Secuenciación de Nueva Generación (NGS)

para la Caracterización y Análisis de

Organismos Genéticamente
Modificados (OGM)
Marco legal
De acuerdo con el Protocolo de Cartagena sobre seguridad
de la biotecnología del convenio sobre la diversidad
biológica.
Anexo III, sobre la Evaluación del Riesgo:
a. Una identificación de cualquier característica
genotípica y fenotípica nueva relacionada con el
organismo vivo modificado que pueda tener efectos
adversos en la diversidad biológica y en el probable
medio receptor, teniendo también en cuenta los
riesgos para la salud humana;
Diferentes regulaciones en el mundo:
• Información del evento o construcción (Argentina)
• Caracterización genético molecular (Uruguay)
• Caracterización del OGM (México)
• Caracterización del evento (Colombia)
a) Métodos convencionales de ingeniería genética:
1. Agrobacterium tumefaciens
2. Bombardeo de partículas “biobalística”

b)Nuevas técnicas de mejoramiento

1. Mutagénesis dirigida por Oligonucleótidos
2. Cisgénesis
3. Metilación de ADN, ARN-dependiente
4. Injertos en Biotecnología
5. Ingeniería reversa
6. Agro-infiltración
7. Edición de Genomas con Nucleasas
Sintéticas
8. Genómica sintética
 Identificación
del OGM
Evaluación • NGS
del Riesgo • PCR

• Análisis
• Dictamen
Información de la
caracterización
molecular
• Genotípica
•Fenotípica
Objetivo:
Mostrar el uso de la tecnología de la
secuenciación de nueva generación para
coadyuvar en la evaluación del riego a través
de dotar de mayores elementos técnico
científicos a los reguladores en materia de
bioseguridad de organismos genéticamente
modificados.
¿QUÉ ES LA SECUENCIACIÓN?

La
SECUENCIACIÓN
Determinación del amplía la
orden exacto de los información genética
pares de bases de una del organismo a
región específica analizar y permite
de DNA confirmar su
identidad
HISTORIA DE LA SECUENCIACIÓN

Publicación del
método de
Reacción en Cadena Inicio del Pirosecuenciación
de la Polimerasa proyecto del por Pál Nyren y
Secuenciación de (PCR), desarrollada genoma Mostafa Ronaghi
Maxam-Gilbert por Kary B. Mullis humano

1953 1977 1983 1986 1990 1995 1996

Applied Biosystems Primer genoma
Descubrimiento Secuenciación de
pone en el mercado completo de un
de la doble Frederick Sanger
el primer organismo libre
hélice del DNA
secuenciador vivo, la bacteria
por Watson y
automatizado (ABI Haemoplhilus
Crick
370) Influenzae
HISTORIA DE LA SECUENCIACIÓN

Publicación del método

“MPSS” por Lynx 454 Life Sciences saca
Technologies, lanzando al mercado la versión de Life Technologies
la Secuenciación de secuenciación por pone en el
Nueva Generación Pirpsecuenciación mercado nuevas
(NGS) tecnologías

2000 2003 2004 2006 2010 2011

Término del Proyecto Sale al mercado el Pacific Biosciences
del Genoma humano secuenciador de comercializa la
nueva generación de secuenciación
Illumina SMRT(del
inglés single
molecule real time
sequencing)
CLASIFICACIÓN DE LA SECUENCIACIÓN
 Platform Instrument Year Reads per run Read length Bases per run (gigabases)
ABI Sanger 3730xl - 96 800 0.0000768
454 GS20 2005 200000 100 0.02
Illumina GA (launch?) 2006 28000000 25 0.7
454 GS FLX 2007 400000 250 0.1
SOLiD 1 2007 40000000 25 1
Illumina GA 2008 28000000 35 1
SOLiD 2 2008 115000000 35 4
454 GS FLX Titanium 2009 1000000 500 0.45
Illumina GAIIx 2009 440000000 75 33
Illumina HiSeq 2010 2000000000 100 200
454 GS FLX+ 2011 1000000 700 0.5
IonTorrent PGM 314 chip 2011 100000 100 0.01
IonTorrent PGM 316 chip 2011 1000000 100 0.1
IonTorrent PGM 318 chip 2011 5000000 100 0.5
Illumina GAIIx 2011 640000000 75 48
Illumina HiSeq 2011 3000000000 100 600
Illumina MiSeq 2011 30000000 150 4.5
SOLiD 5500xl 2011 3000000000 60 180
PacBio RS C1 2011 36000 1300 0.045
IonTorrent PGM 318 2012 5000000 200 1
IonTorrent Proton 2012 50000000 200 10
Illumina MiSeq 2012 30000000 250 8.5
PacBio RS C2 2012 36000 2500 0.09
PacBio RS C2 XL 2012 36000 4300 0.155
EVOLUCIÓN EN LA ESCALA DE LOS PROYECTOS CIENTÍFICOS

www.454.com
EVOLUCIÓN DE LA CAPACIDAD DE
SECUENCIACIÓN

Ejemplo:
Genoma humano

Antes Ahora
 1 laboratorio de
20 instituciones de todo el
secuenciación masiva
mundo
 14 - 45 días
10-13 años de trabajo
 Aprox 5,000-10,000
 3,000 millones de dólares
dólares (Dependiendo del
Miles de científicos y
nivel de análisis deseado)
técnicos
 Un par de científicos y
técnicos
SECUENCIACIÓN TIPO SANGER

 Usa dideoxinucleotidos.

 Reacción de Terminación de Cadena.

SECUENCIACIÓN DE NUEVA
GENERACIÓN (NGS)
Secuenciación masiva en paralelo, durante la cual
millones de fragmentos de ADN a partir de una
sola muestra se secuencian al unísono.
¿Qué es la Bioinformática?
 ¿Qué es la Bioinformática?
Genoma
completo Exoma Metageno
RNAseq mica
Deteccion
de SNPs
CHIPseq
NGS
 Integración
Datos B+T+C+E+Q conceptual y Modelos Bioinformática
computacional

Biología

TI
Bioinformática
C.
Computacionales

Estadística

Química
 Ciencias computacionales y
Biología
Bioinformática tecnologías de la información

Ejemplo: Búsqueda de una

secuencia de ADN o de proteína
en una base de datos.
 Es la integración y análisis de datos (principalmente moleculares)
mediante una intersección de modelos bioquímicos, matemáticos y
biológicos a través de métodos computacionales y de tecnologías de la
información para extraer y estructurar información de tipo biológica,
química, epidemiológica, etc a partir de dichos datos.
 Bioinformática para OGM
• La bioinformática se aplica en el análisis de OGM a distintos niveles:
1. Estructuración de la información molecular regulatoria asociada a OGMs
en bases de datos.Ejemplo: GmoDetectionDatabase
(http://gmdd.shgmo.org/) .
2. Desarrollo de software para la toma de decisiones. Ejemplo: GMOseek
(http://www.gmoseek.com/) .
3. Desarrollo de algoritmos para el análisis de datos de secuenciación masiva
de OGM. Ejemplo: Transeq.
(http://www.nature.com/srep/2013/131003/srep02839/full/srep02839.ht
ml)
4. Creación in-silico de sistemas análisis de OGM: Ejemplo: Métodos de
detección por primers y PCR.
5. Integración de datos moleculares, bases de datos, información regulatoria
y datos de secuenciación en sistemas de análisis que permitan caracterizar
muestras transgénicas: Ejemplo: Trabajo del CNRDOGM.
 Bioinformática básica para análisis de datos de NGS:
Los dos tipos básicos de análisis:
Mapeo a referencia y ensamble de novo

Tomado de : http://www.diss.fu-berlin.de/diss/servlets/MCRFileNodeServlet/FUDISS_derivate_000000014352/thesis_nocv_neu.pdf
Consideración de la información de secuencia en la ley
• La palabra secuencia aparece 14 veces en el reglamento
de la Ley de Bioseguridad de OGM al 28 de Abril del 2015.

• El término secuencia se encuentra contemplado en los

títulos segundo (Permisos para las actividades con OGM) y
tercero (De las autorizaciones) de dicho reglamento.

• Aún donde el término secuencia no es usado hay

apartados donde esta información en conjunto el análisis
bioinformático podría proveer el dato requerido por la ley.

A continuación los ejemplos para el caso del titulo segundo…

Food Anal. Methods, DOI 10.1007/s12161-013-9673-x
Información solicitada en el RLBOGM que
puede ser presentada a partir de NGS
Tomado de: http://www.foodstandards.gov.au/code/applications/Documents/A1097-GM-CFS-SD1.pdf
INJERTOS VEGETALES

El injerto es la unión física de dos

plantas, la que proporciona la raíz se
llama patrón, portainjerto o pie y la
segunda es el vástago o injerto.

Ambas crecen como un solo individuo.

El portainjerto y/o el injerto pueden

transformarse a través de:

• Agrobacterium thumefasciens
• Biobalística
• Transgénesis
• Cisgenesis
• Etc.

Beatriz Xoconostle Cázares, Depto. de Biotecnología, CINVESTAV IPN

INJERTOS VEGETALES
A B
Posibilidades:

Caracterización Detección Referencia

Secuenciación del PCR (diseño de Science 1 May 2009:
fruto y/o porta-injerto oligos) Vol. 324 no. 5927 pp. 649-
Secuenciación de 651,DOI: 10.1126/science.1170,397
genoma completo Proc Natl Acad Sci U S A. 2012 Feb 14; 109(7):
2439–2443.

Beatriz Xoconostle Cázares, Depto. de Biotecnología, CINVESTAV IPN

MUTAGÉNESIS DIRIGIDA POR
OLIGONUCLEÓTIDOS (ODM)
Mutare (cambiar)
alteración o cambio en la información
genética (genotipo) de un ser vivo y que
por lo tanto, va a modificar las
características de éste; además se
puede heredar a la descendencia.

Técnica empleada para corregir o

introducir cambios específicos en sitios
definidos del genoma.

El oligonucleótido NO se integra al
genoma de las células de la planta
hasta que se INDUCE el Mecanismo de
Reparación que
cambia la secuencia endógena por la
secuencia deseada.
Dvorak Montiel Condado, Ph. D Profesor Tiempo Completo Facultad de Ciencias Biológicas, UANL.
MUTAGÉNESIS DIRIGIDA POR
OLIGONUCLEÓTIDOS (ODM)

NO requiere de la introducción
de secuencias de ADN de
otras especies al genoma
natural.

Caracterización Detección Publicación

Secuenciación por NA GA21
amplicones/Resecuenciación

Dvorak Montiel Condado, Ph. D Profesor Tiempo Completo Facultad de Ciencias Biológicas, UANL.
 METILACIÓN DE DNA DIRIGIDA POR RNA (RdDM)

La expresión de genes se modifica a

través de epigenética

RdDM induce al gen transcripcional de

silenciamiento (TGS ) de determinados
genes a través de la metilación de
secuencias promotoras. A fin de que
obtener la RdDM, los genes que
codifican para RNAs, los cuales son
homólogas a las regiones promotoras,
son liberados a las células de las
plantas por métodos adecuados de
transformación. Esto implica , en algún
momento, la producción de una planta
transgénica.

Dr. Edgar Rodríguez Negrete, CINVESTAV-IRAPUATO

METILACIÓN DE DNA DIRIGIDA POR RNA (RdDM)

Caracterización Detección Publicación

Secuenciación de bisulfito NA Methods Mol Biol. 2011;744:187-97. doi:
10.1007/978-1-61779-123-9_13.
MEJORAMIENTO GENÉTICO REVERSO

Método en el cual el orden de los

acontecimientos que conducen a la
producción de una variedad de
planta híbrida se invierte.

Se lleva a cabo a través del

silenciamiento de genes.

Hace uso de transgénesis para

suprimir la recombinación meiótica.
en pasos subsiguientes, sólo las
plantas no transgénicas son
seleccionadas.

DR. YURI JORGE PEÑA RAMÍREZ, ECOSUR CAMPECHE

MEJORAMIENTO GENÉTICO REVERSO

Hace uso de transgénesis para suprimir

la recombinación meiótica. en pasos
subsiguientes, sólo las plantas no
transgénicas son seleccionadas.

Caracterización Detección Referencia

Secuenciación de genoma
NA Sin referencia
completo
DEDOS DE ZINC

Tecnología Técnica de NGS Técnica de detección Referencia

aplicable aplicable
Moreover, sequence analysis of the entire ben-
Dedos de Zinc Secuenciación de PCR de región 1(y462) mutant genome revealed only two
indels: the ZFN-induced ben-1 mutation and a
genoma completo modificada por los deletion unlikely to have been caused by ZFN
activity. The latter arose at a site unrelated to
dedos de zinc the ZFN site (fig. S4) and at a frequency
consistent with spontaneous C. elegans indels
(3).
PMCID: PMC3489282
CISGÉNESIS E INTRAGÉNESIS

Tecnología Aplicación de NGS Técnica de Referencia

detección
aplicable
Schubert and Williams state it would be difficult to characterize cisgenic plants
Cisgénesis Secuenciación de PCR de at the genomic level and monitor them after release. However, this is not the
case. As long as the insertion site differs from the native genomic site, an
/Intragénesis regiones regiones event-specific PCR reaction can be developed with one primer that anneals to
the inserted sequence and another primer that anneals to flanking DNA. The
flanqueantes flanqueantes. flanking DNA can be sequenced by using commonly available genome walking
kits.
Nature Biotechnology 24, 1331 - 1333 (2006)
doi:10.1038/nbt1106-1331
Agroinfiltración

Tecnología Aplicación de NGS Técnica de detección Referencia

aplicable
Prior to further propagation of plant tissue infected

Agroinfiltración
RNAseq, RNAseq, no withAgrobacterium, the plant material should be screened
for the absence of any foreign DNA sequences (e.g.,
Metagenómica, aplica PCR chromosomal Agrobacterium DNA or T-DNA).
Use of Novel Techniques in Plant Breeding and Practical
Consequences Concerning Detection, Traceability,
Labeling, and Risk Assessment
GENÓMICA SINTÉTICA

Tecnología Técnica de NGS Técnica de Referencia

aplicable detección aplicable
Secuenciación de PCR de marcas de Creation of a Bacterial Cell
Genómica Controlled by a Chemically
genoma completo agua de “mensajes
sintética encriptados en el
Synthesized Genome

genoma”
GRACIAS POR SU ATENCIÓN

Muchas Gracias!!!