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NOVEMBRE 2014
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Afnor, Normes en ligne le 27/01/2015 à 11:20 NF T72-281:2014-11
Pour : PIERRE LABAT
NF T 72-281
8 Novembre 2014
ICS : 11.080.20
Résumé Le présent document décrit une méthode destinée à déterminer l’activité désinfectante des
procédés de désinfection des surfaces par voie aérienne utilisés dans les secteurs de la santé
humaine, vétérinaire, agro-alimentaire, industriel et collectivité par des procédés physiques
et/ou chimiques.
Cette méthode permet de rechercher, dans les conditions voisines de la pratique, l’activité
désinfectante de procédés utilisés pour la désinfection des surfaces par voie aérienne, soit non
dirigés (assimilés à une mise en oeuvre automatique ou semi-automatique hors présence
humaine), soit dirigés (assimilés à des procédés manuels en présence de l’opérateur).
Modifications Par rapport au document remplacé, révision et mise à jour complètes du document.
Par ailleurs, les modifications suivantes majeures ont été apportées : inclusion de l’activité
virucide, mycobactéricide ajout de substances interférentes et de conditions obligatoires
complémentaires, modification des prescriptions pour la contamination artificielle des supports
et pour l’étalement de l’inoculum sur le support (5.5.1.2.1), ajout d’un tableau récapitulatif des
conditions de test et objectifs selon le secteur d’application (Annexe D), ajout d’une annexe
informative sur les procédés à base de rayonnements ultra-violets (Annexe E), ajout d’une
annexe informative pour l’évaluation de l’activité mycobactéricide (Annexe F).
Corrections
Éditée et diffusée par l’Association Française de Normalisation (AFNOR) — 11, rue Francis de Pressensé — 93571 La Plaine Saint-Denis Cedex
Tél. : + 33 (0)1 41 62 80 00 — Fax : + 33 (0)1 49 17 90 00 — www.afnor.org
NF T 72-281 —2—
La norme
La norme est destinée à servir de base dans les relations entre partenaires économiques, scientifiques,
techniques et sociaux.
La norme par nature est d’application volontaire. Référencée dans un contrat, elle s’impose aux parties.
Une réglementation peut rendre d’application obligatoire tout ou partie d’une norme.
La norme est un document élaboré par consensus au sein d’un organisme de normalisation par
sollicitation des représentants de toutes les parties intéressées. Son adoption est précédée d’une enquête
publique.
La norme fait l’objet d’un examen régulier pour évaluer sa pertinence dans le temps.
Toute norme est réputée en vigueur à partir de la date présente sur la première page.
Seules les formes verbales doit et doivent sont utilisées pour exprimer une ou des exigences qui doivent être
respectées pour se conformer au présent document. Ces exigences peuvent se trouver dans le corps de la
norme ou en annexe qualifiée de «normative». Pour les méthodes d’essai, l’utilisation de l’infinitif correspond
à une exigence.
Les expressions telles que, il convient et il est recommandé sont utilisées pour exprimer une possibilité
préférée mais non exigée pour se conformer au présent document. Les formes verbales peut et peuvent
sont utilisées pour exprimer une suggestion ou un conseil utiles mais non obligatoires, ou une autorisation.
En outre, le présent document peut fournir des renseignements supplémentaires destinés à faciliter la
compréhension ou l'utilisation de certains éléments ou à en clarifier l'application, sans énoncer d'exigence
à respecter. Ces éléments sont présentés sous forme de notes ou d'annexes informatives.
Commission de normalisation
Une commission de normalisation réunit, dans un domaine d’activité donné, les expertises nécessaires
à l’élaboration des normes françaises et des positions françaises sur les projets de norme européenne ou
internationale. Elle peut également préparer des normes expérimentales et des fascicules de documentation.
Si vous souhaitez commenter ce texte, faire des propositions d’évolution ou participer à sa révision,
adressez-vous à «norminfo@afnor.org».
La composition de la commission de normalisation qui a élaboré le présent document est donnée ci-après.
Lorsqu’un expert représente un organisme différent de son organisme d’appartenance, cette information
apparaît sous la forme : organisme d’appartenance (organisme représenté).
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Sommaire
Page
Avant-propos ...................................................................................................................................................... 6
Introduction ........................................................................................................................................................ 7
4 Prescriptions ..................................................................................................................................... 9
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Sommaire
Page
Annexe A (normative) Préparation des suspensions stocks de spores de Bacillus subtilis .................. 46
A.1 Matériel et réactifs : ceux définis en 5.2 et les suivants ..................................................................... 46
A.1.1 Bouillon (TGB) ................................................................................................................................... 46
A.1.2 Gélose (MYA) .................................................................................................................................... 46
Bibliographie ..................................................................................................................................................... 61
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Avant-propos
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Introduction
Le présent document a pour objet de décrire une méthode de détermination de l’activité désinfectante des
procédés de désinfection des surfaces par voie aérienne dans des conditions expérimentales précises.
Les procédés concernés incluent ceux mettant en jeu des désinfectants chimiques sous formes dispersés ou
vapeur et ceux mettant en jeu des agents physiques, tels que les UV. (Annexe E, informative).
Le présent document ne prend pas en compte les procédés dont le mode d’action est basé sur le trempage et/ou
sur le contact associé ou non à une action mécanique par essuyage. Les effets ci-dessus se traduisent par un
déplacement de tout ou partie des micro-organismes, en dehors de la surface du support tel que défini dans le
document sans que ces derniers soient inactivés. En conséquence, pour les procédés qui en conditions réelles
d’utilisation associent une action mécanique à l’action désinfectante, seule l’action désinfectante sera évaluée.
Le présent document comprend des conditions, obligatoires, des conditions obligatoires complémentaires et des
conditions additionnelles (voir 5.5.1.1) adaptées aux divers domaines. Les conditions obligatoires
complémentaires permettent des évaluations en dehors des fourchettes obligatoires de volumes, température et
humidité; les conditions additionnelles autorisent l'utilisation de micro-organismes ou souches pertinentes, en
alternative à ceux décrits dans les conditions obligatoires, dans le cas d'essais en grand volume (voir NOTE du
paragraphe 5.5.1.1 d)). L'équivalence avec les souches obligatoires qu'elles remplacent, devra toutefois être
préalablement établie.
Le lait écrémé ajouté aux suspensions microbiennes joue, à la fois, le rôle de substance protectrice et interférente.
Le document permet pour les germes fragiles au séchage, et pour ces derniers uniquement (parmi les germes
obligatoires actuels, seul P. aeruginosa est concerné) une possibilité d’augmentation de la concentration de
matière protectrice afin de limiter la perte au séchage (voir 3.6, 5.2.2.4.1.1, 5.2.2.4.1.1 a), 5.2.2.4.1.2 b),
5.2.2.4.1.3 a), 5.4.2.1 et Annexe D).
1 Domaine d'application
La méthode décrite est destinée à déterminer l’activité désinfectante des procédés utilisés dans les secteurs 1)
de la santé humaine, 2) vétérinaire, 3) agro-alimentaire, industriel et collectivité par des procédés physiques
et/ou chimiques.
Les procédés concernés ont pour objectifs la désinfection des surfaces de l’ensemble de l’espace y compris les
surfaces externes des équipements contenus dans ces locaux. Le traitement de l’air et les produits ou procédés
spécifiquement destinés à la désinfection des dispositifs médicaux sont exclus du domaine d’application de
ce document.
2 Références normatives
Les documents suivants, en tout ou partie, sont référencés de manière normative dans le présent document et
sont indispensables pour son application. Pour les références datées, seule l'édition citée s'applique. Pour les
références non datées, la dernière édition du document de référence s'applique (y compris les éventuels
amendements).
NF EN 13610, Désinfectants chimiques — Essai quantitatif de suspension pour l'évaluation de l'activité virucide
contre les bactériophages des désinfectants chimiques utilisés dans le domaine de l'agro-alimentaire et
dans l'industrie — Méthode d'essai et exigences (phase 2, étape 1) (indice de classement : T 72-183)
NF T 72-281 —8—
NF EN 14885, Antiseptiques et désinfectants chimiques — Application des Normes européennes sur les
antiseptiques et désinfectants chimiques (indice de classement : T 72-900)
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions donnés dans la norme NF EN 14885 ainsi que
les termes et définitions suivants s'appliquent.
3.1
procédé physique
procédé utilisant un agent physique par exemple UV (Annexe E, informative). Le procédé comprend la source
émettrice et le système de génération et de diffusion. Les procédés à base de vapeur et les radiations ionisantes
ne sont pas prises en compte dans le cadre de ce document
3.2
procédé chimique
procédé dont le principe actif est un agent chimique diffusé sous forme gazeuse, liquide ou solide. Le procédé
comprend le produit chimique et le système de diffusion associé qui ne peuvent être évalués séparément
Le procédé comprend de manière indissociable le produit chimique et le système de diffusion.
3.3
procédés de désinfection non dirigés
procédé destiné à la désinfection de toutes les surfaces incluses dans un volume donné, quelle que soient leurs
orientations. Les procédés concernés ont pour objectif la désinfection des surfaces de l’ensemble de l’espace.
Ce type de procédé est généralement mis en œuvre hors présence humaine dans la zone traitée
3.4
procédés de désinfection dirigés
procédés destinés à la désinfection de surfaces directement exposées au système de diffusion ou à la source.
Ces procédés sont manœuvrés par un opérateur qui est présent dans la salle pendant le cycle
Sont distingués les procédés :
— sans pression (petits pulvérisateurs type « spray » par exemple) ;
— avec pression (appareils plus volumineux à lance et compresseur ou « aérosols »)
3.5
activité désinfectante d’un procédé de désinfection par voie aérienne
activité d’un procédé capable de réduire, par destruction le nombre de micro-organismes dénombrables dans les
conditions du document et issus de souches déterminées appartenant à au moins un des sept groupes de
micro-organismes suivants : bactéries, spores bactériennes, levures, moisissures, virus humains, bactériophages,
et mycobactéries, dans des conditions définies et après dépôt sur un support de référence non poreux
Dans le cas où le procédé n’a été testé ou ne répond aux critères du document que sur une partie des espèces
préconisées, il conviendra de préciser les activités parmi la liste ci-après : activité bactéricide, activité sporicide,
activité fongicide, activité levuricide, activité virucide, activité virucide contre les bactériophages,
activité tuberculocide et activité mycobactéricide.
3.6
germe fragile au séchage
selon les critères spécifiques du présent document, lorsque la perte au séchage est supérieure à 1,5 log à l’issue
de la phase de séchage, hors période exposition
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4 Prescriptions
Les taux de réduction recherchés sont exprimés en logarithmes décimaux et dépendent du domaine d’application.
Ils sont repris dans les tableaux de l’Annexe D et résumés ci-dessous :
— activité bactéricide : réduction supérieure ou égale à 5 sur les supports-essais comparativement
aux supports-témoins non exposés au procédé, pour les cinq souches bactériennes mises en œuvre
(voir 5.2.1.1 — 5.2.1.2 — 5.2.1.3 — 5.2.1.4) ;
— activité sporicide : réduction supérieure ou égale à 3 sur les supports-essais comparativement aux
supports-témoins non exposés au procédé, pour la souche de bactérie sporulée mise en œuvre (voir 5.2.1.5) ;
— activité fongicide : réduction supérieure ou égale à 4 sur les supports-essais comparativement aux
supports-témoins non exposés au procédé, pour les deux souches fongiques (levure et moisissure) mises
en œuvre (voir. 5.2.1.6 – 5.2.1.7) ;
— activité levuricide : réduction supérieure ou égale à 4 sur les supports-essais comparativement aux
supports-témoins non exposés au procédé, pour la souche de levure mise en œuvre (voir 5.2.1.6) ;
— activité virucide : réduction supérieure ou égale à 4 sur les supports-essais comparativement
aux supports-témoins non exposés au procédé, pour la ou les souche(s) virale(s) mise(s) en œuvre
(voir 5.2.1.8 — 5.2.1.9 — 5.2.1.10) ;
— activité virucide contre les bactériophages : réduction supérieure ou égale à 4 sur les supports-essais
comparativement aux supports-témoins non exposés au procédé, pour la ou les souche(s) de
bactériophages(s) mise(s) en œuvre (voir 5.2.1.11 — 5.2.1.12) ;
— activité mycobactéricide : réduction supérieure ou égale à 4 sur les supports-essais comparativement aux
supports- témoins non exposés au procédé, pour la ou les souche(s) mycobactérienne(s) mise(s) en œuvre
(voir 5.2.1.13 et 5.2.1.14).
Ces activités peuvent être déterminées indépendamment.
Ces sept activités doivent être déterminées dans des conditions expérimentales de référence définies en 5.5.
Le cas échéant, une activité bactéricide, sporicide, fongicide, levuricide, virucide (virus humains)
bactériophagicide et mycobactéricide spécifique additionnelle peut être déterminée dans d’autres conditions de
durée de contact, nature des supports, micro-organismes, volume du local d’essais, hygrométrie, température,
conformément au 5.5 en vue de tenir compte des conditions qui correspondent à l’usage spécifique auquel les
procédés sont destinés.
Ces conditions additionnelles doivent être décrites, résumées et rapportées dans le rapport d’essai.
5 Méthode d'essai
5.1 Principe
5.1.1 Essai préliminaire de validation de l’absence d’effet résiduel
L‘essai préliminaire est effectué dans le but de révéler une éventuelle activité résiduelle due aux résidus de
désinfectant transportés par les supports, vers les milieux de subculture (en gélose et sur les membranes) et de
trouver une méthode pour l’éliminer. Ainsi, lors de l’essai proprement dit, une activité bactéricide, fongicide,
levuricide, sporicide, virucide y compris contre les bactériophages et mycobactéricide véritable est déterminée et
non un simple effet inhibiteur résiduel.
Exposition de supports non contaminés, au gaz ou au dispersat.
Récupération dans 100 mL (20 mL pour la virucidie) de liquide stérile et recherche de l’effet bactériostatique
(ou fongistatique ou d’inhibition de la germination des spores ou de réduction de sensibilité des cellules) dû au
désinfectant fixé sur les supports, qui pourrait avoir une action inhibitrice en milieu gélosé et sur les membranes
filtrantes ou une diminution du titre viral résiduel.
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La multiplication de ces deux phages doit être obtenue à partir de la souche hôte suivante : Lactococcus lactis
sous-espèce lactis F7/2 (DSM 4366).
g) Pour l’activité mycobactéricide et/ou tuberculocide :
- 5.2.1.13 Mycobacterium avium ATCC 15769 ;
- 5.2.1.14 Mycobacterium terrae ATCC 15755.
Si des micro-organismes d’essai additionnels sont utilisés, ils doivent être incubés dans des conditions de
croissance optimale (température, temps, atmosphère, milieu) qui seront mentionnées dans le rapport d’essai.
Si les micro-organismes d’essai additionnels choisis ne correspondent pas aux espèces spécifiées,
leurs aptitudes à fournir les inoculums nécessaires doivent être vérifiées. Si ces micro-organismes d’essai
additionnels ne sont pas répertoriés par un centre de collection, il est indispensable d’établir leurs caractéristiques
d’identification. De plus, ils doivent être référencés et conservés par le laboratoire d’essais ou le centre de
collection national pendant cinq ans.
5.2.2.1 Milieux de culture pour bactéries, levures, moisissures, spores bactériennes et mycobactéries
5.2.2.1.1 Généralités
Toutes les masses de substances chimiques indiquées dans ce document correspondent aux sels anhydres.
Les formes hydratées peuvent être employées mais les masses requises doivent être ajustées pour tenir compte
des différences de masse moléculaire.
Les réactifs doivent être de qualité analytique et/ou satisfaire aux besoins microbiologiques. Ils doivent être
exempts de substances toxiques ou inhibitrices pour les micro-organismes d’essai.
5.2.2.1.2 Eau
L’eau doit être fraîchement distillée sur verre et non déminéralisée.
Stériliser par autoclavage (5.3.2.1 a)).
NOTE 1 L’eau distillée stérile est nécessaire pour la préparation des suspensions de tests. En revanche, il n’est pas
toujours nécessaire de stériliser l’eau utilisée, par exemple, pour la préparation des milieux de culture qui sont ensuite
stérilisés.
NOTE 2 En l’absence d’eau distillée de qualité appropriée, il est possible d’utiliser de l’eau pour préparations injectables.
5.2.2.1.4 Gélose pour entretien des souches 5.2.1.1 à 5.2.1.4 voir 5.2.2.1.3 sans neutralisant
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5.2.2.1.7 Milieu pour l’entretien des souches 5.2.1.6 et 5.2.1.7 : voir 5.2.2.1.6 sans neutralisant
Préparation :
Dissoudre le chlorure de sodium et la Tryptone dans l’eau. Ajouter éventuellement un neutralisant spécifique du
désinfectant à l’étude.
Préparer le diluant en grands volumes puis répartir en récipients adaptés. Stériliser à l’autoclave.
1) Cette information est donnée par souci de commodité à l’intention des utilisateurs du présent document et ne
saurait constituer un engagement d’AFNOR à l’égard de ce produit. Des produits équivalents peuvent être
utilisés s’il est démontré qu’ils conduisent aux mêmes résultats.
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5.2.2.1.10 Gélose pour dénombrement des Mycobactéries cultivables (souches 5.2.1.13 et 5.2.1.14)
Voir Annexe F (F.1.2.1).
5.2.2.2 Milieux de culture et réactifs pour la préparation des virus (souches 5.2.1.8 à 5.2.1.10)
5.2.2.3 Milieux de culture et réactifs pour la préparation des bactériophages (souches 5.2.1.11 à 5.2.1.12)
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Stériliser par autoclavage. Après stérilisation, le pH du milieu doit être équivalent à 7,0 02 pour une mesure
à 20 °C.
Lorsque le bouillon M17 est le diluant utilisé pour préparer le neutralisant (voir NF EN 13610), il faut alors utiliser
le bouillon de culture M17 préparé à double concentration (c’est-à-dire qu’il convient de doubler la concentration
de tous les ingrédients qui sont ajoutés aux 1 000 mL d’eau).
5.2.2.3.5 Tampon SM
Pour la remise en suspension et la conservation intacte des particules phagiques :
Tris/HCl ........................................................................................... 2,4 g ;
NaCl ................................................................................................ 5,8 g ;
MgSO4, 7 H2O ................................................................................. 2,5 g ;
eau (voir 5.2.2.1.2) compléter à ................................................ 1 000 mL.
Ajuster le pH du tampon à 7,4 0,1. Stériliser par autoclavage.
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5.2.2.4.1 Généralités
Il faut choisir la ou les substance(s) interférente(s) selon le secteur d’application du procédé (voir l'Annexe D).
Il est toujours possible d’ajouter, du lait écrémé pour certains germes fragiles (par exemple Pseudomonas
aeruginosa) en plus des substances interférentes préconisées. La ou les substance(s) interférente(s) doivent) être
stérile(s) et préparée(s) 10 fois concentrées par rapport à la concentration finale dans l’essai.
Les méthodes de préparation et de stérilisation ainsi que la composition doivent être notées dans le rapport
d’essai.
Pour l’activité virucide, il convient d’utiliser l'albumine bovine (fraction V de Cohn) disponible dans le commerce et
la préparer comme suit :
— dissoudre 0,3 g d'albumine bovine dans 100 mL d'eau ;
— compléter avec de l’eau distillée jusqu’au trait de jauge ;
— stériliser par filtration sur membrane de 0,22 ;
— conserver au réfrigérateur durant un mois maximum ;
— la concentration finale en albumine bovine (SAB) dans l'essai est de 0,3 g/L.
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La concentration finale dans l’essai est de 10 g/L d’albumine bovine et 10 g/L d’extrait de levure.
NOTE La préparation de la condition de saleté de niveau élevé en présence de lait écrémé peut demander un protocole
spécifique et un ratio inoculum / substance interférente différent de 1/10ème pour des raisons de solubilité des ingrédients
et de la concentration élevée de la solution mère. Dans ce cas, il convient de tenir compte du ratio du mélange dans
les calculs.
5.2.2.4.1.3 Conditions pour désinfectants utilisés dans les domaines agroalimentaires, industriels, domestiques
et institutionnels
a) Conditions de propreté
Pour les activités bactéricides, mycobactéricides, fongicides, bactériophagicides, levuricides et sporicides, la
condition de propreté est représentée par l’utilisation du lait écrémé tel que décrit en 5.2.2.1.9 et dilué au 1/20ème
qui limite la perte au séchage pour les micro-organismes.
Pour les germes fragiles tels que définis en 3.6 (parmi les germes obligatoires seul Pseudomonas aeruginosa est
concerné) voir conditions en 5.2.2.4.1.1 a).
Pour l’activité virucide, il convient d’utiliser l'albumine bovine (fraction V de Cohn) disponible dans le commerce et
la préparer comme suit :
— dissoudre 0,3 g d'albumine bovine dans 100 mL d'eau (voir 5.2.2.1.2) ;
— stériliser par filtration sur membrane ;
— conserver au réfrigérateur durant un mois maximum ;
— la concentration finale en albumine bovine (SAB) dans l'essai est de 0,3 g/L.
Dissoudre 0,3 g de fraction V d’albumine bovine dans 100 mL d’eau dans une fiole jaugée de 100 mL.
Compléter jusqu’au trait de jauge avec de l’eau. Stériliser par filtration sur membrane de 0,22 .
La concentration finale d’albumine bovine dans l’essai est de 0,3 g/L et concerne les virus.
b) Conditions de saleté
Dissoudre 3 g de fraction V d’albumine bovine dans 100mL d’eau dans une fiole jaugée de 100 mL.
Compléter avec de l’eau distillée jusqu’au trait de jauge. Stériliser par filtration sur membrane de 0,22 et
conserver au réfrigérateur pour une durée d’un mois maximum.
La concentration finale de l’albumine bovine durant l’essai est de 3 g/L.
c) Conditions de saleté en présence de lait écrémé : Pour les germes fragiles tels que définis en 3.6 (parmi les
germes obligatoires seul Pseudomonas aeruginosa est concerné) voir conditions en 5.2.2.4.1.1 a).
Dissoudre 6 g de fraction V d’albumine bovine dans 90 mL d’eau dans une fiole jaugée de 100 mL.
Compléter avec de l’eau distillée jusqu’au trait de jauge. Stériliser par filtration sur membrane de 0,22 et
conserver au réfrigérateur pour une durée d’un mois maximum.
Mélanger volume pour volume avec du lait écrémé reconstitué (5.2.2.1.9).
La concentration finale de l’albumine bovine durant l’essai est de 3 g/L et le lait écrémé reconstitué est dilué
au 1/20ème.
NF T 72-281 — 18 —
Les solutions de petit-lait doivent être conservées entre 4 °C et 8 °C un mois au maximum. Pour des durées de
conservation plus longues, elles doivent être maintenues congelées à des températures comprises entre – 18 °C
et – 20 °C, ou plus basses.
Pour le mode opératoire d’essai, la concentration finale de la solution de petit-lait doit être égale à une fraction
volumique de 1,0 %.
b) Lait écrémé
Pour les conditions d’essai, préparer le lait écrémé reconstitué (1,5 % de teneur en matières grasses) de la
manière suivante :
— reconstituer le lait écrémé en poudre, garanti exempt d’antibiotiques ou d’additifs, à raison de 100 g/L d’eau
(voir 5.2.2.1.9) ;
— stériliser à la vapeur trois jours successifs (30 min chaque jour) à 100 °C et laisser à température ambiante
entre les traitements à la vapeur.
Ne pas laisser au réfrigérateur entre les traitements successifs à la vapeur.
Le lait écrémé non dilué est utilisé pour conserver la souche bactérienne hôte.
Il est également possible de stériliser à (115 3) °C pendant 15 min.
— Pour obtenir une solution de travail d’une fraction volumique égale à 10 %, requise comme substance
interférente facultative pour l’essai vis-à-vis des phages, diluer une partie de lait écrémé avec neuf parties
d’eau stérile (voir 5.2.2.1.2). Conserver le lait écrémé d’une fraction volumique de 10 % entre 4 °C et 8 °C.
Pour le mode opératoire d’essai, la concentration finale du lait écrémé doit être égale à une fraction volumique
de 1,0 %.
2) Les disques en acier inox peuvent généralement être obtenus localement auprès d’entreprises fabricantes.
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5.3.2.3 Incubateurs
— Incubateur bactériologique, ventilé ou non ventilé réglé à une température maximale de (37 1) °C pour le
séchage en moins de 2 h des supports contaminés.
— Incubateur pour l’activité bactéricide, pouvant être maintenu à (36 1) °C ou à (37 1) °C. Incubateur
(pour l’activité levuricide, fongicide sporicide, virucide et virucide envers les bactériophages), pouvant être
maintenu à (30 1) °C.
— Incubateur à CO2 (95 % air, 5 % CO2), capable d’être maintenu à (36 1) °C ou à (37 1) °C pour l’incubation
des cultures cellulaires et des virus.
5.3.2.5 Chronomètre
5.3.2.7 Appareils de filtration sur membrane, construit dans un matériau compatible avec les substances
à filtrer.
L’appareil doit avoir un entonnoir d’un volume utile au moins égal à 50 mL. Il doit être adapté à une utilisation avec
des filtres de 47 mm à 50 mm de diamètre et de 0,45 m de porosité.
La source de vide utilisée doit assurer un débit de filtration régulier. Afin d’obtenir une répartition uniforme des
micro-organismes sur la membrane et d’éviter une filtration trop longue, le dispositif doit être réglé pour
filtrer 100 mL de liquide de rinçage en 20 s à 40 s.
5.3.2.9 Pipettes graduées d’une capacité nominale de 10 mL, 2 mL, 1 mL et 0,1 mL. Des pipettes
automatiques calibrées peuvent être utilisées.
5.3.2.12 Filtre en verre fritté : porosité comprise entre 40 m et 100 m (ISO 4793) = porosité 2
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Pour : PIERRE LABAT
NF T 72-281 — 20 —
5.3.2.13 Centrifugeuse capable d’une accélération de 2 000 g (4 000 g minimum dans le cas des
bactériophages)
5.3.2.17 Pompe à vide (débit max. 3,8 m3/h, vide final 75 mbar)
5.3.2.18 Membranes filtrantes stériles à bords hydrophobes de porosité 0,45 m (diamètre 47 mm à 50 mm)
en esters de cellulose ou toute autre matière adaptée au produit à l’essai.
5.3.2.20 Microscope
— De préférence à contraste de phase (pour les essais de sporicidie) ;
— microscope inversé pour la lecture des essais de virucidie.
5.3.2.21 Pinces
5.3.2.26 Pipettes à embouts à usage unique, délivrant 0,05 mL = 50 l pour le dépôt de I’inoculum.
5.3.2.28 Agitateur magnétique pour conserver les cellules en suspension avant inoculation
5.3.2.29 Boites de Petri, tubes à essais stériles, flacons de culture de capacité appropriée
5.3.2.31 Plaques de micro-titration stériles 96 puits, plaques à six ou huit puits pour culture cellulaire et fioles
de culture cellulaire.
5.3.2.32 Une machine à glace ou de la glace du commerce pour refroidir le milieu de conservation cellulaire et
les mélanges réactionnels pendant l'essai
5.3.2.34 Enceinte de sécurité biologique, classe II (pouvant également servir lors de l’étape de séchage
des inoculums)
5.3.2.36 Dessiccateur avec manomètre de contrôle du vide ou l’utilisation de PSM ventilés comme alternative
pour l’opération de séchage des inoculums sur supports.
— 21 — NF T 72-281
b) Moisissures et levures :
Afin de préparer la culture de travail de Candida albicans, repiquer à partir de la culture stock sur gélose GEM et
incuber à (30 1) °C. Au bout de 42 h à 48 h, préparer un deuxième repiquage de la même manière à partir du
premier repiquage et incuber pendant 42 h à 48 h. Un troisième repiquage peut être réalisé de la même façon à
partir du deuxième.
NOTE 2 Le deuxième et/ou le troisième repiquage constituent la ou les cultures de travail.
S’il n’est pas possible de préparer un deuxième repiquage un jour particulier, il est admis d’utiliser un repiquage
de 72 h pour repiquage ultérieur, à condition que le repiquage ait été maintenu dans l‘incubateur pendant les 72 h.
Dans ce cas, préparer un autre repiquage de 48 h avant de faire l’essai. Ne pas effectuer un quatrième repiquage.
Pour Aspergillus brasiliensis utiliser un repiquage sur GEM dans des boites de Roux et incuber à (30 1) °C de
sept à neuf jours.
NF T 72-281 — 22 —
Ajuster le nombre de cellules de la suspension à l’aide du diluant (5.2.2.1.5), en estimant le nombre d’unités au
moyen d’un spectrophotomètre ou par un moyen approprié.
Ajouter à cette suspension selon le cas comme définie en 5.2.2.4.1.1, 5.2.2.4.1.2 et 5.2.2.4.1.3, le lait écrémé afin
d’obtenir une dilution de cette dernière au 1/20ème ou la substance interférente afin d’obtenir une dilution de cette
dernière au 1/10ème. Le titre final de bactéries doit être compris entre 5.107 et 2.109 UFC/mL.
Pour les germes fragiles tels que définis en 3.6 (parmi les germes obligatoires seul Pseudomonas aeruginosa est
concerné) deux adaptations méthodologiques sont proposées pour la prise en compte de la perte au séchage :
— il est admis d’augmenter la quantité de matière protectrice jusqu’à 1/5ème de lait écrémé reconstitué afin de
limiter la perte au séchage (quantité de germes non viables) en dessous de 1,5 log. Le titre initial témoin
minimal ainsi que l’objectif de réduction logarithmique requis pour revendiquer la conformité restent identiques
à ceux des germes de la catégorie, par exemple respectivement 6 log et 5 log respectivement pour
Pseudomonas aeruginosa ;
— il est admis d’augmenter l’inoculum initial jusqu’à 5.109 de façon à obtenir un titre de 6 log sur les supports
témoin aprés séchage.
Lors des essais les deux méthodes seront réalisées en parallèle. Dès lors qu’un des deux résultats est positif,
l’activité pourra être revendiquée. Les deux résultats devront cependant figurer sur le rapport.
Il appartient au laboratoire réalisant les essais de s’assurer de la précision des titres obtenus lors d’essais
préliminaires.
Conserver cette suspension dans le bain d’eau à (20 1) °C et l’utiliser dans les 2 h qui suivent sa préparation.
— 23 — NF T 72-281
Ajuster ensuite par ajout d’eau stérile (5.2.2.1.5) le nombre de spores dans la suspension en estimant le nombre
d’unités formant colonies par un moyen approprié.
Cette suspension d’essai ne doit pas être conservée plus de 2 j à une température comprise entre 2 °C et 8 °C.
Mélanger la suspension d’essai immédiatement avant usage afin de remettre les spores en suspension.
Ajouter à cette suspension, selon le cas comme définie en 5.2.2.4.1.1, 5.2.2.4.1.2 et 5.2.2.4.1.3, le lait écrémé
afin d’obtenir une dilution de cette dernière au 1/20ème ou la substance interférente afin d’obtenir une dilution de
cette dernière au 1/10ème. Le titre final d’Aspergillus brasiliensis doit être compris entre 5.106 et 1.107 UFC/mL.
Il appartient au laboratoire réalisant les essais de s’assurer de la précision des titres obtenus lors
d’essais préliminaires.
NF T 72-281 — 24 —
5.4.3.1 Bactéries
Dénombrement des suspensions bactériennes d’essai :
Diluer les suspensions bactériennes ajustées (voir 5.4.2.1) jusqu’à 10-6, 10-7 et 10-8 dans le diluant 5.2.2.1.5.
Les dénombrements sont réalisés en parallèle par inclusion N1 et par filtration N2.
Inclusion : prélever en double un échantillon de 1,0 mL de chaque dilution et inoculer par ensemencement en
profondeur N1. À l’aide d’une pipette, introduire chaque échantillon de 1,0 mL dans des boîtes de Petri distinctes
et ajouter 15 mL à 20 mL de gélose TSA en surfusion et refroidies à (45 1) °C pour les bactéries.
Filtration : prélever en double un échantillon N2 de 1,0 mL de chaque dilution et transférer chaque échantillon
de 1,0 mL dans un appareil distinct de filtration sur membrane (5.3.2.7). Filtrer immédiatement. Filtrer en faisant
passer du liquide de rinçage (5.2.2.1.8) de la même manière que lors de l’essai (5.5.1.4.3). Puis déposer chacune
des membranes sur la surface du milieu gélosé (5.2.2.1.3).
Pour les souches bactériennes, incuber les boîtes à (36 1) °C ou à (37 1) °C pendant 24 h. Écarter toutes les
boîtes sur lesquelles il n’est pas possible de compter les colonies, pour quelque raison que ce soit. Incuber les
boîtes 24 h de plus. Ne pas recompter les colonies sur les boîtes qui ne présentent plus de colonies bien
séparées. Les recompter sur les boîtes restantes.
Soit N1 le nombre de colonies obtenu par inclusion, et N2 le nombre de colonies par filtration qui sera effectuée
en parallèle.
Pour les souches fongiques, incuber les boîtes à (30 1) °C pendant 24 h (Candida albicans) et pendant 42 h
à 48 h (Aspergillus brasiliensis). Écarter toutes les boîtes sur lesquelles il n’est pas possible de compter les
colonies, pour quelque raison que ce soit. Compter les boîtes et déterminer le nombre de colonies formant unités.
Incuber les boîtes 24 h de plus. Ne pas recompter les colonies sur les boîtes qui ne présentent plus de colonies
bien séparées. Les recompter sur les boîtes restantes.
Pour Aspergillus brasiliensis, poursuivre l’incubation entre 20 h et 24 h de plus et, si nécessaire, encore 20 h
à 24 h, à condition que le nombre de colonies (petites colonies) augmente.
Soit N1 le nombre de colonies obtenu par inclusion, et N2 le nombre de colonies par filtration qui sera effectuée
en parallèle.
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— 25 — NF T 72-281
5.4.3.3 Spores
Pour le dénombrement de la suspension d’essai de spores, préparer des dilutions à 10-4 et 10-5 de la suspension
d’essai en utilisant le diluant (5.2.2.1.5).
Les dénombrements sont réalisés en parallèle par inclusion N1 et par filtration N2.
Inclusion : prélever en double un échantillon de 1,0 mL de chaque dilution et transférer chaque échantillon
de 1,0 mL sur des boîtes de Petri distinctes et ajouter entre 12 mL et 15 mL de gélose glucosée à l’extrait de
levure GGL (5.2.2.1.10) en surfusion refroidie à (45 1) °C.
Filtration : prélever en double un échantillon N2 de 1,0 mL de chaque dilution et transférer chaque échantillon
de 1,0 mL dans un appareil distinct de filtration sur membrane (5.3.2.7). Filtrer immédiatement. Filtrer en faisant
passer du liquide de rinçage (5.2.2.1.8) de la même manière que lors de l’essai (5.5.4.3). Puis déposer chacune
des membranes sur la surface du milieu gélosé (5.2.2.1.11).
Incuber les boîtes de Petri à (30 1) °C pendant 3 j. Déterminer le plus grand nombre de colonies pour
chaque boîte. Calculer le nombre d’UFC/mL dans la suspension d’essai.
Soit N1 le nombre de colonies obtenu par inclusion, et N2 le nombre de colonies par filtration qui sera effectuée
en parallèle.
5.4.3.4 Mycobactéries
Pour le dénombrement de la suspension d’essai : voir F.2.2 de l’Annexe F.
NOTE 2 Pour vérifier la qualité de la suspension virale, une évaluation des protéines (i.e. méthode de Lowry) pourra être
réalisée pour une meilleure reproductibilité.
NOTE 3 Le titre de la suspension viral doit tenir compte de la perte occasionnée par l’étape de séchage des supports
contaminés (5.5.1.2.1 et 5.5.2)
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— 27 — NF T 72-281
NF T 72-281 — 28 —
Choisir parmi les boîtes ensemencées à partir des dilutions en cascade celles qui présentent une lyse confluente.
Sur ces boîtes, les plages doivent se toucher et un fin tapis de cellules restantes non lysées doit être à peine
visible. 3) Ne pas choisir des boîtes sur lesquelles le tapis bactérien a été entièrement éliminé ou sur lesquelles
les plages individuelles ne se touchent pas (c’est-à-dire sur lesquelles les plages sont totalement isolées),
car il n’est pas possible d’obtenir des lysats de titre élevé à partir de ces boîtes.
Prélever les phages sur les boîtes de gélose qui révèlent une lyse confluente en grattant la gélose molle avec une
baguette en verre coudée stérile, et les transférer dans un tube ou une fiole à centrifuger.
Rincer soigneusement chaque boîte avec 5 mL de tampon SM (voir 5.2.2.3.5) et verser ces tampons dans les
tubes à essai (à centrifuger) correspondant aux boîtes.
Agiter doucement les tubes de temps à autre pendant au moins 15 min à température ambiante.
Faire sédimenter la gélose molle et les débris cellulaires par centrifugation (c’est-à-dire pendant 15 min à 4 000 g).
Le surnageant doit être filtré à travers une membrane filtrante (voir 5.3.2.7).
Les phages provenant d’une même souche mais récoltés sur différentes boîtes doivent être regroupés avant de
déterminer le titre de la suspension de phages.
NOTE 2 Un lysat de phages préparé selon cette méthode est quasiment exempt de contamination protéique.
D’une manière générale, les titres des suspensions de phages ainsi obtenus se situent entre 1 1010 et 5 1011 UFP/mL).
Conserver la suspension de bactériophages de titre élevé entre 4 °C et 8 °C pendant trois mois au maximum.
3) La lyse confluente se produit généralement sur les boîtes de gélose ensemencées à partir des dilutions de
rangs 10-3 ou 10-4.
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Pour : PIERRE LABAT
— 29 — NF T 72-281
Pour le dénombrement des suspensions de bactériophages de titre élevé, préparer des dilutions en série dans le
diluant pour phages (voir 5.2.2.3.4). Pour ce faire, ajouter 1,0 mL de la suspension de bactériophages de titre
élevé à 9,0 mL du diluant pour phages. Mélanger et préparer de la même façon les dilutions suivantes jusqu’à la
dilution 10-9. Prélever en double un échantillon de 0,1 mL dans les dilutions 10-8 et 10-9 et verser chaque
échantillon de 0,1 mL dans un tube à essai distinct. Ajouter 0,3 mL d’une culture bactérienne de travail de 16 h
à 24 h dans le bouillon de culture M17 (voir 5.4.4.3.1.6). Ajouter 0,1 mL d’une solution de CaCl2 à 0,05 mol/L
(voir 5.2.2.3.6), mélanger brièvement et incuber 10 min à température ambiante pour permettre l’adsorption des
phages sur les cellules bactériennes hôtes.
Ajouter 2,5 mL à 3 mL de gélose de recouvrement M17 (voir 5.2.2.3.3), préalablement mise en surfusion dans
un bain d’eau bouillante ou dans un four à micro-ondes puis refroidie dans un bain d’eau à (47 1) °C.
Mélanger brièvement, puis étaler uniformément les échantillons dans des boîtes contenant de la gélose de
fond M17 (voir 5.2.2.3.2). Pour obtenir une répartition homogène des échantillons, il faut incliner lentement les
boîtes à la main avant solidification de la gélose de recouvrement.
NF T 72-281 — 30 —
— 31 — NF T 72-281
— Le tableau ci-dessous décrit des modalités de mise en œuvre selon le cas rencontré.
NOTE
Limite haute du volume 150 m3 150 m3 et à préciser par le fabricant À préciser par le fabricant
d'usage du procédé
selon la revendication
du fabricant
Tests requis Tests en conditions Tests en conditions obligatoires dans Test en fonction de la technologie de
obligatoires dans un un volume entre 30 m3 et 150 m3 l'appareil et des salles de tests disponibles
volume entre 30 m3 + comme indiqué ci-dessous :
et 150 m3 Tests conformément au document
dans le volume maximum revendiqué
par le fabricant en fonction des salles
de test disponibles comme indiqué
ci-dessous :
Disponibilité d’une salle d'essai Disponibilité d’une salle d'essai
correspondant au volume maximum correspondant au volume maximum
revendiqué, dans laquelle il est revendiqué, dans laquelle il est possible de
possible de manipuler les manipuler les micro-organismes tests
micro-organismes tests (classe 2) (classe 2) spécifiés dans le document
spécifiés dans la norme
ð Oui : Les tests seront réalisés sur ð Oui : Les tests seront réalisés sur ces
ces souches en suivant les exigences souches en suivant les exigences du
du document document
ð Non : Les tests seront réalisés dans ð Non : Les tests seront réalisés avec
le volume maximum d’application du l'appareil destiné aux grands volumes ou
procédé avec des souches de classe avec un autre appareil de technologie du
1 selon les exigences décrites même type adapté au volume du local
ci-dessous (*) (dans le cas où il n'est pas possible
techniquement d'utiliser le même appareil),
dans un volume compris entre 30 m3 et
150 m3 avec les micro-organismes de
référence en suivant les exigences du
document et des tests complémentaires
doivent être faits dans le volume maximum
d’application du procédé avec l'appareil
destiné à l'usage dans les grands volumes
avec des souches de classe 1 selon les
exigences décrites ci-dessous (*)
Les résultats doivent être conformes Les essais dans les deux conditions devront
aux exigences requises dans les deux être réalisés avec une dose de produit
conditions expérimentales, pour diffusée par m3 et un temps de contact,
statuer de la conformité au document identiques.
Les résultats doivent être conformes aux
exigences requises dans les deux
conditions expérimentales, pour statuer de
la conformité au document.
NF T 72-281 — 32 —
NOTE 2 Il a été observé lors d’essais qu’une température basse (23 1) °C et un séchage doux était moins traumatisant
pour les germes sensibles.
Afnor, Normes en ligne le 27/01/2015 à 11:20 NF T72-281:2014-11
Pour : PIERRE LABAT
— 33 — NF T 72-281
Une fois le séchage réalisé, la période d’exposition au procédé de désinfection commence (période plus ou moins
longue définie par les fabricants pour obtenir l’inactivation des micro-organismes). Les supports témoins seront
non exposés au désinfectant et conservés au laboratoire pendant la durée du temps de contact. En fin de période
d’exposition on procèdera au dénombrement des deux supports (voir 5.5.1.2.2).
NOTE 3 Sachant que le titre initial obtenu sur les supports témoins et la quantité de germes non-viables à la surface de
l’inoculum (perte N-T) peuvent avoir un impact sur les résultats et sur les conclusions de conformité au document, il pourra
être requis, pour certains procédés d’ajuster les titres initiaux avec précision juste au-dessus des limites fixées par la
norme. De même la méthode de séchage devra être sélectionnée avec soin, en particulier pour les germes connus pour
leur sensibilité au séchage.
NOTE 4 Dans le cas de tests effectués sur un même procédé et conduisant à des conclusions de conformité au
document opposées, une répétition des essais est recommandée avec une méthode de séchage correspondant à la perte
la plus faible et un titre ajusté à la valeur la plus basse.
Quel que soit la méthode de séchage choisie elle devra être documentée dans le rapport d’essais et permettre
l’obtention d’un titre microbien et d’une quantité de matière interférente conformément aux critères du document.
NF T 72-281 — 34 —
Après une nouvelle agitation rapide, diluer 1 mL du liquide de récupération dans 9 mL de diluant pour phage
(voir 5.2.2.3.4) et continuer à effectuer des dilutions successives jusqu’à la dilution 10-3 (dilution à adapter selon
les titres des suspensions préparées).
Prélever en double 0,1 mL des dilutions 10-2 et 10-3 et transférer chaque échantillon dans un tube à essai distinct.
Ajouter 0,3 mL d’une culture bactérienne de travail de 16 h à 24 h dans le bouillon de culture M17 (5.4.5.2).
Ajouter 0,1 mL de solution de CaCl2 à 50 mmol/L (voir 5.2.2.3.6), mélanger brièvement et incuber 10 min à
température ambiante pour permettre l’adsorption des phages sur les cellules bactériennes hôtes.
Ajouter 2,5 mL à 3 mL de gélose de recouvrement M17 (voir 5.2.2.3.3), préalablement mise en surfusion dans un
bain d’eau bouillante puis refroidie dans un bain d’eau à (45 1) °C. Mélanger brièvement, puis étaler uniformément
les échantillons sur les boîtes de gélose de fond M17 (voir 5.2.2.3.2). Pour obtenir une répartition homogène des
échantillons, il faut incliner lentement les boîtes à la main avant solidification de la gélose de recouvrement.
Pour chaque souche, dénombrer le nombre de phages dans le milieu gélosé, déterminer les moyennes pour les
dilutions précitées et rapporter le résultat au nombre de phages récupérés sur les supports, soit T.
5.5.1.3.1 Récupération des résidus de désinfectant à la surface des supports et recherche de leur éventuel effet
antimicrobien
Réaliser au minimum deux supports :
— à une distance d définie dans le tableau en Annexe B, inoculum en position verticale orienté dans la direction
opposée à l’appareil de désinfection pour les procédés automatiques ;
— sur lesquels le spray dirigé sera pulvérisé pour les sprays dirigés.
Préparation des supports
Déposer avec une pipette de précision 0,05 mL = 50 L soit de lait reconstitué dilué au 1/20ème soit de substance
interférente seule diluée au 1/10ème v/v dans le diluant 5.2.2.1.5.
Pour les germes fragiles tels que définis en 3.6 déposer 50 L de lait reconstitué au 1/5ème pour les essais
retenant cette option.
Laisser sécher les supports comme en 5.5.1.2.1.
Mise en contact des supports avec le produit à essayer
Exposer les supports au produit dispersé dans le local d’essai ou pulvériser le spray dirigé à leur surface,
afin d’obtenir la même fixation de désinfectant que lors d’un essai.
Récupération du désinfectant déposé
Retirer les supports après le temps de contact revendiqué par le fabricant et les transférer dans 100 mL de liquide
de récupération.
Soit S cette solution de recueil.
— 35 — NF T 72-281
NF T 72-281 — 36 —
Répartir les trois supports par souche à une hauteur (h) comprise entre 1 m – 1,5 m, à une distance (d) définie
dans le tableau en Annexe B en fonction du volume du local.
Position des supports : verticale.
Orientation : inoculum microbien orienté dans la direction opposée à l’appareil de désinfection.
Mettre le procédé en marche et diffuser le produit pendant le temps préconisé selon le volume du local. Déterminer
précisément les quantités diffusées par pesées ou mesures volumétriques.
Retirer les supports après le temps d’exposition revendiqué par le fabricant.
Le local devra être aéré après chaque essai et les supports traités devront être transférés aussitôt après l’essai
dans le liquide de récupération.
Fournir un schéma d’essai à l’échelle, indiquant précisément les contours du local, la position de l’appareil de
désinfection ainsi que des porte-germes pour chacune des manipulations effectuées.
Le cas particulier des UV non dirigés est décrit en Annexe E.
NOTE La méthode qui y est décrite représente les conditions de test considérées comme minimale pour pouvoir
revendiquer une désinfection par voie aérienne selon le présent document mais ne préjuge pas de l’efficacité de ces UV
par exposition directe.
5.5.1.4.3 Dénombrement des bactéries, des mycobactéries, des levures, des moisissures, des spores
bactériennes et des bactériophages récupérés
Transférer chaque support, dès qu’il est retiré du local d’essai ou dès la fin du temps de contact avec le
dispersat dirigé, dans un contenant 100 mL de liquide de récupération stérile (5.2.2.1.8).
Agiter manuellement pendant quelques secondes. Avec un agitateur de verre stérile ou à l’aide de la pointe
d’une pipette, gratter pendant 1 min au moins en tous sens la surface du disque acier pour détacher les
micro-organismes. Utiliser éventuellement un vibreur ultrasonique (5.3.2.27).
Après nouvelle agitation rapide, diluer 1 mL du liquide de récupération dans 9 mL de diluant 5.2.2.1.5 et continuer
à effectuer des dilutions successives jusqu’à la dilution 10-3.
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Pour : PIERRE LABAT
— 37 — NF T 72-281
Transférer deux fois 1 mL du liquide de récupération pur et/ou de ses dilutions 10-1 10-2 et/ou 10-3 en fonction de
l’efficacité présumée du procédé, en boîtes de Petri pour en réaliser le dénombrement par inclusion dans le milieu
gélosé adapté (5.2.2.1.3, 5.2.2.1.6 et 5.2.2.1.11). Pour les bactériophages, utiliser la même méthode de
dénombrement qu’en 5.5.1.2.3. Verser d’une part 10 mL du liquide de récupération sans faire tomber le support
dans un appareil de filtration stérile, puis séparément dans un autre appareil de filtration le restant du liquide
(environ 87 mL). (La technique par filtration n’est pas applicable pour les bactériophages et ne sera donc
pas réalisée.)
Filtrer, laver la membrane trois fois avec 50 mL de liquide de récupération (5.2.2.1.8) qui aura été versé au
préalable et agité dans la fiole conique avec le support.
Transférer ensuite la membrane sur le milieu gélosé pour dénombrement (5.2.2.1.3), (5.2.2.1.6), (5.2.2.1.10),
(5.2.2.1.11), solidifiée en couche de 4 mm d’épaisseur.
Prélever aseptiquement chaque support et les poser dans une boîte de Petri inoculum vers le haut. Couler une
quantité suffisante de gélose pour recouvrir le support de façon homogène.
Pour les bactériophages : Déposer les supports sur fond de gélose M17. Mélanger dans un tube 0,3 mL d’une
culture bactérienne de travail de 16 h à 24 h dans le bouillon de culture M17 et 0,1 mL de solution de CaCl2
à 50 mmol/L, mélanger brièvement et incuber 10 min à température ambiante. Ajouter 2,5 mL à 3 mL de gélose
de recouvrement M17, préalablement mise en surfusion dans un bain d’eau bouillante ou un four à micro-ondes
puis refroidie dans un bain d’eau à (47 1) °C. Mélanger brièvement, puis étaler uniformément les échantillons
sur les boîtes de gélose de fond M17 contenant les supports.
Procéder de même pour chacun des temps de contact et des souches d’essai et pour chacun des supports.
5.5.2.1 Généralités
Avant d'effectuer un essai, équilibrer tous les réactifs — à l'exception de la suspension virale d'essai —,
c'est à dire la substance interférente, l'eau, le milieu de culture cellulaire, le diluant et la solution d'essai du produit
à (20 3) °C ou (10 2) °C au moyen d'un bain thermostaté.
Les tubes sont remplis de milieu (MEM 2 % SFV) glacé pour les divers titrages qui doivent être réalisés après les
différents temps de contact et placés dans un bain de glace fondante. Les plaques de microtitration sont
étiquetées pour identification.
Afnor, Normes en ligne le 27/01/2015 à 11:20 NF T72-281:2014-11
Pour : PIERRE LABAT
NF T 72-281 — 38 —
5.5.2.2.1 Récupération des résidus de désinfectant sur le support et évaluation de l’effet virucide potentiel
— 39 — NF T 72-281
NF T 72-281 — 40 —
5.5.3 Mode opératoire pour évaluer l’activité mycobactéricide du procédé : description dans l’Annexe F
(voir F.3)
Les conditions expérimentales des essais sont décrites en 5.5.1.4.2.1 pour procédés automatiques et en 5.5.1.4.2.2
pour procédés dirigés.
— 41 — NF T 72-281
EXEMPLE On obtient pour 1 mL de suspension de S. aureus : 233 et 215 colonies à 10-6 et, 27 et 21 colonies à 10-7.
Le taux de germes dans la suspension N s’obtient en faisant :
T = [(225 + 232 + 21 + 23) / 2,2] 102 100 = 228 104 = 2,3.106 germes/support
Pour le calcul des phages sur les supports témoins (T), formule de calcul spécifique pour les bactériophages :
Le nombre de phages par support T s'obtient en faisant :
c/((n1 + 0,1 n2) d V)) 100 où V = 0,1 ml dans le cas des phages dénombrés sur support.
5.6.6 Détermination du nombre de germes et de plages sur les supports-essais après contact et du taux
de réduction logarithmique d (5.5.1.4.3)
Pour les supports essais, n’1 représente le nombre de germes (ou de plages) survivants dans 100 mL de liquide
de reprise ; il s’obtient :
— soit à partir de la filtration de 87 mL de liquide de reprise (en faisant la règle de 3) ;
Si le dénombrement sur une membrane est supérieur à 165 pour les bactéries et levures ou 55 pour les moisissures,
consigner le nombre comme > 165 (ou > 55).
— soit à partir de la filtration de 10 mL de liquide de reprise ;
— soit à partir du nombre de colonies ou de plages obtenu à partir de 1 mL de liquide de reprise, ou d’une dilution
du liquide de reprise ;
— soit à partir de deux dilutions successives si le calcul pondéral est possible.
Le nombre n’2 est le nombre de colonies (ou de plages) obtenu directement par inclusion du support d’essai.
Si le dénombrement sur une boîte est supérieur à 330 pour les bactéries et levures ou 165 pour les moisissures
et les phages, consigner le nombre comme 330 (ou 165). Pour les phages noter 165 UFP.
La somme n’1 + n’2 correspond au nombre total de germes (ou de phages) survivants par support essai.
Le taux de réduction logarithmique d s’obtient en prenant en compte d’une part le nombre de germes (ou de phages)
sur les témoins T, d’autre part le nombre de germes (ou de phages) survivants n’1 + n’2.
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NF T 72-281 — 42 —
Une fois la réduction logarithmique obtenue pour chaque support d’essais, la moyenne des trois supports
sera réalisée.
Pour considérer qu’un procédé de décontamination est conforme, il est impératif que la moyenne de réduction
logarithmique soit supérieure ou égale aux exigences rappelées dans le Tableau 1.
Si les dénombrements amenant au calcul de n’1 et n’2 sont tous égaux à 0, alors la valeur lue de d = log T.
EXEMPLE 1 Nombres de colonies dans l’intervalle comptable et taux de réduction intermédiaire.
Soit un essai avec C. albicans et un témoin T = 4,5.106 germes/support.
Les germes survivants dénombrés sont :
— 22 colonies en moyenne pour 1 mL de liquide de reprise pur ;
— 15 colonies en moyenne pour l’inclusion du support en gélose.
n’1 = 22 100 = 2,2.103 germes/100 mL ;
n’2 = 15.
Alors, le résultat obtenu est :
d = log [T / (n’1+n’2)] = log [4,5.106 / (2,2.103 +15)] soit d = 3,3.
NOTE Dans le cas où une des valeurs n’1 et/ou n’2 est indéterminable ( à une des limites mentionnées en 5.6.1),
le calcul peut être néanmoins effectué en prenant pour hypothèse n’1 ou n’2 = à la limite mentionnée et en rendant une
activité à la valeur calculée en log pour cette limite :
EXEMPLE 2 Nombres de colonies 330 et taux de réduction d réduit.
Soit un essai avec C. albicans et un témoin T = 4,5.106 germes/support.
Les germes survivants dénombrés sont (pour les trois supports) :
— 330 colonies pour 1 mL de la dilution 10-1 du liquide de reprise ;
— 330 colonies pour l’inclusion du support en gélose.
Alors :
n’1 330 10 100 soit 3,3.105 germes/100 mL ;
n’2 330.
On a donc d = log [T / (n’1 + n’2)] = log [4,5.106 / (3,3.105 + 330)] soit d 1,1 log.
EXEMPLE 3 Nombres de colonies peu élevé et taux de réduction d fort.
Soit un essai avec C. albicans et un témoin T = 4,5.106 germes/support.
Les germes survivants dénombrés sont (pour les trois supports) :
— 3 colonies dans 87 mL de liquide de reprise filtré ;
— 0 colonies dans 10 mL de liquide de reprise filtré ;
— 0 colonies dans 1 mL de liquide de reprise pur et dilué 10-1 filtré ;
— 0 colonies pour l’inclusion du support en gélose.
Alors :
n’1 = 3 ;
n’2 = 0.
On obtient donc d = log [T / (n’1 + n’2)] = log [4,5.106 / (3 + 0)] soit d = 6,17 log.
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— 43 — NF T 72-281
NF T 72-281 — 44 —
— quantités de produit utilisées : temps de diffusion, quantité initiale mise en œuvre dans le cas d'un procédé de
diffusion faisant appel à une réaction chimique, dose en g ou mL/m3 de local, débit mesuré de l’appareil ;
— supports : nature et disposition dans le local (distance de l’appareil, orientation) ;
— durée d’exposition depuis l’instant de la fin de diffusion au retrait du local.
Joindre un schéma d‘essai à l’échelle pour chaque manipulation effectuée.
Observations
— nature des supports ;
— distance entre l’appareil et les supports ;
— temps d’émission du produit dispersé (si mesurable) ;
— temps d’action (si mesurable) ;
— quantité moyenne de produit dispersé fixé par support ;
— vitesse d’évaporation (si mesurable).
NOTE 2 Séparer les conditions obtenues avec les 2 types de procédés de dispersion : sans pression et avec pression.
Conclusions
— Faire apparaitre la mention « conforme » ou « non conforme » pour chaque catégorie de micro-organisme
ainsi que les réductions logarithmiques obtenues pour chaque germe.
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— 45 — NF T 72-281
voir interprétation
NORME n1 0,5 N1 n2 0,5 N2 n3 0,5 N1
(5.7)
5.107 à 5.109
P. aeruginosa 1.106 par support d1
UFC/mL
5.107 à 2.109
BACTÉRIES
5.107 à 2.109
E. coli 1.106 par support d3
UFC/mL
5.107 à 2.109
E. hirae 1.106 par support d4
UFC/mL
SPORES
2.107 à 1.108
ET MOISISSURES
5.106 à 1.107
A. brasiliensis 1.105 par support d7
UFC/mL
1.107 à 1.109
Adenovirus 1.105 par support d8
UFC/mL
VIRUS
1.107 à 1.109
Norovirus 1.105 par support d9
UFC/mL
1.107 à 1.109
Enterovirus 1.105 par support d10
UFC/mL
8.108 à 3.109
BACTÉRIOPHAGES
8.108 à 3.109
P008 1.105 par support d12
UFP/mL
MYCOBACTÉRIES
NF T 72-281 — 46 —
Annexe A
(normative)
Préparation des suspensions stocks
de spores de Bacillus subtilis
Init numérotation des tableaux d’annexe [A]!!!
Init numérotation des figures d’annexe [A]!!!
Init numérotation des équations d’annexe [A]!!!
— 47 — NF T 72-281
Annexe B
(normative)
Distances appareil de désinfection –
porte-germes à mettre en œuvre
Tableau B.1
Conditions obligatoires
[30 – 40 m3 [ 2,6 m
au 2/3 de la diagonale
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NF T 72-281 — 48 —
Annexe C
(normative)
Schémas d’essais
Init numérotation des tableaux d’annexe [C]!!!
Init numérotation des figures d’annexe [C]!!!
Init numérotation des équations d’annexe [C]!!!
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NF T 72-281 — 50 —
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— 51 — NF T 72-281
Comparer n1 et n3 à N1 et n2 à N2
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NF T 72-281 — 52 —
Annexe D
(normative)
Tableau récapitulatif des conditions de test
et objectifs en fonction des revendications d’activité
Init numérotation des tableaux d’annexe [D]!!!
Init numérotation des figures d’annexe [D]!!!
Init numérotation des équations d’annexe [D]!!!
Tableau D.1
Conditions obligatoires : Titre témoin minimal (log10) / Objectifs de réduction logarithmique (log10)
P001 NA NA 5/4
Bactériophages
P008 NA NA 5/4
Conditions additionnelles pour les trois domaines : Titre témoin minimal (log10) / Objectifs de réduction logarithmique (log10)
selon le microorganisme éventuel.
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— 53 — NF T 72-281
Substances interférentes
Conditions obligatoires :
Type de support
Étalement
Étalement circulaire sur 3 cm2 (2 cm de diamètre) de façon à obtenir une répartition uniforme de l’inoculum et de la surface
interférente
Méthode de séchage
120 min au maximum à température maximale de (37 1) °C sous PSM, en étuve ventilée ou non
Conditions d’essais
NF T 72-281 — 54 —
Annexe E
(informative)
Méthodologie spécifique liée à l'évaluation
de l'efficacité antimicrobienne des procédés
de désinfection par rayonnement Ultra-violet non-dirigés
E.1 Généralités
La méthode décrite dans cette annexe concerne spécifiquement l’évaluation de l'efficacité antimicrobienne des
procédés de désinfection par rayonnement Ultra-Violet non-dirigés selon le présent document.
Les procédés de rayonnement par Ultra-violets sont caractérisés, entre autres, par l’intensité la longueur d’onde
du rayonnement, leur intensité exprimé en Watt/cm2, et la dose d’exposition (intensité Temps) couramment
exprimée en mJ/cm2.
L'efficacité des procédés de désinfection par rayonnement Ultra-Violet dépend de la distance entre les supports
et la source émettrice. Elle est également influencée par la présence d’obstacle pouvant générer des zones
d’ombre. La nature des surfaces rencontrées peut conduire à la réflexion des rayonnements UV vers des surfaces
non directement exposées à la source de rayonnements Ultra-violets.
Afin d’établir une évaluation représentative de la réalité, les supports de test seront donc positionnés dans une
zone d’ombre face à un mur dont les propriétés réfléchissantes comme indiqué à l’Article 3 de cette annexe.
Bien que l’efficacité des procédés de décontamination par rayonnement UV soit dépendante des conditions
d’utilisation, des conditions de tests spécifiques sont définies pour vérifier la conformité aux exigences de
performance de ce document. Si les conditions d’utilisation préconisées par le fabricant diffèrent des conditions
d’essais décrites dans la présente annexe, le fabricant doit réaliser des essais complémentaires pour démontrer
la conformité aux exigences du présent document dans les conditions d’utilisation préconisées (conditions
complémentaires obligatoires). L’efficacité de désinfection des systèmes de décontamination par UV devra
cependant être toujours démontrée selon les conditions obligatoires conformément aux tests décrits ci-après.
Le reste de la pièce ne doit pas être constitué de matériaux réfléchissants aux UV (miroirs, surfaces métalliques,
etc.) ou fortement absorbants (verre, bois, etc.).
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Pour : PIERRE LABAT
— 55 — NF T 72-281
La distance entre les supports et le mur peint (E.2.a)) doit être de 0,5 m et ininterrompue.
Figure E.1 — Exemple de positionnement dans une salle de test (30 m3 à 150 m3)
lors d’une désinfection par procédés aux UV
NF T 72-281 — 56 —
Annexe F
(normative)
Mode opératoire pour l’évaluation
de l’activité mycobactéricide
Init numérotation des tableaux d’annexe [F]!!!
Init numérotation des figures d’annexe [F]!!!
Init numérotation des équations d’annexe [F]!!!
Init numérotation des tableaux d’annexe [G]!!!
Init numérotation des figures d’annexe [G]!!!
Init numérotation des équations d’annexe [G]!!!
Init numérotation des tableaux d’annexe [H]!!!
Init numérotation des figures d’annexe [H]!!!
Init numérotation des équations d’annexe [H]!!!
F.1.3 Appareil
F.1.3.1 Homogénéisateur à haute vitesse, par exemple homogénéisateur POTTER
— 57 — NF T 72-281
b) Ajouter au surnageant, les substances interférentes pour les désinfectants utilisés dans les trois domaines
d’activité.
Neuf volumes de surnageant mélangés à un volume de substance interférente.
Ajuster le nombre de cellules de la suspension d’essai à l’aide de diluant (5.2.2.1.5), Le nombre de cellules
peut être estimé au moyen d’un spectrophotomètre ou d’un néphélémètre.
Le titre final de la suspension d’essai doit être compris entre 1,0 107 UFC/mL et 1,0 108 UFC/mL.
Conserver cette suspension d’essai dans le bain d’eau à (20 1) °C et utiliser la préparation dans la
journée.
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Pour : PIERRE LABAT
NF T 72-281 — 58 —
b) Incubation
Incuber les boîtes pendant 21 j à (36 1) °C (F.2.1.2). Écarter toutes les boîtes sur lesquelles il n'est pas possible
de compter les colonies. Compter les boîtes afin de déterminer le nombre d'unités formant colonie (UFC) sur
chaque boîte.
Incuber les boîtes pendant 7 j supplémentaires. Ne pas recompter celles où les colonies ne se présentent plus de
façon bien séparée. Recompter les boîtes restantes. Si le nombre a augmenté, ne retenir que le nombre le plus
élevé pour les calculs ultérieurs.
Pour chaque boîte, noter le nombre exact de colonies :
Sur gélose : noter 330 chaque fois que le nombre est supérieur à 330.
Si une valeur de est inférieure à 14, consigner le nombre (mais remplacer par « 14 » pour les calculs ultérieurs).
Sur membranes : Noter 165, chaque fois que le nombre est supérieur à 330.
Si une valeur de est inférieure à 14, consigner le nombre (mais remplacer par « < 14 » pour les calculs ultérieurs).
Calculer le nombre d’UFC/mL dans la suspension d’essai N1 et N2 au moyen de la méthode indiquée à l’Article
6 du présent document.
— 59 — NF T 72-281
NF T 72-281 — 60 —
F.3.2.4 Recherche d’un effet inhibiteur du au support dans le milieu gélosé noté n3
Dans une boite de Petri contenant 18 Ml à 20 mL de gélose 7H10 solidifiée (F1.2.1), déposer le support exposé
au produit.
Déposer 1 mL de la dilution 10-5 ou 10-6 sur la surface de la gélose (F.2.2 a)).
Comparer à N1 le nombre de colonies obtenues.
— 61 — NF T 72-281
Bibliographie
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de l'activité bactéricide de base des antiseptiques et des désinfectants chimiques — Méthode d'essai et
prescriptions (phase 1) (indice de classement : T 72-152)
[2] NF EN 1650+A1, Antiseptiques et désinfectants chimiques — Essai quantitatif de suspension pour
l'évaluation de l'activité fongicide ou levuricide des antiseptiques et des désinfectants chimiques utilisés dans
le domaine de l'agro-alimentaire, dans l'industrie, dans les domaines domestiques et en collectivité —
Méthode d'essai et prescriptions (phase 2, étape 1) (indice de classement : T 72-203)
[3] NF EN 10088-1, Aciers inoxydables — Partie 1 : Liste des aciers inoxydables (indice de classement :
A 35-572-1)
[4] NF EN 10088-2, Aciers inoxydables — Partie 2 : Conditions techniques de livraison des tôles et bandes
en acier de résistance à la corrosion pour usage général (indice de classement : A 35-572-2)
[5] NF EN 14204, Antiseptiques et désinfectants chimiques — Essai quantitatif de suspension pour l'évaluation
de l'activité mycobactéricide des antiseptiques et des désinfectants chimiques utilisés dans le domaine
vétérinaire — Méthode d'essai et prescriptions (Phase 2, étape 1) (indice de classement : T 72-802)
[6] NF EN 14563, Désinfectants et antiseptiques chimiques — Essai quantitatif de porte-germe pour l'évaluation
de l'activité mycobactéricide ou tuberculocide des désinfectants chimiques utilisés pour instruments en
médecine humaine — Méthode d'essai et prescriptions (phase 2, étape 2) (indice de classement : T 72-246)
[7] ISO 4793, Filtres frittés de laboratoire — Échelle de porosité — Classification et désignation