
yellow x x x
9 X X
green x x x 10 X X X
11 X X
blue x x x 12 X X
13 X X
14 X X X
15 X X X
16 X X
17 X X X
18 X X X
19 X X X
20 X X X
21 X X X
22 X X X
X X X
Y X X
 Técnicas derivadas de FISH

Multi Color Spectral Karyotyping

+ + +

Gold Red Green Aqua

Aqua
Gold Red Green

+ + =

FRed
FRed DAPI
DAPI
 Técnicas derivadas de FISH

Multi Color Spectral Karyotyping

 Técnicas derivadas de FISH
Multi Color Spectral Karyotyping

Se han desarrollado dispositivos especiales asociados a programas

informáticos que captan diferencias mínimas entre los colores emitidos.
De esta forma la imagen puede obtenerse de dos maneras distintas:

fluoróforo
Y
Imagen directa:

X color
Y

Transformación
de Fourier:
X
 Técnicas derivadas de FISH

Multi Color Spectral Karyotyping

Pseudocoloreado
 Técnicas derivadas de FISH

Multi Color Spectral Karyotyping

De esta forma es posible identificar las aberraciones/reordenamientos

y los cromosomas involucrados en todo el complemento cromosómico
al mismo tiempo.
Técnicas derivadas de FISH

FISH por bandeo de alta resolución

 Técnicas derivadas de FISH
FISH por bandeo de alta resolución
Cada región cromosómica Emisión de los distintos colores
detectada con sondas marcadas Para cada región cromosómica
con distintas proporciones de
fluorocromos
Fluorocromos utilizados
Técnicas derivadas
de FISH

Pseudocoloreado
 Técnicas derivadas de FISH

FISH por bandeo de alta resolución

 Técnicas derivadas de FISH

FISH por bandeo de alta resolución: ejemplo

Inv. Paracéntrica Inv. Pericéntrica

Cent. Cent.
 Técnicas derivadas de FISH

FISH por bandeo

de alta resolución
 Técnicas derivadas de FISH

Hibridación genómica comparativa (CGH)

(Kallioniemi & col., 1992)

OBJETIVO

• Detectar desbalances génicos o cromosómicos

• Detectar diferencias en cantidad de ADN entre dos genomas
 Técnicas derivadas
DNA tumoral
de FISH
DNA normal

Protocolo Metafase normal

de CGH

Intensidad de
fluorescencia

Proporción
verde/rojo
 Técnicas derivadas de FISH

Hibridación genómica comparativa (CGH)

 Técnicas derivadas de FISH

Hibridación genómica comparativa (CGH)

 Técnicas derivadas de FISH
Hibridación genómica comparativa (CGH)

Detección de desbalance numérico del cromosoma X en la línea celular GM00157 (4x)

Muhlmann & col. (1998)
 Técnicas derivadas de FISH
Hibridación genómica comparativa (CGH)
Hibridación genómica comparativa (CGH)
Conclusiones

CGH
•Mayor información sobre el estado cariotípico de los
embriones (interfase)
•Detección de patrones de anomalías en embriones detenidos
de los mismos pacientes (diseño PGD-FISH)
•Baja eficiencia de amplificación

FISH
•Rapidez (no es necesario el congelamiento)
•Practicidad en la rutina (PGS)
•Menor información acerca de embriones detenidos
•No hay posibilidades de contaminación
Hibridación genómica comparativa (CGH)

CGH aplicado al Diagnóstico genético prenatal. Aberraciones estructurales encontradas en

cromosomas 2 y 7 de distintos embriones. Dagan Wells and Joy D.A. Delhanty (2000)
Hibridación genómica comparativa (CGH)

Biología molecular

CGH array

CGH acoplado a la técnica de microarray génico para detectar desbalances de genes

específicos. Angela Bik-Yu Hui & col (2001)
 Técnicas derivadas de FISH

Síntesis con iniciadores in situ

(PRINS)

OBJETIVO

Mejorar la especificidad y aumentar la rapidez en la detección

de secuencias específicas en extendidos citogenéticos
 Técnicas derivadas de FISH

Síntesis con iniciadores in situ (PRINS)

 Técnicas derivadas de FISH
Síntesis con iniciadores in situ (PRINS)

Detección del transposón HSMAR2 involucrado en la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth

Lawrence T. Reiter & col. (1999)
Técnicas derivadas de FISH

Hibridización In Situ
(reacción enzimática)

OBJETIVO

Analizar hibridaciones in situ mediante

microscopía no fluorescente
 Técnicas derivadas de FISH
Hibridización In Situ (reacción enzimática)

1º Anticuerpo 2º Anticuerpo

Enzima

Peroxidasa + 2H2O2 O2 + 2H2O

O2 + DAB Precipitado insoluble

 Técnicas derivadas de FISH
Hibridización In Situ (reacción enzimática)
Enzima Substrato Marca (MO)
Peroxidasa H2O2/DAB Marrón

H2O2/TMB Verde

Fosfatasa N-ASMX-P/FR Rojo

Alcalina
BCIP/NBT Púrpura

Galactosidasa X-Gal Azul

DAB: Diaminobenzidina
TMB: Tetrametilbenzidina
N-ASMX-P: naftol-ASMX-fosfato
BCIP: Bromo-cloro-inolilfosfato
FR: Fast red
NBT: Nitroblue-tetrazolium
X-Gal: 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-ß-D-galactoside
 Técnicas derivadas de FISH
Hibridización In Situ (reacción enzimática)

Sonda Sat αIII (peroxidasa) Centróm. 1 (marrón) detect. con Peroxidasa

Centróm. 7 (rojo) detect. con Fosf. Alc.-Fast Red
 Técnicas derivadas de FISH

Fiber FISH
Heng &col. (1992)

OBJETIVO

Mapeo físico y ordenamiento de genes en extendidos citogenéticos

Fiber FISH

3 Mb

21Kb

2Kb
 Técnicas derivadas de FISH
Fiber FISH

Dynamic Molecular Combing (DMC)

Técnicas derivadas de FISH
….y estas sólo hasta 2008…