Práctica N°10: Cinética de Muerte Microbiana

1. Tras el conteo de unidades formadoras de colonias se ordenó la siguiente tabla:

Tiempo de Exposición UV (s) Irradiados con UV (UFC/mL) Fotorreactivados (UFC/mL)

0 1.2*10^8 120000000 - -
15 3.4*10^7 34000000 3.3*10^8 330000000
30 - - 1.88*10^8 188000000
45 8*10^5 800000 - -
60 5.35*10^3 5350 6*10^3 6000
90 5*10^1 50 5*10^3 5000
Tabla 1. Datos del número de unidades formadoras de colonias con respecto al tiempo de
exposición a los rayos UV a 235,7 nm con o sin exposición a luz solar para inducir
fotorreactivación.

Se evidenciaron vacíos en la tabla por el extravío de una de las placas (30s para irradiación sin
fotorreactiación) y por la ausencia de UFC en las placas de 45 s para fotorreactivación.

2. Se corrigen los datos pertinentes:

De la tabla anterior se pudo identificar que la concentración de UFC/mL original del cultivo era
1.2x108, valor dentro de lo esperado debido a que lo informado por el laboratorio era que la
concentración original de microorganismos debía hallarse entre 1 x 108 y 2 x 108 UFC/mL. No
obstante, para el experimento de fotorreactivación se identificaron valores por encima del
inicial, lo que indicaría una supervivencia por encima del 100%, por lo que se descartaron,
considerándolos erróneos. A partir de los datos admitidos se elaboró la siguiente tabla de la
supervivencia porcentual y su versión logarítmica.

Tiempo de Porcentaje de Porcentaje de

Log % Log %
Exposición UV Supervivencia tras Supervivencia tras
Superviv.UV Fotorreact.
(s) Exposición UV (%) Fotorreactivación (%)
0 100.00000 - 2.00 -
15 28.33333 - 1.45 -
30 - - - -
45 0.66667 - -0.18 -
60 0.00446 0.00500 -2.35 -2.30
90 0.00004 0.00417 -4.38 -2.38
Tabla 2. Datos corregidos y porcentuales de supervivencia tras exposición UV con y sin
exposición a luz solar para inducir fotorreactivación.
3. Obtención de curvas de supervivencia:

Porcentaje de Supervivencia tras Exposición UV vs. Tiempo (s)

100
90 y = 245.41e-0.169x
80 R² = 0.9697
Supervivencia (%)

70
Porcentaje de

60
50
40
30
20
10
0
0 20 40 60 80 100
Tiempo de Exposición UV (s)

Gráfico 1. Porcentaje de Supervivencia tras Exposición UV vs. Tiempo (s). Se identifica una
curva exponencial asintótica al valor 0. La tasa de mortalidad se identifica como el negativo del
valor que acompaña a x (tiempo en s) y resulta ser 0.169 s-1.

Logaritmo del Porcentaje de Supervivencia tras Exposición UV vs.

Tiempo (s)
3.00
y = -0.0734x + 2.3899
Log (% de Supervivencia)

2.00
R² = 0.9697
1.00
0.00
-1.00
-2.00
-3.00
-4.00
-5.00
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Tiempo de Exposición UV (s)

Gráfico 2. Logaritmo del Porcentaje de Supervivencia tras Exposición UV vs. Tiempo (s). Con
un 𝑅 2 cercano a 1 que nos da certeza de una correcta transformación. Además se señala la
región donde la supervivencia sería entre el 0.1-1% (de -1 a 0 en escala logarítmica) de la
original, que caería en el intervalo de exposición a radiación UV entre 33s y 46s
aproximadamente.

A partir del último gráfico puede interpretarse que una exposición a rayos UV de entre 33 a 46s
sería adecuado para la muerte del 99 al 99,9% de microorganismos.
4. Obtención de parámetros cinéticos para la curva de supervivencia sin fotorreactivación:
a. Tasa de Mortalidad (k): 𝑘 = −0.169𝑠 −1 por la pendiente hallada.
∆𝑡 90
b. Tiempo de Reducción decimal (D): 𝐷 = 𝑁0 = = 13.6𝑠
log( ⁄𝑁 ) log(245.41⁄ )
𝑓 6.085∗10−5

5. Obtención de curva de supervivencia y fotorreactivación:

Curvas de Supervivencia tras Exposición UV para E. coli

con y sin fotoreactivación
100
Log (% de Supervivencia)

80
60 Supervivencia sin
40 Fotorreactivación
20 Supervivencia con
0 Fotorreactivación
0 20 40 60 80 100
Tiempo (s)

Gráfico 3. Se comparan los valores aceptados de supervivencia con y sin fotorreactivación, sin
lograr una diferenciación adecuada ni dos curvas, puesto que para el caso con fotorreactivación
solo se lograron obtener dos puntos de los cinco inicialmente planteados.

Curvas de Supervivencia tras Exposición UV para E. coli

con y sin fotoreactivación
0.006
Log (% de Supervivencia)

0.004
Supervivencia sin
0.002 Fotorreactivación
Supervivencia con
0 Fotorreactivación
50 60 70 80 90 100
Tiempo (s)

Gráfico 4. Comparando los 2 puntos válidos para la supervivencia con y sin fotorreactivación se
evidencia que la supervivencia con fotorreactivación es mayor que la supervivencia sin
fotorreactivación, esto se explica no como si aquellas fotorreactivadas hubieran sufrido menos
daño por la radiación, pero sí sufrieron una reparación mayor gracias al mecanismo inducido
por la luz visible (viable gracias al complejo proteico UVRABC (Sancar & Rupp, 1983)).
6. Determinación de la dosis de radiación suministrada de acuerdo al tiempo:
𝑒𝑟𝑔𝑖𝑜𝑠
De acuerdo a la ecuación 𝑖𝑛𝑡𝑒𝑛𝑠𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑑𝑒 𝑟𝑎𝑑𝑖𝑎𝑐𝑖ó𝑛 = 3.2 𝑚𝑚2 /𝑠𝑒𝑔
se obtiene:

Dosis
Tiempo (s)
(ergios/mm2)
0 0
15 48
45 144
60 192
90 288
Tabla 3. Dosis de radiación para los diferentes tiempos utilizados.

Por otro lado, de acuerdo al rango obtenido en el Gráfico 2. la dosis de radiación necesaria para
la muerte del 99 al 99.9% de m.o. sería entre 104 y 148 ergios/mm2.

7. Discusión

La mayoría de los datos recolectados y a partir de los cuales se trabajó no tenían una
significacnia estadística, puesto que se tuvieron menos de 30 UFC/mL o bien más de 300
UFC/mL en las placas de Petri cultivadas. Este factor pudo afectar en gran medida las
estimaciones asumidas y por lo mismo generar puntos irreales que no pudieron ser admitidos
para el análisis dando algunos gráficos incompletos como la recta de fotorreactivación.

8. Conclusiones

 Se encuentra una curva de muerte exponencial de la cual se obtiene la tasa de

mortalidad (k) igual a -0.169, además el tiempo de reducción decimal (D) es 13.6s, lo
que indicaría que la población de microorganismos se reduce 90% en 13.6 segundos de
exposición a la luz ultravioleta o bien 43.6 ergios/mm2.

 La exposición a luz visible aumenta el número de supervivientes tras la exposición a luz

UV. Esto probablemente por la activación del mecanismo de reparación de ADN
asociado al complejo UVRABC conocido como fotorreactivación que aumenta el
número de supervivientes relativos, reparando el daño del ADN.

 El tiempo de exposición a luz UV de 235,7 nm para la reducción del 99 al 99.9 % de la

población de microorganismos sería entre 33 a 46 segundos o bien entre 104 y 148
ergios/mm2.