BIOCHIMIE MEDICALĂ
– ediţia a VI-a, revizuită –
Referent ştiinţific: Prof. dr. Maria Greabu
Facultatea de Medicină Dentară „UMF Carol Davila”, Bucureşti
577.1:61(075.8)
Tipărit în România
ISBN: 978-973-748-867-1
Toate drepturile rezervate. Nici o parte a acestei cărţi nu poate fi reprodusă sau transmisă sub nici o formă şi prin nici un mijloc, electronic sau
mecanic, inclusiv prin fotocopiere, înregistrare sau prin orice sistem de stocare şi accesare a datelor, fără permisiunea Editurii NICULESCU.
Orice nerespectare a acestor prevederi conduce în mod automat la răspunderea penală faţă de legile naţionale şi internaţionale privind
proprietatea intelectuală.
Prefaţă
Autorul
CUPRINS
2.AMINOACIZI ŞI PROTEINE 24
2.1.Aminoacizi 24
2.2.Peptide 31
2.3.Proteine 35
2.4.Hemoproteine 51
2.5.Proteine plasmatice 61
3.ENZIME 73
3.1.Caracteristici generale ale enzimelor 73
3.2.Factori care influenţează eficienţa catalitică a enzimelor 75
3.3.Cinetica enzimatică 78
3.4.Enzime alosterice 87
3.5.Reglarea activităţii enzimelor 90
3.6.Antienzime 94
3.7.Izoenzime 95
3.8.Complexe multienzimatice 96
3.9.Clasificarea şi denumirea enzimelor 96
4.VITAMINE 100
4.1.Caracteristici generale 100
4.2.Vitamine hidrosolubile 100
4.3.Vitamine liposolubile 111
1.1.3.Legăturile de hidrogen
Legăturile de hidrogen sunt interacţii electrostatice între atomii de hidrogen
legaţi prin valenţa lor de un element puternic electronegativ şi cu volum mic (X=oxigen,
azot, fluor) şi electronii neparticipanţi ai unui atom electronegativ dintr-o moleculă vecină
(Y= oxigen sau azot):
X H Y
1.1.5.Ionizarea apei
Apa are proprietăţi atât acide cât şi bazice, fiind aptă să cedeze sau să accepte
protoni: H 2 O + H 2 O ←→ H 3O + + HO -
Gradul de ionizare al apei fiind foarte mic, echilibrul reacţiei de ionizare este
mult deplasat spre stânga. Constanta de echilibru a reacţiei de ionizare a apei este dată
de relaţia:
[H3O + ][HO− ]
Ke =
[H 2O]2
12
La 25oC, valoarea lui Ke este 1,8x10-16 moli/l.
Deoarece apa nedisociată este în exces concentraţia ei este constantă 55,56 M
(masa moleculară a apei este 18 g prin urmare într-un litru sau 1000 g se află 1000/18
moli).
Valoarea “constantă” pentru concentratia apei poate fi încorporată în constanta de
disociere, formând o nouă constantă, produsul ionic al apei sau Kw:
−
K w = [H3O][HO ]
La introducerea unui acid (AH) în apă, soluţia apoasă capătă reacţie acidă. Are
loc transferul de protoni între acid şi apă:
AH + H 2 O ⇔ A − + H 3O +
Echilibrul reacţiei de autoprotoliză a apei este deplasat spre stânga de către ionii
de H3O+, iar concentraţia ionilor HO- scade pentru a satisface relaţia:
[H 3O + ][HO − ] = 10 −14
O bază B, introdusă în soluţie apoasă conferă soluţiei reacţie bazică. Baza acceptă
proton de la apă:
B + H 2 O ⇔ BH + + HO −
13
Fig.1.1 Valorile pH pentru unele lichide
1.2.Echilibrul acido-bazic
2 H2 PO −4 ⇔ HPO 24 − + PO 34−
14
Molecule de acelaşi fel, în stare lichidă, ionizează prin transfer de protoni: acid
acetic, etanol.
CH 3 − CH 2 − OH + CH 3 − CH 2 − OH ⇔ CH 3 − CH 2 − O − + CH 3 − CH 2 − O + H 2
Substanţe complexe care conţin funcţiuni acide şi bazice distincte cum sunt:
aminoacizi, proteine, lipide complexe.
[A − ][H 3O + ]
Ke =
[AH][H 2 O]
Concentraţia iniţială a apei fiind foarte mare în comparaţie cu a acidului,
termenul [H2O] poate fi considerat mărime invariabilă şi în aceste condiţii:
[A − ][H 3O + ]
K a = K e ⋅ [ H 2 O] =
[AH]
Mărimea Ka este constanta de aciditate şi precizează tăria unui acid; cu cât Ka
are o valoare mai mare cu atât acidul este mai puternic.
Mărimea pKa este definită de relaţia:
pK a = −lg K a
Cu cât acidul este mai puternic, cu atât pKa este mai mic.
2.Ecuaţia lui Henderson – Hasselbalch
Concentraţia ionilor de hidrogen în soluţia unui acid slab se obţine prin
rearanjarea expresiei lui Ka:
[HA ]
[H + ] = K a ⋅
[A − ]
Raportul dintre acidul nedisociat şi baza sa conjugată [HA]/[A-], se referă la
valorile concentraţiilor la echilibru.
Prin logaritmarea expresiei de mai sus obţinem:
[A − ]
− lg[H + ] = −lgK a + lg
[HA]
sau
[Baza conjugatăo
pH = pK a + lg
[Acid]
sau
Csare
pH = pK a + lg
Cacid
Aceasta este ecuaţia lui Henderson – Haselbalch şi este valabilă în domeniul
de pH de la 4 – 10 unde ioni de H+ şi OH- nu contribuie, seminificativ la concentraţia
ionică totală.
15
1.2.4.Constanta de bazicitate, este o măsură a tăriei bazelor
In soluţie apoasă o bază este ionizată:
B + H 2 O ⇔ BH + + HO −
La echilibru:
[BH + ][HO − ]
Ke =
[B][H 2 O]
Neglijând variaţia concentraţiei apei obţinem expresia care defineşte Kb:
[BH + ][HO − ]
K b = K e x [H 2 O] =
[ B]
Mărimea Kb este constanta de bazicitate şi precizează tăria unei baze; cu cât Kb
este mai mică cu atât baza este mai slabă.
Mărimea pKb, în mod similar mărimii pKa, se poate defini prin:
pK b = −lgK b
Cu cât o bază este mai tare cu atât mărimea pKb are o valoare mai mică.
16
Cu această relaţie putem afla pK-ul unuia dintre termenii unei perechi de
conjugaţi atunci când se cunoaşte valoarea constantei celuilalt.
Valorile constantelor pKa şi pKb pentru unele perechi de conjugaţi, care participă
la menţinerea pH-ului fluidelor din organism, la o valoare apropiată de neutralitate, se dau
în tabelul 1.2.
1.2.6.Hidroliza sărurilor
Unele săruri prin dizolvare nu schimbă pH-ul apei; soluţiile lor rămân neutre.
Exemple: NaCl, KCl, Na2SO4 etc.
Alte săruri prin dizolvare, dau soluţii apoase cu reacţie acidă sau bazică.
La dizolvarea în apă a sării formată din neutralizarea acidului HA cu B, sarea
disociază:
BH + A − → BH + + A -
acid bază
Ionii formaţi reacţionează cu apa:
BH + + H 2 O ⇔ B + H 3O +
A − + H 2 O ⇔ AH + HO −
Poziţia echilibrelor protolitice depinde de tăria speciilor A − şi BH + .
Soluţia prezintă o reacţie alcalină dacă afinitatea pentru protoni a bazei A −
este mai mare decât tendinţa acidului BH+ de a ceda protoni.
Tabelul 1.2.Constantele pKa şi pKb ale unor perechi acid – bază conjugaţi (la 250C).
NH NH
Soluţia prezintă o reacţie acidă, dacă acidul BH + este un acid mai tare decât
baza A − .
Hidroliza unei sări înseamnă descompunerea reversibilă a sării în soluţie prin
reacţia ionilor sării cu apa. Sărurile care suferă această reacţie sunt hidrolozabile.
Comportarea în soluţie a diverselor categorii de săruri:
17
a.Sărurile acizilor tari cu baze tari: NaCl, KCl, NaNO3, Na2SO4, nu
hidrolizează, iar soluţiile lor au reacţie neutră. Cationii: Na+, K+ nu sunt nici acizi nici
baze iar anionii: Cl-, SO42-, NO3- sunt doar virtual baze.
b.Sărurile acizilor slabi cu baze tari, hidrolizează în soluţie (CH3 – COONa,
Na2CO3, Na2HPO4 etc).
Acetatul de sodiu la dizolvare disociează electrolitic:
CH 3 − COONa → CH 3 − COO − + Na +
Ionul acetat reacţionează protolic cu apa
CH 3 − COO − + H 2O ←→ CH 3 − COOH + HO −
H + + HO − ⇔ H 2 O
Ca răspuns la această îndepărtare a lui H+, va disocia o cantitate mai mare de HA,
pentru a restabili echilibrul între HA şi ionii săi.
Titrarea unui acid slab cu o bază tare este suma celor două reacţii:
HA + HO − ←→ H 2 O + A −
pKa − lg[HA]
sau pH =
2
b.Calcularea valorilor intermediare ale pH-ului
Valorile pH-ului pentru punctele curbei de titrare, corespunzătoare unei
neutralizări a acidului cuprinsă între 10% şi 90% se calculează cu ajutorul ecuaţiei lui
Herderson – Hasselbalch.
Fig. 1.2. Curba de titrare pentru 50 ml acid lactic 0.1N (pKa = 3,86) cu NaOH 0,1N
1.4.Sisteme tampon.
2.Sisteme tampon formate dintr-o bază slabă (B) şi sarea sa cu un acid tare:
(BHCl). Exemple:
N N+HCl
NH3 R-NH2
;
NH4Cl R-NH3+ Cl- NH NH
H + + HO − ⇔ H 2 O
Ca răspuns la această îndepărtare a lui H+, va disocia o cantitate mai mare de HA,
pentru a restabili echilibrul între HA şi ionii săi.
Titrarea unui acid slab cu o bază tare este suma celor două reacţii:
HA + HO − ←→ H 2 O + A −
de unde [ H + ] = K a x [HA]
pKa − lg[HA]
sau pH =
2
1.4.2.Componentele funcţionale ale sistemului tampon
1.Pentru sistemul tampon de tip I acid acetic – acetat de sodiu:
Sarea fiind compus ionic disociază în ioni:
→ CH 3 − COO − + Na +
CH 3 − COONa
Acidul reacţionează protolitic cu apa:
CH 3 − COOH + HOH ←→ CH 3 − COO − + H 3O +
Se poate admite că, în prezenţa sării sale acidul acetic este practic neionizat.
Tamponarea unui acid o face componenţa bazică a sistemului:
CH 3 − COO − + H 3O + ←→ CH 3 − COOH + H 2 O
Echilibru reacţiei protolitice este deplasat spre stânga de către ionul sării
( NH 4+ ).
Tamponarea unui acid o face componenta bazică a sistemului tampon
NH3 + H3O + → NH 4 + + H2O
Tamponarea unei baze este realizată de componenta acidă a sistemului tampon
NH 4 + + HO − → NH 3 + H2O
1.4.3.pH-ul unui sistem tampon se poate calcula cu ajutorul ecuaţiei
Henderson – Hasselbalch:
[Baza]
pH = pK + lg
a [Acid]
care poate fi aplicată pentru ambele tipuri de sisteme tampon I şi II
pH-ul sistemului tampon depinde de pKa. La un raport Cbază / Cacid = 1,
tamponul are pH = pKa.
Acidul carbonic fiind un acid slab, ionizează într-o proporţie mică în soluţie
apoasă:
H 2 CO 3 + H 2 O ←→ HCO3− + H 3O +
22
[HCO 3− ][H 3O + ]
Ka =
[H 2 CO 3 + CO 2 ]
În plasmă, bioxidului de carbon şi acidul carbonic sunt dozate împreună şi suma
concentraţiilor lor este denumită [CO 2 ]liber .
Pentru sistemul acid carbonic - bicarbonat de sodiu, ecuaţia Henderson-
Hasselbalch este:
−
pH = pKa + lg [HCO 3 ]
[CO 2 ]liber
Prin pH-ul său uşor alcalin şi prin faptul că sistemul tampon acid carbonic-
bicarbonat cuprinde un exces de bază, acest sistem este adaptat funcţiei sale de a
tampona şi de a transporta acizii de la locurile lor de formare la organele de
eliminare fără ca pH-ul sângelui să se modifice.
Modificarea raportului [HCO-3]/ [CO2]liber poate determina: acidoză (scăderea
pH-ului sângelui) sau alcaloză (creşterea pH-ului sângelui)
Concentraţiile CO2 şi HCO3− în sânge sunt reglate, prin intermediul plămânului şi
rinichiului.
e.Sistemul tampon al fosfaţilor, ai căror componenţi funcţionali sunt:
− acid cu pKa = 6,8 (la 370C);
H PO
2 4
2− bază.
HPO4
–sistemul tampon format din:
NaH2PO4 / Na2HPO4 este predominant în compartimente extracelulare
–sistemul tampon format din KH2PO4 / K2HPO4 este predominant în
compartimentul intracelular
4.Variaţii ale pH-ului sanguin
pH-ul sângelui poate varia ca urmare a afecţiunilor respiratorii sau metabolice.
Scăderea pH-ului sub 7,4 determină acidoza, iar creşterea peste 7,4 determină
alcaloza.
Variaţiile pH-ului determinate de modificarea conţinutului de CO2 produce
acidoza sau alcaloza respiratorie. Variaţiile pH-ului determinate de modificări ale
concentraţiei de HCO-3 produc acidoza sau alcaloza metabolică. Organismul
compensează variaţiile de pH, prin coordonarea activităţii plămânului şi a rinichilor.
Starea de acidoză sau alcaloză respiratorie pot fi compensate prin starea de alcaloză
sau acidoză metabolică.
Tăria unui acid sau a unei baze se definesc prin pka și pkb, care este pH-ul
mediului la care jumatate din acidul sau baza respectivă sunt disociate. Cu cât pka este
mai mic, cu atât acidul este mai puternic. De exemplu, acidul lactic are pka = 3,8, adică la
pH=3,8 jumătate din acid este disociat. La pH-ul organismului, care este 7,4, întreaga
cantitate de acid lactic este disociată. Deci, acidul lactic este un acid puternic pentru
organism, putând induce o acidoză metabolică puternică.
23
2. AMINOACIZI ŞI PROTEINE
2.1.Aminoacizi
2.1.1.Introducere
Aminoacizii sunt unităţile constituente ale proteinelor.
Aminoacizii sunt sursa primară de azot pentru ţesuturi şi servesc ca precursori
pentru alţi compuşi cu azot.
Produşii cu importanţă fiziologică derivaţi din aminoacizi includ: hemul,
purinele, pirimidinele, hormonii, neurotransmiţătorii inclusiv peptidele biologic active.
Prin decarboxilarea histidinei se obţine histamina care are un rol important în multe
reacţii alergice, iar prin decarboxilarea acidului glutamic se formează acidul
γ−aminobutiric
γ− (GABA) cu rol de neurotransmiţător.
Aminoacizii esenţiali (valina, leucina, izoleucina, lizina, metionina, treonina,
fenilalanina, triptofanul şi histidina) se procură în special din alimente deoarece
organismul nu este în măsură să sintetizeze scheletul atomilor de carbon al acestor
aminoacizi.
Anomalii în transportul aminoacizilor în celule duc la diferite afecţiuni. Multe
dintre aceste afecţiuni se caracterizează prin creşterea cantităţii unuia sau mai multor
aminoacizi în urină (aminoacidurie).
2.1.2.Structura aminoacizilor
Toţi aminoacizii au cel puţin două grupări funcţionale: –NH2 şi –COOH. Din
cei aproximativ 300 aminoacizi care se află în natură numai 20, numiţi aminoacizi
naturali (proteinogeni specificaţi prin codul genetic), intră în structura proteinelor.
Prin hidroliza totală a proteinelor rezultă 21 L-α−aminoacizi. In aminoacizii naturali care
sunt α−aminoacizi, grupările amino şi carboxil sunt ataşate la acelaşi atom de carbon
(Cα). Face excepţie unul din cei 21 de aminoacizi, prolina, care are o funcţie aminică
secundară. Selenocisteina este un aminoacid natural, codat de tripletul UGA (care este şi
tripletul de oprire în sinteza proteică). Spre deosebire de cisteină acest aminoacid conţine
Se în locul atomului de S şi este mai reactiv. Aminoacizii naturali au formula generală:
R CH COOH
NH2
Aminoacizii se deosebesc între ei prin natura radicalului R care poate fi o catenă
hidrocarbonată alifatică sau aromatică, un heterociclu sau poate să cuprindă o grupare
funcţională polară (Tabelul 2.1).
2.1.3.Activitatea optică a aminoacizilor
Cu excepţia glicinei toţi aminoacizii naturali sunt optic activi, deoarece conţin
în moleculă cel puţin un atom de carbon asimetric (un centru chiralic). Carbonul asimetric
este de obicei carbonul alfa:
α -
R CH COO
+
NH3
24
Formulele de configuraţie ale enantiomerilor unui aminoacid oarecare,
reprezentate în sistemul D-L, în care compusul de referinţă este aldehida glicerică sunt:
- -
COO COO
+ +
H C NH3 H3N C H
R R
D-aminoacid L-aminoacid
Aminoacizi alifatici
Glicina Gly (G) - Nepolar
H CH COO
+
NH3
Alanina Ala (A) - Nepolar
H3 C CH COO
+
NH3
Valina Val (V) - Nepolar
H3C CH CH COO
+
CH 3 NH3
Aminoacizi aromatici
Fenilalanina Phe (F) Nepolar
-
CH2 CH COO
+
NH3
Tirozina Tyr (Y) -
Polar
HO CH 2 CH COO neincarcat
+
NH3
Triptofan Trp (W) - Nepolar
CH2 CH COO
+
NH3
N
H
25
Aminoacizi cu grupări hidroxil
-
Serina Ser (S) HO CH2 CH COO Polar
+ neâncarcat
NH3
-
Treonina Thr (T) H3C CH CH COO Polar
+ neâncărcat
OH NH3
Aminoacizii dicarboxilici
- -
Aspartat (Acid Asp (D) O OC CH 2 CH COO Polar încărcat
aspartic) + negativ
NH3
-
Glutamat (Acid Glu (E) -
O OC CH 2 CH 2 CH COO Polar încărcat
glutamic) + negativ
NH3
Aminoacizi bazici
Lizina Lys (K) -
H 2 C CH 2 CH 2 CH 2 CH COO Polar încărcat
pozitiv
+ +
NH 3 NH3
Iminoacizi
-
Prolina Pro (P) COO Nepolar
+
H2N CH
H2 C CH2
CH2
26
2.1.4.Ionizarea aminoacizilor în soluţie apoasă
In funcţie de pH-ul mediului în care se află, aminoacizii pot avea sarcină (+), (-)
sau încărcare electrică netă zero.
Aminoacizii conţin cel puţin două grupări ionizabile: carboxil, cu caracter slab
acid şi amino, cu caracter slab bazic. In soluţie cele două forme ale acestor grupări sunt în
echilibru:
- H+ -
COOH COO
acid + H+ baza conjugată
+ H+ +
NH2 NH3
+
bază -H acidul conjugat
R R R
Funcţia carboxil de la Cα este caracterizată prin pKaα-COOH (pK1) iar funcţia
aminică de la Cα printr-un pKaα-NH3 (notată pK2).
In cazul alaninei pI-ul se calculează astfel:
pK 1 + pK 2 2,35 + 9,69
pI = = = 6,02
2 2
Pentru aminoacizii neutri, punctele izoelectrice sunt situate la valori de
aproximativ 6, aproape de pH-ul fiziologic.
Aminoacizilor dicarboxilici, diaminici precum şi cisteinei, histidinei şi tirozinei li
se adaugă o a treia mărime pKR, corespunzătoare funcţiei acide sau bazice adiţionale.
Formele acidului aspartic şi glutamic în funcţie de pH-ul soluţiei în care se află, pot fi
deduse, ca şi în cazul aminoacizilor neutri, prin titrarea formei protonate total cu o bază.
Grupările care au caracter acid vor ceda protonii în ordinea descrescătoare a tăriei lor.
28
Astfel, pentru acidul glutamic stările ionizate începând de la un pH foarte
acid sunt:
- - -
COOH COO COO COO
+ + +
-H -H -H
HC NH3+ HC NH3+ HC NH3 + HC NH2
CH2 CH2 CH2 CH2
CH2 CH2 CH2 CH2
- -
COOH COOH COO COO
Bazicitatea acestei grupări este mai redusă (pK=6,00) şi pI este situat la valori
apropiate de pH-ul fiziologic.
29
În tabelul 2.2 se dau valorile pK1, pK2 şi pKR ale celor 20 de aminoacizi naturali
precum şi valorile pI.
În organismele vii, ţinând cont de pH-ul fiziologic, aminoacizii din structurile
lanţurilor polipeptidice ale proteinelor au sarcini diferite; astfel: resturile aspartil şi
glutamil au în aceste condiţii sarcina net negativă pe când resturile lizil, histidil şi
arginil au sarcina pozitivă.
Sarcina electrică a aminoacizilor din structura proteinelor, la pH fiziologic este
un criteriu de clasificare al acestora.
Anumite proteine conţin aminoacizi derivaţi, formaţi după încorporarea
aminoacidului în molecula proteică (hidroxiprolina, hidroxilizina, acidul
γ−carboxiglutamic, cistina, ornitina).
- -
COO H2 C CH CH2 CH2 CH COO
+
H 2N CH H3 N
+
OH +
NH3
H2 C CH2 5-hidroxi lizină
CH
OH
4-hidroxi prolină - -
-
O OC CH CH2 CH COO
CH2 CH2 CH2 CH COO - +
COO NH3
+ +
H3 N NH3
Ornitină Acid γ−carboxi glutamic
2.1.5.Proprietăţile aminoacizilor
Proprietăţile aminoacizilor sunt determinate de proprietăţile grupărilor –COOH şi
–NH2 de la Cα, şi de proprietăţile radicalilor.
La Cα aminoacizii conţin o grupare amino care la pH fiziologic este în formă de
–NH3+ şi o grupare carboxil care este în formă –COO-. Din cauza sarcinilor pozitive şi
negative această parte a moleculei este hidrofilă şi interacţionează cu moleculele de apă
sau cu alte molecule polare.
Aminoacizii formează legături covalente, între ei, prin eliminarea unei molecule
de apă rezultând peptide şi proteine, şi legături necovalente: interacţiuni electrostatice,
legături de hidrogen şi interacţiuni hidrofobe.
Legăturile necovalente formate între radicalii R pot fi:
1.Legăturile de hidrogen sunt interacţii electrostatice între atomii de hidrogen
legaţi covalent la un atom puternic electronegativ (O sau N) şi electronii neparticipanţi ai
unui atom electronegativ dintr-o moleculă vecină. Direcţia favorabilă, care duce la
interacţiunea cea mai puternică, corespunde colinearităţii celor trei atomi: X, H şi Y:
Xδ− Ηδ+ −δ
Υ
donor de hidrogen Acceptor de hidrogen
N H O C N H N
2.2.Peptide.
C N
H
ϕ
H ψ
H
N Cα
C Radicalii aminoacizilor
Cα
Fig.2.2 O porţiune dintr-un lanţ peptidic care arată gradul de rotire al fiecărei legături peptidice
(unghiuri de rotire în sensul acelor de ceasornic cum priveşti de la Cα).
Atomul de hidrogen al grupării amino este aproape totdeauna în poziţie trans faţă
de oxigenul grupării carbonil. Singurele excepţii sunt legăturile peptidice X-Pro (X poate
fi orice rest aminoacidic), care pot fi cis sau trans.
Aceste consideraţii geometrice sunt similare cu cele pentru dubla legătură din
etenă (Fig.2.3).
32
2.2.2.Prin condensarea aminoacizilor se formează peptide şi proteine
Cei 20 aminoacizi naturali se pot combina în multe feluri. Posibilităţile de
combinare sunt determinate de numărul mare de aminoacizi naturali. Glicina şi alanina
formează două dipeptide mixte cu proprietăţi fizice şi chimice diferite.
Trei aminoacizi distincţi dau naştere la 6 tripeptide izomere (peptidul cuprinde
câte un rest din fiecare aminoacid). Din condensarea a 4 aminoacizi pot rezulta 24
tetrapeptide iar din 5 aminoacizi 120 tetrapeptide.
Prin condensarea mai multor molecule de aminoacizi se formează polipeptide.
Un polipeptid cuprinde o catenă principală în care se repetă grupul de atomi: –
NH–CH–CO–. Varietatea lanţurilor este asigurată de radicalii R legaţi la Cα.
Capătul N-terminal Capătul C-terminal
+ -
H3 N CH CO NH CH CO NH CH CO HN CH CO NH CH CO NH CH COO
R1 R2 R3 R4 R5 R6
Capetele moleculei unui peptid sunt diferite, unul are gruparea aminică liberă,
capăt N-terminal, iar celălalt are gruparea carboxil neangajată, este capătul C-terminal.
Peptidele încep cu capătul N-terminal.
Denumirea peptidelor se face considerându-le derivaţi acilaţi ai restului
aminoacidic C-terminal. Se citesc succesiv radicalii aminoacidici începând cu capătul N-
terminal până la restul C-terminal.
Uneori la legătura peptidică participă grupări carboxil şi amino, care nu sunt
legate la Cα. Peptidele în care se găsesc astfel de legături se numesc atipice (cazul
glutationului, a unor peptide ciclice şi ramificate).
NH2 CH2
SH
Glutationul (G-SH), se află în celulele animalelor superioare îndeplinind
următoarele roluri:
Acţionează ca agent redox:
- 2 H+
2 G SH G S S G
forma redusă + 2 H+
forma oxidată
2.2.3.Rolul peptidelor
Peptidele îndeplinesc diferite roluri fiziologice. In creier au fost identificate
numeroase peptide cu roluri reglatoare în procesele de memorie, durere, somn, etc.
Aceste peptide rezultă din prelucrarea unor precursori polipeptidici proveniţi din
proopiomelanocortină (POMC), polipeptid care cuprinde aproximativ 285 resturi
aminoacidice. Prin prelucrarea acestor precursori, se formează α, β, γ- endorfine şi Met-
encefalină. Endorfinele sunt neuropeptide cu acţiuni asemănătoare cu ale morfinei,
principiu activ extras din opiu, compus cu acţiune analgezică şi euforică. Endorfinele se
leagă prin receptori specifici de terminaţiile nervoase din creier, la care se poate lega şi
morfina, şi alte opioide. Primele opioide descoperite au fost cele două pentapeptide
numite encefaline (Fig.2.4).
+ -
H3 N Thr Gly Gly Phe Met COO
+ -
H3 N Thr Gly Gly Phe Leu COO
OR`
34
Anumite peptide au rol hormonal. De exemplu, bradikinina este agent
hipotensiv pe când angiotensina II care stimulează secreţia de aldosteron este agent
hipertensiv.
Vasopresina numit şi hormon antidiuretic (stimulează reabsorbţia apei în tubii
renali distali) şi oxitocina (determină contracţia musculaturii netede din uter) sunt
nonapeptide cu câte o punte disulfurică intracelulară, sintetizate în hipotalamus şi
depozitate în neurohipofiză.
Somatostatina care este sintetizată atât în hipotalamus cât şi în pancreas reglează
eliberarea glucagonului ca şi a altor hormoni.
Glucagonul este hormon produs de pancreas cu rol în reglarea glicemiei.
Alte peptide au importanţă comercială. De exemplu, aspartamul (L-aspartil L-
fenilalanil-1-metil ester) este un îndulcitor artificial de 160 de ori mai dulce ca zaharoza.
Indivizii care nu pot metaboliza fenilalanina au intoleranţă la acest îndulcitor.
-
COO
CH2 CH2
+
H3 N CH CO NH CH CO OCH3
L-aspartil-L-fenilalanin-1-metil ester
2.3.Proteine
2.3.1.Clasificarea proteinelor
1.Clasificare după compoziţia chimică
a.Proteinele simple sunt formate numai din aminoacizi (lizozimul,
ribonucleaza).
b.Proteinele conjugate conţin grupări adiţionale (prostetice) care nu sunt de
natură aminoacidică:
–hem (hemoglobina, mioglobina, citocromii, catalaza, peroxidazele);
–coenzime care sunt derivaţi ai vitaminelor (succinat dehidrogenaza,
transaminazele, lactat dehidrogenaza);
–metale (feritina, ceruloplasmina, carboxipeptidaza);
–acizi nucleici (ribozomii, nucleozomii);
–lipide (chilomicroni, lipoproteinele cu densitate foarte mică-VLDL,
lipoproteinele cu densitate mică-LDL, lipoproteinele cu densitate mare-HDL);
–hidraţi de carbon (imunoglobulinele, colagenul).
2.3.2.Structura proteinelor
Complexitatea proteinelor a făcut necesară introducerea mai multor trepte de
organizare structurală denumite structură primară, secundară, terţiară şi cuaternară
(Fig.2.5).
1.Structura primară a proteinelor sau structura covalentă
In 1953, Frederick Sanger a determinat secvenţa aminoacidică a insulinei,
proteină cu rol hormonal. El a demonstrat că insulina conţine numai L-α-aminoacizi.
Cercetările care au urmat au dus la stabilirea secvenţei aminoacidice la mai mult de 104
proteine. S-a stabilit că fiecare proteină are o structură primară unică, foarte precis
definită.
a.Structura primară precizează natura chimică, proporţia şi succesiunea
resturilor aminoacidice din moleculă. Ea redă totalitatea legăturilor covalente din
moleculă şi mai este denumită şi structură covalentă.
Studiile effectuate între anii 1950-1960 au arătat că secvenţa aminoacizilor din
proteine este determinată genetic. Secvenţa nucleotidelor din ADN, molecula eredităţii,
este transcrisă într-o secvenţă complementară de nucleotide din molecula ARN, care
specifică secvenţa aminoacizilor din proteine. Fiecare aminoacid, din cei 20 de
aminoacizi naturali, este codificat de una sau mai multe secvenţe de trei nucleotide
numite codoni. Proteinele din toate organismele sunt sintetizate din aminoacizii lor
constituenţi printr-un mecanism comun.
b.Importanţa cunoaşterii structurii primare a proteinelor
Cunoaşterea structurii primare a proteinelor este necesară pentru determinarea
structurii sale tri-dimensionale şi pentru înţelegerea mecanismului molecular de acţiune al
acestora (ex. mecanismul de acţiune al enzimelor). Succesiunea de legare a aminoacizilor
este legătura între mesajul genetic din ADN şi structura tridimensională care conferă
proteinei proprietăţile ei biologice.
Compararea structurii primare a proteinelor omoloage (proteine înrudite în
cursul evoluţiei) arată care dintre resturile aminoacidice sunt esenţiale pentru funcţia
proteinelor, care sunt mai puţin semnificative şi care au un rol foarte mic.
Unele resturi de aminoacizi din poziţii specifice ale proteinelor omoloage, sunt
relativ invariante; adică, sunt identice în toate speciile sau sunt înlocuite doar rareori.
Proteinele omoloage conţin şi resturi variabile, de obicei majoritatea resturilor din lanţ,
care variază mult mai mult de la o specie la alta şi în care mai mulţi aminoacizi diferiţi se
pot înlocui unii pe alţii.
Determinarea secvenţei aminoacidice este importantă pentru patologia
moleculară. Modificarea secvenţei aminoacidice poate duce la modificarea funcţiei
36
proteinei şi în final la boală. Boli ca anemia falciformă rezultă din înlocuirea acidului
glutamic din poziţia 6 a lanţului β al hemoglobinei cu valina. Inlocuirea aminoacidului
este rezultatul unei mutaţii în molecula ADN care codifică sinteza catenei β a
hemoglobinei.
Aminoacid
a).Structura
primară
Legătură
peptidică
b).Structură
secundară
β-foaie pliată
α-helix
Legături de hidrogen
c).Structura Lasou
tertiară
d).Structura
cuaternară
R1 H O R3
N H O C
HH
NN
NN
39
a) Atomii Cα ai resturilor
aminoacidice b)
consecutive
R
R R
R
R
0.54 nm
3,6 aminoacizi R
per tur
R
R
Catena polipeptidică
Fig.2.8 Structură α- helix. a) geometria elicei; b) secţiune în structura helixului, care arată
poziţiea radicalilor R.
b.Structura β
In 1951 anul în care Pauling a propus structura de α-helix, Pauling şi Corey au
postulat existenţa structurii β-foaie pliată. Ca şi structura α, structura β se referă tot la
capacitatea coloanei vertebrale polipeptidice, de a forma număr maxim de legături de
hidrogen.
In cadrul acestei structuri toate legăturile peptidice componente sunt
implicate în legături de hidrogen. Legăturile de hidrogen, în cadrul acestei
structuri, sunt perpendiculare pe axul catenei.
Spre deosebire de structura α, care se referă la legăturile de hidrogen dintre
punţile peptidice din cadrul aceluiaşi lanţ polipeptidic, structura β se referă la
legăturile de hidrogen dintre punţile peptidice, care fac parte din lanţuri polipeptidice
diferite.
Tipuri de structuri β
–structură β cu lanţuri antiparalele (un lanţ evoluează de la capătul N-terminal
spre C-terminal şi celălalt în sens invers) (Fig.2.9).
H R O H R O H
N N N
N N
R O H R O H R O
R H O R H O R H
N N N
N N
O R H O R H O
Fig.2.9 Structură β cu lanţurile polipeptidice antiparalele. (Liniile punctate reprezintă
legăturile de hidrogen care sunt perpendiculare pe catena polipeptidică).
40
H R O H R O H
N N N
N N
R O H R O H R O
H R O H R O H
N N N
N N
R O H R O H R O
Fig.2.10 Structură β cu lanţurile polipeptidice paralele
HOOC
c.Structuri supersecundare
In structura proteinelor globulare se combină elemente de structură secundară (α-
helix, β-foaie pliată, secvenţe nerepetitive). Fig.2.11
Repartizarea segmentelor de α-elice şi β-foaie pliată în cuprinsul moleculei
este diferită de la o proteină la alta, în funcţie de distribuţia factorilor stabilizatori şi
destabilizatori ai elicei în structura primară. Structurile regulate de α-elice şi β-foaie
pliată pot fi întrerupte adesea de structuri neregulate.
41
Unitate β−α−β Greek key β-meander β-barell
~450 A
Capete
Protofibrilă
C-terminale
Colagenul.
Colagenul este cea mai abundentă proteină fibroasă reprezentând cca. 25% din
masa proteinelor organismului uman. Este componentul major al ţesutului conjunctiv din
oase, dinţi cartilagii, tendoane cornee şi din matricea fibroasă a pielii şi vaselor de sânge.
Colagenul reprezintă 90% din matricea organică a osului. Colagenul este unicul
constituent al organismelor superioare care prezintă rezistenţă la tracţiune. El conferă
rezistenţă şi păstrează integritatea structurală a ţesuturilor în constituţia cărora intră.
Compoziţia şi secvenţa aminoacidică
Colagenul are o compoziţie aminoacidică specifică. Printre aminoacizii
constitutivi predomină glicina (33%) reprezentând fiecare al treilea rest aminoacidic (X-
Y-Gly)n. Intr-o măsură mai mică (10%) se află prolina iar într-o proporţie şi mai redusă
se găsesc doi aminoacizi atipici: hidroxiprolina şi hidroxilizina. Aceşti doi aminoacizi
atipici se formează din prolină şi lizină în procesul de biosinteză al colagenului, ca
rezultat al modificărilor post-traducere. Hidroxilarea prolinei şi lizinei se face în prezenţa
enzimelor prolilhidroxilaza şi respectiv lizilhidroxilaza. Pentru activarea
prolilhidroxilazei este necesară prezenţa oxigenului molecular, a ionilor Fe2+ şi a
vitaminei C. Deficienţa vitaminei C afectează hidroxilarea şi, prin urmare, obţinerea unui
colagen normal.
Structura tropocolagenului. O singură moleculă de colagen este formată din
trei lanţuri polipeptidice numite lanţuri α (fiecare formând câte o elice cu răsucire spre
43
stânga) care se înfăşoară unul în jurul celuilalt rezultând un triplu helix cu răsucire spre
dreapta (Fig.2.13).
Secventa de
aminoacizi - Gly - X - Y - Gly - X - Y -Gly - X - Y -
α-helix
Triplu helix
Tropocolagen
Fibrila de colagen
Fibra de colagen
44
încrucişate precum şi prin grosimea fibrelor. Microfibrilele se dispun în mod deosebit
în diverse organe; în tendoane formaţiunile fibrilare sunt dispuse în mănunchiuri paralele.
Elastina
Elastina, este cea mai importantă scleroproteină din compoziţia fibrelor elastice ale
tendoanelor, vaselor de sânge, pielii şi ale altor ţesuturi elastice ale corpului. În aortă se află
în proporţii cuprinse între 30 şi 57 % din greutatea uscată .
Caracteristici structurale. Elastina se diferenţiază de colagen prin compoziţia sa
în aminoacizi: conţine multă prolină (aproximativ 10% din totalul aminoacizilor) şi multă
glicină (aproximativ 30%); conţine o proporţie foarte mică de hidroxiprolină şi nu conţine
hidroxilizină; conţine mulţi aminoacizi nepolari.
Elastina, ca şi colagenul, se sintetizează în fibroblaşti sub formă de proelastină
care devine elastină propriu-zisă numai după “secreţia” în mediul extracelular. Ea
formează agregate de câte două molecule care se unesc covalent prin intermediul
resturilor de lizină constitutive. In mediul extracelular elastina se asociază cu colagenul şi
alţi constituenţi.
Este de remarcat că în ţesuturi elastina se asociază cu glucide şi lipide. Această
acumulare de lipide în ţesutul elastic al arterelor coronare şi aortă constituie unul dintre
factorii patogenici ai aterosclerozei.
Ca şi colagenul, elastina este degradată prin hidroliză enzimatică. Hidrolaza
corespunzătoare acestui proces se numeşte elastază.
NH NH
- +
CH CH2 COO H3N (CH2)4 CH
CO CO
Aspartil Lizil
Punţi de hidrogen între radicalii cu grupări alcoolice (din resturi seril, treonil),
fenolice (din resturi tirozil), amidice (din resturi glutaminil şi asparaginil):
NH H NH
CH CH2 OH O CH2 CH
CO CO
Seril Seril
45
Interacţiuni hidrofobe între resturile aminoacizilor nepolari ca valină, leucină,
izoleucină, fenilalanină, alanină:
NH H3 C NH
CH CH3 CH CH
CO H3 C CO
Alanil Valil
Resturile cisteinil din multe proteine formează legături disulfurice care leagă
covalent resturi de cisteină din regiuni mai depărtate ale lanţurilor polipeptidice:
NH NH
CH CH2 S S CH2 CH
CO CO
Cisteinil Cisteinil
46
Suprafaţa externă a moleculei cuprinde toate resturile polare şi cu sarcină electrică,
aşezate printre radicali nepolari.
Hem
C
F
B D
G
E
H
A
3.Structura cuaternară
Multe proteine, în particular cele cu masa moleculară >100 kD, sunt alcătuite din
mai multe lanţuri peptidice, de regulă un număr mic şi pereche (proteine oligomere)
(Tabelul 2.3 ). Lanţurile individuale denumite protomeri sau subunităţi, prezintă fiecare
structura sa primară, secundară şi terţiară. Asamblarea protomerilor, structura
cuaternară, se realizează numai prin forţe slabe necovalente şi asocierea devine
stabilă, numai dacă suprafeţele de contact sunt complementare şi un număr cât mai mare
de atomi se apropie până la nivelul razelor lor van der Waals (raze de contact).
Fig. 2.15. Reprezentarea schematică a unei structuri cuaternare formată din patru
protomeri.
4.Şaperonii moleculari
Împachetarea proteinelor in vivo se produce în condiţii în care în mediu se află
concentraţii mari din alte proteine cu care acestea ar putea interacţiona. Şaperonii sunt
proteine care se leagă la lanţurile polipeptidice neîmpachetate sau parţial împachetate
pentru a preveni asocierea improprie a segmentelor hidrofobe din care ar rezulta o
formă ne-naturală a proteinei ca şi o agregare şi o precipitare a proteinei. Acest proces
este important mai ales în cazul proteinelor multidomeniale, formate din mai multe
subunităţi sau ale căror componente trebuie să se împacheteze complet înainte ca ele să se
asocieze unele cu altele. Şaperonii moleculari permit de asemenea proteinelor greşit
împachetate să se rearanjeze în forma lor nativă.
Şaperonii au fost descrişi pentru prima oară ca proteine de şoc termic (Hsp)
deoarece viteza lor de sinteză creşte cu creşterea temperaturii. Probabil, este necesară o
cantitate mai mare de şaperoni pentru a repara proteinele împachetate greşit sau a preveni
împachetarea greşită, din cauza stresului termic sau oxidativ.
48
S-au identificat două clase de şaperoni moleculari la procariote şi eucariote:
familia Hsp 70, proteine cu masa moleculară 70-kD şi şaperonine, proteine mari cu
multe subunităţi.
Proteina Hsp 70 leagă polipeptidul nou sintetizat, chiar de la începutul sintezei
lui, după legarea a 30 aminoacizi la nivelul ribozomului. Scopul legării este împiedicarea
împăturirii premature.
Şaperoninele sunt formate din două tipuri de proteine:
–proteine Hsp 60 (Gro EL în E. coli.) formate din 14 subunităţi aranjate în forma
unui cilindru;
–proteine Hsp 10 (Gro ES în E. coli), formate din 7 subunităţi aşezate în forma
unui dom.
Paul şi Singler au arătat că unul din capetele goale ale cilindrului Gro EL este
acoperit cu complexul Gro ES. In interiorul cilindrului proteina are mediu hidrofob
favorabil împăturirii fiind protejată de contactul cu alte proteine parţial împăturite.
Subunitatea Gro EL leagă ATP şi catalizează hidroliza la ADP şi fosfat
anorganic, process care determină o modificare conformaţională cu mascarea zonelor
hidrofobe. Proteina legată este eliberată şi stimulată să continue împăturirea. Acest ciclu
ATP-dependent de legare, eliberare şi împăturire a proteinei continuă până când proteina
capătă conformaţia nativă.
6.Denaturarea proteinelor.
Modificarea conformaţiei native a proteinelor poartă denumirea de denaturare.
Prin denaturare sunt afectate legăturile necovalente din structura unei proteine, care
asigură conformatia acesteia.
Procesul denaturării nu presupune hidroliza legăturilor peptidice. Prin denaturare
se pierde, parţial sau total, activitatea biologică specifică.
Agenţi denaturanţi mai importanţi sunt: radiaţiile UV, γ, X , temperatura, pH-uri
extreme (acide sau bazice), alcooli, acizi organici, ureea, guanidina etc. Nu toti agentii
denaturanţi actionează în acelaşi mod. Unii (alcooli, uree, guanidina, temperatura) desfac
legăturile de hidrogen, alţii (acizi tari, baze tari) scindează legăturile ionice, etc.
49
7.Solubilitatea.
Hidrosolubilitatea proteinelor depinde de pH-ul mediului în care se află proteina,
deoarece această însuşire este datorată repartizării pe suprafaţa moleculelor proteice a
resturilor de aminoacizi cu sarcini electrice şi grupări polare.
Diverse săruri ale metalelor uşoare, influenţează considerabil solubilitatea
proteinelor, dintre acestea mai importante sunt: NaCl, MgCl2, Na2SO4, etc.
De altfel sulfatul de amoniu este utilizat pentru a separa globulinele [care
precipită când soluţiile în care se află sunt aproximativ semisaturate cu (NH4)2SO4] de
albumina [care precipită în soluţie saturată de (NH4)2SO4].
b.Bolile prionice
Prionii sunt proteine implicate în maladii ca: encefalopatia spongiformă
transmisibilă, care include maladia Creutzfeldt-Jakob la oameni, scrapie la oi şi
encefalopatia spongiformă bovină la vaci (cunoscută popular ca boala vacii nebune
50
“mad cow disease”). Forma neinfecţioasă a prionilor are aceiaşi secvenţă aminoacidică
(structura primară şi genetică) cu proteina infecţioasă şi este prezentă în creierul
mamiferelor fiziologic normale, pe suprafaţa neuronilor şi a celulelor gliale. Nu s-au
identificat modificări post-traducere în forma normală a prionilor. Prionii sunt proteine
gazdă. Transformarea proteinei normale într-o proteină infecţioasă este determinată
de modificări ale conformaţiei tri-dimensionale ale acesteia. S-a constatat că prin
transformarea unor structuri α-helix în β-foaie pliată proteina normală devine infecţioasă.
Este posibil ca această diferenţă conformaţională să confere rezistenţă la degradarea
proteolitică a prionilor infecţioşi. Agentul infecţios este , prin urmare, o versiune
modificată a proteinei normale, care acţionează ca “template” pentru transformarea
proteinei normale într-o formă patogenică.
2.4.Hemoproteinele
2.4.1.Hemul
Hemul este o grupare prostetică care permite legarea oxigenului la mioglobină şi
hemoglobină. Fără această grupare, apoproteina nu leagă oxigenul. (Fig.2.17)
Hemul este format din Fe2+ şi protoporfirina IX. Protoporfirina IX este un
compus cu structură macrociclică, tetrapirolică, cu caracter aromatic, care poartă în
poziţiile 1-8 următorii substituenţi:
–1, 3, 5, 8 grupări –CH3 (metil, M);
–2, 4 grupări –CH=CH2 (vinil);
–6,7 grupări –CH2-CH2-COOH (propionic, P)
M V
HC CH
M N M
H
N N
H
P N V
HC CH
P M
Protoporfirină IX
51
Asocierea Fe2+ la protoporfirină se face prin cei patru atomi de azot ai porfirinei,
şi alţi doi liganzi externi, de regulă furnizaţi de grupări din proteină (Fig.2.17).
His proximală
N N
Fe2+
N N
Plămân
PO2=100mm Hg
PO2=20 mm Hg
Muschi CO2 Mioglobină + O2
Mitocondria
52
Mioglobina are rol în depozitarea şi transportul oxigenului la nivel muscular.
Pentru a realiza acest rol mioglobina trebuie să lege oxigenul la o presiune mică a
acestuia, cum se întâmplă la nivel tisular, unde oxigenul este eliberat de pe hemoglobină
(Fig.2.19).
100
Saturare cu O2 (%)
80 Mb
60
40
20
20 40 60 80 100 120
Presiunea O2 (mm Hg)
53
a) b) β2 β1
β
Hem
Locul de legare a α2
2,3-bisfosfogliceratului α1
Fig.2.21. Structura hemoglobinei (a.structura terţiară a lanţului β al hemoglobinei; b.structura
cuaternară a hemoglobinei).
α2β2 2 αβ 2α+2β
b.Rolul fiziologic
Hemoglobina transportă oxigenul de la plămân la ţesuturi, şi dioxidul de carbon
şi protonii de la ţesuturi la plămân.
O2 O2 O2
O2
Hb HbO2 Hb(O2)2 Hb(O2)3 Hb(O2)4
54
Mioglobină Hemoglobină (pH=7,4)
100
Saturare cu O2 (%)
80 Tesut
Plămân
60
40
20 P50 (Hb)
20 40 60 80 100 120
Presiunea O2 (mm Hg)
Asp His
NH3+ COO- β2
94 146
CH CH
H2C H2C O
N 2+
Fe N Fe2+ O
C C
CH O2 CH
Histidina proximală
(F 8)
Fig.2.24. Poziţia Fe2+ faţă de planul protoporfirinei în Hb neoxigenată şi oxigenată.
Plasarea oxigenului între planul protoporfirinei şi His distală aduce Fe2+ în planul
protoporfirinei IX. Deoarece legătura Fe2+ cu His proximală nu se scindează în urma
fixării oxigenului (Fe2+ trece din starea pentacoordinată în starea hexacoordinată) acest
rest aminoacidic antrenează modificări în structura secundară şi terţiară ale fiecărei
subunităţi (Fig.2.25). Subunităţile fiind strâns cuplate, o modificare în structura terţiară a
unei subunităţi nu se poate face fără modificări în întregul tetramer.
Legarea primei molecule de oxigen favorizează prin cooperativitate legarea
oxigenului la celelalte subunităţi. Datorită scindării celor opt legături ionice se produc
modificări semnificative în structura cuaternară, care constituie tranziţia stării T în starea
R (relaxată). Starea R are o afinitate mare pentru O2.
Disocierea O2 de hemoglobină se face după aceiaşi curbă dar parcursă în sens
invers. Presiunea parţială mică a O2, în ţesuturi , favorizează procesul cedării sale de către
hemoglobină dar îl şi întrerupe în momentul când hemoglobina este încă oxigenată în
proporţie de 50-60 %. Deci, hemoglobina va prelua în plămâni doar restul de 40-50% O2.
În muşchi, oxigenul cedat de Hb este uşor preluat de Mb. În timpul sarcinii O2
este cedat cu uşurinţă de la Hb mamei la Hb embrionului şi a fătului ale căror curbe de
oxigenare sunt, sigmoidale, dar deplasate la stânga în raport cu cea a HbA1.
Forma T Helix F
Leu
Leu Val
Forma R
Histidina proximală (F 8)
Planul protoporfirinei
O2
56
d.Transportul CO2 şi efectul Bohr.
În 1904 Christian Bohr a precizat că Hb cedează mai uşor O2 dacă pH-ul este mai
mic decât cel fiziologic şi presiunea parţială a CO2 este mai mare, curba de oxigenare
fiind deplasată spre dreapta (Fig.2.26).
100
pH=7,6
Saturare cu O2 (%)
80
pH=7,4
60
pH=7,2
40
20
20 40 60 80 100 120
Presiunea O2 (mm Hg)
Aceste constatări sunt cunoscute sub numele de “efect Bohr”. In vivo, la nivelul
ţesuturilor, se află concentraţii mari de CO2 şi de protoni rezultate în urma proceselor
catabolice.
CO2 reglează oxigenarea hemoglobinei prin formarea carbamaţilor:
Aproximativ 15% din CO2 este transportat la plămân în vederea eliminării în
formă de carbamaţi. Forma T (deoxi) a Hb leagă mai mult CO2 decât forma R (oxi).
Grupările –NH2 ale aminoacizilor terminali din lanţurile Hb şi a altor proteine
reacţionează cu CO2:
-
R NH2 + CO2 R NH COO + H+
ion carbamat
H2CO3 H+ + HCO3-
57
Plămân Sânge Muschi
Respiratie
Expirare
AC AC
CO2+H2O CO2 HCO3- +H+ HCO3- +H+ CO2 CO2+H2O
H2 O H2 O
MbO2
+ +
Inspirare Hb HbH HbH Hb
O2 O2
O2
Mb
pO2=100 tori HbO2 HbO2
pO2=20 tori
H C O PO32-
H C O PO32-
H
D-2,3-bisfosfoglicerat
Lys
82 His 2
G
P
NH3+
B
NH3+
Lys 82
His 2
His 143
80
Cu 2,3-BPG
60
40
20
20 40 60 80 100 120
Presiunea O2 (mm Hg)
Saturare cu O2 (%)
80
60 Hematii de la mamă
40
O2 trece de la oxihemoglobina
20 maternă la deoxihemoglobina
fetală
20 40 60 80 100 120
Presiunea O2 (mm Hg)
Fig. 2.30. Reprezentarea curbelor de oxigenare pentru Hb F şi Hb A1.
e.Aspecte clinice
Glicozilarea Hb A1 în diabetul zaharat
In condiţii fiziologice hemoglobina reacţionează neenzimatic, lent cu glucoza
formând un compus cunoscut sub numele de hemoglobină glicozilată (Hb1c). Intre
gruparea carbonil din glucoză şi gruparea amino a aminoacidului terminal al lanţului β se
formează neenzimatic, un compus de tip bază Schiff.
Gradul de glicozilare a hemoglobinei este dependent de concentraţia plasmatică a
glucozei. Concentraţia hemoglobinei glicozilate în sânge este mică în condiţii fiziologice,
dar în diabet, când concentraţia glucozei în sânge este mare, peste 12% din cantitatea
totală de hemoglobină poate fi glicozilată.
Hemoglobinopatiile sunt afecţiuni determinate de mutaţiile din structura
subunităţilor proteice:
Hemoglobina S sau anemia falciformă (cu hematii în formă de seceră) este
determinată de înlocuirea acidului glutamic din poziţia 6 a lanţului de globină β cu valină.
Thalasemiile sunt anemii hemolitice determinate de producerea unor cantităţi
insuficiente de subunităţii α sau β din hemoglobină.
60
cit c
1 e- Fe3+ 1 e-
citocrom c citocrom c
reductaza cit c oxidaza
Fe2+
Lant polipeptidic
H3C HC CH
N CH3
N Fe2+ N
CH2 N
HC CH CH 2 S CH 2
-
CH 2
O OC
CH 3
CH 2 CH 3
CH 2
-
O OC Hys 18
Fig.2.31. Structura citocromului c
1.Serumalbuminele
Sunt cele mai abundente proteine plasmatice depăşind cu puţin proporţia de 50%
din totalul proteinelor plasmatice. Sunt proteine sintetizate în ficat. Au pI = 5.
La pH-ul fiziologic migrează spre anod, având o încărcare negativă.
Prin concentraţia lor plasmatică mare, sunt componentele responsabile de
presiunea coloid osmotică a plasmei, având rolul de a menţine apa în compartimentul
intravascular.
61
Serumalbuminele au proprietatea de a lega, mai mult sau mai puţin specific,
diverşi componenţi plasmatici, îndeplinind rolul de transportori al acestora: hormoni,
vitamine şi medicamente, cationi, acizi graşi liberi, bilirubină.
Prin concentraţia lor ridicată reprezintă un important sistem tampon plasmatic
2.Globulinele
Sunt mai heterogene, fiecare componentă enumerată mai sus fiind alcătuită din
mai multe subcomponente:
−α1-globulinele sunt alcătuite din următoarele subcomponente: α1-glicoproteina
(orosomucoid), α1-antiproteaza (α1-antitripsina), apolipoproteina A şi α1-fetoproteina
−α2-globulinele sunt alcatuite din haptoglobina, α2-macro-globulina şi
ceruloplasmina.
−β-globulinele cuprind: transferina, apolipoproteina B, C4 şi C3 (componente ale
complementului), β2-microglobulina, etc.
−γ-globulinele cuprind anticorpii (imunoglobulinele).
Clase de antigene
Proteinele sunt cele mai puternic antigenice. Au putere imunogenă foarte mare.
Glucidele pot deveni antigene numai legate de proteine. In schimb acestea
conferă specificitate înaltă.
Lipidele nu sunt antigenice. Ele devin antigene prin legare de proteine
(complexele fosfolipoproteice); Acizii nucleici sunt slab antigenici.
64
d.Structura anticorpilor (Fig.2.32).
Anticorpii sunt tetrameri cu formula moleculară H2L2.
Molecula anticorpului este alcătuită din două lanţuri grele identice H (heavy) ce
cuprind aproximativ 440 resturi aminoacidice şi două lanţuri uşoare identice L (light)
cu aproximativ 220 resturi aminoacidice, unite între ele prin punţi disulfurice. Cele patru
lanţuri pot fi separate prin reducerea acestor legături.
VL VL
Loc de legare Lant usor Loc de legare
antigen antigen
CL CL
VH VH
COO- -
OOC
Lant CH 1 CH 1
greu Fab
Fab Papaina Zonă flexibilă
CH 2 CH 2
Punti de sulf
Fc
CH 3 CH 3 V = Zone variabile
C = Zone constante
-
OOC COO-
66
anticorpii IgM şi IgE, pe care îi înlocuiesc. In cursul răspunsului imun secundar se vor
sintetiza în principal IgG, în cantităţi mari.
IgA. Se prezintă sub formă monomeră şi dimeră. Forma dimeră a IgA se
constituie din două subunităţi monomer legate prin punţi de sulf la extremitatea C-
terminală cu participarea lanţului polipeptidic J (joint=legare) (Fig.2.33). Au masa
moleculară de 400 kDa şi reprezintă 17% din totalul imunoglobulinelor organismului. Se
află în sânge în proporţie de 42% din totalul lor, restul fiind dispersate în secreţii şi pe
suprafaţa mucoaselor unde constituie imunoglobulinele active majore. Timpul de
înjumătăţire este de 5,9 zile. IgA nu activează complementul.
IgM. Sunt pentameri cu masa moleculară 900 kDa. Prezintă doar cinci situsuri
de legare a antigenului restul situsurilor până la 10 fiind mascate. La constituirea
moleculei participă un lanţ polipeptidic J (Fig.2..33). Reprezintă 3% din totalul
imunoglobulinelor organismului. Se găsesc predominant intravascular (80%). Pot traversa
bariera vasculară alterată, apărând în focarele inflamatorii. Nu se transmit transplacentar,
dar apar în concentraţii reduse în colostru şi secreţii. Timpul de înjumătăţire al IgM este
de 5,1 zile. In dinamica răspunsului imun IgM intervin după IgE, dar înaintea IgG.
S C
λ
S S J µ
S S
VIII Factor X
Factor X Factor Xa
Va
V
Protrombina Trombină
Factor XIII
II
a.Structură.
Este un hexamer alcătuit din trei tipuri de lanţuri: Aα (610 aminoacizi), Bβ (461
aminoacizi) şi γ (411 aminoacizi). Formula sa moleculară este (AαBβγ)2. Molecula este
alungită (460 Å), prezentând trei zone globulare, două periferice şi una centrală
(Fig.2.35). Lanţurile Bβ şi γ cuprind oligozaharide legate N-glicozidic. Fibrinogenul
cuprinde 17 punţi disulfurice.
Segmentele N-terminale A şi B (fibrinopeptide) din lanţurile Aα şi Bβ, cuprind
multe resturi de Glu şi Asp; în segmentul B se găsesc şi resturi de tirozină sulfatată.
69
Fibrinopeptidul A
Fibrinopeptidul B Lantul Aα
α
Lantul Bβ
β
Lantul γ
- +
-COO -NH3 -COO-
47,5 nm
Fig.2.35. Structura fibrinogenului
Fibrinogen
H2 O
Fibrinopeptide
Monomer de fibrină
Agregare
70
Fibrinogenul este transformat în fibrină a cărei formulă moleculară este (αβγ)2,
prin îndepărtarea fibrinopeptidelor A şi B, ca urmare a acţiunii proteolitice a trombinei.
Prin îndepărtarea fibrinopeptidelor A şi B, bogate în sarcini negative,
responsabile de menţinerea fibrinogenului în soluţie, nodulul central capătă sarcina +5.
Moleculele de fibrină se asociază longitudinal şi lateral, prin interacţiuni
necovalente, formând agregate de fibrină fragile (chiag moale) (Fig.2.36).
Agregatele fragile de fibrină se stabilizează sub acţiunea factorului XIIIa, factor
stabilizator al fibrinei, prin formarea de legături covalente între resturile de lizină şi
glutamină. Ca urmare a acestor legături, polimerii de fibrină devin insolubili şi rezistenţi.
Hematiile şi trombocitele sunt încorporate în reţeaua de fibrină formând chiagul.
O-OC COO-
CH
R CH2
NH CH CO NH CH CO
71
b.Inhibarea coagulării de către componenţi plasmatici
–inhibitorul căii extrinseci comută formarea chiagului de la calea extrinsecă la
cea intrinsecă, el nefiind un inhibitor general al coagulării;
–antitrombina III este un inhibitor al factorilor: trombină, factorul IXa, factorul
Xa, factorul XIa;
–proteina C este o serin protează plasmatică, dependentă de vitamina K,
activată de trombină, care transformă factorii activi VIIIa şi Va ai coagulării în forme
inactive;
–trombomodulina, o glicoproteină integral membranară din celulele endoteliului
vascular (conţine 560 aminoacizi şi prezintă secvenţe omoloage cu receptorul pentru
lipoproteinele cu densitate mică) acţionează ca receptor pentru trombină; în complexul
trombină-trombomodulină-Ca2+, trombina prezintă specificitate scăzută pentru
fibrinogen şi crescută pentru proteina C (trombina comută astfel de la rolul procoagulant
la cel anticoagulant).
72
3. ENZIME
NAD+ NADH + H+
CH2 C
HOOC H
COOH FAD FADH2
Acid succinic Acid fumaric
3.2.1.Formarea complexului ES
Enzima poate lega molecula de substrat în centrul său activ aducând astfel
legătura susceptibilă transformării în imediata vecinătate a grupării catalitice a enzimei
şi astfel orientată faţă de aceasta încât starea de tranziţie să fie uşor formată. Cele mai
simple reacţii enzimatice se pot reprezenta:
E + S ES E + Produsi
S S S S
α-chimotripsina contine 5 legături disulfurice
La structura centrului activ al chimotripsinei, care este formată din trei lanţuri A,
B, C, contribuie: His - 57 din lanţul B, Ser - 195 din lanţul C şi Asp - 102 din lanţul B.
Centrele active ale enzimelor au resturi aminoacidice care asigură legarea
substratului (centre de legare) şi altele care sunt responsabile de catalizarea propriu-zisă
(centre catalitice).
Resturile de aminoacizi care se întâlnesc cel mai frecvent în situsurile catalitice
ale enzimelor sunt resturile de: cisteină, serină, histidină, tirozină, acid glutamic şi
acid aspartic, cu grupările funcţionale:
-OH, -SH, -NH3+, -COO-, imidazol.
Centrul activ nu este o suprafaţă plană ci este o entitate tridimensională cu
forme diferite.
75
2.Complexul enzimă – substrat (ES)
Complexele ES sunt structuri labile, cu o viaţă foarte scurtă. Legarea
substratului la enzimă se face prin forţe necovalente (punţi de hidrogen, interacţiuni
hidrofobe, interacţiuni electrostatice) sau covalente reversibile. Specifi-citatea de legare
a substratului în centrul activ al enzimei este determinată de complementaritatea
chimică şi geometrică. S-au elaborat două modele cu privire la legarea substratului la
centrul activ al enzimei:
a.Modelul clasic al structurii spaţiale a centrului activ în raport cu structura
substratului, este acela de lacăt - cheie, propus de Emil-Fischer (Fig. 3.1).
Este un model rigid. Modelul presupune că centrul activ al enzimei şi substratul
sunt perfect complementare, se potrivesc ca o cheie în broască
Substrat
+
Complex ES
Enzimă
Substrat
+
Complex ES
Enzimă
77
Energia liberă de activare
Energia liberă
a reactiei (necatalizate)
Stare de tranzitie
(reactie necatalizată)
Stare de tranzitie
(reactie catalizată) Energia liberă de activare
Stare initială a reactiei (catalizate)
Reactanti A + B
Energia totală
eliberată Stare finală
Produsi C + D
Durata reactiei
Fig.3.3 Diagrama energiei libere de activare pentru o reacţie: (A+B C+D) catalizată şi
necatalizată.
O enzimă permite unei reacţii să se producă mai rapid în condiţiile din celule,
prin producerea unei căi alternative de reacţie, cu o energie liberă de activare mai mică.
Enzima nu modifică energia liberă a reactanţilor sau a produşilor şi nici echilibrul
reacţiilor.
Centrul activ al enzimelor foloseşte o diversitate de mecanisme chimice pentru a
favoriza transformarea substratului în produşi. Factorii responsabili de eficienţa catalitică
a enzimei sunt:
-stabilizarea stării de tranziţie (centrul activ acţionează ca un template
molecular flexibil care stabilizează starea de tranziţie a substratului);
-centrul activ prezintă resturi aminoacidice care măresc probabilitatea
producerii stării de tranziţie (anumite resturi aminoacidice acceptă sau cedează protoni
în cataliza acido-bazică în anumite enzime sau pot fi implicate în formarea unor complexe
intermediare covalente instabile, în alte enzime).
Enzimele scad mult energia de activare în raport cu catalizatorii chimici.
3.3.Cinetica enzimatică
78
d[A ] d[B]
v=− sau v=+
dt dt
Relaţiile matematice dintre vitezele de reacţie şi concentraţiile reactanţilor se
numesc ecuaţii cinetice.
v = K[A]
v = K[A][B]
50
20 40 Toptimă 60
temperatura
Fig. 3.4 Variaţia activităţii enzimelor în funcţie de temperatură
80
activitatea
enzimatică pepsina tripsina colinesteraza
100
%
50
1 2 7 8 9 10 14
pH
Fig. 3.5. Variaţia activităţii unor enzime în funcţie de pH
concentratia enzimei
vmax
saturatie
vmax
2
KM concentratia substratului
Fig. 3.7 Variaţia vitezei unei reacţii enzimatice în funcţie de [S]
[Etotal] = [ES]
Într-o stare staţionară, [ES] rămâne practic constantă, adică viteza cu care se
formează complexul ES este egală cu viteza lui de disociere:
v1 = v2 + v3
[ E][S] K 2 + K 3
= = KM
[ES] K1
K 2 [ E ][S]
KM = =
K1 [ES]
82
În aceste condiţii, KM este o constantă de echilibru, constanta de disociere a
complexului ES, inversul constantei de asociere dintre S şi E.
KM este o măsură a afinităţii dintre E şi S (afinităţile enzimelor pentru
substraturile lor sunt cu atât mai mari cu cât valorile KM sunt mai mici).
Etapa a 3-a este ireversibilă deoarece este o etapa lentă iar „în vivo“ P devin
substraturi în alte reacţii.
Viteza globală a transformării: S → P este:
v0 = K3[ES]
Când [S] este atât de mare încât toată E este în forma de complex ES, vo poate fi
înlocuit cu Vmax:
[Etotal] = [ES] şi vo = Vmax => Vmax = K3[Et]
[E ][S] [E][S]
Din KM = => [ ES] =
[ES] KM
v0 [S ]
=
Vmax K M + [ S ]
Vmax .[ S ]
v0 =
K M + [S ]
1 1
Reprezentarea grafică = f( ) este o dreaptă, (Fig. 3.8)
V0 [S]
1/V
Panta = KM/Vmax
1/Vmax
- 1/KM 0 1/[S]
HC O P O CH HC O P O CH
84
Fig.3.9 Acţiunea diizopropil-fluorofosfatului (DIFP) asupra activităţii enzimelor
Hemoproteinele (citocromi, hemoglobina) sunt inactivate de către: CO, CN care
se leagă de ionul de Fe2+ din hem
EI
EI + S ESI
v`max + In 1/v`max
vmax / 2
v`max / 2 1/vmax
ESI
3.4.Enzime alosterice
vmax / 2
KM concentratia substratului
87
Teoria complementarităţii induse dintre enzimă şi substrat poate explica acest
comportament, prin propagarea modificării conformaţionale indusă de substrat într-un
centru, până la nivelul celui de-al doilea centru de legare. Contactul dintre subunităţi, în
cadrul structurii cuaternare, permite comunicarea între centre de legare depărtate în
spaţiu.
Enzimele care dau curbe v=f([s]) sigmoide sunt denumite alosterice.
Liganzii fixaţi pot să fie de acelaşi fel (de ex. substratul să fie fixat în ambele
locuri ale unui dimer) sau diferiţi;
Într-un centru este legat substratul (centru izosteric) şi în alt centru care poate
fi situat pe acelaşi lanţ polipeptidic dar în regiune diferită, denumit centru alosteric
(allos=altul) este fixat un compus distinct de substratul enzimei, denumit efector
alosteric;
Ocuparea cu ligand a centrului alosteric, induce o tranziţie conformaţională
resimţită şi de centrul de legare a substratului, fie în sensul creşterii afinităţii, fie în sensul
scăderii afinităţii sale pentru substrat (Fig. 3.13).
activitatea vmax
enzimatică 100
%
3 1
50 2
KM [S]
Fig. 3.13 Reprezentarea grafică a vo=f([S]) pentru: (1.enzima alosterică cu efect homotrop,
2.enzima alosterică + modulator negativ, 3.enzima alosterică + modulator pozitiv).
Fig. 3.15 În modelul simetric un inhibitor alosteric stabilizează forma T pe când un activator
alosteric stabilizează forma R
89
Activatorii stabilizează starea R cu afinitate mare pentru substrat
Efectorii negativi stabilizează starea T cu afinitatea mică pentru substrat.
90
1.Enzimele constitutive sunt enzimele la care Ks = Kd.
Ele catalizează procese fundamentale pentru existenţa celulei. Enzimele
constitutive se găsesc în celule în cantităţi relativ constante. Aceste enzime nu suferă
fluctuaţii semnificative în raport cu factorii de mediu.
2.Enzimele inductibile sunt enzimele pentru care Ks > Kd :
In general, enzimele inductibile sunt implicate în căi catabolice. Enzima este
sintetizată numai dacă există substratul asupra căruia să acţioneze. Substratul acţionează
ca un inductor, accelerând sinteza enzimelor.
3.Enzimele represibile, sunt enzimele pentru care Ks < Kd:
Sunt represibile unele enzime implicate în procese de sinteză a unor constituenţi
celulari (procese anabolice). Sinteza acestor enzime este încetinită de produsul final al
reacţiei catalizate;
Represia se face de obicei, prin intermediul unor compuşi cu molecula mică
numiţi corepresori care acţionează sub forma unor complexe cu proteine specializate
numite aporepresori.
91
Glucoză + ATP Glucozo-6-P + ADP
E3 D P1
E1 E2
A B C
E4 E P2
3.5.4.Reglarea covalentă
Apare la organismele superioare şi presupune:
1.Transformarea unor enzime din forma activă în forma inactivă şi invers prin
ruperea unor legături covalente. Enzimele supuse acestui tip de reglare se numesc enzime
interconvertibile, conversia având loc prin:
–fosforilare;
–nucleotidilare (adăugarea reversibilă a unui nucleotid, la un aminoacid
specific, predominantă la bacterii);
2.Trecerea enzimelor inactive în enzime active prin proteoliză, ruperea unei
legături covalente (proces unidirecţional).
1.Enzime interconvertibile prin fosforilare <==> defosforilare
Fosforilarea se face prin transferul unui singur rest de acid fosforic de pe ATP
pe un rest de serină şi mai rar de treonină sau tirozină care nu fac parte din centrul activ al
enzimei (Fig.3.17).
Fosforilările sunt catalizate de kinaze specifice care la rândul lor sunt enzime
convertibile (fosfokinaze sau defosfokinaze) supuse unui control hormonal;
Reacţiile de fosforilare sunt ireversibile fiind puternic endergonice;
92
Transformarea inversă este tot ireversibilă, şi se face hidrolitic în prezenţa unor
fosfataze. Fosfatazele sunt la rândul lor supuse unui control hormonal.
Unele enzime sunt active în forma fosforilată (glicogen fosforilaza implicată în
catabolismul glicogenului), altele sunt active în forma defosfo (glicogen sintaza implicată
în biosinteza glicogenului, proces anabolic).
Acest tip de activare este, de multe ori, etapa finală într-o cascadă de evenimente
declanşate de legarea unui hormon la o membrană celulară.
ATP ADP
proteinkinaze
fosfataze
Pi H2O
93
b.Enzimele coagulării şi fibrinolizei.
Iniţierea procesului de coagulare este urmată de activarea în cascadă a
factorilor de coagulare (Fig.2.34).
Unii dintre factorii coagulării sunt zimogeni care după activare se transformă în
enzime proteolitice cu specificitate foarte mare.
Avantajele unui răspuns reglator în cascada sunt:
-o cantitate foarte mică de iniţiator este necesară pentru a iniţia un răspuns
amplu. Activarea nu are loc fără iniţiator, răspunsul putând fi astfel localizat la locul de
activare.
-fiecare etapă a cascadei amplifică răspunsul ceea ce asigură un răspuns amplu şi
rapid.
Există două căi iniţiate de activatori diferiţi care converg într-o cale finală
comună (vezi cap 2, Fig. 2.34)
–calea intrinsecă, cu participare de factori sanguini;
–calea extrinsecă, la care participă şi factori de origine exclusiv tisulară.
Fibrinoliza. Componenţii necesari dezagregării chiagului se găsesc în sânge în
formă inactivă şi se activează proteolitic (Fig. 3.18).
Factor tisular
Plasminogen Plasmină
Fig. 3.18. Plasmina formată din plasminogen prin acţiunea proteolitică a factorului tisular de
activare a plasminogenului, lizează chiagul de fibrină.
3.6.Antienzime (antiproteaze)
3.7.Izoenzimele
Lactat dehidrogenaza
H3C CH COOH H3C C COOH
OH O
Acid L-lactic + + Acid piruvic
NAD NADH + H
LDH este o proteină tetramerică, alcătuită din lanţuri M (de la muscle) şi din
lanţuri H (de la heart). Prin combinarea celor două tipuri de protomeri rezultă cinci
izoenzime: H4, H3M, H2M2, HM3, şi M4 sau după mobilitatea electroforetică LDH1
LDH5.
95
Izoenzimele LDH au afinităţi diferite pentru piruvat (sau lactat):
Izoenzimele H4 şi H3M sunt caracteristice inimii, cu un metabolism oxidativ
aerob.
Izoenzima H4 are cea mai mica afinitate pentru piruvat (îl transformă greu în
lactat).
Izoenzimele M4 şi M3H sunt caracteristice muşchilor scheletici, ficatului,
unde prin metabolizarea glucozei se formează cantităţi mari de lactat. Izoenzima M4 are
afinitate mai mare pentru piruvat ca H4.
Determinarea activităţii enzimelor serice poate fi folosită în clinică pentru
stabilirea originii ţesutului lezat, dacă se are în vedere distribuţia relativ diferită a
izoenzimelor LDH în diferite ţesuturi.
3.8.Complexe multienzimatice
3.9.1.Denumirea enzimelor
Pentru denumirea enzimelor se pot utilza două modalităţi:
1.In cele mai multe cazuri numele enzimei se formează prin adăugarea sufixului –
ază la numele substratului (zaharază, urează, glucozidază) sau se dă denumirea după
acţiunea specifică a enzimei (guanilat ciclază, lactate dehidrogenază, glutation reductază).
96
Pentru unele enzime s-au atribuit denumiri particulare fără legătură cu reacţia catalizată:
pepsină, chimotripsină, tripsină.
2.Identificarea unui număr mare de enzime a impus intoducerea unor denumiri
bazate pe criterii chimice prin care numele enzimei cuprinde denumirea substratului, tipul
reacţiei catalizate, coenzima şi este corelat cu clasa, subclasa, sub-subclasa şi numărul de
ordine al enzimei. Fiecare enzimă este codificată de patru cifre, care definesc: clasa,
subclasa, sub-subclasa, numărul de ordine al enzimei din şir.
3.9.2.Clasificarea enzimelor
Sunt 6 clase de enzime după tipul de reacţie catalizat:
1.Oxidoreductaze
2.Transferaze
3.Hidrolaze
4.Liaze
5.Izomeraze
6.Ligaze
97
Monooxigenazele încorporează numai un atom de oxigen în substrat, celalalt
atom al dioxigenului este redus la apă. Multe monooxigenaze sunt hidroxilaze care
implică participarea sistemului redox: NADP+ - (NADPH + H+)
R-H + O2 + (NADPH + H+) R-OH + H2O + NADP+
Subclase
Împărţirea în subclase se face, după natura grupării transferate, transferul fiind de
multe ori mediat de o coenzima:
Aminotransferaze (transaminaze) catalizează transferul unei grupări amino între
un amino şi un cetoacid. Coenzima participantă este piridoxal fosfatul.
R1 CH COOH + R2 C COOH R1 C COOH + R2 CH COOH
NH2 O O NH2
Aciltransferazele catalizează transferul restului acil de pe compuşi cu potenţial
chimic ridicat (R-CO~SCoA), pe acceptori potriviţi cu formare de esteri, amide,
anhidride:
R-CO~S-CoA + R1-OH R-CO-OR1 + CoA-SH
Subclase
Esterazele care pot fi:
–carboxilesteraze (cu substrat R-COOR’)
–tiolesteraze (cu substrat R-CO -SR’)
–fosfomonoesteraze (substrat R-O-PO3H2)
–fosfodiesteraze sau fosfataze (substrat R-O-PO2H-O-R1)
Glicozidaze
Peptidaze
98
CO2 + H2O H2CO3
H COOH COOH
C Fumaraza HC OH
+ H2O
C CH2
HOOC H
COOH
Acid fumaric Acid malic
COOH COOH
mutază
HC OH HC OPO3 H2
H2 C OPO3 H2 H2 C OH
99
4. VITAMINE
4.1.Caracteristici generale
4.1.3.Clasificare
După solubilitate vitaminele pot fi: solubile în apă sau liposolubile.
Vitaminele solubile în apă, includ: vitaminele B, acidul folic, niacina, acidul
pantotenic, biotina şi vitamina C. Vitaminele hidrosolubile şi adesea derivaţii lor servesc
drept cofactori pentru enzime. Vitaminele cofactor sunt adesea denumite coenzime.
Vitamine liposolubile includ: vitaminele A, D, E şi K sunt vitamine liposolubile
ce conţin un rest izoprenic:
CH2 C CH CH2
CH3
Dintre vitaminele liposolubile ţesuturile umane pot sintetiza vitamina D. În
ţesuturile umane se folosesc resturile de izopren pentru sinteza colesterolului şi a
ubiquinonei (coenzima Q).
4.2.Vitamine hidrosolubile
Tiamină Tiaminpirofosfat
tiaminkinaze
(ex. tiamin pirofosfokinaza)
complexul multienzimatic
Piruvat Acetil-CoA + CO2
al piruvat-dehidrogenazei
complexul multienzimatic
α-cetoglutarat Succinil-CoA + CO2
al α-ceto-glutarat dehidrogenazei
O
(H)
lumicrom
lumiflavină (H)
(OH)
riboflavină (H) adenozin 5`-monofosfat
(H) (AMP)
flavin mononucleotid (FMN)
FMN poate lega în continuare AMP dintr-o moleculă de ATP sub influenţa flavin
mononucleotid-pirofosfatazei şi a Mg2+ cu formarea de FAD.
Mg2+
FMN + ATP FAD + PPi
Prima reacţie are loc în mucoasa intestinului subţire, iar în ficat, rinichi şi alte
ţesuturi au loc ambele reacţii cu formare de FMN şi FAD.
Flavoproteinele funcţionează ca transportori de hidrogen.
Enzime
SH2 + FMN (FAD) Sox + FMNH2 (FADH2)
102
Exemple de reacţii catalizate de dehidrogenaze flavinice:
–dehidrogenarea oxidativă a aminoacizilor, cu formarea de cetoacizi:
FAD FADH2
FAD FADH2
4.2.3.Vitamina PP, acidul nicotinic sau niacina şi amida sa, nicotinamida sau
niacinamida (Fig.4.3).
Structura sa este reprezentată de acidul piridin-β-carboxilic sau nicotinic şi
amida sa, nicotinamida sau niacinamida (amida este considerată ca adevărata vitamină)
CONH2
+
CONH2 N
COOH O H2 C
O
O P O-
NH2
N N
O OH OH
Acidul nicotinic Amida acidului nicotinic N
N
(niacina) (niacinamida) O P O-
O H2 C N N
O
+
Nicotinamid-adenin dinucleotid (NAD )
(R = H formează NAD+ ;
R = -PO3H2 formează NADP+)
OH OR
Fig.4.3 Vitamina PP, NAD+ şi NADP+
4.2.4.Vitamina B6
Structura. Există trei vitamere: piridoxina, piridoxamina şi piridoxalul, cu rol de
vitamină B6. Ele conţin un nucleu piridinic substituit.
H2 C OH HC O H2C NH2
HO CH2 OH HO CH2 OH HO CH2 OH
H3 C N H3C N H3C N
Piridoxina Piridoxal Piridoxamina
H2 C NH2 H2 C NH2 O
CH2 OH ATP ADP
HO HO CH2 O P O-
O-
piridoxamin-kinaza
H3 C N H3C N
Piridoxamina Piridoxaminfosfatul
4.2.5.Acidul folic
Structura acizilor folici conţine trei compuşi condensaţi:
COOH
OH 9 10
N CH2 NH CO NH CH
N 5
CH2
H2 N N N CH2
106
–metilarea homocisteinei la metionină
CH3
H
H2 C SH N CH2 NH H2 C S CH3 N CH2 NH
5 homocistein- H2 C
H2 C + metiltransferaza +
HC NH2 metilcobalamina HC NH2
N N
COOH H COOH H
Homocisteină N5-metil FH4 Metionină FH4
N
N
OH OH
S-Adenozil metionină
HO CH2 CH2 NH3+ + 3 SAM HO CH2 CH2 N+(CH3 ) + 3 SAH
Etanolamină Colină
4.2.6.Vitamina B12
Structură. Vitamina B12 are un nucleu de bază, corina similar cu porfirinele, dar
cu o legătura –CH= mai puţin şi cu partea „periferică“ asemănătoare unui nucleotid cu
riboză (Fig.4.4).
Sistemul tetrapirolic central diferă de hem prin următoarele caracteristici:
–în centru se află ionul de Co2+:
107
–două nuclee pirolice sunt unite direct;
–este mult mai saturat;
–are un număr mai mare de substituenţi, mulţi dintre ei cu grupări amidice.
H3C
H 2 N CO CH2 CH2 C H3 C
CH2-CO-NH2
H 2 N CO CH2
(CH2)2-CO-NH2
A B
H3C N R N
H3C CH
Co+
CH3
H2N-OC-H2C N N
D C
CH3
HC CH2 NH
-
O O N
P HO CH3 rest de
O 5,6-dimetilbenzimidazol
O N CH3
H H H
O
HO CH2 H
4.2.7.Acidul pantotenic
Structura. Acidul pantotenic poate fi considerat un produs de condensare al
acidului 2,4-dihidroxi-3,3–dimetil butiric (acid pantoic) cu β- alanina.
CH3 OH
HO CH2 C CH C NH CH2 CH2 COOH
CH3 O
Acid pantoic β-alanină
Acid pantotenic
CH2 O CH3 O P O-
NH2
CH2 O
N
O P O- N
SH
ADP
O H2 C N N
O
O OH
PO3H2
Fig. 4.5. Structura coenzimei A (CoA-SH).
4.2.8.Biotina
Structura sa conţine un heterociclu imidazolic saturat condensat cu tiofenul, un
alt heterociclu saturat. În funcţie de catena laterală se deosebesc 2 biotine (α separată din
albuşul de ou şi β izolată din ficat).
O α-biotina O
β-biotina
HN NH HN NH
HC CH CH3
HC CH
H2C CH CH HC H2C CH
S CH3 S (CH2)4- COOH
COOH
Surse. Se găseşte în natură în stare liberă sau legată de proteine prin intermediul
lizinei. La om se sintetizează de către bacteriile intestinale.
Mecanismul biochimic de acţiune. Biotina este coenzimă în transportul şi
activarea CO2. Reacţiile de carboxilare necesită bioxid de carbon “activat“, legat de
biotină.
Carboxilarea acetil-CoA cu formare de malonil-CoA:
HCO3- + Biotin - Enz CO2- - Biotin - Enzimă
ATP ADP + Pi
-
Biotin - Enzima + CH3 - CO ~ SCoA OOC - CH2 - CO ~ SCoA + Biotin - Enzima
ca şi carboxilarea acidului piruvic cu formarea acidului oxaloacetic sunt dintre cele mai
importante (vezi metabolismul).
Deficienţa de biotină la om poate apare prin consumarea de albuş de ou crud care
conţine avidină, o proteină care se combină cu biotina şi îi împiedică absorbţia sau în
cazul hrănirii artificiale îndelungate. Semnele carenţei: tulburări digestive, instalarea unei
acido-cetoze metabolice cu acumularea de acizi organici în urină.
110
4.2.9.Vitamina C
Structura. Acidul ascorbic (vitamina C) sau 2-ceto-L-gulonolactona în forma
endiolică.
O O O
C C C OH
HO C O C + H2O O C
O -2H O
HO C O C O C
+2H
H C H C H C OH
HO C H HO C H HO C H
H2 C OH H2C OH H2 C OH
Acid ascorbic Acid dehidroascorbic Acid diceto L-gulonic
111
proteinelor specifice celulare de a lega vitamina A este depăşită se manifestă toxicitatea
acesteia.
Acidul retinoic este transportat de către albuminele serice.
H3 C
H3 C CH3 CH3 CH3
Reducere Oxidare
Funcţiile biologice
Acidul retinoic, intervine în controlul exprimării genelor (asemănător hormonilor
steroizi). Favorizează creşterea şi diferenţierea ţesuturilor. Intervine în sinteza
glicoproteinelor, funcţionând ca un transportor al oligozaharidului prin membrana lipidică
celulară.
Retinolul ca şi acidul retinoic acţionează prin receptori specifici intracelulari
influenţând sinteza unor proteine implicate în reglarea creşterii şi diferenţierii celulare.
În organism retinolul se transformă în retinil fosfat care serveşte la fel ca dolicol
fosfatul ca donor de resturi glicozil pentru sinteza glicoproteinelor şi a
mucopolizaharidelor. Retinil fosfatul este esenţial pentru sinteza unor glicoproteine cu rol
în reglarea creşterii celulare şi a secreţiei de mucus.
Retinalul este implicat în procesul vederii. El este un component al pigmentului
vizual numit rodopsină prezent în celulele cu bastonaşe din retină şi care este responsabil
de vederea la lumina slabă.
În ţesutul epitelial retinian all-trans-retinolul este izomerizat la cis-retinol
care este oxidat la 11-cis-retinaldehidă.
112
H3C CH3 CH3
H3 C CH3 CH3 CH3 11
H
C 12
O
CH3
CH3 All-trans-retinal 11
∆ -cis-retinal
C
H
O
11-cis-retinalul reacţionează cu un rest de lizină din proteina numită opsină
din celulele cu conuri şi bastonaşe formând rodopsina (Fig.4.7).
All-trans-retinal ∆11-cis-retinal
Opsina
impuls nervos
Rodopsina
hν
Fig.4.7. Rolul vitaminei A în procesul vederii (ciclul rodopsinei)
4.3.2.Vitaminele K
Vitaminele K se află în vegetale. Se sintetizează în intestin.
Structura. Sunt derivaţi substituiţi ai naftochinonei.
Vitaminele K diferă după natura lui R.
Menadiona (vitamina K3) (R=H). Nu este compus natural.
O
CH3
R
O
Vitamina K (structura generală)
113
Menachinona (vitamina K2):
CH3
R= CH2 CH C CH2 H n = 6, 7 sau 9
n
Filochinona (vitamina K1) este forma prezentă în plante:
CH3 CH3
R= CH2 CH C CH2 CH2 CH2 CH CH2 H
3
OH O
CH3 CH3
R R
OH O
4.3.3.Vitaminele E (tocoferoli)
Vitaminele E (tocoferolii) se află în cantităţi mari în alimente.
Structura. Există mai mulţi compuşi înrudiţi care diferă prin numărul şi poziţia
grupărilor metil fixate pe compusul de bază numită tocol.
Compusul cel mai activ biologic este α-tocoferolul (5, 7, 8 trimetil-tocol).
114
CH3
CH3
H3C O CH3 CH3 CH3
CH2 CH CH2 CH CH2 CH CH3
3 3 3
HO
CH3 α-tocoferol
Mecanismul de acţiune:
.
CH CH CH2 CH CH +X CH CH CH CH CH
.
acid gras polinesaturat radical al acidului gras
+ O2
CH CH CH CH CH CH CH CH CH CH
O OH O O
.
radical al acid gras
peroxid lipidic radical peroxil
acidului gras
Tocoferol-OH
(forma fenolică)
.
CH CH CH CH CH Tocoferol-O
O OH
peroxid lipidic
115
5. STRUCTURA ŞI PROPRIETĂŢILE
ACIZILOR NUCLEICI
5.1.Introducere
În structura acizilor nucleici se găsesc formele lactam, care sunt mai stabile.
Derivaţii aminaţi care nu conţin grupări -OH prezintă tautomerie imino-amino, cu
echilibrul deplasat în favoarea formei amino:
NH2 NH
N C NH C
forma amino forma imino
NH H2 N NH H2 N N NH
N NH N N
Amino Imino Lactim Lactam
Adenina (6-amino purina) Guanina (2-amino-6-hidroxi purina)
117
b.Pirimidine (derivaţi ai pirimidinei)
Există trei pirimidine în structura acizilor nucleici: citozina (2-hidroxi-4-amino-
pirimidina), timina (2,4-dihidroxi-5-metil-pirimidina) şi uracilul (2,4-dihidroxi-
pirimidina). (Fig.5.2). Citozina se găseşte în ADN şi ARN, timina numai în ADN şi
uracilul numai în ARN.
OH O OH O
N HN CH3 CH3
N HN
HO N O NH HO N O NH
Lactim Lactam Lactim Lactam
Uracil (2,4-dihidroxi-pirimidina) Timina (5-metil-uracil)
NH2 NH2
N N
HO N O NH
Lactim Lactam
Citozina (2-hidroxi-4-amino-pirimidina)
5.2.1.Nucleozide şi nucleotide
1.Nucleozidele rezultă prin stabilirea unei legături N-glicozidice între hidroxilul
glicozidic de la C1 al pentozei şi atomul de azot din poziţia 9 a unei baze purinice sau din
poziţia 1 a unei baze pirimidinice. Ribonucleozidele conţin ca pentoză β-D-ribofuranoza.
Cele patru ribonucleozide care intră în structura ARN sunt: adenozina (A), guanozina
(G), citidina (C) şi uridina (U) (Fig.5.3).
NH2 O
N N
N NH
9 9
5` N
HO H2 C N N N NH2
O HO H2 C
4` 1` O
3` 2`
OH OH Adenozină (A) Guanozină (G)
OH OH
NH2 O
N NH
1 1
5` O
N O
HO H2 C N
O HO H2 C
4` 1` O
3` 2` Citidină (C)
OH OH Uridină (U)
OH OH
Fig.5.3. Structura ribonucleozidelor.
Abreviaţiile A, G, C, U sunt folosite atât pentru nucleozide cât şi pentru bazele corespondente.
5.2.2.Structura nucleotidelor.
Nucleotidele sunt esteri fosforici ai nucleozidelor. Orice grupare hidroxil a
ribozei din molecula nucleozidelor poate fi fosforilată. În structura acizilor nucleici intră
nucleozidele fosforilate la C-5`. Restul fosfat fiind un acid tare conferă aciditate acizilor
nucleici. Se pot adăuga la monozaharid, până la trei grupări fosfat (α, β şi γ ), pentru a
forma nucleozid mono, di, tri-fosfaţi (fig. 5.5).
NH2
γ β α N
N Adenină Adenozină
O O O
5` sau
O- P O P O P O N N
O Dezoxiadenozină
O- O- O- 4` 1` (nucleozide)
X=H Dezoxiriboză
3` 2` X=OH Riboză
OH X
AMP (adenozinmonofosfat)
ADP (adenozindifosfat)
ATP (adenozintrifosfat)
Fig.5.5. Structura unor nucleotide de tip adenozin sau dezoxiadenozin mono-, di-, sau trifosfat
119
Nucleotidele care intră în structura ARN conţin riboză şi sunt denumite
ribonucleotide. Nucleotidele din structura ADN conţin 2`-dezoxiriboză şi se denumesc
adăugând prefixul dezoxi, la numele nucleotidului conţinând riboza (dezoxiadenozin-5`-
monofosfat sau 5`-dezoxiadenilat) (tabel 5.1.).
1` 1`
3` .
5,9 A PO 2`
. PO
7,0 A C-2` endo C-3` endo
"South" "North"
Prin convenţie, când baza ciclului şi C-5` sunt deasupra acestui plan se consideră
faţa endo. Se întâlneşte conformaţia C-2` endo când C-2` este deasupra planului şi C-3`
endo când C-3` este deasupra planului. Distanţa între grupările fosfat ataşate în poziţiile
5` şi 3` este mult mai mare pentru conformaţia C-2` endo decât pentru C-3` endo
(Fig.5.6).
O O
NH HN
1 1
N O O N
HO H2 C HO H2 C
O O
121
Cele două forme sunt în echilibru, ribonucleotidele adoptând, în general,
conformaţia C-3` endo, favorizată de prezenţa unui substituent electronegativ în poziţia
2`, iar 2`-dezoxinucleotidele care au un atom de hidrogen în locul grupării 2`-OH,
conformaţia C-2` endo.
Există două conformaţii posibile pentru nucleozide şi nucleotide, anti şi syn,
determinate de poziţia bazelor azotate faţă de monozaharid (Fig.5.7). Repulsia sterică
dintre bazele azotate, care au structură plană şi monozaharid, limitează rotirea acestora în
jurul legăturii N-glicozidice. In natură, se produc ambii conformeri, dar forma anti
predomină. Pirimidinele manifestă preferinţă pentru forma anti.
În guanozin 5`-fosfat conformaţia syn este stabilizată de interacţiile dintre
gruparea –NH2 de la C2 din nucleul purinic şi atomii de oxigen ai grupării fosfat.
Conformerii anti sunt prezenţi în ADN-forma B în timp ce conformerii syn sunt prezenţi
în ADN- forma Z.
122
Metilxantinele sunt derivaţi metilaţi ai xantinei, identificaţi la plante, care
prezintă proprietăţi farmacologice. Exemple de metilxantine sunt: cofeina (1,3,7-
trimetilxantina) din cafea, teofilina (1,3-dimetilxantina) din ceai şi teobromina (3,7-
dimetilxantina) din cacao.
O 7 O CH3
N H3 C N
HN 1 N
3
O NH NH N
O N
Xantina Cofeina
(2,6-dioxipurina) CH3
(1,3,7-trimetilxantina)
O
O CH3
H3 C N
N N
HN
O N NH
O N N
CH3 Teofilina Teobromina
(1,3-dimetilxantina) CH3 (3,7-dimetilxantina)
123
O NH2 O
CH3
N
HN 6
HN N 8N N
NH N
6N H2N N
O N O N
8-Azaguanina S NO2
HO H2 C HO H2C
O O
HO HO N 6 N
8
N 6 NH
OH N
OH OH 9 N
Arabinozil citozină NH Azatioprin
6-Azauridină N
Alopurinol
5.3.2.Polaritatea catenei
In fiecare catenă polinucleotidică, legăturile dintre nucleotide au aceeaşi orientare
de-a lungul lanţului, catenele având o polaritate specifică.
Fiecare catenă polinucleotidică va avea două capete: capătul 5`, la care gruparea
–OH de la C5’ are ataşat un rest fosfat şi capătul 3`, la care gruparea –OH de la C3’ nu
este angajată într-o legătură internucleotidică.
Prin convenţie, structura unei catene poli-nucleotidice este scrisă întotdeauna în
direcţia 5` la 3`. Structura fragmentului polinucleotidic din fig. 5.8. poate fi scrisă GCA şi
semnifică faptul că gruparea 5`-OH a guanozinei este legată cu un rest fosfat în timp ce
adenozina are gruparea 3`-OH liberă.
Două lanţuri polinucleotidice sunt antiparalele atunci când unul evoluează în
direcţia 5` 3`, iar celălalt în direcţia 3` 5` (Fig.5.9).
Diversitatea polinucleotidelor este dată de bazele azotate legate de scheletul
format din molecule de monozaharid legate între ele fosfat diesteric.
124
Ordinea bazelor determină capacitatea codificatoare a acizilor nucleici.
O
N
NH
O G
- 5` N NH2
O P O N
O
-
O
3`
NH2
X
N
O C
N O
O P O CH2
O
-
O
3`
NH2
X
N
NH
O A
O P O CH2 N N
O
-
O
3`
3` OH X
Fig.5.8 Fragment din structura unui polinucleotid şi reprezentarea sa schematică (pGCA)
(Dacă X = - OH; monozaharidul = riboza; acidul nucleic= ARN. Dacă X= -H; monozaharidul =
dezoxiriboza; acidul nucleic = ADN).
5` O 3`
CH2 O
5` B1 B1 5`
3` 3`
P P
5` B2 B2 5`
3` 3`
P P
5` B3 B3 5`
3` 3` 3` 5`
O CH2
125
5.4. Conformaţia moleculei de ADN; tipuri de conformaţii
O H
N O H N
H2 C
O
N G N H N C H
O N
H N O
N
H O
Dezoxiguanozină H O
Dezoxicitidină CH2
O
H
O
N N H
H2 C O
O
N A N H N
T
O H
N N
H O
O
O
Dezoxiadenozină
H2 C
Dezoxitimidină
O
126
în adenină este egal cu cel de timină şi conţinutul în guanină este egal cu cel de
citozină.
Interacţiile hidrofobe, van der Waals, dipol-dipol indus care implică orbitalii
π ai bazelor azotate produc stivuirea bazelor dintr-o catenă polinucleotidică şi determină
conformaţia helicoidală a acesteia. Intre grupările polare ale perechilor de baze din două
catene complementare, antiparalele se formează legături de hidrogen care asigură
stabilitatea termodinamică a helixului.
5.5.1.Denaturarea
Ruperea legăturilor de hidrogen şi a interacţiunilor van der Waals dintre catenele
moleculei ADN aflate în soluţie se poate realiza prin creşterea temperaturii, la valori
extreme de pH (molecula de ADN este stabilă la pH-uri cuprinse între 4 şi 10) sau la
modificarea tăriei ionice (Fig.5.11).
Când toate legăturile s-au rupt, catenele sunt separate iar procesul este numit
denaturare. Dacă separarea catenelor este determinată de modificări de temperatură
procesul se numeşte topire.
Prin denaturare, se modifică unele proprietăţi fizice ale ADN: scade vîscozitatea
şi creşte absorbanţa la 260 nm.
127
Renaturare ADN Denaturare ADN
1.5
Hipercromicitate (λ=260)
100
Denaturare (%)
1.4
G:C A:T 75
1.3
A:T G:C
1.2 50
1.1 25
1.0 0
Tm
0 70 80 90 100
Fig. 5.12 Curba de topire ADN. Tm creşte cu creşterea procentului de perechi de baze
G:C şi scade cu creşterea procentului de A:T. Denaturarea ADN şi absorbanţa la 260 nm cresc cu
temperatura.
128
Concentraţia cationilor monovalenţi influenţează temperatura de topire. O
creştere de zece ori a concentraţiei cationilor determină o creştere a Tm cu 16,60C.
Formamida destabilizează legăturile de hidrogen dintre baze, micşorând astfel Tm.
Catenele din duplexul ADN sau din hibridul ADN-ARN pot fi astfel separate la
temperaturi mai mici, evitându-se ruperea legăturilor fosfat diesterice care s-ar putea
produce la creşterea temperaturii pentru denaturare, în lipsa formamidei.
5.6.1.Endonuclezele de restricţie
Endonuclezele de restricţie sau restrictazele recunosc secvenţe specifice de
nucleotide de pe ADN dublu catenar (secvenţe de recunoaştere), formate de obicei din 4,
5 sau 6 nucleotide şi taie ambele catene ale ADN într-un loc specific al secvenţei
recunoscute.
a.Nomenclatura. Enzimele de restricţie au fost evidenţiate la bacterii, unde au un
rol important în protejarea celulelor bacteriene de infecţiile virale. Bacteriile îşi cruţă
propriul ADN prin metilarea unora dintre resturile de adenină şi citozină cuprinse în
secvenţele recunoscute de către enzimele de restricţie. Restrictazele taie într-un anumit
loc din secvenţa specifică orice ADN, cu excepţia celui care este metilat la nucleotidele
adeninei sau citozinei, din acea secvenţă, adică a propriului ADN. Cel mai adesea
acţiunea endonucleazică şi cea metilazică aparţine aceleiaşi proteine.
Au fost izolate peste 100 enzime de restricţie care au fost denumite în acord cu
specia bacteriană de la care au fost izolate (Tabelul 5.2). Deoarece fiecare bacterie
conţine mai multe enzime de restricţie, se utilizează o cifră romană pentru a identifica
fiecare enzimă. De exemplu, EcoRI a fost prima restrictază izolată de la
Escherichia Coli .
130
b.Modalităţi de acţiune ale restrictazelor. Situsurile de recunoaştere pentru cele
mai multe enzime de restricţie sunt palindroame care prezintă dublă simetrie rotaţională.
Un palindrom este definit ca o porţiune de ADN în care secvenţa nucleotidică, citită
pe ambele catene în direcţia 5` 3` este identică.
Unele endonucleze de restricţie taie ADN bicatenar, formând capete boante
(blunt ends), drepte, necoezive. Altele taie moleculele de ADN bicatenar pe o latură a
centrului de simetrie, producând segmente purtătoare de extremităţi monocatenare
coezive, care fiind complementare se pot asocia. Sunt trei modalităţi de a tăia catena de
ADN după cum se vede în (Fig. 5.14).
Capetele fragmentelor de ADN rezultate pot fi legate între ele de către ADN
ligază formând ADN recombinat (Fig.5.15).
5`---A 5`
AGCTT---3` 5`---TGG CCA---3` 5`---GAGCT3` C---3`
3`---TTCGA 5` A ---5` 3`---ACC GGT---5` 3`---C 3`TCGAG ---5`
Fig. 5.14. Cele trei posibilităţi de clivare a ADN de către restrictaze (cu capătul 5` mai lung, cu
capete boante şi cu capătul 3` mai lung).
ADN1 ADN2
5`---GAATTC---3` 5` GAATTC 3`
3`---CTTAAG---5`
3` CTTAAG 5`
EcoRI EcoRI
5`---GAATTC 3` 5` GAATTC---3`
3`---CTTAAG 5` 3` CTTAAG---5`
5.6.2.Hărţile de restricţie.
Orice ADN dublu catenar prezintă diferite secvenţe nucleotidice care vor fi
recunoscute şi clivate de enzime de restricţie specifice. Prin separarea fragmentelor de
restricţie şi măsurarea dimensiunii acestora este posibil să se deducă locurile unde
enzimele de restricţie taie molecula de ADN (locurile de restricţie), adică să se deseneze
harta de restricţie. Este uşor să se compare două molecule de ADN (de ex. examinarea
relaţiei între două specii de-a lungul evoluţiei) prin analizarea hărţilor de restricţie fără să
fie necesară determinarea secvenţei nucleotidice a fiecărei moleculă de ADN.
Conţinutul în ADN al celulelor de la diverse specii este diferit. Cu cât celula este
mai evoluată, are nevoie de mai multă informaţie genetică şi conţinutul în ADN este mai
mare. ADN-ul există în celule sub formă liniară sau circulară (formată prin legarea
covalentă a capetelor 5`,3`). Moleculele de ADN, cu lungimi şi greutăţi moleculare
diferite, dintr-o celulă, alcătuiesc cromozomii celulei.
Fragmentele cromozomiale care conţin informaţia genetică cu privire la sinteza
unui singur lanţ polipeptidic sau a unei singure molecule de ARN (ribozomal sau de
transfer) au fost denumite gene. Având în vedere faptul că unele proteine sunt oligomere
relaţia dintre materialul genetic (ADN) şi expresia sa finală (proteinele) este corect
exprimată prin conceptul, o genă – un lanţ polipeptidic.
Fiecare cromozom conţine un set unic de gene. Totalitatea genelor cuprinse în
cromozomii unei celule, constituie genomul acesteia.
La procariote, o moleculă de ADN circular cu 4 x 106 perechi de baze,
alcătuieşte un cromozom, care cuprinde setul complet de gene pentru specificarea
caracterelor celulei. ADN din celulele de Escherichia coli cuprinde aproximativ 4,6 x
106 perechi de baze, lungimea conturului ADN cromozomial fiind de ~1,6 mm. Diametrul
celulei de E. coli este ~2µm.
La om, fiecare cromozom conţine o singură moleculă de ADN. Cel mai scurt
cromozom uman conţine o singură moleculă de ADN cu 34 x 106 perechi de baze iar cel
mai lung cuprinde o singură moleculă de ADN cu 263 x 106 perechi de baze. Lungimea
totală a moleculelor desfăşurate de ADN dintr-o singură celulă umană este de
aproximativ 2 m. Molecula de ADN va trebui să adopte în celulă o formă cât mai
compactă , care s-o facă compatibilă cu spaţiul oferit de către celulă.
În celulele procariote, care nu au structuri subcelulare (nuclee, mitocondrii,
lizozomi, reticul endoplasmatic), ADN este distribuit într-o masă cromozomială. Pe
lângă ADN reprezentând materialul cromozomial, ce cuprinde setul complet de gene
pentru specificarea tuturor caracterelor celulei, în citoplasma celulelor bacteriene se află
cantităţi mici de ADN circular, extracromozomial. Aceste molecule, numite plasmide
conţin o cantitate redusă de informaţie genetică.
Plasmidele sunt molecule mici care trec uşor prin membrana celulei gazdă. Pe
lângă alte gene, ele conţin şi gene care specifică proteine, ce conferă bacteriei rezistentă
la antibiotice. Plasmidele pot migra de la o celulă cu rezistentă la un antibiotic la altă
132
celulă, cu sensibilitate la antibioticul respectiv, făcând-o şi pe aceasta rezistentă.
Rezistenţa la antibiotice, transferabilă nu numai în cadrul aceleiaşi specii bacteriene ci şi
de la o specie la alta, pune probleme serioase antibioterapiei.
Plasmidele sunt instrumente ideale de manipulare a genelor. Manifestând adesea
autonomie faţă de ADN cromozomial, plasmidele se autoreplică extrem de rapid.
Posibilitatea încorporării unui fragment de ADN străin într-un plasmid, prin tehnicile
ingineriei genetice, şi reintroducerea plasmidului modificat într-un organism gazdă
permite obţinerea unor mari cantităţi din gena străină sau din proteina specificată de
aceasta.
În celulele eucariote, nucleul este delimitat de citoplasmă printr-o membrană.
Cea mai mare cantitate de ADN se află în nucleu.
In perioadele de repaus ale celulei, deci în afara perioadelor de diviziune,
materialul genetic se găseşte sub formă de cromatină (cromozomii interfazici), un
material amorf, dispersat în nucleu, care conţine ADN, proteine bazice denumite histone,
proteine nehistonice denumite hertone şi cantităţi mici de ARN.
In timpul mitozei şi puţin înainte de aceasta, cromatina se condensează şi se
subdivide în cromozomi care sunt complexe ADN - proteine. Fiecare cromozom conţine
o singură moleculă de ADN linear lungimea sa variind de la un cromozom la altul.
Numărul cromozomilor depinde de specie; de exemplu, celulele somatice de la specia
umană conţin 46 de cromozomi, grupaţi în 23 de perechi.
În mitocondriile celulelor eucariote, se află molecule de ADN circular, cu masă
mică, care diferă de cel nuclear prin structură şi anumite proprietăţi. Acesta reprezintă
aproximativ 1 % din ADN celular, total.
Prezenţa ADN mitocondrial, conferă celulei o oarecare autonomie genetică, o
parte din proteinele mitocondriale sintetizându-se pe tipar de ADN propriu. Printre
acestea se află 13 subunităţi proteice ale lanţului respirator (din totalul de 67): şapte
subunităţi ale NADH dehidrogenazei (complex I), citocromul b din complexul III, trei
subunităţi ale citocrom oxidazei (complex IV), două subunităţi ale ATP sintazei.
Majoritatea proteinelor mitocondriale sunt specificate însă de gene nucleare.
133
a.Secvenţe de ADN unice, nerepetitive. Aproximativ 60% din ADN-ul din
fiecare celulă de la specia umană se află o singură dată în genom. Acesta este ADN care
codifică proteine.
b.Secvenţe de ADN cu grad mediu de repetare. Secvenţele de ADN care
codifică ARNr, ARNt, histone reprezintă 20% din ADN-ul eucariot şi se află în zeci până
la sute de copii per celulă.
c.Secvenţe de ADN cu grad foarte mare de repetare. Aproximativ 10% din
ADN-ul eucariot se află în mii de copii per celulă. Aceste secvenţe formate din 5-500
perechi de baze se repetă de multe ori în tandem. Ele sunt distribuite în centromerele şi
telomerele cromozomilor şi sunt prezente în 1-10 milioane de copii per genomul
haploid. Aceste secvenţe sunt inactive transcripţional având un rol structural în
cromozomi.
Deoarece aceste secvenţe de ADN au un conţinut diferit în G+C faţă de restul de
ADN din celulă, într-un gradient de clorură de cesiu formează o bandă cu poziţie diferită
faţă de restul ADN. Din acest motiv a fost denumit ADN satelit. Capetele cromozomilor
numite telomere conţin, de asemenea, secvenţe scurte de ADN care se repetă în tandem
de sute de ori. La om, secvenţa din telomeră care se repetă este AGGGTT. Acest ADN,
formează deasemenea, o bandă satelit în gradient de clorură de cesiu. ADN din
centromere şi telomere are probabil rol structural, dar rolul restului de ADN care se repetă
în copii multiple este încă necunoscut.
5.9.1.Structura superhelicoidală
In moleculele de ADN circular (ADN cromozomial de la E.coli, ADN
mitochondrial, plasmide) şi ADN liniar de dimensiuni mari ale cărui capete nu sunt libere
numărul de răsuciri ale unei catene în jurul celeilalte este fix. Numărul de răsuciri nu
poate fi modificat decât prin incizia unei legături fosfat diesterice de pe una dintre
catenele ADN, permiţând astfel celor două capete ale ADN să se rotească unul faţă de
celălalt.
O propritate universală a ADN dublu catenar este suprarăsucirea moleculei
în jurul propriei axe. Formele superhelicoidale sunt în raport cu forma helicoidală,
topoizomeri. Enzime specifice, denumite topoizomeraze, catalizează aceste modificări
topologice, interconvertind izomerii topologici.
Flexibilitatea structurală a ADN îi permite să adopte o structură cât mai compactă
pentru a fi compatibil cu spaţiul oferit de celulă. ADN-ul circular se răsuceşte în jurul
propriei axe iar cel nuclear se răsuceşte mai întâi în jurul proteinelor iar structurile
formate se răsucesc în jurul axei proprii apărând formele superhelicoidale
(suprarăsuciri). Ele pot fi suprarăsuciri negative şi positive (Fig.5.16).
a.Suprarăsucirile spre stânga, determinate de creşterea numărului de perechi de
baze per tur elice sunt considerate suprarăsuciri negative (negative supercoiling). Ele
se formează, când molecula de ADN se răsuceşte în direcţie opusă dublei helice cu
orientare dreaptă prezentă în ADN forma B. Structura superhelicoidală negativă este
proprie celulelor vii, ea relaxând dubla helice. Suprarăsucirile spre stânga pregătesc
ADN pentru procese care presupun separarea catenelor: replicare, transcriere,
recombinare.
134
Suprarăsuciri Suprarăsuciri
spre stânga spre dreapta
(superhelix (superhelix
negativ) pozitiv)
5.9.2.Topoizomerazele
Gradul de suprarăsucire al ADN bacterian este determinat de acţiunea opusă a
două enzime numite topoizomeraze care afectează topologia ADN. Aceste enzime sunt
foarte importante pentru procesul de replicare.
Sunt două tipuri de topoizomeraze:
a.Topoizomeraza I, acţionează ca o endonuclează reversibilă, este formată
dintr-un singur lanţ polipeptidic şi nu necesită ATP. Ea incizează o legătură fosfat
diesterică numai de pe una dintre catenele ADN, permiţând trecerea celeilalte catene prin
spaţiul creiat; numărul de răsuciri ale unei catene în jurul celeilelte creşte cu 1 relaxând
starea superhelicoidală a ADN. Energia legăturii fosfat diesterice incizate a fost
conservată într-o legătură fosfat esterică, implicând tirozina din centrul activ al enzimei,
printr-o reacţie reversibilă care nu necesită aport energetic (Fig.5.17).
Tyr
Tyr Tyr
5` O
5` O
OH P Enzima P
P P OH
OH 3`
Incizie si legare 3` Rotirea Disocierea
la enzimă capătului 3` enzimei
135
b.Topoizomeraza II, conţine cel puţin două subunităţi polipeptidice, necesită
ATP şi produce incizii reversibile în ambele catene ADN (Fig.5.18).
Mecanismul de acţiune al topoizomerazei II este ilustrat (Fig.5.18) prin utilizarea
unei molecule ADN relaxată care a fost transformată în etapa 1 la o moleculă cu o
suprarăsucire + şi una -. Topoizomeraza II (şi giraza) taie ambele catene ADN şi trece un
segnemt ADN prin tăietura formată, transformând suprarăsucirea + în suprarăsucire -.
ADN giraza, o topoizomerază II prezentă numai la procariote, are abilitatea
de a produce sau desfiinţa suprarăsuciri negative. ADN giraza este formată din două
subunităţi (fiecare subunitate fiind compusă din câte două lanţuri peptidice de 105 kd şi
respectiv 95 kd): una introduce superhelixuri negative cu consum de ATP (având şi
activitate ATP-azică) iar cealaltă are abilitatea de a le desfiinţa fără consum de ATP.
ADN giraza (topoizomeraza II) introduce în molecula ADN supertorsiuni
negative,, astfel încât supertorsiunile pozitive generate de avansarea bifurcaţiei de
replicare sunt în mare măsură contracarate. Cantităţile de topoizomerază I şi II sunt
reglate pentru a menţine în celulele vii un grad potrivit de superhelicitate negativă.
Anumite antibiotice ca: acid nalidixic (negram) şi derivaţii săi fluoruraţi (norfloxacin,
ciprofloxacin), superiori prin toxicitatea redusă şi prin faptul că nu dezvoltă rezistenţă
plasmidică transferabilă, suprimă creşterea şi dezvoltarea bacteriană prin inhibarea
ADN-girazei.
Fig.5.18 Mecanismul de acţiune al topoizomerazei II. Enzima incizează ambele catene şi trece un
segment ADN prin spaţiul creiat schimbând suprarăsucirea (+) în suprarăsucire (-).
5.10.Cromozomii eucariotelor
136
5.10.2 Histonele reprezintă o clasă de proteine bazice, cu masa moleculară mică,
care interacţionează ionic cu anionii fosfat din catenele ADN, cu formare de
nucleozomi.
Există 5 tipuri de histone:
Histone bogate în lizină: H2A şi H2B şi histone bogate în arginină: H3 şi H4 care
intră în structura miezului nucleozomului,
Histone de legătură: H1 ce leagă nucleozomii între ei, cu rol în protejarea ADN de
acţiunea nuleazelor.
Histonele şi-au conservat bine structura, fapt ce demonstrează că ele şi-au
păstrat rolul stabilit iniţial de-a lungul evoluţiei eucariotelor. Secvenţa aminoacizilor în
H3 şi H4 este aproape aceeaşi la plante şi animale.
Miezul nucleozomului
ADN de (H2A, H2B, H3, H4)2
legătură
ADN
Histona H1
137
Solenoizii se asociază între ei determinând o condensare suplimentară a ADN
(fig. 5.20).
Proteine nehistonice sunt componente ale cromatinei. În afara histonelor,
enzimelor şi a factorilor necesari replicării şi transcrierii, cromatina mai conţine şi alte
proteine, unele cu rol în destinderea stării condensate a cromatinei, pentru a permite
replicarea şi transcrierea, altele cu rol în viabilitatea celulei, ele prezentând o mobilitate
electroforetică mare.
138
6. BIOSINTEZA ADN (REPLICAREA)
ORI
ADN initial
1 Bifurcatii de
2
replicare
1 2
Puncte de initiere
replicare
Originea replicării
ADN după replicare
O OH
O OH
-
O P O
-
O P O
O
A O
CH2 U
O U A
CH2
O
3` PPa
..OH OH
-
O OH
O O O
-
O P O
-
O P O P O P O
O
- -
O O O
CH2 T A
CH2 T A O
O
OH H
OH H 5` 5`
Fig.6.3 Elongarea ARN primerului prin adăugarea dezoxinucleozid trifosfaţilor de către ADN
polimerază ca urmare a activităţii polimerazice.
3` 3`
5` 5`
Centrul cu activitate
a) exonucleazică
b)
Fig.6.5 Ilustrarea activităţilor polimerazice (a) şi exonucleazice (b) ale ADN polimerazei I.
T ......
A C A
Locul de hidroliză al Locul de hidroliză al
exonucleazei 3` 5` T ...... A T ...... A
exonucleazei 5` 3`
T ...... A
C A
3` HO T ...... A
A
A T ...... A
5` 3` 5`
a) b)
Fig.6.6. Ilustrarea activităţii exonucleazice a) 3` → 5` şi b) 5` → 3` a ADN polimerazei I.
ADN polimeraza III are o procesivitate mare adică leagă strâns şi eliberează
catena matriţă numai după replicarea completă a acesteia; are o eficienţă catalitică foarte
mare în calitate de polimerază (polimerizează 1000 nucleotide pe secundă); prin
activitatea exonucleazică 3’ → 5’ are rol de corector (proofreading).
ADN polimeraza III asigură fidelitatea procesului de replicare pe două căi:
–respectarea principiului complementarităţii bazelor şi
–activitatea de corector (proofreading).
Selecţia iniţială a dezoxinucleotidelor proprii pentru crearea unei catene noi, se
face pe principiul complementarităţii bazelor cu catena matriţă. La catena în creştere se
adaugă numai dezoxinucleotidul care se leagă în centrul activ al enzimei şi este
complementar cu nucleotidul de pe catena matriţă. Se asigură astfel acurateţea sintezei cu
o frecvenţă a erorilor de 10-4 perechi de baze.
ADN polimeraza III stabileşte o legătură fosfat diesterică între capătul 3`-OH al
catenei în creştere şi nucleotidul următor, numai dacă la capătul 3`-OH se găseşte un
nucleotid corect împerecheat cu catena matriţă. Enzima are calitatea de a descoperi o
eventuală eroare de împerechere matriţă – dezoxiribonucleotid impropriu (încorporat la
capătul 3`-OH al catenei în creştere) şi de a selecta pe cel adecvat. O asemenea situaţie
poate să decurgă din apariţia tranzitorie a unor forme tautomere rare ale bazelor azotate
(frecvenţa este de 10-4-10-5). Astfel, citozina în forma imino, instabilă, se împerechează cu
adenina nu cu guanina. Dacă ADN polimeraza III nu ar avea activitate de corector ,
perechea adenină-citozină s-ar menţine în ADN nou sintetizat, generând o mutaţie.
ADN polimeraza III prin activitatea sa exonucleazică îndepărtează nucleotidul
împerecheat greşit de la capătul 3` al lanţului în creştere. În eventualitatea unor erori
repetate, ea îşi continuă activitatea exonucleazică până când găseşte capătul 3`-OH
adecvat (împerecheat cu matriţa), proces consummator de energie.
Abilitatea ADN polimerazei III de a face deosebirea între nucleotidul corect
împerecheat şi cel impropriu este compromisă când catena în creştere este foarte scurtă,
deoarece catena nouă este slab legată de matriţă. Aceasta ar putea fi o explicaţie pentru
incapacitatea ADN polimerazei III de a iniţia catene.
Ca rezultat al funcţiei de corrector a ADN polimerazei şi a imperativului
complementarităţii bazelor, frecvenţa erorilor în procesul de replicare a ADN este de una
144
la 106-107 perechi de nucleotide. Datorită existenţei unui sistem enzimatic post-replicativ
frecvenţa erorilor în ADN la E. Coli este de numai una la 109 perechi de nucleotide.
Deşi acurateţea procesului de replicare este foarte mare polimerazele pot
încorpora nucleotide analoage. Analogi ai nucleotidelor sunt utilizaţi în chimioterapie.
3`
OH OH
Ligază
P-R-A
3` 5` Ligază-AMP 3` 5` AMP 3` 5`
Fig. 6.7. – Reacţia catalizată de ADN ligază
Având în vedere faptul că ADN polimerazele, din orice sursă, catalizează numai
sinteza unui lanţ polinucleotidic cu direcţia 5` → 3, iar cele două catene din molecula
ADN sunt antiparalele, ar rezulta că numai catena cu direcţia 3 ` 5` dintr-o bifurcaţie
de replicare poate fi copiată.
Cum are loc sinteza catenei având ca matriţă catena cu direcţia 5` 3` ?
Răspunsul la această întrebare l-a dat Okazaki, care pe baza cercetărilor, in vitro,
a propus un model, conform căruia replicarea este semidiscontinuă (Fig.6.8).
Sensul de deplasare al bifurcatiei 3`
5`
ARN primer
5` Catena leading
3`
Catena lagging
Fragmente Okazaki 3`
5`
ARN primer
Conform modelului o catenă fiică, desemnată catena în avans sau catena leading
este sintetizată continuu, în direcţia 5` 3`, de către ADN polimeraza III, iar cealaltă
catenă fiică desemnată catena în întîrziere sau catena lagging este sintetizată discontinuu
de către ADN polimeraza III. Enzima catalizează sinteza unor fragmente de 150-200
nucleotide, numite fragmente Okazaki, în direcţia 5` 3`. Sinteza fiecărui fragment
Okazaki necesită ARN primer.
146
ADN parental
suprarăsucit
Ori C 1 2
.......... 3
dna C
dna B
Proteine stabilizatoare
de ADN monocatenar
...
.... 4
148
5` ADN ligaza
3` ADN polimeraza I
Catena "lagging"
Primaza
Helicaza Primozom
3`
5`
ADN polimeraza III
ADN giraza
Catena "leading"
5`
3`
Fig. 6.10. Modul de acţiune al replizomului în replicare. Formarea buclei de către matriţa catenei
lagging permite sinteza acesteia în aceiaşi direcţie cu catena leading.
ADN polimeraza III fiind un dimer asimetric fiecare dintre catenele ADN devine
substrat pentru cele două subunităţi diferite ale enzimei.
6.6.Replicarea la eucariote
G2
Mitoza
Faza S
G1
G0
150
6.6.3.Replicarea la eucariote începe în multe origini, este semiconservativă şi
se produce bidirecţional din fiecare origine.
ADN
Puncte start
Repliconi
Puncte stop
segment ADN
complet replicat ( ADN parental ADN nou sintetizat)
152
Cele două telomere complementare, datorită legăturilor de hidrogen dintre bazele
azotate, formează un quadruplex telomeric, structură care reglează activitatea
telomerazei (Fig.6.15).
T
T T
G G
T
G G
G G
G G
G G
G G
G G
G G T
T T
T
Fig. 6.15. Secvenţele bogate în guanină pot forma o structură tetrameră (quadruplex).
6.6.5.Reconstituirea cromatinei
Organizarea ADN nuclear şi structura cromatinei sunt implicate în reglarea şi
iniţierea sintezei ADN. După replicare, structura cromatinei trebuie reformată.
Ritmul sintezei histonelor, proteine bazice care se asociază cu ADN pentru a
forma nucleozomii, este cel al sintezei ADN. In faza S cantitatea de ADN şi histone se
dublează.
În timpul replicării, histonele existente se asociază cu duplexul care conţine
catena fiică „leading“ iar cele nou sintetizate se asociază cu duplexul care conţine catena
fiică „lagging“.
153
6.7.Sinteza de ADN pe matriţă de ARN (reverstranscrierea)
154
7. MUTAŢII. REPARAREA ADN
7.1.Tipuri de mutaţii.
7.1.1.Substituţia unei baze cu altă bază. Este cel mai comun tip de mutaţie care
se poate divide în:
Tranziţia, în care o purina este înlocuită cu altă purină sau o pirimidină este
înlocuită cu altă pirimidină. Această mutaţie poate fi determinată de:
Prezenţa unei baze azotate în momentul împerecherii, într-o formă tautomeră
neuzuală.
Formele tautomere imino, rare, ale adeninei pot forma pereche cu citozina,
rezultând o moleculă ADN în care perechea de baze AT este înlocuită cu GC.
Transversia, în care o purina este înlocuită cu o pirimidină sau invers.
7.1.2.Deleţia unei baze sau mai multor baze, determină citirea incorectă a întregii
secvenţe ce succede deleţia. Se produc deleţii la variaţii de pH sau temperatură.
7.2.2.Mutagene chimice.
Multe substanţe chimice afectează structura bazelor din ADN.
a.Agenţii nealchilanţi:
–formaldehida (HCHO): reacţionează cu grupările amino;
155
–hidroxilamina (NH2-OH) reacţionează specific cu citozina;
–acidul azotos (HNO2), dezamineaza oxidativă: citozina, adenina, guanina,
modificând împerecherea bazelor deoarece o amină se transformă în cetonă.
b.Agenţii alchilanţi.
–etilmetan sulfonatul, adaugă o grupare metil la azotul din nucleul purinic
labilizând legătura N-glicozidică prin a cărei hidroliză apare un loc depurinat;
–N-metil-N`-nitro-N-nitrozoguanidină este un agent de alchilare care duce la
mutaţii prin tranziţie şi transversie.
Br N
HN 5 N
O N H2N 2 N NH
H
5-bromo uracil 2-amino purina
7.2.4.Radiaţiile
a.Radiaţiile ultraviolete (200-400 nm) induc formarea dimerilor de timină TT
(fig.7.1). ADN polimeraza nu poate replica ADN deoarece dimerii de timină
distorsionează helixul.
UV
156
7.3.Repararea ADN
Molecula de ADN, fiind dublu catenară poate fi reparată în cazul apariţiei unor
leziuni. Dacă o catenă este lezată cealaltă catenă va păstra informaţia genetică şi va servi
la repararea catenei lezate. Sistemele majore de reparare a ADN sunt repararea prin
excizie, repararea directă, şi repararea prin recombinare.
7.3.1.Repararea prin excizie.
Sistemele de reparare au capacitatea de a recunoaşte şi a exciza leziunea ADN
dar şi de a înlocui ADN excizat cu ADN nou sintetizat.
a.Repararea ADN la procariote prin excizia dimerilor de timină.
Proteine specifice desfac, ATP dependent, duplexul ADN şi prin activitatea
endonucleazică, clivează o legătură fosfat diesterică, aşezată la şapte baze distanţă de
dimerul de timină, de obicei, spre capătul 5` al catenei ADN (fig.7.2)
ADN polimerază I, elimină porţiunea de ADN formată din 12 nucleotide ce
conţine dimerul de timină, prin activitatea exonucleazică 5` → 3`. ADN polimerază I
umple golurile din catena lezată. ADN ligază reface legătura fosfat diesterică între
segmentul nou sintetizat şi catena principală.
b.Repararea ADN în cazul dezaminarii uneia dintre bazele azotate (prin
dezaminarea citozinei, adeninei, guaninei rezultă uracil, hipoxantina şi xantina) se face
analog reparării prin excizie.
c.Prezenta timinei şi nu a uracilului în ADN permite repararea ADN ce conţine
citozina dezaminată (uracil). Folosirea timinei (uracilul căruia i s-a introdus o grupare
metil) în structura ADN şi nu a uracilului măreşte fidelitatea mesajului genetic.
5` 3`
3` 5`
Excizia unui fragment
de 12 nucleotide
8.1.Introducere
8.2.1.Structura primară. ARN este iniţial sintetizat prin transcriere, sub forma
unui polimer monocatenar. Ribonucleotidele se condensează formând legături fosfat
diesterice între gruparea –OH din poziţia 3` a unui nucleotid şi gruparea –OH din poziţia
5` a nucleotidului succesiv, asemănător cu condensarea dezoxiribonucleotidelor din
structura ADN (cap. 6, Fig. 6.3).
8.2.2.Structura secundară.
Spre deosebire de ADN care este bicatenar, ARN este monocatenar. Pe anumite
porţiuni, acolo unde permite complementaritatea bazelor, moleculele ARN monocatenare
se organizează în structuri dublu helicoidale. Porţiunile de baze necomplementare sunt
expulzate ca bucle în afara zonelor dublu helicoidale, dând moleculei aspectul de ac de
păr (Fig.8.1).
Buclă cu baze
neâmperechiate
Segment cu baze
complementare
8.3.1.ARNr
a.Caracteristicile structurale ale ARNr.
Deoarece în structura ARNr se află zone dublu catenare, întrerupte de zone
monocatenare, moleculele acestora sunt flexibile şi deformabile. ARNr este extrem de
heterogen ca formă şi mărime. In funcţie de coeficientul de sedimentare (S), care depinde
de forma şi mărimea moleculei, la procariote, se întâlnesc trei tipuri de ARNr (23S,
16S şi 5S) iar la eucariote patru tipuri de ARNr (28S, 18S, 5,8S şi 5S).
ARNr este tipul de ARN cel mai stabil metabolic şi reprezintă aproximativ 80%
din totalul de ARN celular.
Una dintre modificările care vizează nucleotidele din structura ARNr este
metilarea ribozei în poziţia 2` cu formarea 2`-O-metilriboză. Metilarea ARNr este legată
direct de dezvoltarea rezistenţei bacteriilor la antibiotice.
ARNr intră în constituţia ribozomilor având rol de componentă catalitică a
acestora ARNr 23S reprezintă centrul activ pentru formarea legăturii peptidice.
b.Ribozomii (Fig.8.2).
Ribozomii constituie sediul biosintezei proteinelor. In interiorul celulelor, ARNr este
prezent în formă liberă sau sub forma complexelor ribonucleoproteice numite ribozomi.
Ribozomii independenţi sintetizează proteine de structură iar ribozomii legaţi de
reticulul endoplasmic, cu care formează reticulul endoplasmic rugos, sintetizează
proteine de secreţie.
5`
Perechi de baze
complementare Brat TΨ
ΨC
Bratul DHU
Bratul
DHU
Bratul variabil
Bucla Bratul anticodon
anticodon
Anticodon
Fig.8.3 Structura ARNt. a) Structura primară a ARNt formată prin legarea covalentă a
ribonucleotidelor. Complementaritatea bazelor permite formarea de structuri bicatenare, bazele
necomplementare fiind expulzate sub forma a trei bucle. b) Structura tridimensională a ARNt.
160
a.Caracteristicile structurale ale ARNt. Moleculele ARNt, numit şi ARN
solubil sau adaptor, conţin atât la procariote cât şi la eucariote între 75 şi 90
ribonucleotide. Procentul de baze complementare din structura ARNt este deosebit de
mare comparativ cu celelalte specii ARN. Raportul A+G/U+C din ARNt este apropiat de
1. Intr-o reprezentare bidimensională ARNt nuclear, prezintă o conformaţie în “foaie
de trifoi”, având 4 zone de perechi complementare şi 3 necomplementare, expulzate ca
bucle (Fig.8.3).
Molecula ARNt are cel mai mare conţinut de baze minore. După sinteza
completă a moleculei ARNt, anumite baze azotate pot fi modificate structural prin:
metilări, tiolări, hidrogenări, rezultând baze minore (Fig.8.4).
Modificările ARNt sunt necesare pentru realizarea unei structuri care să permită
îndeplinirea rolului specific al acestei molecule. Au fost isolate şi secvenţializate peste
600 specii de ARNt de la diferite organisme, toate având forma unei foi de trifoi. După
cum se vede din Fig.8.3, numele diferitelor regiuni ale ARNt derivă din proprietăţile
chimice sau funcţionale ale acestora.
La capătul 3` toţi ARNt maturi au secvenţa nucleotidică CCA la care se leagă
aminoacidul, iar la capătul 5` terminal cei mai mulţi ARNt au restul acid guanilic. O
scvenţă dublucatenară de 7 nucleotide prezentă la toate speciile ARNt, conferă stabilitate
braţului acceptor (locul de legare al aminoacidului la ARNt).
O O O
H3C
NH NH HN NH
N O N O O
HO H2 C HO H2 C HO H2 C
O O O
OH OH OH OH OH OH
Dihidrouridină Ribotimidină Pseudouridină
(DHU) (T) (Ψ)
S O
NH N
NH
N O N N
HO H2 C HO H2 C
O O
HO OH OH OH
4-Tiouridină Inozină
Fig.8.4 Structura unor nucleozide care conţin baze minore, din ARNt.
161
În soluţie, ARNt adoptă o structură tridimensională în forma literei L, braţul la
care se leagă aminoacidul şi braţul TΨC aflându-se pe o latură iar anticodonul şi braţul
DHU pe cealaltă latură a literei L. Structura terţiară de forma L a ARNt este stabilizată
prin:
–forţe de stivuire între nucleele aromatice adiacente;
–legături de hidrogen între bazele majore şi minore complementare;
–legături de hidrogen în care este implicată gruparea –OH din poziţia 2` a ribozei,
care acţionează atât ca donor cât şi ca acceptor de protoni; aceste interacţii nu se produc
în molecula de ADN care conţine dezoxiriboză
Anticodon 3` C C G 5` Anticodon 3` A G U 5`
GGC UCA
ARNm
5` Codon 1 Codon 2 3`
Fig.8.5. Recunoaşterea codon-anticodon.
8.3.3.ARNm
a.Caracteristici structurale. ARNm sunt molecule monocatenare, liniare, de
lungime variabilă, sintetizate prin utilizarea uneia dintre cele două catene ADN,
desemnată drept matriţă sau template. Acest process este denumit transcriere deoarece
informaţia rămâne în limbaj nucleotidic. O genă structurală este transcrisă, în sensul
complementarităţii bazelor (A corespunde la U, iar G la C), obţinându-se o moleculă de
ARNm a cărei compoziţie în baze reflectă compoziţia în baze a genei transcrise.
Informaţia depozitată în ARNm sub forma tripletelor de nucleotide numite
codoni este decodificată la nivelul ribozomilor. ARNm conţine la capătul 5` o secvenţă
162
care nu este tradusă în proteine, denumită secvenţă “leader” (la procariote, secvenţa Shine
Dalgarno) şi la capătul 3` o secvenţă netradusă, cunoscută ca secvenţă “trailer”.
Moleculele ARNm dictează ordinea în care se leagă la ribozomi moleculele
aminoacil~ARNt, şi prin urmare, ordinea în care se leagă aminoacizii pentru formarea
polipeptidelor (Fig.8.6). Acest proces este denumit traducere deoarece limbajul este
modificat de la secvenţă nucleotidică la secvenţă de aminoacizi.
Transcriere Traducere
ADN ARN Proteine
A
U
G
ARN
C
A A
T U
A G U
C
C C
G C
A T G
U A
C G
G
C G U
G C U
G C C
A
U
U
A
G
Fig.8.6. Transformarea secvenţei de nucleotide din moleculele de ADN şi ARN în secvenţă de
aminoacizi din proteină.
b.ARNm procariot poate conţine informaţia pentru sinteza unui singur polipeptid
(ARNm monogenic sau monocistronic) sau a mai multor polipeptide implicate în aceiaşi
cale metabolică (ARNm poligenic sau policistronic). In ARNm policistronic, cistronii
individuali sunt separaţi prin secvenţe intercistronice denumite spaţiatori (spacers).
La procariote, între gena transcrisă, ARNm şi proteină există o relaţie de
colinearitate, succesiunea tripletelor nucleotidice dintr-o genă corespunzând exact celei a
aminoacizilor în proteina codificată.
c.ARNm eucariot rezultat în urma transcrierii este monogenic (reprezintă matriţa
pentru sinteza unui singur lanţ polipeptidic) şi, de cele mai multe ori, cu mult mai lung
163
decât ARNm citoplasmatic. La capetele 5` şi 3`, ca şi la procariote, ARNm conţine regiuni
netraductibile.
La eucariote, relaţia de colinearitate genă-ARNm-polipeptid, valabilă la
procariote, este încălcată. Gena nu este corespondentul structural al ARNm, subiect al
traducerii, fiind cu mult mai lungă decât ar fi necesar pentru codificarea unui anumit
polipeptid; ea cuprinde secvenţe codificatoare numite exoni (expressed regions) separate
prin secvenţe necodificatoare numite introni (intervening sequences).
Moleculele ARNm matur care trec în citoplasmă şi reprezintă matriţa pentru
sinteza polipeptidului iau naştere prin prelucrări, la nivelul nucleului, ale precursorilor
ARNm rezultaţi prin transcriere, una dintre prelucrările importante fiind excizia
intronilor.
ARNm eucariot are o viaţă de ordinul orelor, în timp ce ARNm bacterian are o
viaţă foarte scurtă (2-3 minute).
8.3.4.ARN nuclear de mici dimensiuni, (small nuclear RNA). Acest tip de ARN
există, în nucleu, citosol şi mitocondrie sub forma mai multor specii moleculare (U1, U2,
U4, U5, U6) bogate în uridină. Prin asociere cu proteine, generează particule
ribonucleoproteice (small nuclear ribonucleoproteins) sau snRNP ( denumite “snurps”),
cu rol în excizia intronilor din ARNm transcript primar, controlul traducerii ca şi în
recunoaşterea proteinelor ce urmează a fi exportate.
Fig. 8.7 Catenele sens şi antisens din molecula ADN. Catena sens sau codificatoare are aceiaşi
orientare (5` 3`) ca şi secvenţă nucleotidică din catena ARN transcrisă.
Fig.8.8. Figura ilustrează faptul că ambele catene ADN pot fi catene template. Catenele template
se citesc, invariabil, în direcţia 3` 5`. Catena opusă este numită catenă codificatoare, deoarece,
este identică cu ARN transcris (cu excepţia înlocuirii T cu U).
Pentru ca reacţia să aibă loc este necesară prezenţa simultană a celor patru
ribonucleozid-5`-trifosfaţi şi a ADN. Polimeraza ataşază, la capetele 3`-hidroxil ale
catenei ARN, unităţi mononucleotidice, sintetizând ARN în direcţia 5` 3`, antiparalelă
catenei ADN folosită ca matriţă. Ca şi în cazul ADN polimerazei, hidroliza enzimatică a
pirofosfatului face ca reacţia să decurgă în celulă în sensul sintezei ARN.
Spre deosebire de ADN polimeraza III, ARN polimerazele nu au activitate de
corector.
Procariotele au o singură ARN polimerază responsabilă pentru sinteza tuturor
tipurilor ARN. Holoenzima, este un pentamer (α ββ σ), cu structură complexă,
α2ββ`σ),
constituită din:
–“enzima miez” care conţine patru subunităţi: două de tip α, una de tip β, şi una
de tip β` (α2ββ`), importantă în procesul de elongare;
–subunitatea adiţională σ, proprie procesului de iniţiere a transcrierii.
In absenţa subunităţii σ, ARN polimeraza, se leagă nespecific la ADN.
165
Eucariotele prezintă diferite ARN polimeraze:
a.ARN polimeraza mitocondrială, localizată în matrixul mitocondrial,
sintetizează toate tipurile de ARN mitocondrial;
b.ARN polimerazele nucleare, sunt enzime distincte, cu masă moleculară mare,
constituite din mai mult de zece subunităţi polipeptidice, cu sensibilitate diferită la α-
amanitină (octapeptid biciclic, toxic, existent în ciupercile otrăvitoare). ARN
polimerazele nucleare sintetizează diferite tipuri de ARN:
–ARN polimeraza I, localizată în nucleoli, care sintetizează ARNr 45S, nu este
sensibilă la α-amanitină;
–ARN polimeraza II, localizată în nucleoplasmă, sintetizează, ARNm, şi ARN
nuclear de dimensiuni mici, şi este foarte sensibilă la concentraţii mici de α-amanitină;
–ARN polimeraza III, localizată în nucleoplasmă, sintetizează, ARNt, ARNr 5S
şi ARN nuclear de dimensiuni mici, şi este sensibilă la concentraţii mari de α-amanitină;
166
b.La eucariote, fiecare tip de ARN polimerază, utilizează promotori diferiţi.
Promotorii utilizaţi de ARN polimeraza I şi II sunt situaţi, la fel ca şi promotorul
procariot, în “amonte” faţă de punctul start al transcrierii (+1). Promotorii utilizaţi de
ARN polimeraza III sunt situaţi, de obicei, în “aval” faţă de punctul de start al transcrierii
(în porţiunea transcriptibilă a genei).
Spre deosebire de ARN polimeraza I care utilizează promotori identici, ARN
polimeraza II utilizează o diversitate de promotori, având ca secvenţe consens
(Fig.8.10.a):
–caseta TATA, asemănătoare casetei Pribnow, centrată la 25-35 perechi de baze,
în „amonte” de punctul de start al transcrierii; este considerată responsabilă de acurateţea
iniţierii transcrierii;
–casetele CAAT şi GC, situate de asemenea în amonte faţă de +1, la 40-200
perechi de baze, sunt considerate responsabile de frecvenţa transcrierii.
Fig.8.10.Promotorii eucariotelor. a.Promotorul pentru ARN polimeraza II, situat în amonte faţă de
punctul de start al transcrierii; b.Promotorul ARN polimerazei III pentru ARNr 5S, situat în aval
faţă de punctul de start al transcrierii, în regiunea de transcris a genei.
167
celulelor bacteriene supravieţuirea în condiţii stresante de mediu, cum ar fi lipsa de azot
sau creşterea bruscă a temperaturii.
Iniţierea transcrierii presupune următoarele etape:
–formarea „complexului închis” de iniţiere ca urmare a legării holoenzimei la
promotorul specific, în regiunea –35 recunoscută de factorul σ;
ARN polimeraza holoenzima
Catena matrită
Promotor
169
Catena ADN codificatoare
Punctul de renaturare Punctul de denaturare
Catena matrită
Hibrid ARN-ADN
Fig.8.12 Ilustrarea procesului de transcriere. O catenă ADN acţionează ca template. ARN creşte în
direcţia 5` 3`.
8.5.4.Terminarea transcrierii
Procariotele şi eucariotele utilizează un mecanism comun pentru sinteza ARN.
Ele prezintă similitudini în legătură cu iniţierea transcrierii dar se pare că nu au nimic
comun în legătură cu terminarea transcrierii.
La procariote, există cel puţin două modalităţi de terminare a transcrierii: rho (ρ)
dependentă şi rho independentă, rho fiind un factor proteic reglator.
a.Terminarea transcrierii independentă de factorul proteic rho este impusă
de anumiţi factori. Catena matriţă ADN conţine semnale stop.
Secvenţe nucleotidice palindromice bogate în perechi G-C, urmate de o zonă
bogată în perechi A-T, formează prin transcriere ARN cu structură în “ac de păr”, stabilă
datorită conţinutului în perechi de baze G-C (Fig.8.13). Această structură în “ac de păr”
stabilă se termină cu o secvenţă poli-U care datorită împerecherii mai sumare cu catena
ADN matriţă favorizează terminarea transcrierii.
170
b.Terminarea transcrierii rho dependentă. Secvenţele terminatorii care nu
conţin structuri în “ac de păr” necesită prezenţa unui factor proteic rho. Factorul rho se
leagă la o secvenţă specifică de ARN monocatenar. Activitatea ATP-azică a factorului
rho determină deplasarea unidirecţională a acestuia de-a lungul ARN în creştere, spre
bucla de transcriere. ARN este desprins de catena matriţă şi de enzimă (Fig.8.14).
Terminarea transcrierii este mediată şi de alte proteine, semnalele active pentru acestea
fiind situate ca şi pentru factorul rho, pe catena ARN în creştere.
Fig.8.14. Terminarea transcrierii rho dependentă. Proteina rho, cu rol de ATP-ază se leagă de
catena ARN în creştere pe care o desprinde de catena matriţă ADN şi de enzimă.
c.Transcriptul primar ARNm procariot este mai lung decât gena de transcris.
ARN polimeraza transcrie pe lângă gena corespunzătoare unui ARNm şi două secvenţe
suplimentare care o flanchează. ARNm transcript primar prezintă la capătul 5` o secvenţă
denumită “leader” iar la capătul 3` o secvenţă “trailer” care nu se exprimă în proteină:
8.5.5.Inhibitorii transcrierii.
Transcrierea ADN este inhibată de către unii compuşi exogeni, fie prin
modificarea structurii ADN împiedicînd atât transcrierea cât şi replicarea, fie prin
inhibarea ARN polimerazelor.
a.Antibioticul actinomicină D, ca şi colorantul acridină, prin intercalarea între
perechile de baze G ≡ C distorsionează molecula ADN împiedicînd atât transcrierea cât
şi replicarea.
171
b.α
α-amanitina (octapeptid biciclic, toxic, existent în ciupercile otrăvitoare) este
un inhibitor al ARN polimerazelor din celulele animale. In concentraţii mici inhibă ARN
polimeraza II.
c.Antibioticele din familia rifamicin, inhibă specific iniţierea transcrierii la
bacterii. Rifamicina nu împiedică legarea ARN polimerazei la promotor dar împiedică
formarea primelor legături fosfat diesterice. Odată iniţiată transcrierea, rifamicina nu are
rol inhibitor asupra procesului de elongare.
Rifampin, un derivat semisintetic al rifamicinei, inhibă iniţierea transcrierii, la
procariote, prin legarea la subunitatea β a ARN polimerazei-holoenzimă. Deoarece nu
inhibă ARN polimerazele eucariotelor, antibioticul rifampin este folosit în tratarea
tuberculozei şi a altor infecţii bacteriene.
Pentru ca transcriptele primare să fie biologic active, multe dintre ele trebuie să
fie prelucrate posttranscriere prin:
–eliminarea exo- şi endonucleazică a unor fragmente polinucleotidice;
–adăugarea unor fragmente polinucleotidice la capetele 3` şi 5`;
–modificări covalente la nivelul unor resturi nucleotidice.
Excizia intronilor
Excizia intronilor se realizează în nucleu, pentru toate tipurile de ARN, în
prezenţa enzimelor specifice, care trebuie să recunoască secvenţele de baze de la
172
joncţiunea intron-exon şi să catalizeze excizia intronilor şi legarea exonilor. In general
intronii au la capătul 5` secvenţa GU iar la 3` secvenţa AG încadrate adesea de secvenţe
consens mai lungi. Mutaţii la nivelul joncţiunilor intron-exon pot genera un ARN
inactiv (care conţine un intron rezidual). Un defect de excludere a intronilor, având drept
consecinţă incapacitatea ARN nuclear de a “ieşi” în citoplasmă pentru a fi citit, ar putea
duce la o sinteză scăzută a lanţurilor de β-globină, fapt constatat în unele β-thalasemii.
a.Excizia intronilor din ARNr se realizează autocatalitic.
GTP sau guanozina acţionează ca agent nucleofil pentru desfacerea legăturii
fosfat diesterice de la unul din capetele intronului.
Capătul 3` eliberat, al exonului I, efectuează o transesterificare la capătul 5` al
exonului II, realizându-se odată cu excluderea intronului, legarea celor doi exoni
(splicing) Fig.8.15.
Extensie 5`
5`
Prelucrări posttranscriere
Intron
ARNt matur
ARNt transcript primar
Fig. 8.18. Structura şi exprimarea unei gene care codifică proteine la eucariote
(SN=secvenţă necodificatoare).
175
O CH3
+
N
HN
O O O
H2N N N 2` 3` CH2 O P O P O P Transcript primar
OH HO OH OH OH
O legătură 5` - 5` trifosfat
7-metil guanozină între 7-metil-guanozină si transcriptul primar
8.7.1.Tipuri de gene:
a.gene ce codifică proteine care nu sunt necesare într-o celulă dată, numite gene
represate (fenomen determinat de modificări în structura cromatinei, absenţa
activatorilor sau prezenţa represorilor specifici);
b.gene accesibile transcrierii, care se împart în două categorii:
–gene activate constitutiv cu posibilitatea ca exprimarea lor să fie “up“ sau
“down“ reglată;
177
–gene inductibile, care sunt inactive, dar care pot fi activate ca răspuns la stimuli
specifici celulari cum ar fi: şocul termic, hormoni, esteri ai forbolului, ioni ai metalelor
grele, factori de creştere, AMPc şi stresul oxidativ.
178
Galactozide ca izopropiltiogalactozid sunt inductori puternici
ai β−galactozidazei,
β− dar nu acţionează ca substraturi ale enzimei (sunt inductori
nemetabolizabili).
181
prezentă în mediu, ea poate fi metabolizată, ARN polimeraza putând efectua transcrierea
genelor lac.
Când concentraţia glucozei este mare, concentraţia AMPc este redusă şi, prin
absenţa complexului AMPc - PRAMPc, ARN polimeraza nu se leagă la promotor şi
genele lac nu sunt transcrise indiferent dacă operatorul este ocupat de repressor (Fig.
8.21, a).
Complexul AMPc - PRAMPc, spre deosebire de represor, exercită un efect
pozitiv în exprimarea operonului lac.
Operonul lactozei este subiectul controlului pozitiv şi negativ. Când concentraţia
glucozei scade, complexul AMPc - PRAMPc, se leagă la operonul lac stimulând
transcrierea genelor lac, control pozitiv. In lipsa lactozei operonul este controlat de
represorul lac, control negativ. Astfel, bacteria se asigură că genele structurale x, y, z sunt
transcrise numai dacă glucoza este absentă şi lactoza este prezentă. Această dublă
modalitate de reglare conferă bacteriilor o mare flexibilitate metabolică.
a) -Glucoză
+Lactoză
locuri de
genă reglatoare control gene structurale
i p o x y z
ARN polimerază
Proteină
receptoare - AMPc ARNm policistronic
ARNm
Represor
+ Alolactoza
Represor inactiv
b) + Glucoză
+ Lactoză
locuri de
genă reglatoare control gene structurale
i p o x y z
ARNm + Alolactoza
Represor
Represor inactiv
9.1.Codul genetic
Cum primele două baze ale codonilor sinonimi sunt constante, asocierea
nucleotidelor 1 şi 2 din codon cu nucleotidele 3 şi 2 din anticodon este fermă,
respectând principiul complementarităţii Watson-Crick.
Asocierea nucleotidului 3 din codon cu nucleotidul 1 din anticodon este, în
general, slabă datorită particularităţii de „bază nedecisă” a nucleotidului 1 din anticodon
(capătul 5`). Această bază care încalcă regulile de complementaritate se poate asocia şi cu
alte nucleotide (efect wobble). Un ARNt care conţine un anticodon cu o bază oscilantă în
poziţia 1 (care poate fi o bază minoră de ex. inozina) se poate lega la mai mulţi codoni
sinonimi (Tabelul 9.2). In concluzie, bazele minore din anticodoni se asociază cu bazele
„oscilante“ din codoni.
b.Codul genetic nu are semne de punctuaţie. Citirea mesajului genetic se face
neîntrerupt, de la un codon start până la un codon terminator, adică începutul sau sfârşitul
unui codon nu sunt marcate de puncte sau virgule.
c.Codul genetic este universal, este aproape acelaşi la multe organisme. O
abatere de la universalitate se întâlneşte la codul genetic al mitocondriei unde, codonul
UGA corespunde triptofanului, nefiind un codon stop, codonul AUA corespunde
metioninei şi nu izoleucinei, etc.
185
d.Codul genetic nu este ambiguu, niciodată acelaşi triplet nu specifică doi
aminoacizi diferiţi.
Tabelul 9.2 Ilustrarea posibilităţilor de asociere a nucleotidului 3 din codon cu nucleotidul 1 din
anticodon.
Prima bază din anticodon A 3-a bază din codon
C G
A U
U A sau G
G U sau C
I U, C sau A
1.Activarea aminoacizilor
Legătura între ARNm şi proteine este realizată de către moleculele ARNt care
leagă covalent aminoacizii activaţi şi îi adaptează în poziţiile corespunzătoare, la nivelul
ribozomului, prin recunoaştere codon-anticodon.
a.Procesul de legare a aminoacizilor, în forma lor activată, la ARNt specific
presupune trei etape.
Formarea complexului aminoacil~AMP, care conţine o legătură macroergică
de tip anhidridă mixtă, în urma reacţiei aminoacidului cu ATP:
NH2
N
N
O
R CH COO- + ATP R CH CO~ O P O N N
O
+ -
NH3 H3N + O
Aminoacid PPi
Aminoacil~AMP
(aminoacil~adenilat) OH OH
186
Transferul restului aminoacil activat la gruparea –OH din poziţia 2` sau 3` a
ribozei de la nucleotidul adenilic din capătul 3` al ARNt, cu formarea unei legături
macroergice:
ARNt
NH2
N O
N NH2
O O- P O
R CH CO~ O P O N N N
O + ARNt O N
H3N+ O-
H2C N N
AMP O
Aminoacil~AMP
(aminoacil~adenilat) OH OH
OH O CO HC R
+
H3N
Global reacţia poate fi scrisă:
(IF-1) (IF-3)
70S ←→ 50S + 30S → 30S ⋅ IF - 3 + 50S
187
Factorul de iniţiere IF-3 are rolul de a preveni reasocierea prematură a celor două
subunităţi ribozomale iar IF-1 măreşte viteza de disociere a aestora. De remarcat, că la
concentraţii fiziologice ale Mg2+, aproape toţi ribozomii se găsesc sub formă de ribozom
70S.
b.N-formil-metionil- ARN fMet
t , numit ARNt iniţiator, aduce metionina formilată
la codonul AUG din locusul P al subunităţii 30S. La procariote, aminoacidul N-terminal
este, invariabil, N-formil-metionina. Există două specii diferite de ARNt purtătoare ale
metioninei, pentu cele două tipuri de codoni AUG (iniţiator şi din interiorul ARNm). Atât
ARN Met
t utilizat pentru codonul AUG din interiorul lanţului cât şi ARNfMet
t utilizat pentru
codonul AUG iniţiator, leagă metionina, prin reacţia catalizată de aceiaşi aminoacil-ARNt
sintetază, generând: metionil- ARN Met
t şi metionil- ARNfMet
t . Dintre acestea numai
metionil- ARNfMet
t este susceptibilă la formilare generând aminoacidul iniţiator care se va
lega la codonul de iniţiere, şi nu la orice codon AUG de pe ARNm.
Formilarea metionil- ARNfMett este catalizată de o transformilază având ca
donator de grupare formil N -formiltetrahidrofolatul (N10-CHO-FH4):
10
fMet
metionina + ARN t → metionil ~ ARN fMet
+ ATP t + AMP + PP
fMet 10
metionil ~ ARN t + N − CHO − FH 4 → formil - metionil ~ ARNfMet
t + FH 4
188
Etapa a doua în procesul de formare a complexului de iniţiere este reprezentată
de legarea N-formilmetioninei-ARNtfMet la complexul format anterior, respectiv,
ARNm-subunitate 30 S. Factorul de iniţiere 2 (IF-2) este decisiv în legarea ARNt
iniţiator la subunitatea 30S.
GTP acţionează ca un factor steric, în realizarea acestui complex favorizând
asocierea stabilă a IF-2 cu subunitatea ribozomala 30 S.
Etapa a treia, cuprinde procesul de legare a subunităţii ribozomale mari, 50 S,
la complexul format în etapa a doua, însoţită de hidroliza GTP şi eliberarea
factorilor de iniţiere (Fig.9.1).
În acest fel se constituie aşa numitul ribozom funcţional sau complexul de
iniţiere (70 S). Pe ribozomul 70 S sunt delimitate două situsuri de legare ARNt : situsul
aminoacil (A) şi situsul peptid (P) şi situsul E de eliminare a ARNt liber. De remarcat că
pe ribozomul funcţional în acest moment N-formilmetionil~ARNtfMet ocupă situsul
peptid (P), care este în mod obişnuit ocupat de lanţul polipeptidic în creştere, iar situsul A
(aminoacid) este liber.
189
din complexul EF-Tu-GDP de către factorul EF-Ts. EF-Tu şi EF-Ts formează un
complex care este disociat de o moleculă de GTP formându-se complexul EF-Tu-GTP
necesar legării următorului aminoacid.
EF-Tu-GTP favorizează legarea tuturor aminoacil-ARNt la locusul A, cu excepţia
fMet- ARN fMet
t .
b.Transferul restului formil-metionil la gruparea amino a aminoacil2- ARNaa2 t
din locusul A (aminoacid) conduce la formarea primei legături peptidice (restul formil-
metionil acilează gruparea amino din aminoacidul 2). Formarea legăturii peptidice este
catalizată de peptidil-transferază care face parte din subunitatea 50S.
În acest moment, locusul P (peptid) este ocupat de ARNtfMet, iar locusul A
(aminoacid) este ocupat, nefiresc, de un ARNt ce poartă dipeptidul format.
Suportul energetic al acestei reacţii de transfer este asigurat de energia rezultată
la desfacerea legăturii aminoacid iniţiator~ARNtfMet.
190
c.Translocarea ribozomului spre capătul 3` al ARNm pe distanţă de un
codon. În acest moment dipeptidul legat de ARNt se află în locusul P (firesc), ARNt
nelegat de aminoacid trece în locusul E de unde este eliberat în citosol, iar poziţia A este
neocupată. Alunecarea ribozomului pe ARNm se numeşte translocare.
Acest proces de translocare este controlat de către cel de-al treilea factor al
elongarii (EF-G). EF-G formează un complex cu GTP, care este hidrolizat în timpul
translocării la GDP şi Pa.
Elongarea se repetă după acelaşi mecanism pentru fiecare legătură peptidică din
structura proteinei sintetizate.
191
Codonii stop sunt recunoscuţi de anumite proteine numite factori de
eliberare.
Legarea factorilor de eliberare la codonul terminal activează peptidil-transferaza
ribozomală care acţionează ca o hidrolază desfăcând legătura polipeptid-ARNt. In urma
acţiunii acestei hidrolize, polipeptidul, ARNt şi ARNm părăsesc ribozomul. In final,
ribozomul disociază în subunităţile 30S şi 50S gata să înceapă o nouă traducere.
Necesarul energetic pentru formarea unei legături peptidice este de patru
legături macroergice.
Două dintre acestea se consumă în etapa de activare a aminoacizilor (sub formă
de ATP), iar alte două în etapa de elongare sub formă de GTP.
Faptul că la hidroliza unei legături peptidice se eliberează 5 kcal, comparativ cu
cele 29 kcal necesare pentru formarea ei, traduce ireversibilitatea procesului de
biosinteză.
Fidelitatea traducerii se asigură prin:
–acurateţea aminoaciltransferazei şi capacitatea de corector a acesteia
–recunoaşterea codon-anticodon.
Consecinţele fidelităţii scăzute a traducerii constau în înlocuirea neconservativă a
unui aminoacid cu altul, fapt care generează o proteina nefuncţională sau chiar nocivă.
Citirea greşită a codonilor terminali generează proteine anormale.
Frecvenţa erorilor în procesul traducerii la Escherichia coli este estimată la o
eroare la 2000 de aminoacizi.
192
Fig. 9.4. Poliribozomi
194
10. METABOLISM ENERGETIC
10.2.2. Funcţiile de stare reprezintă valori bine definite ale unor mărimi
variabile (temperatură, presiune, număr de moli, etc.), ce caracterizează o anumită stare a
sistemului.
Termodinamica nu urmăreşte desfăşurarea proceselor în timp. Ea analizează
modificarea conţinutului în energie al unui sistem când acesta trece dintr-o stare (starea
iniţială) în alta (starea finală) şi schimbul de energie dintre sistem şi mediul exterior.
Analiza termodinamică a unei reacţii nu dă indicaţii cu privire la mecanismul şi
viteza cu care sistemul a trecut din starea iniţială în cea finală (prin oxidarea unui mol de
glucoză, până la CO2 şi H2O, se eliberează aceiaşi cantitate de energie indiferent de calea
pe care are loc transformarea).
Timpul şi viteza nu apar în relaţiile termodinamice. Cu aceste mărimi
operează cinetica chimică.
10.2.3. Legile termodinamicii sunt relaţii între funcţiile de stare, la baza cărora
stau cele două principii ale termodinamicii:
1.Principiul I, principiul conservării energiei, afirmă că energia universului
este constantă. “Energia nu poate fi creiată nici distrusă, ea poate suferi doar transformări
dintr-o formă în alta sau poate trece de la un sistem la altul“.
2.Principiul al II-lea, principiul evoluţiei, stabileşte sensul în care au loc
transformările însoţite de schimbări de energie. El statuează că “entropia universului
creşte“ sau “orice transformare liberă şi spontană se face în direcţia corespunzătoare
creşterii entropiei, ansamblului constituit din sistem şi mediul înconjurător“.
∆ E = ∆ G + T ∆S
A + B C + D
Energia liberă în starea iniţială, Greactanţi, este dată de suma energiilor libere ale
reactanţilor GA şi GB. Starea finală, a rezultanţilor, are o energie liberă dată de suma GC
+ GD.
Variaţia energiei libere la trecerea reactanţilor în rezultanţi:
∆ G = Grezultanţi – Greactanţi
197
Energia liberă este o mărime aditivă. Majoritatea reacţiilor chimice care au loc
în organismele vii fac parte din căi metabolice. O cale metabolică este alcătuită din
secvenţe de reacţii, fiecăreia dintre acestea corespunzându-i o variaţie a energiei libere:
–dacă ∆ Gtotal < 0, calea metabolică este exergonică (căile catabolice, degradative
sunt exergonice;
–dacă ∆ Gtotal > 0, calea metabolică este endergonică (căile anabolice sunt
endergonice).
Energia liberă este o mărime extensivă, depinde de cantitatea de substanţă.
Deoarece energiile libere depind de cantităţile de substanţă, o aceiaşi reacţie poate avea
valori ∆G variabile în funcţie de concentraţiile reactanţilor şi ale rezultanţilor.
Pentru a putea compara diverse reacţii în ceea ce priveşte gradul lor de spontaneitate,
trebuie ca aceste reacţii să presupună transformarea unor cantităţi echivalente de
substanţe şi în aceleaşi condiţii de mediu. Pentru aceasta se defineşte o stare standard a
substanţelor şi condiţii standard de mediu ( temperatura standard este de 250 C, presiunea
de 1 atmosferă şi concentraţia molară a compuşilor este de 1M).
A + B C + D
[C][D]
este ∆G = ∆G 0 + RTln
[A][B]
[C] ⋅[D]
=1 rezultă: ∆ G = ∆ G0
[A] ⋅[B]
La echilibru: ∆ G = 0
0 = ∆ G0 + RT ln Kechilibru
∆ G0 = - RT ln Kechilibru
Cuplurile Ared şi Aox sau Box şi Bred , constituite din forma redusă şi forma
oxidată ale aceluiaşi compus poartă denumirea de sistem redox.
Dacă într-o soluţie se află două sisteme redox, electronii vor trece de la sistemul
cu afinitate mai mică pentru electroni (sistemul reducător), spre cel cu afinitate mai mare
(sistemul oxidant). Sensul şi intensitatea fluxului de electroni depind de afinităţile relative
pentru electroni ale celor două sisteme. Tendinţa sistemelor redox de a ceda sau primi
electroni (caracterul lor oxidant sau reducător), se măsoară cu ajutorul potenţialelor redox
(E).
199
Potenţialele redox sunt diferenţe de potenţial între două sisteme redox
cuprinse în compartimente diferite între care electronii pot circula prin intermediul a doi
electrozi conectaţi printr-un conductor, iar ionii circulă prin intermediul unei punţi
realizată prin încorporarea unui electrolit (KCl), într-un gel de agar (Fig.10.2).
Potentiometru
e-
e-
Punte de sare
Zinc Cl- K+
Cupru
Zn2+ Cu2+
SO42-
Zn2+ Cu2+
ZnSO4 CuSO4
SO42- SO42-
∆ G0` = - n F ∆E0`
unde: n – numărul de electroni transferaţi;
F – echivalentul caloric al lui Faraday 23,062 kcal;
∆E0` −diferenţa
− dintre potenţialele redox standard ale reactanţilor.
200
Deoarece potenţialele redox sunt uşor de măsurat, relaţia permite evaluarea
efectelor energetice ale proceselor redox din organism.
201
In molecula acidului pirofosforic (PPi) se păstrează o legătură macroergică. In
celule, acidul pirofosforic este hidrolizat imediat sub acţiunea catalitică a unei hidrolaze,
pirofosfataza:
PPa + HOH 2 Pa ∆G0`= - 9 kcal/mol.
2-
C O ~PO3 + H2 O C O + Pa ∆G0` = - 14,8 Kcal/mol
CH2 CH3
5. Fosfocreatina conţine o legătură fosfoamidică. Deosebit de importantă este
relaţia dintre ATP şi creatinfosfat. În stare de repaus creatinfosfatul se poate acumula în
anumite limite în muşchi, constituindu-se ca o rezervă de legături macroergice.
202
NH2
NH~PO3H2
∆G0` = - 10,3 Kcal/mol
HN
HN
N CH2 COOH
N CH2 COOH H O Pa
2
CH3
CH3
Acidul carboxilic şi acidul fosforic prezintă fiecare mai multe structuri limită în
rezonanţă decât anhidrida carboxil-fosforică
O O O O
.. .. ..
R C ..O ~ P OH + H2O R C OH + HO P OH
OH OH
b.Prin reacţia de hidroliză se micşorează repulsiile electrostatice dintre sarcini
de acelaşi fel din molecula reactantului. Deoarece în soluţie apoasă compuşii fosforilaţi
203
sunt ionizaţi, prin reacţia de hidroliză a ATP se reduce numărul sarcinilor negative de la 4
pentru ATP la 3 pentru ADP:
O O O O O
O- P O P O P adenozină O- P O P adenozină
O- O- O- O- O-
H2O Pa
c.Prezenţa ionilor de Mg2+ în celule. Deoarece afinitatea ADP pentru Mg2+ este
de ~ 6 ori mai mare decât afinitatea ATP, reacţia este orientată spre formare de ADP + Pa
O O O O O
- -
O P O P O P adenozină O P O P adenozină
O- O O O O
Mg2+ Mg2+
Complexul Mg - ATP Complexul Mg - ADP
H2 O Pa
- - -
COO COO COO
2-
C O ~PO3 C OH C O
CH2 CH2 CH3
Fosfoenol- Enolpiruvat Piruvat
piruvat
204
Cuplarea se poate face în două moduri:
-când unul dintre produşii de reacţie ai reacţiei exergonice este reactant în reacţia
endergonică (fosforilarea glucozei sau a glicerolului se face, în prezenţa enzimelor
specifice, pe seama energiei eliberate la hidroliza ATP);
-printr-un intermediar energetic comun, care în lumea vie este ATP.
Tabelul 10.3. Valorile ∆ G0` pentru reacţiile de hidroliză ale unor compuşi macroergici şi ale unor
compuşi care nu sunt macroergici.
Compusul ∆G0`
Acidul fosfoenol piruvic -14,8
Carbamilfosfatul -12,3
Acidul 1,3-bisfosfogliceric -11,8
Creatinfosfatul -10,5
Acil-CoA -7,5
ATP ADP + Pa -7,3
Glucozo-1-fosfatul -5,0
Glucozo-6-fosfatul -3,3
Glicerol-3-fosfatul -2,2
ADP + Pa ATP
D C
reactie
endergonică
205
Fosfoenol 1,3-Bisfosfo-
piruvat glicerat Glucozo- Glicerol-
6-fosfat 3-fosfat
Creatin fosfat
~P ~P
~P
Glucoză Glicerol
ADP ATP
Fig.10.3. Transferul grupării ~P de la compuşii macroergici, prin intermediul ATP, la glicerol şi
glucoză.
Această activare necesită mai mult de 7,3 kcal/mol. ATP-ul se scindează la AMP
+ PPa, pirofosfatul scindându-se rapid la 2Pa. O parte din energia eliberată este utilizată
pentru favorizarea termodinamică a reacţiei.
206
4.Activarea acizilor graşi necesită scindarea ATP la AMP şi PPa.
Pentru formarea legăturii macroergice C~S este nevoie de mai mult de 7,3
kcal/mol.
R-COOH + ATP + CoA-SH R-CO~SCoA + AMP + PPa
pirofosfatază
PPa + HOH 2 Pa
10.6.3.Sinteza ATP
Concentraţia de ATP în celulă este mică. Sinteza sa are loc în măsura utilizării
(rata sintezei este egală cu rata utilizării). Necesarul de ATP în celule este funcţie de
organ şi de activitatea metabolică. Sinteza ATP în celulele animale se face prin:
–fosforilare la nivel de substrat;
–fosforilare oxidativă.
1.Sinteza de ATP prin fosforilare la nivel de substrat.
Acest gen de sinteză a ATP-ului constă dintr-un ansamblu de reacţii prin care
energia mobilizată prin dehidrogenarea unui substrat este utilizată imediat pentru
fosforilarea ADP-ului la ATP. Celulele animale dispun de trei reacţii de acest gen:
-două etape din secvenţa anaerobă de degradare a glucozei (glicoliza);
-o etapă din ciclul Krebs.
a.Sinteza de ATP cuplată cu oxidarea gliceraldehidei-3-fosfat.
Esterul fosforic al gliceraldehidei este intermediar al secvenţei glicolitice.
Transformarea grupării -CHO în –COOH, reacţie puternic exergonică, este cuplată cu
sinteza de ATP. In etapa oxidativă se formează acidul 1,3-bisfosfogliceric, compus
macroergic cu potenţial mare de transfer al grupării fosfat. Gruparea ~P este transferată
pe ADP.
NAD+ NADH+H+
HC O COO ~PO3H2 ADP ATP COO-
HC OH HC OH HC OH
fosfoglicerat
H2 C OPO3 H2 H2 C OPO3 H2 kinază H2 C OPO3 H2
Pa
gliceraldehidă 1,3-bisfosfoglicerat 3-fosfoglicerat
3-fosfat
207
b.Sinteza de ATP cuplată cu transformarea acidului 2-fosfogliceric în acid
piruvic.
Legătura alcool fosforică din acidul 2-fosfogliceric este transformată în legătură
enol-fosforică, având loc creşterea potenţialului chimic al restului fosforil. Grupul fosforil
activat este transferat pe ADP.
COO- COO-
ADP ATP COO-
enolaza C O
HC OPO3 H2 C O ~PO3H2
-H2O piruvat kinaza
H2 C OH CH2 CH3
2-fosfoglicerat Piruvat
Fosfoenolpiruvat
Citocrom (Fe2+)
Oxidarea unui mol de NADH este asociată cu sinteza a trei moli de ATP.
Oxidarea unui mol de FADH2 este asociată cu sinteza a doi moli de ATP.
Surse extramitocondriale
de echivalenti reducători
Fig.10.4 Surse de echivalenţi reducători
O 2 + 4 e- + 4 H +
→ 2 H 2O
3.Structura mitocondriilor
Mitocondriile sunt formaţiuni intracelulare, cu forme diferite, în funcţie de
ţesutul în care sunt distribuite (aproape sferice în ficat, cilindrice şi cu multe criste în
muşchiul cardiac). Mitocondriile sunt prevăzute cu două membrane (internă şi externă),
care delimitează între ele un spaţiu intermembranar (Fig.10.6). În acest spaţiu sunt
localizate câteva enzime implicate în transferul energiei înmagazinate în legăturile
macroergice ale ATP: adenilat kinaza, creatin kinaza şi nucleozid difosfat kinaza.
Membrana internă delimitează un spaţiu intern, numit matrix. Solul matrixului se
numeşte mitosol.
a.Membrana externă, liber permeabilă pentru moleculele cu masa mai mică de
10 kDa, nu reprezintă o barieră de permeabilitate, între citosol şi spaţiul
intermembranar, pentru mulţi compuşi organici, ioni, nucleotide cu rol în metabolismul
energetic.
Spatiu intermembranar
Membrana externă
Membrana
internă
Criste
Matrix
210
–enzime implicate în metabolismul lipidic (fosfolipaza A2, acil-CoA sintetaza,
glicerol fosfat acil transferaza);
– fosfonucleozidkinaze;
–pe suprafaţa externă a membranei, la nivelul tesutului nervos, sunt localizate
enzime cu rol în eliberarea neurotransmiţătorilor.
b.Membrana internă este extrem de pliată. Pliurile numite “criste” măresc
suprafaţa acestei membrane.
Este practic impermeabilă liber pentru:
–ioni anorganici: K + , Na + , Ca2 + , H+ , HO − , Pa
–nucleotide: ADP, ATP, NAD+ , NADH, CoA - SH, etc.
–compuşi organici ionizaţi sau neionizaţi: malat, oxaloacetat, glutamate, aspartat,
piruvat, acil-CoA, etc.
Este liber permeabilă pentru gaze (O 2 , CO2 , NH3 ) şi pentru molecule mici,
neionizate (apă, acid acetic, acid acetoacetic, acid 3-hidroxibutiric).
Structura membranei interne este mult mai complexă ca a membranei externe. Ea
conţine ~20% lipide complexe bogate în acizi graşi nesaturaţi şi proteine (~80%).
Cardiolipina şi fosfatidilglicerolul sunt prezente în concentraţie mare în această
membrană.
Proteinele cu activitate enzimatică existente în membrana internă sunt:
–succinat-dehidrogenaza, enzimă componentă a ciclului Krebs:
–enzime implicate în transportul acizilor graşi, din citosol, în mitosol;
–citocromul P-450 implicat în hidroxilări;
–majoritatea componenţilor lanţului transportorilor de electroni;
–o parte a sistemului de sinteză a ATP prin fosforilare oxidativă (F1F0ATP
sintaza);
–permeaze sau translocaze, sisteme proteice care permit transportul selectiv
împotriva gradientului de concentraţie, al unor perechi de compuşi din mitosol în spaţiul
intermembranar şi invers (Fig.10.7); aceste translocaze permit mitocondriilor din celulele
mamiferelor să importe din citosol compuşi ca piruvat sau acizi graşi necesari proceselor
mitocondriale oxidative, şi să exporte din mitocondrie compuşi care vor fi utilizaţi în
etape citosolice ale: lipogenezei, gluconeogenezei, ureogenezei. Anumiţi compuşi inhibă
specific unele dintre aceste translocaze.
Translocaza nucleotidelor cu adenină, prezentă în concentraţie de ~14% în
membrana internă mitocondrială, transferă ATP sintetizat, prin fosforilare oxidativă în
matrixul mitocondrial, în citosol, unde este necesar proceselor consumatoare de
energie. Adenin nucleotid translocaza este homodimer cu un singur centru de legare
pentru nucleotid, ADP sau ATP. Translocaza adoptă 2 conformaţii, la expunerea
alternativă a centrului de legare spre matrix şi spre spaţiul intern mitocondrial.
Schimbarea conformaţiei translocazei este determinată de legarea ligandului. Potenţialul
exterior pozitiv al membranei, stabilit în cursul transportului de electroni, va favoriza
transportul prin membrană al ATP cu patru sarcini negative la schimb cu ADP cu trei
sarcini negative.
Al doilea transportor important pentru fosforilarea oxidativă este translocaza
fosfatului necesar pentru sinteza de ATP în matrix. Fosfatul este transportat simport cu
un proton, pentru acest transport fiind necesar un gradient de protoni. Forţa proton
211
motrice furnizează energia necesară pentru sinteza ATP ca şi pentru preluarea a două
substraturi ADP şi fosfat.
Spatiu Membrana
intermembranar Matrix
internă
Translocarea Piruvat-
acizilor monocarboxilici HO-
Translocarea HPO42-
acizilor dicarboxilici Malat2-
Translocarea
Malat2-
acizilor tricarboxilici Citrat3- + H+
Translocarea Glutamat
aspartat - glutamat Aspartat
Translocarea Malat
malat - α - cetoglutarat α-cetoglutarat
Fe Fe S
Fe
(Cys)-S S S-(Cys) S S
(Cys)-S Fe
Centru binuclear Fe2S2Cys4 S-(Cys)
O .
O OH
H3CO CH3 H3CO CH3 H3CO CH3
+H+ ; e- +H+ ; e-
R= CH2 CH C CH2 H
n
Fig. 10.9. Participarea ubichinonei la reacţii redox
213
d.Citocromii sunt hemoproteine care diferă prin structura grupării prostetice de
tip hem al cărui Fe poate oscila între Fe2+ şi Fe3+. Diferenţele structurale între
porfirinele conţinute determină diferenţe spectrale (absorbţia selectiveă diferită a unor
radiaţii din domeniul vizibil).
La mamifere se cunosc trei tipuri de citocromi (a, b, c) componenţi ai lanţului
respirator, cu subtipurile bK (sau b562 care absoarbe specific la 562 nm), bT (sau b566 care
absoarbe specific la 566 nm), c1, a, a3.
Mecanismul prin care acţionează fiecare dintre citocromi în lanţul respirator
constă în acceptarea electronilor de la un transportor cu potenţial redox standard mai
negativ (sau pozitiv mai mic) decât al său şi cedarea apoi a acestor electroni către un
transportor cu potenţial redox standard mai puţin negativ (sau electropozitiv mai mare)
(Fig. 10.10). Insuşirea citocromilor de a-şi schimba valenţa fierului între Fe2+ şi Fe3+,
diferită de a mioglobinei şi a hemoglobinei la care valenţa fierului nu se modifică odată
cu fixarea sau cedarea O2, este determinată atât de diferenţele structurale între porfirine
cât şi de componentele proteice diferite.
e- citocrom (Fe3+) e-
citocrom (Fe2+)
214
Met 80
CH 3
H 3C CH S CH 2
Lant polipeptidic
H 3C HC CH
N CH 3
N Fe2+ N
CH 2 N
HC CH CH S CH 2
-
CH 2
O OC
CH 3
CH 2 CH 3
CH 2
-
O OC Hys 18
Fig.10.11. Structura citocromului c.
FPS
Succinat
Cu excepţia CoQ şi a cit. c care funcţionează individual în membrană, celelalte
componente se grupează în complexe notate I, II, III şi IV (Fig.10.12) fiecare complex
catalizând o anumită reacţie de oxido-reducere.
Succinat
215
Complexul I (NADH-CoQ reductază), numit adesea NADH dehidrogenază,
transferă H+ şi electronii de pe (NADH + H+) din matrix pe CoQ. Acest complex cuprinde
cca. 40 polipeptide diferite în care sunt incluse dehidrogenaza FMN-dependentă şi câteva
proteine cu Fe şi S notate FeS1, FeS2, FeS3 şi FeS4, această ordine corespunzând
descreşterii valorii negative a potenţialului E0` . Curgerea echivalenţilor de reducere în
interiorul acestui complex este:
CoQ
+ 1e- 1e- 1e- 1e- 2e-
NADH+H FPN(FMN) FeS1 FeS2 FeS3 FeS4
CoQH2
2H+
NAD +
FPN(FMNH2) 2H+
ADP + Pa ATP
217
Pe baza unor determineări spectroscopice, se admite că în complexul IV
electronii recepţionaţi de la cit. c de către cit.a trec de la acesta pe proteina cu CuA şi de
aici pe cit. a3 şi proteina cu CuB care îi transferă apoi pe oxigen.
Pe lângă cei 4 electroni utilizaţi pentru reducerea oxigenului, alţi 4 protoni sunt
translocaţi din mitocondrie în spaţiul intermembranar (pentru fiecare 2 electroni care
traversează complexul IV sunt translocaţi 2 protoni).
Căderea de potenţial la trecerea electronilor mediată de complexul IV este de 0,54
V căreia îi corespunde o valoare ∆G 0` = −24,8 kcal / mol , deci energie suficientă pentru
sinteza a trei moli de ATP; nu se sintetizează însă decât un singur mol.
Funcţionarea lanţului respirator mitocondrial este prezentată în Fig.10.13.
γ H+
Interior
Membrana internă
mitocondrială
Exterior
6.Teoria chemiosmotică
Teoria chemiosmotică, propusă în 1961 de Peter Mitchell, postulează că
transportul direcţionat al electronilor prin lanţul respirator produce translocări vectoriale
de protoni prin membrana internă mitocondrială, din matrix, în spaţiul intermembranar
(Fig.10.13).
Membrana internă mitocondrială este străbătută de la o faţă la cealaltă de
complexele I, III şi IV ale lanţului respirator care sunt “ pompe de protoni” din matrix în
spaţiul intermembranar.
Diferenţa de pH apărută prin funcţionarea pompelor de protoni corespunde unui
matrix mai alcalin şi unui spaţiu intermembranar mai acid.
219
Gradientul de pH apărut ( ∆pH ) este parţial convertit într-un potenţial de
membrană ( (∆Ψ ) , prin schimbul de H+ cu cationi şi de HO− cu anioni, prin membrana
internă.
Dublul gradient, de pH şi de sarcină, care apare prin funcţionarea lanţului
respirator determină apariţia forţei proton-motrice (∆µ H+ ) , conform relaţiei:
R ⋅T
∆µ +H = ∆Ψ - 2,3 ∆pH
F
Această forţă (cu valoare maximă de ~230 mV) reprezintă energia disponibilă
pentru sinteza ATP prin fosforilare oxidativă şi pentru alte procese endergonice
mitocondriale.
Prin ATP sintază protonii acumulaţi în spaţiul intermembranar vor fi translocaţi
înapoi în matrix. Această translocare se realizează însă în josul gradientului de pH şi de
sarcină, deci cu eliberare de energie; energia eliberată va servi la sinteza de ATP:
[ADP] ⋅ [P]
∆G `ATP = ∆G `0 + RT ln
[ATP]
Lanţul respirator cuplat cu fosforilarea oxidativă va produce un circuit al
protonilor prin membrana internă, reprezentat în Fig. 10.13.
221
Matrix Spatiu intermembranar
Mediu bazic Mediu acid
-
O
-
O NO2
HO
HO
NO2
HO 2,4-dinitrofenol
Membrană
internă
Fig.10.15 Acţiunea 2,4-Dinitrofenolului ca decuplant, ionofor de protoni care echilibrează
pH-ul de-a lungul membranei mitocondriale.
Norepinefrină Receptor β H+ H+
adrenergic UCP-1 H+
AMPc
H2O
Protein kinaza A NADH FADH
+ 2
H
1/2O2+2H+
ATP Sintaza
Acizi grasi
Trigliceride
Fig.10.16. Frigul stimulează via noradrenalină eliberarea acizilor graşi liberi care
activează proteina de decuplare, conductoare de protoni, UCP-1.
Acizii graşi liberi produşi prin lipoliză activează UCP-1 pentru transportul
protonilor în matrix. Se presupune că stimularea transportului de protoni de către acizii
graşi este determinată de eliberarea protonilor de către grupările carboxil. UCP-1 face
parte din familia transportorilor mitocondriali având structură asemănătoare cu
translocaza nucleotidelor cu adenină cu deosebirea că prezintă un canal specific pentru
transportul protonilor în matrix. Frigul cronic stimulează via norepinefrină transcrierea
genei UCP-1 stimulând biogeneza mitocondrială şi eventual hiperplazia ţesutului adipos
brun. La animalele care nu hibernează, la naştere, se găsesc depozite discrete de ţesut
adipos brun care se răresc la dezvoltarea ulterioară.
222
Recent s-au descoperit alte patru proteine de decuplare UCP-2, UCP-3, UCP-4 şi
UCP-5 cu secvenţă aminoacidică similară cu UCP-1, în alte ţesuturi decât ţesutul adipos
brun. Prezenţa acestor proteine în ţesuturi cum ar fi muşchiul scheletic pare să aibă rol în
reglarea consumului de energie şi probabil în obezitate.
Mitocondriile din ţesutul adipos brun au foarte puţine complexe ATP-sintazice
sau nu au deloc. Energia mobilizată din lanţul respirator este folosită în special pentru
producere de căldură.
10.Controlul respirator
Organismele vii produc energie şi deci sintetizează ATP în funcţie de necesităţile
de consum din fiecare moment. Fosforilarea oxidativă cuplată cu lanţul respirator,
constituind etapa finală a degradării glucidelor, lipidelor şi proteinelor, controlul
respirator se poate exercita prin:
–intermediari ai degradării celor trei clase de compuşi;
–compuşi şi factori implicaţi direct în lanţul respirator şi fosforilarea oxidativă
(complexe enzimatice, coenzime reduse, ATP, ADP, O2, Pi, etc.).
S-a constatat că, dintre aceştia, rolul principal îl are ADP-ul.
Deoarece ADP-ul se cuplează cu Pi pentru a forma ATP, controlul respirator
se mai numeşte şi “control prin acceptor de fosfat”.
Controlul respirator se exercită prin forţa proton motrice:
Când respiraţia are loc, translocarea H+ din matrix va determina creşterea ∆pH şi
∆Φ ducând la creşterea forţei proton motrice. Fosforilarea ADP la ATP se produce numai
când energia disponibilizată din translocarea protonilor prin F0, înapoi în matrix, va
depăşi ca valoare energia necesară sintezei ATP prin F1.
Când ADP se fosforilează, raportul ATP/ADP creşte, ∆G `ATP creşte şi
fosforilarea oxidativă începe să scadă, eventual se opreşte. L.R. translocă protonii contra
forţei proton-motrice; aceasta, nemaifiind disipată prin acţiunea ATP-sintazei, va creşte
∆µ + spre valorile ei maxime; în aceste condiţii respiraţia diminuă sau se opreşte.
Η
Utilizarea ATP-ului în procese endergonice celulare va creşte concentraţia ADP-
ului, deci va descreşte energia necesară F.O. Reluarea F.O. va micşora forţa proton-
motrice, iar respiraţia va fi stimulată
Viteza de funcţionare a lanţului respirator depinde de concentraţia acceptorului de
fosfat, adică de concentraţia ADP-ului, rol justificat de următoarele fapte:
–ADP este modulator alosteric pentru multe enzime cu rol reglator care
controlează diversele etape ale degradării glucidelor, lipidelor şi proteinelor;
–intensitatea fluxului de protoni prin componenta F0 a ATP sintazei este
determinată de nivelul ADP;
–factorul de cuplare din ATP sintază, present în cantităţi limitate în membrane
internă mitocondrială, rămâne “blocat” în forma energizată în lipsa ADP.
În concluzie, consumul celular de ATP controlează activitatea lanţului respirator.
Scăderea vitezei F.O. va micşora viteza L.R. şi invers. Viteza L.R. va afecta raportul de
concentraţii NADH/NAD+ sau FADH2/FAD, care vor influenţa vitezele ciclului Krebs, β-
oxidării acizilor graşi sau altor procese mitocondriale.
223
10.7.2. Alte modalităţi de utilizare celulară a oxigenului
În multe ţesuturi, circa 15% din consumul total de oxigen nu utilizează L.R.
mitocondrial.
Multe dintre reacţiile în care se consumă O2 au loc în formaţiuni intracelulare
numite peroxizomi, unde enzime, adesea flavoproteine, reduc direct O2 la H2O2 în
timpul oxidării unor substrate ca: acil-CoA, etanol, xantină. H2O2 produsă poate fi
descompusă de catalază sau poate fi utilizată la oxidarea altor substrate, ca metanol sau
etanol.
În mitocondrii sau reticulul endoplasmic există diferite enzime, clasificate ca
oxidaze sau oxigenaze, care utilizează O2 direct.
Oxidazele nu încorporează O2 în substratul pe care îl oxidează, ci reduc oxigenul
la apă (ca în cazul citocrom c-oxidazei) sau la H2O2 (ca în cazul monoaminoxidazelor ,
MAO, sau a aminoacidoxidazelor). Toate oxidazele au grupări prostetice ce vehiculează
electroni: flavine sau ioni de cupru.
Oxigenazele sunt enzime care încorporează oxigen în substrat. Ele pot fi:
–dioxigenaze, care includ toată molecula de O2 în substrat (ex. sinteza retinalului
prin oxidarea β−carotenului, în intestin) :
− CH = CH − + O2
→ − CH = O + - CH = O
unde R-H este substratul care se hidroxilează, reprezentat de: compuşi sintetizaţi
endogen (cholesterol, hormone steroizi, acizi graşi) sau compuşi exogeni (medicamente,
aditivi alimentari, componenţi ai fumului de ţigară, pesticide şi alte substanţe chimice
care intră în organism prin inhalare absorbţie prin piele sau ingestie alimentară) iar XH2
coreducător, donator de hidrogen, care poate fi:
–NADPH (implicat în biosinteza steroizilor, transformările vitaminei D,
metabolizarea xenobioticelor şi a unor medicamente);
–ascorbat (implicat în sinteza noradrenalinei din dopamină, hidroxilările prolinei
sau lizinei, la biosinteza colagenului);
–tetrahidrobiopterina (sinteza DOPA şi a tirozinei);
–NADH (desaturarea acizilor graşi);
R R H R H
H3 C N N O H3 C N N O H3 C N N O
- +
C e +H C e-+H+ C
NH . NH NH
H3 C N C H3 C N C H3 C N C
O H O
O
FAD sau FMN FADH2 sau FMNH2
(forma oxidată) FAD sau FMN
(semichinonă) (forma redusă)
Citocrom P-450
A
dr
FAD en
Fe, S od SH + O2
ox
in S-OH + H2O
a
Matrix Fe, S
Au fost identificate 3 gene specifice pentru cele 3 izoenzime ale NOS: NOS-I (de
origine neuronală), NOS-II (din macrofage sau inductibilă), NOS-III (din endoteliul
vascular). Cele trei izoenzime au structură asemănătoare dar diferă prin modul de reglare.
Mecanismul de acţiune al NOS este similar cu cel catalizat de citocromul P-450.
Atomii de oxigen încorporaţi în L-citrulină şi NO⋅ provin din oxigenul atmosferic.
Procesul de oxigenare este mediat de tetrahidrobiopterină (H4B) cofactor necesar
pentru toate reacţiile analoage cu reacţia de hidroxilare a fenilalaninei. NOS conţine un
domeniu cu rol de reductază ce conţine FAD şi FMN şi un domeniu cu rol de oxigenază
ce conţine hem şi BH4 (Fig.10.21). Transportul electronilor între cele două domenii este
controlat de calmodulină.
NADPH e-
e- e- HEM
FAD FMN Calmodulină
BH4
Reductază L-Arginină L-Citrulină + NO .
Oxigenază
227
Activitatea celor două domenii este reglată de calmodulină. NOS din macrophage
este totdeauna activă deoarece calmodulina este strâns legată de enzimă. NOS din celulele
neuronale şi endoteliale leagă slab calmodulina astfel încât enzima devine activă numai
după legarea Ca2+ la calmodulină.
Transportul electronilor se produce într-un mod asemănător cu cel din sistemul
citocromului P-450. NADPH donează electroni care vor reduce FAD iar acesta reduce
FMN. FMN reduce Fe3+ din gruparea prostetică hem la care se leagă oxigenul necesar
oxigenării substratului, L-arginină. Reacţia globală este inhibată de monoxidul de carbon
iar activitatea enzimei este dependentă de legarea calmodulinei care necesită concentraţii
mari de calciu pentru izoenzimele din celulele neuronale şi endoteliale.
Moleculele oxidate pot fi enzime (cel mai vulnerabil rest aminoacidic este
metionina care devine metionin-sulfoxid), receptori celulari, lipide membranare, ADN.
Activarea O2 poate fi realizată fie prin transformare în starea singlet 1O2 (de ex.
prin fotoactivare), fie prin reducere secvenţială (Fig.10.22).
Cea mai mare parte a oxigenului molecular consumat de către celulele
aerobe este redus tetravalent cu formare de H2O.
228
Durata de viaţă a radicalului superoxid este de numai 1µ sec. Radicalul superoxid
se poate combina cu oxidul nitric cu formarea anionului peroxinitrit din care se
formează radicalul nitro şi radicalul hidroxil care este cel mai puternic mutagen.
Prin acceptarea unui electron de către radicalul superoxid se formează anionul
peroxid, care nu este radical.
Anionul superoxid nu are o reactivitate mare dar prin reacţia de dismutare
catalizată de superoxid dismutază este transformat în peroxid de hidrogen, H2O2 :
.
O2 + O2
. + 2H+
H2O2 + O2
superoxid
dismutază
Radicalul hidroxil este forma cea mai “incriminată” în patologia radicalilor liberi
derivaţi din oxigen, deoarece are o mare reactivitate, iar organismele nu dispun de nici o
armă de apărare. Această formă apare în multe reacţii ce constituie variante ale reacţiei
Haber-Weiss:
Fe 2 +
H 2O 2 + O −2ɺ → HO ⋅ + HO − + O 2
229
10.9.1.Sursele de SRO în organism
Surse endogene de SRO, în condiţii fiziologice, sunt cele legate de implicarea
oxigenului în procese ca:
–amplificarea transportului electronic la nivelul membranei fagocitelor sub
acţiunea unor antigeni, sau în mitocondrii în prezenţa unor inductori sau
pseudosubstraturi;
–activitatea enzimatică a unor proteine (xantinoxidaza, ciclooxigenaze,
monoaminoxidaza, triptofan şi indolamin oxigenaze);
–proliferarea peroxizomală în cursul oxidării acizilor graşi cu catenă lungă
însoţită de creşterea producţiei de apă oxigenată;
–autooxidarea unor compuşi: Fe2+, hem, tioli, adrenalină;
–biosinteza hormonilor tiroidieni;
–transformarea acidului arahidonic în prostaglandine, tromboxani, lipoxine;
Surse exogene de SRO pot fi:
–unii compuşi aromatici, paracetamol, solvenţi (CCl4), nitriţi, hidrazine, SO2,
metale toxice ca aluminiul şi cadmiul din apa potabilă ;
– aditivii alimentari chimici, fumul de ţigară, gazele de eşapament;
–radiaţiile UV, razele X şi microundele.
În condiţii patologice sau de activare metabolică (inflamaţii, metabolizarea unor
xenobiotice) se adaugă alte surse de SRO, în special procesele de liză celulară cu
deversarea şi expunerea acizilor graşi polinesaturaţi (AGPN), principalul substrat al SRO.
230
Localizarea antioxidanţilor le permite să acţioneze în cupluri, completându-se
reciproc:
–în mediu hidrofil (citoplasmatic), acţionează vitamina C, glutationul;
–în mediu lipofil (membranar), acţionează vitamina E, carotenii;
–în mitocondrii: superoxid dismutaza, catalaza, vitaminele C, E, coenzima Q;
–în citoplasma celulară: superoxid dismutaza, glutationul, glutation peroxidaza;
–în sânge: albumina, bilirubina, acidul uric ceruloplasmina, vitamine, hormoni.
Sistemele de protecţie naturale sunt concentrate mai ales pe primul radical, O −2ɺ şi
pe ultimul (peroxizii), lăsând astfel descoperit radicalul hidroxil, HO•. Pentru a mări
eficienţa, pentru aceiaşi specie reactivă de oxigen acţionează antioxidanţi enzimatici şi
neenzimatici, localizaţi în medii diferite (membrane, citoplasmă, lichide extracelulare).
Catalază
+ e- . H2O
O2 O2 H 2O 2
Glutation
Superoxid peroxidză
dismutază
G-S-S-G
2 G-SH
NADPH + H+
Glutation
reductază
NADP+
2 G-SH
Fig. 10.23 Sistemul enzimatic de apărare împotriva speciilor reactive ale oxigenului.
(SOD mitocondrială transformă radicalul superoxid în H2O2. Apa oxigenată este descompusă în
mitocondrie de către glutation peroxidază sau difuzează în citosol şi este descompusă în
peroxizomi de către catalază).
Fagocitoza este procesul cel mai important al imunităţii de tip celular, care constă
în recunoaşterea, includerea în interiorul celulei şi distrugerea agentului patogen de
către diverse tipuri de celule albe (neutrofile, macrofage, monocite), Fig.10.24.
La interacţia agenţilor patogeni cu componente din plasmă, se eliberează în sânge
factori chemotactici: peptide, endotoxine, leucotriene, etc., care interacţionează cu
receptorii leucocitelor polimorfonucleare declanşând sistemul activator al fagocitozei
(explozia respiratorie) caracterizată prin trei trăsături esenţiale:
231
–creşterea consumului de oxigen în scopul producerii premeditate de forme
reactive ale oxigenului: H2O2, ClO − , HO⋅ , oxigen singlet O1 , anion superoxid O −ɺ
2
2
(produs al unei NADPH-oxidaze membranare, leucocitare);
–stimularea degradării oxidative a glucozei pe calea pentozo fosfaţilor, cale
producătoare de NADPH;
–activarea sistemelor producătoare de specii reactive ale oxigenului: NADPH-
oxidaza, superoxid dismutaza, mieloperoxidaza.
FAGOZOM
BACTERIA
HO. ClO-
-
HO O21 H2O
MP
. H+
2O
SOD
H2O2 Cl-
. SOD H2O
2O H2O2 GPx
+
H
O2 2O2
2 G-SH G-S-S-G
NADPH-oxidaza
GR
NADP+NADPH
+ NADP+ NADP+ NADPH
R
Calea pentozelor
+
MEMBRANA PLASMATICĂ
Superoxid dismutază
2O −2ɺ + 2H + → H 2 O 2 + O 2
232
Prin reacţia Haber-Weiss se formează HO⋅ , formă puternic reactivă a oxigenului:
Fe 2 +
H 2 O 2 + Oɺ-2 → HO⋅ + HO - + O 2
233
Citosol Membrana externă Membrana internă
Glicerol-3-fosfat Glicerol-3-fosfat
dehidrogenaza dehidrogenaza
FADH2
NADH + H+ Dihidroxiaceton Dihidroxiaceton
fosfat fosfat
LR
NAD+ Malat
1
Malat
NAD+
Transaminare Transaminare
H+ H+
234
11. HIDRAŢI DE CARBON, FUNCŢII ŞI STRUCTURI
11.1.Roluri şi clasificare
11.2. Monozaharide
11.2.1. Clasificare
1.După natura funcţiei carbonilice:
Aldoze, monzaharide care conţin o grupare aldehidică: (-CH=O).
Cetoze, monozaharide care conţin o grupare cetonică: ( >C=O).
235
2.După numărul atomilor de carbon din molecula monozaharidelor:
Trioze, monozaharide cu trei atomi de carbon.
Tetroze, monozaharide cu patru atomi de carbon.
Pentoze, monozaharide cu cinci atomi de carbon.
Hexoze, monozaharide cu şase atomi de carbon.
11.2.2. Nomenclatura
Pentru desemnarea compusului se combină nomenclatura dată de numărul
atomilor de carbon cu a grupărilor carbonilice. De exemplu, glucoza este o aldohexoză
(monozaharid cu 6 atomi de carbon –hexoza, care conţine o grupare aldehidică –aldo).
Atomii de carbon din grupările carbonilice (aldehidice sau cetonice) au cel mai mic indice
numeric: C1 în aldoză şi C2 în cetoză.
1 1
HC O H2C OH
2
H C OH 2 C O
3 3
H C OH H C OH
11.4. Structuri
236
HC O HC O
HO C H H C OH
H2C OH H2C OH
L (-) D (+)
Seriile sterice D şi L
Această încadrare a compuşilor optic activi în seriile D şi L este destinată unei
mai bune clasificări şi nomenclaturi a substanţelor. Toate monozaharidele, care au atomul
de carbon asimetric, cel mai depărtat de gruparea carbonil, cu aceeaşi configuraţie ca şi
atomul de carbon asimetric din D glicerin aldehidă aparţin seriei D. Toate
monozaharidele, care au atomul de carbon asimetric, cel mai depărtat de gruparea
carbonil, cu aceeaşi configuraţie ca şi atomul de carbon asimetric din L glicerin aldehida
aparţin seriei L. In Fig. 11.1 şi 11.2 sunt redate structurile stereoizomerilor cetozelor şi
aldozelor aparţinând seriilor D.
H2C OH
C O
H 2 C OH
Dihidroxiacetonă
H2C OH
C O
H C OH
H2 C OH
D-eritruloză
H2C OH H2C OH
C O C O
H C OH HO C H
H C OH H C OH
H2C OH H2C OH
D-ribuloză D-xiluloză
237
HC O
H C OH
H2C OH
D-gliceraldehidă
HC O HC O
H C OH HO C H
H C OH H C OH
H2C OH H2C OH
D-eritroză D-treoză
HC O HC O HC O HC O
H C OH HO C H H C OH HO C H
H C OH H C OH HO C H HO C H
H C OH H C OH H C OH H C OH
HC O HC O HC O HC O HC O HC O HC O HC O
H C OH HO C H H C OH HO C H H C OH HO C H H C OH HO C H
H C OH H C OH HO C H HO C H H C OH H C OH HO C H HO C H
H C OH H C OH H C OH H C OH HO C H HO C H HO C H HO C H
H C OH H C OH H C OH H C OH H C OH H C OH H C OH H C OH
11.4.2. Forme ciclice. Sunt mult mai răspândite atât în soluţie cât şi în stare
solidă decât formele liniare.
238
HC O HC O HC OH HC OH
H C OH H C OH H C OH H C OH
O
O
HO C H HO C H HO C H sau HO C H
sau
H C OH H C OH H C H C OH
H C OH H C OH H C OH H C
H2C OH H2C OH H2C OH H2C OH
D-Glucoză D-Glucofuranoză D-Glucopiranoză
H2 C OH H2 C OH
H2C OH H2C OH
HO C HO C
C O C O
HO C H HO C H
HO C H HO C H O O
sau sau
H C OH H C OH
H C OH H C OH
H C H C OH
H C OH H C OH
H2C OH H2C
H2C OH H2C OH
D-Fructoză D-Fructofuranoză D-Fructopiranoză
O
-piranozice, din cinci atomi de carbon si unul
de oxigen, al căror nume derivă de la piran.
Piran
O
-furanozice, din patru atomi de carbon si un atom
de oxigen, al căror nume derivă de la furan.
Furan
Carbonul anomeric
Prin ciclizarea unui monozaharid pot apare doi stereoizomeri ciclici care diferă
între ei doar prin configuraţia noului carbon asimetric, numiţi anomeri (α
α şi β).
–anomerul α; are –OH glicozidic aşezat de aceeaşi parte a catenei de atomi de
carbon cu oxigenul din ciclu;
–anomerul β; are –OH glicozidic aşezat invers poziţiei oxigenului din ciclu.
239
H C OH HO C H
H C OH H C OH
O O
HO C H HO C H
Anomer α Αnomer β
HC O HC O H C OH
H C OH H C OH H C OH O HOH2 C
O
H C OH H C OH H C OH
OH
H C OH HO CH2 C H HO CH2 C H
OH OH
H2C OH OH
240
D(+)–xiloza intră în constituţia proteoglicanilor. Este mult răspândită în natură în
formă de xilan, un polizaharid ce însoţeşte celuloza în lemn.
HC O
H C OH
HOH2 C H
O
HO C H
OH H
H C OH H OH
H2C OH H OH
D-Xiloza α-D Xilofuranoză
C O C O
H C OH H C OH
HO C H H C OH
H2C OH H2C OH
L-Xiluloza D-Ribuloza
4.Hexoze
Aldohexoze
D(+)-glucoza naturală sau dextroza, se află în stare liberă în fructe şi flori. Este
principalul zahăr din sânge. Combinată cu ea însăşi se găseşte în maltoză, amidon,
glicogen şi cu alte monozaharide în lactoză şi zaharoză. Este materie primă pentru
formarea depozitelor de glicogen hepatic sau muscular. Furnizează atomi de carbon şi
hidrogen pentru diferite sinteze care au loc în organism. Este absentă în condiţii normale
în urină.
D(+)-galactoza nu se găseşte liberă decât foarte rar. Este constituent al
dizaharidului lactoză. Se sintetizează în glanda mamară din glucoză. Intră în constituţia
glicolipidelor, glicoproteinelor şi a glicozamino-glicanilor.
HC O
H C OH
HO C H
CH2OH
HO C H HO O OH
H
OH H
H C OH
H H
H2C OH H OH
D-Galactoza β-D Galactopiranoză
HO C H
HO C H
CH2OH
H C OH H O H
H
OH OH
H C OH
HO OH
H2C OH H H
D-Manoza α-D Manopiranoză
Cetohexoza D(-)-fructoza sau levuloza este cel mai dulce monozaharid. Este
constituent al dizaharidului numit zaharoză. Amestecul echimolecular de D-fructoză şi D-
glucoză formează mierea. Se află în urme în sânge. Este abundentă în lichidul seminal
care mai conţine şi aminoacizi şi vitamina C.
H2C OH
C O
HO C H
HOH2 C OH
H C OH O
H HO
H C OH
H CH2 OH
H2C OH OHH
D-Fructoză β-D Fructofuranoză
H C OH HO C H
HO C H H C OH
HO C H H C OH
H C OH HO C H
H2C OH H2C OH
D-Galactoză L-Galactoză
242
b.Diastereoizomeri. Au proprietăţi fizico-chimice diferite, denumiri diferite.
Rotesc planul luminii polarizate cu unghiuri diferite. Diferă prin configuraţie la cel puţin
un carbon asimetric şi cel mult (n-1) din carbonii asimetrici conţinuţi. Fiecare enantiomer
dintr-o pereche este diastereoizomer cu toţi stereoizomerii celorlalte perechi de
enantiomeri.
c.Epimeri. Sunt monozaharide care diferă prin configuraţia unui singur atom de
carbon asimetric conţinut. Este un caz particular de diastereoizomerie. (Ex: -D-manoza
este epimer la C2 al D-glucozei și D-galactoza este epimer la C4 al D-glucozei).
În mediu bazic, are loc o izomerizare prin stabilirea unui echilibru între aldoze,
cetoze şi diastereoizomeri ai lor.
HC O HC O HC O
H C OH H C OH HO C H
HO C H HO- HO C H HO- HO C H
HO C H H C OH H C OH
H C OH H C OH H C OH
H2C OH H2C OH H2C OH
D-Galactoză D-Glucoză D-Manoză
C OH
H
CH2 H2N O COOH
R
O H H
H C OH
H OH
H2N C H OH H
Acid β-neuraminic
C H
H C OH
H C OH R
H2C OH
H
H3C-OC-HN O COOH
R
H H
H OH
OH H
Acid N-Acetil-Neuraminic
(NANA)
HC O COOH
H C OH H C OH
HO C H HO C H
+ [O]
H C OH H C OH
H C OH H C OH
H2C OH H2C OH
D-Glucoza Acid D-gluconic
245
2.Acizi uronici, formaţi prin oxidarea energică a grupării hidroxil de la atomul de
carbon primar din aldoze, la gruparea carboxil. Din D-glucoza se formează acid D-
glucuronic, component al proteoglicanilor. Acidul D-glucuronic este implicat în
metabolismul bilirubinei. Epimerul la C5 al acidului glucuronic este acidul L-iduronic,
care intră în constituţia glicoz-aminoglicanilor.
CH=O CH=O
H C OH H C OH
HO C H COOH HO C H H
O H O H
H C OH H H C OH H COOH
H
H OH H
OH
H C OH HO OH HO C H HO OH
H OH H OH
COOH COOH
Acid D-Glucuronic Acid α-D-Glucuronic Acid L-Iduronic Acid β-L-Iduronic
H C OH H C OH C O HO C H HO C H
HO C H HO C H + 2H HO C H HO C H + 2H HO C H
+ 2H
+ 2H
H C OH H C OH H C OH H C OH H C OH
H C OH H C OH H C OH H C OH H C OH
11.6.1. Legături N-glicozidice (αα sau β). Un monozaharid poate reacţiona prin
gruparea –OH glicozidică cu gruparea –NH2 din: amine, baze azotate, aminoacizi (ex. cu
gruparea -NH2 din radicalul amino-acidului asparagina) formând un N-glicozid.
246
CH2-OH CH2-OH
O O Legătura N-glicozidică
OH + H2N-R
OH
HO OH Amină HO
OH NH-R
OH
α-D-Glucopiranoza
N NH
N
N N N O
HO CH2 HO CH2
O Legătură O Legătură
N-glicozidică N-glicozidică
OH OH OH OH
Adenozină Uridină
247
fenomenul de mutarotaţie, gruparea –OH glicozidică liberă, putând avea configuraţia
α sau β.
Maltoza. Două glucopiranoze se leagă între ele prin legatură α (1→ →4)
glucozidică.
CH2-OH CH2-OH
O O
OH OH (H, OH)
HO O
OH OH
α-D (+)-Glucopiranozil (1 4) D-Glucopiranoză
Maltoza
HO O
HO
CH2
O
OH (H, OH)
HO
Izomaltoza OH
248
b.Dizaharide nereducătoare. Ozele componente se leagă O-glicozidic prin
eliminarea de H2O între grupările –OH glicozidice ale celor două monozaharide. Nu
prezintă mutarotaţie.
Zaharoza (sucroza). α–D-glucopiranoza se leagă de β-D-fructofuranoză prin
legătura diglicozidică (1→2) între atomii de carbon anomerici.
CH2-OH 1
O HOH2C
H
O
1 2 5
OH H HO
HO O CH2 OH
OH HO H
HO O O O O
OH OH OH OH
CH2 -OH CH2 CH2 -OH
CH2 -OH CH2 -OH
O O O O O
1
4 OH OH OH OH OH
O O O O
OH OH OH OH
OH OH
Amilopectina
249
b.Heteroglicanii sunt produşi de condensare a mai multor tipuri de unităţi
structurale. Cei mai răspândiţi heteroglicani sunt proteoglicanii şi poliozidele
bacteriene.
11.8.1. Structura
GAG conţin o unitate dizaharidică repetitivă formată din:
-aminozaharuri: -D-glucozamina;
-D-galactozamina.
-acizi uronici: -acid D-glucuronic;
-acid L-iduronic.
Acid uronic
Hexozamină
11.8.3.Tipuri de GAG
1.Acidul hialuronic:
Este întâlnit în ţesuturi embrionare, lichid sinovial, cordon ombilical, corp vitros,
tendoane, piele. Este prezent în substanţa fundamentală a tuturor ţesuturilor conjunctive.
Unitatea dizaharidică este formată din:
–acid β-D-glucuronic şi
250
–N-acetil glucozamina.
- -
COO CH2 -OH COO
O O O
O O
OH OH
O
H HO H
OH NH OH
C O
n
legătura β−1,3-glucuronidică CH3 legătura β−1,4-hexozaminidică
Caracteristici:
Este singurul polimer liniar nesulfatat care nu formează legături covalente cu
molecule proteice;
Este un polianion la pH fiziologic, care poate lega cationi, sarcinile negative
fiind repartizate uniform în lungul moleculei (10 Å distantă între ele).
Molecula este hidrofilă, soluţiile chiar diluate, au vâscozităţi foarte mari.
Este hidrolizat de hialuronidază, enzimă cu o afinitate pentru legăturile β (1→4)
glucozaminidice. Hialuronidaza se găseşte în ţesuturile animale precum şi în toxinele
unor insecte, şerpi.
Structura sa reticulată, determină ocuparea unui volum foarte mare şi înlesneşte
anumite migrări – celulare sau subcelulare – în cursul morfogenezei şi în perioadele de
vindecare a rănilor.
251
–N-acetil-D-galactozamina-4-sulfatată.
Dermatan sulfatul este un stereoizomer al condroitin 4-sulfatului. Acidul L-
iduronic se formează prin epimerizarea la C5 a acidului glucuronic, procesul fiind funcţie
de gradul de sulfatare. Sulfatarea fiind incompletă dermatan-sulfatul conţine atât acid
glucuronic cât şi iduronic.
252
11.8.4.Proteoglicanii sunt substanţe care conţin în moleculă un glicozaminoglican legat
covalent de o proteină numită proteină miez (core proteins). Conţin 95% glicozamino-
glicani si 5% proteine.
Au fost identificate mai multe tipuri de proteoglicani agregaţi: extracelulari
(AGRECAN-cartilaje, VERSICAN-pereţii vaselor, NEUROCAN, BREVICAN-ţesutul
nervos, DECORINĂ, LUMICAN-cornee, BIGLICAN, PERLECAN-membranele
bazale), membranari (CEREBROGLICAN,GLIPICAN, SYNDECAN,BETAGLICAN),
intracelulari (SERGLICINA-granulele de secreţie din mastocite, eozinofile, bazofile,
neutrofile, trombocite, macrofage tisulare, monocite).
1.Legăturile între glicozaminoglicani (GAG) şi proteinele miez sunt de 2
tipuri:
–Legături O-glicozidice
–Legături N-glicozidice
In keratansulfat apare legătura O-glicozidică şi N-glicozidică.
Pentru heparină, condroitin sulfaţi, heparansulfat, şi dermatan sulfat legatura O-
glicozidică se face între xiloza (componentă a unei unităţi trizaharidice –Xyl-Gal-Gal-
care face legătura între GAG şi proteină) şi serină din proteină.
GAG
Proteină
sulfat
serina
sau O Xyl Gal Gal Acid uronic N-Ac hexozamină
treonina n
legături O-glicozidice
2.Caracteristici generale:
Proteoglicanii se asociază între ei şi cu proteinele componente ale matrixului: cu
colagenul, elastina precum şi cu proteinele de adeziune din matrix: fibronectina şi
laminina.
Proteoglicanii formează cu acidul hialuronic, agregate de proteoglicani
(Fig.11.3). Pe o moleculă de acid hialuronic se asociază ionic, prin capătul amino
terminal al proteinei miez din moleculă, mai mulţi monomeri de proteoglicani. O
proteină de legatură, „link protein“, se leagă hidrofob la acidul hialuronic şi la proteina
miez din proteoglican.
Proteoglicanii din cauza formării agregatelor moleculare mari, pot acţiona ca site,
care permit difuzia în spaţiul extracelular doar a moleculelor mici nu şi a celor mari.
Partea polizaharidică a proteoglicanilor care este un polianion, leagă cationii Na+
+
şi K . Osmotic este atrasă apă în matrixul extracelular, asigurând astfel turgescenta
ţesuturilor.
Proteoglicani
condroitinsulfat
cheratansulfat
acid
proteine hialuronic
de
legătură
proteina miez
11.9. Glicoproteinele
H
NH
N-Acetil-Galactozamină legătura O-glicozidică
COCH3
254
Biosinteza glicoproteinelor presupune următoarele etape:
-formarea unui oligozaharid precursor şi transferul acestuia pe proteina
acceptoare la nivelul reticulului endoplasmic;
-prelucrarea oligozaharidului precursor din molecula glicoproteinelor, la nivelul
complexului Golgi, cu formarea glicoproteinelor „mature”, conţinând un fragment
oligozaharidic specific.
Funcţiile glicoproteinelor
Glicoproteinele se întâlnesc la toate formele de viaţă şi sunt ubicuitar
distribuite; sunt componenţi structurali ai membranelor celulare sau ai matrixului
celular;
În general, activitatea biologică a glicoproteinelor este realizată de partea
proteică în timp ca partea glucidică are rol în modularea funcţiei glicoproteinelor ca şi în
stabilirea destinaţiei şi duratei de existenţă a acestora.
Au rol de lubrefianţi (ex: sunt componenti ai mucusurilor);
Intervin în comunicarea intercelulară, celulă-virus, celulă-bacterie, celulă-celulă
(fibronectina are un rol important în procesul de adeziune celulară având implicaţii în
transformarea neoplazică a ţesuturilor);
Au rol de hormoni (ex: gonadotropinele, tireotropina);
Au rol în apărarea organismului (ex: imunoglobulinele, interferonul, factorii
sistemului complement);
Au rol în coagularea sângelui (fibrinogenul, trombina);
Sunt transportori ai unor compuşi endo sau exogeni: feritina, ceruloplasmina,
factorul intrinsec, proteinele de transport ale unor hormoni, haptoglobina (proteină de
fază acută care complexează hemoglobina extracorpusculară din sânge împiedicând
filtrarea glomerulară renală a acesteia şi pătrunderea în tubii renali unde hemoglobina are
tendinţa să precipite) .
Colagenul şi elastina au rol structural important în constituirea matrixului celular.
Glicoforinele, proteine integrale, prezente în glicocalixul eritrocitar (reprezintă
aproximativ 10% din totalul proteinelor membranare), au rol în controlul schimbului
ionic transmembranar.
Acid sialic Acid sialic
Principalele glucide cu valoare nutritivă din alimente se află sub formă de mono-,
di- sau polizaharide:
–polizaharide: amidon (polizaharid vegetal din cereale, cartofi), glicogen şi
celuloză (lipsită de valoare nutritivă deoarece nu poate fi hidrolizată în tractul digestiv al
omului);
–dizaharide: zaharoză (din fructe), maltoză, lactoză (din lapte);
–monozaharide: glucoză, fructoză, galactoză, arabinoză, etc.
Deoarece singura formă absorbabilă este cea de monozaharid, dizaharidele şi
polizaharidele trebuie mai întâi hidrolizate, în tubul digestiv uman, la monozaharidele
componente.
12.1.1.Digestia glucidelor
Digestia glucidelor reprezintă procesul hidrolitic prin care glucidele ingerate sunt
transformate în monozaharide, apte pentru absorbţie. Procesul este catalizat de enzime
specifice, cu localizări specifice, numite glicozidaze.
1.Digestia amidonului, prezent în cantitate mare în dietă, începe în cavitatea
bucală şi continuă în duoden prin acţiunea succesivă a două endoglicozidaze:
–amilaza salivară, produsă de glandele parotide, activă la pH = 6,6 - 6,8 în
prezenţa ionilor de clor;
–amilaza pancreatică, deversată în duoden cu sucul pancreatic, cu pH optim de
acţiune 7,1.
Ambele enzime îşi încep acţiunea de la periferie către centru, desfăcând hidrolitic
exclusiv legături α−1,4-glucozidice din interiorul moleculei de amidon; ele nu
hidrolizează legături α−1,4-sau α−1,6-glucozidice ale resturilor de glucoză aflate la
punctele de ramificare ale moleculei.
Produşii de hidroliză parţială obţinuţi sub acţiunea amilazei salivare şi
pancreatice sunt:
–maltoza şi izomaltoza;
–maltotrioza şi malto-oligozaharide lineare cu 4-6 unităţi de glucoză, legate α-
1,4;
–dextrine limită (oligozaharide cu cel puţin o legătură α−1,6-glucozidică şi cu 5-
8 resturi de glucoză)
2.Digestia oligozaharidelor se realizează prin detaşarea hidrolitică a resturilor
monozaharidice de la capetele nereducătoare al oligozaharidelor din lumenul intestinal şi
necesită exoglicozidaze, asociate “marginii în perie” a celulelor epiteliale ale duodenului
şi jejunului.
Izomaltaza (oligo-1,6-glucozidaza) hidrolizează legăturile α-1,6-glucozidice din
izomaltoză şi din dextrine limită.
Glucoamilaza (exo-1,4-glucozidaza) şi alte maltaze hidrolizează legături α-1,4
din maltotrioză şi din malto-oligozaharide de la capetele nereducătoare ale
oligozaharidelor.
256
Digestia dizaharidelor, provenite direct din alimentaţie sau prin hidroliza
enzimatică a amidonului, se realizează în intestinul subţire sub acţiunea dizaharidazelor,
enzime ce manifestă specificitate pentru natura dizaharidului şi a legăturii glucozidice.
Astfel, maltoza este hidrolizată de maltază (α α-glucozidază), lactoza de lactază (β β-
galactozidază), zaharoza de zaharază (α α-glucozidază sau β-fructozidază). Toate aceste
enzime sunt concentrate la nivelul jejunului şi sunt sintetizate de către enterocite. Ele nu
acţionează în lumenul intestinal ci la nivelul marginii în perie a enterocitului, în
vecinătatea sistemului de transport al monozaharidelor rezultate. De remarcat că
membrana plasmatică a celulelor epiteliale intestinale (suprafaţa apicală) are o structură
microvilară, ceea ce măreşte substanţial suprafaţa activă în procesul de digestie şi
absorbţie a zaharurilor.
Compuşii glucidici fără valoare nutritivă ingeraţi (celuloza, pectine) vor fi
eliminaţi, deoarece nu există în intestinul omului enzime capabile să-i digere.
12.1.2.Absorbţia monozaharidelor
Absorbţia monozaharidelor (glucoză, galactoză, fructoză, manoză, pentoze) se
realizează prin sistemul port hepatic şi implică două mecanisme posibile:
–transportul activ (energodependent), de obicei unidirecţional, contra
gradientului de concentraţie;
–difuzia facilitată care poate fi bidirecţională.
Ambele mecanisme necesită sisteme proteice de transport, localizate în
membrana luminală a enterocitelor caracterizate prin: stereospecificitate de substrat,
saturabilitate, inhibiţie specifică prin diverşi compuşi.
S-a evidenţiat prezenţa unui transportor proteic (I) pentru glucoză, galactoză,
xiloză (monozaharide cu aceeaşi configuraţie la C2) şi a unui transportor proteic (II)
pentru fructoză şi alte monozaharide (Fig.12.1).
Transportorul proteic I realizează transportul simultan (simport) al Na+ şi al
ozei potrivite din lumen în celula epitelială intestinală. Legarea Na+ determină creşterea
afinităţii transportorului pentru monozaharid. Na+ pătruns în celula epitelială intestinală
prin membrana apicală (absorbtivă), este eliberat odată cu glucoza realizându-se
transportul glucozei împotriva gradientului de concentraţie.
Proteina transportoare I este cuplată cu „pompa de sodiu” (Na+-K+-ATP-aza de
transport), o enzimă localizată în membrana celulară, care pompează Na+ în afara celulei,
contra gradientului de concentraţie, în schimbul ionilor de K+, energia necesară
procesului fiind eliberată prin hidroliza ATP. Activitatea acestei enzime, situată în
membrana bazală, permite menţinerea gradientului de concentraţie a Na+ şi deci
reâncărcarea transportorului cu glucoză.
Glucoza acumulată în enterocit iese din celulă prin difuziune facilitată, mediată
de un transportor proteic prezent în membrana bazală, fără consum de energie.
Transportorul proteic II facilitează difuzia fructozei, galactozei şi glucozei în
enterocit, prin membrana luminală, fără să fie necesară prezenţa Na+ şi ATP.
Transportorul proteic prezent în membrana bazală, mediază ieşirea ozelor din
celulele epiteliale în capilarele sanguine.
Transportorul proteic II
independent de Na+
Marginea în perie
Sinteză proteoglicani
Calea Acizi uronici
UDP-Glucuronatului
Detoxifierea unor compusi
endogeni sau exogeni
Sinteză de glicogen
Calea de metabolizare pe care o parcurge glucoza este decisă de starea
metabolică a ţesutului respectiv.
În faza anabolică, caracterizată prin abundenţă de substrate energogene, rezultat
al absorbţiei postprandiale, glucoza va fi transformată în piruvat şi apoi oxidată în ciclul
Krebs în vederea asigurării resurselor energetice ale organismului. În această fază glucoza
este folosită drept combustibil energogen de către toate ţesuturile (atât glucodependente
cât şi glucoindependente).
Când posibilităţile ficatului de a stoca glucoza sub formă de glicogen au fost
depăşite (2-3 ore postprandial), glucoza este transformată în triacilgliceroli, fosfolipide şi
colesterol.
In faza catabolică (în perioade interprandiale sau în cursul unei activităţi fizice
sau intelectuale intense), glucoza reprezintă combustibilul principal numai pentru
ţesuturile glucodependente care o obţin prin glicogenoliză şi gluconeogeneză hepatică.
Sursă de energie pentru celelalte ţesuturi devin rezervele de lipide constituite în faza
anabolică şi, în extremis, proteinele.
12.3.Glicoliza
259
unui aport scăzut de oxigen. În condiţiile unei disponibilităţi de oxigen, lactatul este
transformat în piruvat.
În condiţii anaerobe, în drojdii şi alte organisme are loc fermentaţia alcoolică
prin care piruvatul este transformat în acetaldehidă şi apoi în etanol, regenerând NAD+
care permite continuarea glicolizei.
Glucoză
NAD+
Glicoliză
Lantul respirator NADH + H+
NAD+
NADH + H+
+
NADH + H Piruvat
Fermentatia alcoolică
NAD+
NADH + H+
Fermentatia
lactică NAD+
Etanol + CO2
CO2 + H2O Lactat
Fig.12.2 Soarta metabolică a piruvatului rezultat din glicoliză în condiţii aerobe şi anaerobe.
12.3.1.Rolurile glicolizei
a.Glicoliza este prima etapă în degradarea aerobă, totală, a glucozei la CO2, H2O
şi energie. Este un proces puternic exergonic (∆G0` = - 47 kcal) în care se formează
direct 2 moli de ATP şi se oferă substraturi pentru ciclul Krebs şi lanţul respirator.
În condiţiile unei cantităţi crescute de glucoză (postprandial), toate ţesuturile,
inclusiv cele insulino-dependente (ţesutul adipos, muşchiul), vor utiliza glucoza în
vederea obţinerii resurselor energetice.
Glicoliza este singura modalitate de producere de ATP în celulele fără
mitocondrii (eritrocite, fibre musculare albe)
b.Glicoliza furnizează precursori pentru diferite procese anabolice.
Glucoza existentă în cantităţi mari postprandial, este captată de ficat şi alte
ţesuturi şi transformată în lipide de rezervă, respectiv trigliceride, formă de depozitare
a energiei la care se va face apel în condiţiile în care concentraţia glucozei în sânge este
redusă. Glicoliza furnizează atât componenta glicerol a trigliceridelor cât şi acetil-CoA
necesară sintezei acizilor graşi. Glicerolul este utilizat de asemenea, de către ficat, în
vederea obţinerii fosfolipidelor, iar acetil-CoA în scopul sintezei colesterolului. Aceşti
compuşi de natură lipidică vor fi exportaţi ţesuturilor extrahepatice, cu precădere ţesutului
adipos, sub formă de lipoproteine.
Glicoliza furnizează scheletul de atomi de carbon pentru sinteza unor compuşi
biochimici:
–alanina din piruvat
–glicerol-fosfat din dihidroxiacetonfosfat
–serina din acid 3-fosfogliceric
–2,3-bisfosfoglicerat
In perioadele interprandiale glucoza reprezintă combustibilul principal numai
pentru ţesuturile glucodependente, care o obţin prin glicogenoliză şi gluconeogeneză
hepatică. Pentru celelalte ţesuturi, sursa de energie este reprezentată de rezervele de
lipide constituite în faza anabolică (postprandial), şi în extremis, proteinele.
260
12.3.2.Transportul facilitat al glucozei în celule independent de Na+.
Transportul glucozei prin membranele celulare, fără consum de energie, este
favorizat de o familie de cel puţin 14 proteine transportoare de glucoză desemnate
GLUT-1 la GLUT-14 . Aceste proteine sunt localizate în membranele celulare în două
stări conformaţionale. Ele au două situsuri de legare cu afinităţi diferite pentru glucoză,
unul pe faţa internă şi altul pe faţa externă a membranei. Când glucoza din spaţiul
extracelular se leagă de transportor conformaţia acestuia se modifică glucoza fiind
transportată de-a lungul membranei în spaţiul intracelular.
Genele care specifică transportorii de glucoză se exprimă în mod diferit, în
funcţie de ţesut. De exemplu, GLUT-1 şi GLUT-3 se află în toate celulele (cu excepţia
ficatului şi a celulelor β-din pancreas) unde favorizează difuzia, lent dar constant, a
glucozei în celule unde urmează să fie metabolizată (afinitatea lor pentru glucoză este
mare). GLUT-4 este în cantitate mare în ţesutul adipos şi muscular sinteza sa fiind indusă
de insulină. Insulina stimulează transportul glucozei în celulele insulino dependente
musculare şi adipoase prin redistribuirea GLUT-4 din citoplasmă în membrana
plasmatică. Insulina nu influenţează, semnificativ, transportul glucozei în ţesuturi insulino
independente ca: ficat, creier, eritrocite, cornee, cristalin, leucocite.
In timp ce GLUT-1, 3 şi 4 sunt implicaţi în captarea glucozei din sânge, GLUT-2
care se găseşte în ficat, rinichi, intestin şi celulele β-din pancreas şi are afinitate mică
pentru glucoză poate fie să transporte glucoza din sânge în aceste celule când
concentraţia glucozei în sânge este mare fie invers când concentraţia glucozei în sânge
este mică (de ex., în foame). Activitatea GLUT-2 depinde de concentraţia glucozei în
sânge. Glut 2 mediază creşterea captării glucozei de către celulele β din pancreas care
duce la creşterea secreţiei de insulină fiind considerat “senzor pentru glucoză”. GLUT-5
care se exprimă în intestin, rinichi, testicule, muşchi, adipos şi creier, mediază transportul
activ intestinal şi renal al glucozei şi este transportor pentru fructoză.
H C OH H C OH C O
ATP ADP
HO C H HO C H HO C H
Hexokinaza
H C OH H C OH Glucozo-6-fosfat H C OH
Mg2+ izomeraza
H C OH H C OH H C OH
261
a.Transformarea glucozei în glucozo-6-fosfat. Glucozo-6-fosfatul este aşezat la
răscrucea unor căi metabolice ca: glicoliza, gluconeogeneza, calea pentozo fosfaţilor,
glicogenogeneza şi glicogenoliza.
Metabolizarea glucozei este precedată, de fosforilare, condiţie necesară
rămânerii ei în celulă. Gruparea fosfat, puternic ionizată la pH-fiziologic, conferă
moleculei de glucozo-6-fosfat o încărcare netă negativă şi şanse minime de a străbate
membrana celulară.
Fosforilarea glucozei este o reacţie ireversibilă catalizată de kinaze, donatorul
grupării fosfat fiind molecula de ATP care reacţionează sub forma complexului Mg-ATP.
Glucoză
ATP
1
ADP
Glucozo-6-fosfat
2
Etapa hexozelor
Fructozo-6-fosfat
ATP
3
ADP
Fructozo-1,6-bisfosfat
4
Gliceraldehid-3-fosfat Dihidroxiaceton-fosfat
H3PO4
NAD+
NADH + H+ 5
1,3-Bisfosfoglicerat
ADP
6 Fosforilare la nivel de substrat
ATP
Etapa triozelor
3-Fosfoglicerat
7
2-Fosfoglicerat
8
H2O
Fosfoenolpiruvat
ADP
9 Fosforilare la nivel de substrat
ATP
Piruvat
Membrana plasmatică
Glucoza
glucokinaza
activă
Complex inactiv
Glucozo - 6 - fosfat
glucokinază - proteină
reglatoare
Piruvat
Fig.12.4 Reglarea activităţii glucokinazei prin translocarea ei între citosol şi nucleu.
Glucoza măreşte activitatea glucokinazei prin favorizarea translocării în citosol.
Fructozo-6-fosfatul inhibă glucokinaza prin stimularea translocării în nucleu. Activitatea
glucokinazei este inhibată complet prin legarea ei la proteina reglatoare din nucleu.
263
Concentraţiile mari de glucoză contracarează efectul inhibitor al fructozo-6-
fosfatului. Printr-un mecanism alosteric glucoza favorizează disocierea glucokinazei de
proteina reglatoare, promovând translocarea glucokinazei din nucleu în citosol unde îşi
exercită activitatea catalitică.
Capacitatea ficatului de a “tampona” concentraţia glucozei sanguine este
determinată de caracteristicile reglatoare ale glucokinazei:
–S0,5 pentru glucoză (~7 mM) este mare (concentraţia glucozei pentru care
activitatea glucokinazei este jumătate din viteza maximă);
–curba de saturare a glucokinazei cu glucoză este o sigmoidă;
–glucoza stimulează activarea glucokinazei prin translocarea ei din nucleu în
citosol.
La concentraţia glucozei 5 mM, activitatea glucokinazei este aproape în echilibru
cu activitatea glucozo-6-fosfatazei.
H3PO4 Glucoză ATP
glucozo-6-fosfatază glucokinaza
H2O Glucozo-6
ADP
-fosfat
Acest ciclu în gol între glucoză şi glucozo-6-fosfat, cu pierdere de ATP, combinat
cu procesul de gluconeogeneză, contribuie semnificativ, la îndeplinirea rolului ficatului,
de “tamponare” a concentraţiei glucozei sanguine. Acesta este un mecanism prin care
este împiedicată consumarea fosfatului de către ficat.
Fosforilarea glucozei urmată de defosforilare constituie un ciclu în gol care are
loc în hepatocite.
H2 C OH H2C OPO 3 H 2
C O C O
ATP ADP
HO C H HO C H
H C OH 6-fosfofructo-1-kinaza H C OH
(FFK-1)
H C OH H C OH
264
Reacţii glicolitice, etapa triozelor
a.Scindarea fructozo-1,6-bisfosfatului.
Fructozo-1,6-bisfosfatul este scindat la două trioze: gliceraldehid-3-fosfat şi
dihidroxiaceton-fosfat, într-o reacţie reversibilă catalizată de o liază, fructozo-1,6-
bisfosfat liaza sau aldolaza.
Au fost descrise mai multe aldolaze, toate fiind formate din patru subunităţi.
Aldolaza A se află în mai multe ţesuturi pe când aldolaza B se află în ficat şi rinichi.
Între esterii fosforici ai triozelor obţinute se stabileşte un echilibru, conversia
unuia în celălalt fiind catalizată de o triozofosfat izomerază.
H2C OPO3 H2
C O
HC O H2C OPO3 H 2
HO C H Aldolaza
H C OH + C O
H C OH
H2C OPO3 H 2 H2C OH
H C OH Gliceraldehidă-3-fosfat Dihidroxiaceton-fosfat
H2C OPO3 H2
Triozofosfat izomeraza
Fructozo-1,6-bisfosfat
Cum forma aldehidică este foarte reactivă, echilibrul de mai sus este deplasat în
sensul formării acesteia, în funcţie de gradul său de utilizare.
N N OH OH OPO3 H2 N O OH OPO3 H2
HC O
SH S CH CH CH2 S ~ C CH CH2
+ HC OH
Enzimă H2 C OPO3 H2 Enzimă Enzimă
265
Fosforoliza tioesterului cu formarea 1,3-bisfosfogliceratului şi eliberarea
grupării –SH a enzimei:
H H H H
CO-NH2 CO-NH2
O
O OH OPO3 H2 C ~ OPO3 H 2
N N
S ~ C CH CH2 + H3PO4 SH + HC OH
H2 C OPO3 H2
Enzimă Enzimă
Dacă în mediu este prezent arsenatul, el competiţionează cu fosfatul anorganic
în reacţia de mai sus, cu formare de 1-arseno-3-fosfoglicerat, care hidrolizează spontan la
3-fosfoglicerat cu eliberare de căldură, fără sinteză de ATP. Acesta este un exemplu al
abilităţii arsenatului de a decupla oxidarea de fosforilare.
Enzimă
Enzimă
266
d.Transformarea 3-fosfogliceratului în 2-fosfoglicerat sub acţiunea unei
mutaze specifice, fosfoglicerat mutaza, în prezenţa Mg2+:
COOH COOH
Fosfoglicerat mutaza
HC OH HC OPO 3 H 2
2+
Mg H2 C OH
H2 C OPO 3 H 2
Acid 3-fosfogliceric Acid 2-fosfogliceric
e.Transformarea 2-fosfogliceratului în piruvat are loc în două etape.
În prima etapă, o enolază, enzimă care necesită prezenţa Mg2+ sau Mn2+ şi este
susceptibilă la inhibiţia prin fluoruri, catalizează transformarea 2-fosfogliceratului la 2-
fosfoenolpiruvat:
COOH COOH
Enolază
HC OPO3 H2 C O ~ PO3H2
- H2O
H2C OH CH2
Acid 2-fosfogliceric Acid 2-fosfoenolpiruvic
În etapa a doua, piruvat kinaza catalizează transferul grupării fosforil de pe
compusul macroergic, 2-fosfoenolpiruvat, pe ADP cu formarea unei molecule de ATP. Se
formează astfel o moleculă de ATP prin fosforilare la nivelul substratului:
COOH Piruvat kinaza COOH
C O ~ PO3H2 C O
CH2 CH3
ADP ATP Acid piruvic
Acid 2-fosfoenolpiruvic
Etapa catalizată de piruvat kinază reprezintă un punct de control important al
glicolizei. Piruvat kinaza din toate ţesuturile este activată alosteric de fructozo-1,6-
bisfosfat (“feed-forward stimulare”, stimulare prin intermediar glicolitic anterior) şi este
inhibită de ATP.
Au fost identificate două izoenzime ale piruvat kinazei: L proprie ficatului şi M
proprie muşchiului. Izoenzimele de tip L sunt enzime alosterice, tetrameri, a căror
activitate este influenţată de numeroşi efectori metabolici. Piruvat kinaza hepatică este o
enzimă interconvertibilă activă în forma defosfo promovată de insulină şi inactivă în
forma fosfo, promovată de glucagon şi catecolamine. Insulina acţionează ca inductor al
piruvat kinazei, activând transcrierea genei corespunzătoare, în timp ce glucagonul
acţionează ca represor.
12.3.4.Glicoliza în eritrocite
In eritrocit, are loc o deviere a 1,3-bisfosfogliceratului din calea glicolitică
acesta putând fi convertit la 2,3-bisfosfoglicerat sub acţiunea unei mutaze specifice şi
apoi la 3-fosfoglicerat sub acţiunea aceleiaşi enzime care manifestă şi activitate
fosfatazică Fig. 12.5).
2,3-bisfosfogliceratul este modulator al legării oxigenului la hemoglobină
(stabilizează forma T a hemoglobinei deoxigenate). Acest compus, prezent în eritrocit, la
concentraţii echimoleculare cu hemoglobina, scade marcant afinitatea hemoglobinei
pentru oxigen, favorizând oxigenarea ţesuturilor.
267
In eritrocit, circa 25% din glucoza angajată în glicoliză trece prin “şuntul” 2,3-
bisfosfogliceratului, ocolind prima fosforilare la nivel de substrat din glicoliză; se reduce
astfel cantitatea totală de ATP produsă în glicoliză.
Glucoză
1,3-Bisfosfoglicerat
2,3-Bisfosfoglicerat mutază
ADP
2,3-Bisfosfoglicerat
ATP
3-Fosfoglicerat
2,3-Bisfosfoglicerat fosfatază
2-Fosfoglicerat H3PO4
Lactat
Fig.12.5. Reacţiile şuntului 2,3-bisfosfogliceratului catalizate de o enzimă bifuncţională
2,3-bisfosfoglicerat mutază/fosfatază.
12.3.5.Reglarea glicolizei
Reglarea glicolizei se realizează la nivelul enzimelor ce catalizează cele trei
reacţii ireversibile din glicoliză (Fig.12. 6)
a. Glucoză → Glucozo − 6 − fosfat
b. Fructozo − 6 − fosfat → Fructozo − 1,6 − bisfosfat
c. Fosfoenolpiruvat → Piruvat
Activitatea acestor enzime poate fi influenţată prin modificarea:
–cantităţii de enzimă, prin inducţie sau represie
–eficienţei enzimei, prin:
*control hormonal (reglare covalentă)
*control metabolic (reglare allosterică)
a.Hexokinazele sunt enzime din ţesuturile extrahepatice care catalizează
fosforilarea glucozei chiar la concentraţii mici ale acesteia în sânge (~5mM). Au afinitate
mare pentru glucoză, deci KM mic.
Hexokinazele sunt inhibate de glucozo-6-fosfat, produsul acţiunii lor.
Glucokinaza, prezentă în ficat, are afinitate mică pentru glucoză (KM mare). Are
activitate mare postprandial când concentraţia glucozei în sânge este mare şi este practic
inactivă la concentraţii mici ale glucozei în sânge.
268
Glucokinaza este indusă de concentraţia mare a insulinei
Glucokinaza nu este inhibată de glucozo-6-fosfat, produsul acţiunii ei.
Glucoză
Hexokinaza ATP Gkucokinaza Insulină
KM=0,1 mM KM=10 mM Glucagon
ADP
Glucozo-6-P
Insulină
AMP
Fructozo-2,6-P2
Fructozo-6-P
ATP ATP
Fosfofructokinaza 1 Citrat
ADP Glucagon
Fructozo-1,6-P2
Glucagon
Acetil-CoA
Acil-CoA
Alanină, ATP
Fosfoenolpiruvat
ADP Piruvat kinaza Insulina
(activă defosfo) Fructozo-1,6-P2
ATP
Piruvat
Fig.12.6. Ilustrarea etapelor reglatoare ale glicolizei.
269
Fructozo-2,6-bisfosfat + H2O Fructozo-6-fosfat + H3PO4
H3PO4
Foame 4 Glucozo-6-P
FFK-2
AMPc P Insulină
FFK-2
1 ATP
Nutritie ATP
ADP
FFK-1 ADP
2
Fructozo-1,6-P2
Fig.12.7 Rolul FFK-2 în reglarea glicolizei
Fructozo-2,6-bisfosfatul este un activator al FFK-1 (2), care transformă fructozo-6-fosfatul în
fructozo-1,6-bisfosfat. FFK-2 acţionează ca o kinază în starea de nutriţie (1) şi ca o fosfatază în
foame (4). Fosforilarea FFK-2 (3) este realizată de o protein kinază, activată prin AMPc în
perioade catabolice, iar defosforilarea (5) de către o fosfatază activată de insulină.
270
energetice alternative glucozei (acizi graşi sau corpi cetonici), precum şi de scăderea
pH-ului (creşterea concentraţiei H+).
Glucoză
2 ATP
2 ADP
2 Trioze-P
2 NAD+
2 NADH + H+
4 ADP
4 ATP
2 Piruvat 2 Lactat
Beneficiul net: 4-2 = 2 ATP/mol glucoză degradată la lactat.
271
–în condiţii aerobe, piruvatul este oxidat complet, via ciclul Krebs, la CO2 şi
H2O.
–în condiţii anaerobe, este redus la lactat în scopul reoxidării NADH produs în
glicoliză.
– prin carboxilare cu consum de ATP este transformat în oxaloacetat iar prin
transaminare în alanină (Fig. 12.8).
Glucoză
NADH + H+
NAD+
Transaminare
Alanină Piruvat Lactat
Piridoxal fosfat Lactat
dehidrogenaza
ATP
Piruvat CO2 CO2
Piruvat
carboxilaza Biotină NAD+ dehidrogenaza
NADH + H+
ADP + P
Oxaloacetat Ciclul
Acetil -CoA CO2+H2O
Krebs
Fig.12.8 Reprezentarea schematică a căilor de transformare a piruvatului
S S SH SH
- -
(CH2)4 COO (CH2) 4 COO
Lipoat Dihidrolipoat
O
Piruvat
H NAD+ NADH + H+
+ S
R1 N Piruvatdehidrogenaza
decarboxilantă
R2 FADH2 Dihidrolipoil
H3 C FAD
dehidrogenaza
+
TPP H CO2
H3C C OH
S S
+ S
R1 N (CH2 )4 CO NH Enzimă
Lipoat - Enzima
R2
H3C
Hidroxietil-TPP SH SH
(CH2)4 CO NH Enzimă
Dihidrolipoat - Enzima
Dihidrolipoil
transacetilaza O
H3C C
O
S HS
H3C C S-CoA
(CH2) 4 CO NH Enzimă CoA-SH Acetil-CoA
Acetil-dihidrolipoat-Enzima
273
12.4.2.Reglarea piruvat dehidrogenazei prin efectori alosterici şi prin
modificare covalentă (Fig.12. 10)
1.Reglarea covalentă, fosfo-defosfo. Complexul piruvat dehidrogenazei există în
două forme:
–“defosfo”, forma activă, menţinută prin activitatea unei fosfoprotein-fosfataze
activată de Ca2+;
–“fosfo”, forma inactivă, obţinută în prezenţa unei kinaze, AMPc independentă,
activată de concentraţii crescute de ATP, acetil-CoA şi NADH, dar inhibată prin creşterea
concentraţiei piruvatului, CoA-SH, NAD+, ADP.
Piruvat dehidrogenaz kinaza şi piruvat dehidrogenaz fosfataza sunt
componente ale complexului piruvat dehidrogenazei.
ATP ADP
Kinază
Fosfatază
H3PO4 H2O
+ 2+
(ADP, NAD , CoA-SH, Ca )
Insulină (în adipos nu în ficat)
2.Reglarea alosterică.
Forma activă, defosfo, a complexului piruvat dehidrogenazei este inhibată
alosteric de concentraţii crescute de: acetil-CoA, NADH (produşii acţiunii sale) şi ATP
care sunt în acelaşi timp şi activatori alosterici, ai piruvat dehidrogenaz-kinazei, enzimă
ce inactivează piruvat dehidrogenaza prin fosforilare.
Piruvatul ca şi CoA-SH şi NAD+, substraturi ale complexului multienzimatic,
inactivează, la concentraţii mari, piruvat dehidrogenaz-kinaza.
ATP, acetil-CoA şi NADH rezultate prin β-oxidarea acizilor graşi, în condiţiile
unui aport glucidic scăzut, inactivează complexul piruvat dehidrogenazei făcând
imposibilă utilizarea piruvatului provenit din lactat şi alanină în scop energetic, acesta
fiind orientat spre gluconeogeneză.
Activitatea complexului piruvat dehidrogenază este crescută, în faza
anabolică, când necesităţile energetice crescute impun antrenarea unor cantităţi mai mari
de acetil-CoA provenită din glucoză, în ciclul Krebs.
274
12.5.Ciclul Krebs
Oxaloacetat Citrat
(C4 ) (C6 )
CO2 CO2
275
A fost demonstrată existenţa a două izoenzime ale izocitrat dehidrogenazei:
una NAD+ dependentă, prezentă exclusiv intramitosolic şi cealaltă NADP+ dependentă
având o dublă localizare: intramitosolică şi citosolică.
Izocitrat dehidrogenaza NAD+ dependentă este o enzimă alosterică stimulată de
ADP şi Ca2* şi inhibată de ATP şi NADH.
H3C CO SCoA
Acetil-CoA
O
CoA-SH
- Citrat sintaza
C COO -
H2C COO
Malat -
dehidrogenaza H2C COO -
H2O HO C COO
Oxaloacetat
-
H2C COO
-
HO CH COO Citrat
NAD+ NADH+H+
- Aconitază
H2C COO
Fe2+ H2O
Fumaraza L-Malat
-
H2C COO
H2O -
- C COO
H C COO
-
- HC COO
O OC C H Cis-aconitat
Fumarat
H2O
FADH2
Fe2+ Aconitază
Succinat dehidrogenaza
FAD -
- H2C COO
H2C COO
-
- HC COO
H2C COO
-
Succinat HO CH COO
ATP Izocitrat
CoA-SH NAD+
Mg2+
Succinat ADP+Pa NADH+H+
tiokinaza Izocitrat
- NADH+H+ dehidrogenaza
H2C COO
NAD+ H2C COO
-
CH2
CoA-SH
CO2
CH2
O C ~S-CoA a-Cetoglutarat -
dehidrogenaza O C COO
Succinil-CoA CO2 α−Cetoglutarat
α−
276
4.Complexul multienzimatic al α-ceto-glutarat-dehidrogenazei, catalizează
decarboxilarea oxidativă a α-cetoglutaratului la succinil~SCoA similar cu decarboxilarea
piruvatului. Acest complex care reglează activitatea ciclului are următoarele
caracteristici:
–utilizează drept cofactori: TPP, acid lipoic, CoA-SH, NAD+, FAD, ca şi
piruvat-dehidrogenaza;
–nu este susceptibil de reglare prin fosforilare-defosforilare;
–manifestă activităţile enzimatice: α-cetoglutarat-dehidrogenaza decarboxilantă,
dihidrolipoil-transsuccinilaza, dihidrolipoil-dehidrogenaza;
–este inhibat de concentraţii crescute de ATP, succinil~CoA, NADH şi activat
de Ca2+, CoA-SH şi NAD+.
277
12.5.2.Ecuaţia globală a ciclului Krebs şi beneficiul energetic al ciclului
Ciclul Krebs constituie o cale finală de degradare, comună glucidelor, lipidelor,
proteinelor.
Hidrati de carbon Proteine Lipide
Piruvat Acetil-CoA
(C2 )
Oxaloacetat
(C4 ) H2O Citrat
(C6 )
H2O
L-Malat Cis-aconitat
(C4 ) (C6 )
H2O
2H
Izocitrat
H2O (C6 )
Fumarat
(C4 ) CO2
2H
α−Cetoglutarat
α−
(C5 )
2H
CO2
Succinat NAD+ Succinil-CoA
(C4 )
2H
~ P H2O FP
~P
CoQ
Cit. b, c1 ~P
Cit. c
H2O
278
Aminoacizii glucoformatori (glutamat, aspartat, arginină, prolină, histidină,
valină, metionină, serină, glicocol, treonină, cisteină, tirozină, fenilalanină) se
catabolizează pe căi proprii formând intermediari ai ciclului Krebs.
Aminoacizii cetoformatori: leucina şi lizina generează acetoacetat şi
acetoacetil-CoA care nu pot fi transformate în glucoză. Aminoacizii cetoformatori ca şi
acizii graşi pot furniza numai acetil-CoA.
Glucidele şi anumiţi aminoacizi pot furniza, prin piruvat, pe lângă acetil-CoA
care se consumă şi oxaloacetatul care permite amorsarea ciclului Krebs. Reacţia de
formare a acetil-CoA condiţionează, utilizarea grăsimilor.
CH 3 − CO ~ SCoA + 3NAD + + FAD + GDP + Pa + 2HOH
→
2CO 2 + CoA − SH + 3( NADH + H + ) + FADH 2 + GTP
Fumarat Citrat
Succinat Cis-aconitat
Succinil-CoA Izocitrat
ADP
Succinil-CoA α−cetoglutarat Izocitrat
dehidrogenaza dehidrogenaza
Ca2+
NADH NADH
NAD+ α−Cetoglutarat
ATP
CoA-SH
Ca2+
279
Activitatea ciclului este reglată prin:
–cantitatea de acetil~CoA, provenită din glucoză, aminoacizi sau acizi graşi;
–cantitatea de oxaloacetat, care introduce acetil~CoA în ciclul Krebs;
–cantitatea de O2 şi de ADP, deci prin viteza funcţionării lanţului respirator şi a
fosforilării oxidative, ce permit refacerea continuă a NAD+ şi a FAD, necesare
funcţionării ciclului Krebs;
–modificarea activităţii celor trei enzime reglatoare ale ciclului: citrat sintaza,
izocitrat dehidrogenaza şi α-cetoglutarat dehidrogenaza (concentraţii crescute de
NADH şi ATP inhibă aceste enzime, Fig.12.14).
1.Procese catabolice.
Ciclul Krebs reprezintă o cale pentru oxidarea acetil-CoA derivată din hidraţi
de carbon, acizi graşi şi aminoacizi. Electronii generaţi prin funcţionarea ciclului sunt
transferaţi în lanţul mitocondrial al transportorilor de electroni unde se formează ATP,
prin fosforilarea oxidativă.
2.Procese anabolice
Intermediarii ciclului Krebs sunt utilizaţi ca precursori pentru biosinteza multor
compuşi.
a.Cei doi cetoacizi ai ciclului, oxaloacetatul şi α-cetoglutaratul, pot forma prin
reacţiile de transaminare sau aminare reductivă, aminoacizii corespunzători (aspartic
şi glutamic). Deoarece reacţiile de transaminare sunt reversibile, anumiţi aminoacizi sunt
transformaţi, în funcţie de necesităţile celulei, în intermediari ai ciclului Krebs.
- -
COO COO
- -
C O + H3C CH COO C NH2 + H3C C COO
CH2 NH2 CH2 O
Alanină Piruvat
CH2 CH2
- -
COO COO
α-cetoglutarat Glutamat
280
Reacţia de aminare reductivă:
- -
COO COO
CH2 CH2
- -
COO COO
α-cetoglutarat Glutamat
Glicină Lactat
Cisteină Glucoză
Serină
Treonină Acetoacetil-CoA
Acizi grasi
Transaminare Leucină
Triptofan Alanină Piruvat Acetil-CoA Izoleucină
Triptofan
Oxaloacetat
(citosolic)
CO2
Izoleucină
Metionină Succinil-SCoA
α-cetoglutarat
Valină
Purine
Transaminare
Propionat CO2 Histidină
Porfirine Arginină Glutamat Glutamină
(hem) Prolină
Fig.12.15. Implicarea ciclului Krebs în transaminare, gluconeogeneză (indicată prin liniile groase),
sinteză de acizi graşi
12.5.5.Reacţii anaplerotice
Utilizarea intermediarilor ciclului Krebs în diferite procese biosintetice necesită
refacerea acestora prin mecanisme complementare. Reacţiile care permit creşterea
concentraţiei intermediarilor ciclului Krebs, determinând astfel creşterea vitezei de
oxidare a acetil-CoA, poartă numele de reacţii anaplerotice (ana = din nou; pliro = a
umple, a completa).
282
3.Reacţii anaplerotice sunt considerate şi căile de degradare a acizilor graşi cu
număr impar de atomi de carbon şi a unor aminoacizi (izoleucină, valină,
metionină), soldate cu formarea succinil-CoA (vezi pg. 344, Fig. 14.9).
Reacţiile de transaminare de tipul (Oxaloacetat + Glutamat Aspartat + α-
Cetoglutarat) nu sunt reacţii anaplerotice deoarece ele produc un intermediar al ciclului
Krebs (α-Cetoglutarat) consumând un alt intermediar (Oxaloacetat).
2 Acetil-CoA
(ciclul Krebs)
12.6.Gluconeogeneza (GNG)
Caracteristicile gluconeogenezei:
–este procesul biochimic prin care se sintetizează, în organism, glucoza din
compuşi ca aminoacizi (care formează piruvat sau intermediari ai ciclului Krebs), lactat,
glicerol (care formează dihidroxiacetonfosfat), propionat (provenit din acizi graşi cu
număr impar de atomi de carbon ca şi din aminoacizii cu radical ramificat valina şi
izoleucina); acizii graşi cu număr par de atomi de carbon nu sunt gluconeogeni.
–are loc în principal în ficat şi rinichi, glucoza formată fiind eliberată în sânge
în scopul menţinerii glicemiei în limite normale, în intervalul mai lung dintre mese sau în
inaniţie (foame).
–este un proces caracteristic fazei catabolice caracterizate prin raport
glucagon/insulină mare.
–începe la 4-6 ore de la ultima masă şi devine maximă la ~ 16 ore, când
rezervele (variabile) de glicogen hepatic s-au epuizat.
Cele mai multe dintre reacţiile GNG sunt reacţii ale glicolizei, dar parcurse
invers, cu participarea aceloraşi enzime ca în glicoliză.
Cele trei etape ireversibile, specifice glicolizei, catalizate de kinaze (piruvat
kinaza, FFK-1, hexokinaza/glucokinaza) care necesită consum mare de energie se produc
în GNG prin folosirea enzimelor specifice (piruvat carboxilaza, fosfoenolpiruvat
carboxikinaza, fructozo-1,6-bisfosfataza, glucozo-6 fosfataza).
Unele dintre enzimele participante la GNG sunt citosolice, altele sunt
mitocondriale. Schema generală a GNG este prezentată în Fig.12.17.
GNG este un proces reductiv (necesită NADH + H+), consumator de energie
provenită din arderea acizilor graşi furnizaţi prin lipoliză, din ţesutul adipos.
Sinteza unui mol de glucoză plecând de la 2 moli de piruvat necesită 6 moli ATP
şi 2 moli NADH + H+ conform reacţiei globale:
2Piruvat + 6ATP + 4HOH + 2(NADH + H + ) → Glucoză + 6ADP + 6Pi + 2NAD+
284
Glucoză P
Glucokinază
Hexokinază Glucozo-6-fosfatază
Glucozo-6-fosfat
P
Fructozo-6-fosfat
Fosfofructokinaza-1 Fructozo-1,6-bisfosfatază
Fructozo-1,6-bisfosfat
Dihidroxiaceton-P Gliceraldehidă-3-P
Glicerol Glicerol-3-P
Fosfoenolpiruvat
fosfoenolpiruvat
Aminoacizi carboxikinaza
Oxaloacetat Piruvat kinaza
Ciclul
Krebs
piruvat
carboxilaza Aminoacizi
Succinil-CoA Piruvat Alanină
piruvat Lactat
dehidrogenaza
Propionat
Acetil-CoA
285
Piruvatul produs din lactat, alanină şi alţi aminoacizi este transformat în
mitocondrie la oxaloacetat de către piruvat carboxilază (fig.12.18), enzimă exclusiv
mitocondrială care necesită biotină şi ATP, conform reacţiei:
Piruvatcarboxilaza
HOOC-CO-CH3 + CO2 + ATP HOOC-CO-CH2-COOH + ADP + Pi
(Biotină)
Citosol Glucoză
Glucagon
Fosfoenolpiruvat via AMPc
CO2
fosfoenol-piruvat
carboxikinaza GDP ADP piruvat kinaza
GTP ATP Alanină
NADH+H+
Oxaloacetat Piruvat Lactat
+
NAD NAD +
Asp NADH + H+
Malat
Tesut
Piruvat adipos
piruvat CO2 piruvat Glucagon
carboxilaza ATP dehidrogenaza via AMPc
Biotină
ADP+P Acizi
Asp Oxaloacetat NADH+H+ grasi
NADH+H+
Acizi
NAD+ grasi
Acetil-Coa
Malat
Sânge
Fig. 12.18 Etapele gluconeogenezei din lactat şi alanină.
286
O altă cale de export a oxaloacetatului în citosol poate fi conversia sa la
fosfoenol-piruvat de către fosfoenolpiruvat carboxikinaza mitocondrială. Fosfoenol-
piruvatul este transportat în citosol şi reprezintă direct substrat pentru GNG.
Fosfoenolpiruvatul este convertit la fructozo-1,6-bisfosfat prin parcurgerea
inversă a etapelor glicolizei (Fig.12.17).
2 ATP
2 Lactat 6 ATP
2 Piruvat 2 Piruvat
287
Sânge Muschi
Ficat
Glicoliza
GNG
Ureogeneză
6 ATP Aminoacizi
2 Lactat 2 ATP
2 Piruvat
2 Piruvat NH3
2 NH3
Fructozo-6-fosfat
ATP H3PO4
Fosfofructokinaza-1
ADP Fructozo-1,6-bisfosfataza
Fructozo-1,6-bisfosfat
Dihidroxiacetonfosfat Gliceraldehid-3-fosfat
P
NAD+
+
NADH+H NADH+H+
NAD+ 1,3-Bisfosfoglicerat
Glicerol-3-fosfat ADP
ATP
ADP 3-Fosfoglicerat
Glicerolkinaza
ATP
Glicerol
2-Fosfoglicerat
enzime inactive
enzime inductibile H2O
Fosfoenolpiruvat
Fig.12.21 Gluconeogeneza din glicerol
289
CO2 + H2O CH3
Propionil-CoA carboxilaza
H3 C CH2 CO H C COOH
Biotină
Propionil - CoA CO
ATP ADP + Pa D-metil-malonil-CoA
COOH Metilmalonil-CoA
CH2 racemază
CH3
CH2
Metilmalonil-CoA izomerază
HOOC C H
CO Coenzima vit. B12
Succinil-CoA CO
(Intermediar al ciclului Krebs) L-metil-malonil-CoA
Fig.12.22. Transformarea propionil~CoA în intermediar al ciclului Krebs.
12.6.3.Reglarea gluconeogenezei
Reglarea gluconeogenezei se realizează prin: concentraţia substratelor,
concentraţia ATP (nivelul energetic celular), modificarea concentraţiei enzimelor
reglatoare ale gluconeogenezei şi în mod esenţial prin modificarea activităţii
enzimelor reglatoare ale gluconeogenezei.
Intensitatea procesului de gluconeogeneză trebuie să fie invers proporţională cu
intensitatea glicolizei. Efectorii pozitivi ai enzimelor cheie din glicoliză sunt efectori
negativi ai enzimelor cheie din gluconeogeneză.
290
2.Modificarea covalentă sau alosterică a activităţii enzimelor reglatoare din
gluconeogeneză (Fig.12.23).
a.Piruvat-carboxiligaza este activată alosteric de acetil-CoA.
Piruvat-carboxiligaza, enzimă ce catalizează conversia piruvatului la oxaloacetat
este în competiţie pentru acelaşi substrat cu piruvat dehidrogenaza, enzimă ce catalizează
decarboxilarea oxidativă a piruvatului.
Lactat
Piruvat
Fructozo-1,6- CO2
bisfosfat Acetil-CoA
ATP
ATP ADP+P
Alanină Oxaloacetat
Acetil-CoA GTP
Acil-CoA GDP + CO2
Fosfoenolpiruvat
Fructozo-1,6-bisfosfat
ATP
Citrat AMP
ADP
Fructozo-2,6-
AMP ATP
H3PO4 bisfosfat
Fructozo-2,6-
bisfosfat Fructozo-6-fosfat
Glucozo-6-fosfat
ADP
Fructozo-6-fosfat H3PO4
ATP
Glucoză
Fig.12.23. Etapele reglatoare în gluconeogeneză.
Acetaldehida poate complexa proteine, acizi nucleici sau alţi compuşi fapt ce
explică efectele toxice asociate consumului de alcool.
Efectele metabolice ale intoxicaţiei cu alcool sunt determinate de acţiunea celor
două enzime ADH şi AcDH a căror rezultantă este creşterea raportului NADH/NAD+.
Excesul de NADH în citosol orienteză echilibrul reacţiilor catalizate de lactat
dehidrogenază şi malat dehidrogenază în direcţia formării lactatului şi malatului:
Piruvat + NADH + H
+
LDH
→ Lactat + NAD +
(Etanol + Piruvat Acetaldehidă + Lactat)
Malat dehidrogenază
sau Oxaloacetat + NADH + H + → Malat + NAD+
(Etanol+Oxaloacetat Acetaldehidă + Malat)
292
Aceste reacţii inhibă sinteza de glucoză prin limitarea piruvatului şi
oxaloacetatului necesare pentru reacţia catalizată de piruvat carboxiligază şi respectiv,
fosfoenolpiruvat carboxikinază.
Excesul de NADH în mitocondrie produs de AcDH reduce activitatea ciclului
Krebs, acetil-CoA fiind orientată spre sinteza de acizi graşi. Reducerea NAD+ citosolic
duce la scăderea activităţii glicerol-3-fosfat dehidrogenazei (în direcţia glicerol-3-fosfat
dihidroxiacetonfosfat) rezultând o creştere a concentraţiei glicerol-3-fosfatului care
furnizează glicerolul activat pentru sinteza trigliceridelor. Aceste două procese determină
depozitarea acizilor graşi în ficat ducând la sindromul de ficat gras.
293
3.Calea pentozelor implică două etape majore: oxidativă şi neoxidativă.
H O
HO
C NADPH+H+ C COO
-
NADPH+H+
NADP+ NADP+ CO2
H C OH H C OH H C OH H2C OH
HOH
O O
HO C H Glucozo-6-fosfat HO C H Lactonaza HO C H 6-fosfo-gluconat
C O
dehidrogenază dehidrogenază
H C OH H C OH H C OH H C OH
H C H C H C OH H C OH
294
H2C OH
C O
izomeraza epimeraza
H C OH
HC O H C OH H2C OH
H C OH H2C OPO3 H2 C O
Ribulozo-5-fosfat
H C OH HO C H
H C OH H C OH
Pentozele, sintetizate în această etapă, sunt fie utilizate pentru sinteza acizilor
nucleici, coenzimelor, compuşilor macroergici fie reconvertite la hexoze.
Etapele conversiei pentozelor la hexoze, care implică transaldolaza şi
transcetolaza, sunt menţionate în Fig. 12.26.
Transcetolaza, a cărei coenzimă este tiaminpirofosfatul, transferă fragmentul
glicolaldehidă de pe xilulozo-5-fosfat pe ribozo-5-fosfat cu formarea sedoheptulozo-7-
fosfatului şi a gliceraldehid-3-fosfatului. Formarea gliceraldehid-3-fosfatului reprezintă
un punct de interferenţă a glicolizei cu şuntul pentozelor.
Transaldolaza catalizează transferul restului dihidroxiacetonă, de pe sedulozo-7-
fosfat pe gliceraldehidă-3-fosfat, cu formarea eritrozo-4-fosfatului şi a fructozo-6-
fosfatului (intermediar comun al glicolizei şi căii pentozelor).
Eritrozo-4-fosfatul poate accepta un rest glicolaldehidă, provenit de la o altă
moleculă de xilulozo-5-fosfat, formându-se fructozo-6-fosfat şi gliceraldehid-3-fosfat,
ambele substrate ale glicolizei.
Gliceraldehid-3-fosfatul se poate izomeriza la dihidroxiaceton-fosfat, formând
prin condensare fructozo-1,6-bisfosfatul care sub acţiunea fructozo-1,6-bisfosfatazei,
etapă specifică gluconeogenezei, formează glucozo-6-fosfat.
Rezultatul net al căii pentozelor, dacă nu se utilizează numai pentru producerea
de ribozo-5-fosfat, este oxidarea glucozo-6-fosfatului care conţine 6 atomi de carbon la
un monozaharid cu 5 atomi de carbon. Alternativ, 3 moli de pentoze sunt convertiţi în 2
moli de hexoze şi 1 mol de trioză (Fig.12.26). Hexozele pot fi reciclate în cale în formă
de glucozo-6-fosfat pentru a produce mai mult NADPH. Trioza (gliceraldehidă-3-fosfat)
poate fi oxidată la piruvat în glicoliză sau transformată în fructozo-6-fosfat sau glucozo-
6-fosfat în gluconeogeneză.
Bilanţul net al căii pentozelor este oxidarea nui mol de glucoză conform reacţiei:
295
6 NADPH 3 CO2
3 Glucozo-6-P 3 Ribulozo-5-P
C6 C5
epimerază epimerază
izomerază
Gliceraldehidă-3-P Sedoheptulozo-7-P
C3 C7
transaldolază Eritrozo-4-P
C4 transcetolază
Fructozo-6-P
C6 Fructozo-6-P
C6
Gliceraldehidă-3-P
C3
Glicoliză
Fig.12.26. Etapa neoxidativă a căii pentozo-fosfaţilor în ţesutul adipos
Glucozo-6-fosfat
6-Fosfo-gluco glucozo-6-fosfat
izomeraza
dehidrogenaza
Fructozo-6-fosfat
6-Fosfo-gluconolactonă
Fosfofructokinaza-1
lactonaza
Fructozo-1,6-bisfosfat
Acid 6-fosfogluconic
Aldolaza
6-fosfogluconat
2 Trioze fosforilate dehidrogenaza
Ribulozo-5-fosfat
Piruvat
Glicoliza Calea pentozelor
Fig.12.27. Relaţiile reciproce între glicoliză şi calea pentozofosfaţilor
6-fosfo-gluconat
dehidrogenaza
Ribulozo-5-fosfat NADPH+H+
Fig. 12.28. Şuntul pentozelor furnizează NADPH pentru reducerea glutationului oxidat.
297
Prima etapă în calea acidului glucuronic presupune activarea glucozo-1-
fosfatului sub formă de uridin-difosfat-glucoză (UDP-glucoză) şi necesită UTP şi
enzima UDP-glucozo-pirofosforilaza.
Glucoză
Glicozaminoglicani
Glucozo-6-P
O
2(NADH+H+)
PPa CH2OH HN -
CH2OH COO
UTP
O H H O H 2NAD+
H H O H
H H O O O N
OH H OH H H
OH H
HO O-P HO O P O P O CH2 dehidrogenază
O HO O-UDP
H OH H OH - -
O O H OH
Glucozo-1-P H2O
UDP-glucoză UDP-glucuronat
OH OH
Glicogen + R-COOH
Sinteza de
glicogen -
COO
Acid glucuronic
Sinteza H O O-CO-R
CH2OH glicoproteinelor H
Acid L-gulonic OH H
OH O H HO H
H
OH H H OH
H O-UDP L-xiluloză
β -Glucuronoconjugati
H OH L-gulono-lactonă
UDP-galactoză Xilitol
om, maimută, cobai
D-Xiluloză
2-ceto L-gulonolactonă
D-xilulozo-5-fosfat
Acid ascorbic
Calea pentozelor
12.8.Metabolizarea fructozei
Fructoza parvine organismului din dietă: fructe, miere sau este ingerată sub formă
de zaharoză care prin hidroliză intestinală formează glucoză şi fructoză. Ea se află în
cantitate mare în plante. O mare parte din fructoza astfel obţinută va fi reconvertită, în
ficat, la glucoză. Există două posibilităţi de transformare a fructozei.
299
Metabolizarea fructozei este mai rapidă decât a glucozei deoarece intervenţia
aldolazei B face ca două enzime glicolitice reglatoare, glucokinaza şi fosfofructo-kinaza-
1, să nu fie implicate.
Lipsa reglării transformării fructozei în trioze poate însă introduce în calea
Embden-Meyerhof cantităţi mari de intermediari glicolitici, conducând eventual la
lactacidemie sau la amplificarea lipogenezei.
Dietă NADH+H+ NAD+
D-Fructoză D-Sorbitol
ATP
Blocată în fructozurie fructokinaza
esentială ADP
Fructozo-1-fosfat
Blocată în intolerantă aldolaza B
ereditară la fructoză
D-Gliceraldehidă
+
NADH + H alcool
+ dehidrogenază
NAD
Glicerol
ATP glicerol
ADP kinază
Dihidroxiacetonfosfat Glicerol-3-fosfat
glicerol fosfat
D-Glucoză dehidrogenază
(gluconeogeneză) Lipide
triozkinaza
Gliceraldehidă-3-fosfat
ADP ATP
Glicogen Piruvat sau Lactat
(fructoliză, analog glicolizei)
H O
C H2C OH H2C OH
H C OH H C OH C O
HO C H HO C H sorbitol HO C H
aldoz reductaza dehidrogenaza
H C OH H C OH H C OH
H C OH NADPH+H+ H C OH NAD+ H C OH
+
H2C OH NADP H2C OH NADH+H+ H2C OH
Glucoză Sorbitol Fructoză
300
Aldozoeductaza se află în multe ţesuturi: cristalin, retină, celulele Schwann din
nervii periferici, ficat, rinichi, placentă, hematii şi în celulele din ovare şi veziculele
seminale. In celulele din ficat, ovare, spermă şi veziculele seminale se găseşte sorbitol
dehidrogenaza care oxidează sorbitolul cu producerea fructozei.
Fructoza generată pe această cale în veziculele seminale va fi secretată şi va
reprezenta sursa majoră de energie pentru spermatozoizi. Mitocondriile spermatozoizilor
conţin lactatdehidrogenază, enzimă exclusiv citosolică în orice altă celulă.
Spermatozoizii pot metaboliza complet fructoza la CO2 şi H2O, prin combinarea
eficientă a proceselor: fructoliză, captarea lactatului în mitocondrii şi oxidarea succesivă a
lactatului la piruvat, acetil-CoA, CO2 şi H2O. Se exclude astfel necesitatea funcţionării
“navetelor” în transportul echivalenţilor reducători, din citosol în mitocondrie.
5.Corelaţii clinice
“Fructozuria esenţială” este o afecţiune benignă, asimtomatică clinic,
determinată de lipsa fructokinazei sau defecte ale acesteia. Se caracterizează prin apariţia
unor cantităţi mari de fructoză în sânge şi urină, după mese bogate în fructoză.
“Intoleranţa ereditară la fructoză” este determinată de scăderea sau absenţa
activităţii aldolazei B. Se caracterizează prin:
–blocarea fosfatului intracelular ca urmare a acumulării de fructozo-1-fosfat, şi
inhibarea fosforilării oxidative;
–hipoglicemie severă după ingestie de fructoză, ca urmare a inhibării
fosforilazei a, enzima reglatoare din glicogenoliză, prin fructozo-1-fosfat.
12.9.Metabolismul galactozei
UDP-Glucoza Glicogenn
glicogen sintaza
UDP Glicogen(n + 1)
H3PO4
fosforilaza
rest de glicogen
Lactoza Glucozo-1-fosfat
Glucozo-6-fosfat
ADP HOH
ATP H3PO4
Glucoză
Fig.12.31 Metabolizarea galactozei
302
–se acumulează galactozo-1-fosfat (citotoxic) în ficat şi galactoză liberă (prin
inhibiţia secundară a galactokinazei);
–se produce depleţie celulară de fosfat liber;
–apar: icter, leziuni renale, cerebrale, deteriorare mentală, cataractă, scădere în
greutate
–nou-născuţii cu defect de uridil-transferază, diagnosticaţi rapid, se pot dezvolta
normal, dar cu excluderea lactozei (a laptelui) din dietă.
12.10.Metabolizarea glicogenului
12.10.1.Introducere
Glucoza este singura sursă de energie pentru eritrocitele mamiferelor şi sursa
majoră de energie pentru creier. Creierul consumă 75% din glucoza oxidată zilnic pe cale
aerobă, restul fiind consumată în mare parte de eritrocite, muşchi scheletici şi miocard.
Deoarece nici eritrocitele nici creierul nu depozitează glucoza, este necesară o sursă
constantă care să menţină glicemia normală. Această sursă este reprezentată de glucoza
din dietă şi de glucoza produsă prin gluconeogeneză sau glicogenoliză (degradarea
glicogenului).
Glicogenul reprezintă forma de depozitare a excesului de glucide în
organismele animale, la care se face apel în faza catabolică a metabolismului. Cantităţi
semnificative de glicogen se găsesc în muşchi ( 1% din greutatea umedă) şi în ficat (6%
din greutatea umedă).
Depozitele de glicogen sunt utilizate de către cele două ţesuturi în scopuri
diferite:
–ficatul utilizează depozitul de glicogen în scopul menţinerii glicemiei;
–muşchiul, lipsit de glucozo-6-fosfatază, utilizează glicogenul ca rezervă de
energie, strict, pentru satisfacerea necesităţilor proprii, de ATP.
Rezervele de glicogen, scad dramatic în ficat, în cursul a 12-24 ore de inaniţie, iar
în muşchi, în cursul unei activităţi musculare intense, ca urmare a glicogenolizei; ele se
refac în faza anabolică a metabolismului, caracterizată prin abundenţă de substrate
energogene (glucidice).
Muşchiul în contracţie mobilizează glicogenul pentru producerea de ATP.
Producerea de ATP şi soarta atomilor de carbon din glicogen depinde de tipul fibrei
musculare “albă” sau “roşie”.
Fibrele musculare roşii sunt continuu irigate sanguin, conţin cantităţi mari de
mioglobină şi un număr mare de mitocondrii. Glicogenul mobilizat în aceste celule este
transformat în piruvat care din cauza disponibilităţii de oxigen şi mitocondrii poate fi
convertit la CO2 şi H2O.
În contrast, fibrele musculare albe, au mai puţină mioglobină şi doar câteva
mitocondrii. Glicogenoliza în acest ţesut furnizează substrat pentru glicoliză al cărui
produs final este în principal lactatul. Fibrele musculare albe au o disponibilitate
enormă pentru glicogenoliză şi glicoliză, mult mai mare decât fibrele musculare roşii.
Cum depozitul lor de glicogen este limitat, fibrele musculare albe pot funcţiona la
capacitatea maximă o perioadă limitată de timp. Pieptul şi inima de pui sunt cele mai
bune exemple de muşchi alb şi respectiv, roşu. Inima bate continuu, are multe mitocondrii
şi este irigată puternic. Depozitul de glicogen în miocard este necesar pentru efort intens.
303
Muşchiul pieptului de pui nu este supus efortului continuu. Deoarece glicogenul poate fi
mobilizat rapid, muşchiul pieptului este desemnat pentru o activitate intensă pe o perioadă
scurtă de timp. Spre deosebire de pui, unde muşchiul alb se distinge uşor de cel roşu, cei
mai mulţi muşchi scheletici din corpul uman sunt compuşi dintr-un amestec de fibre roşii
şi albe care conferă muşchiului capacitatea de contracţie rapidă şi susţinută.
Granule de glicogen cu diametrul de 10-40 nm se află în citoplasma
hepatocitelor şi a celulelor musculare. Granulele de glicogen sunt abundente în ficatul
animalelor bine hrănite şi sunt aproape absente în ficat la 24 ore de foame. Activitatea
intensă determină o scădere a cantităţii de granule de glicogen în muşchi. Aceste granule
sunt complexe ale glicogenului cu enzimele implicate în sinteza şi degradarea sa
(Fig.12.32).
10 - 40 nm
Glicogen
Capete Enzime
nereducătoare Granule de glicogen
Capătul reducător
H2C OH H2C OH CH 2 H2 C OH H2 C OH
H O H H O H H O H H O H H O H
H H H H H
OH H OH H OH H OH H OH H
HO O O O O OH
H OH H OH H OH H OH H OH
Legătură α-1 4
Fig.12.32 Ilustrarea structurii glicogenului şi a granulelor de glicogen.
304
a.Fosforoliza glicogenului catalizată de glicogen fosforilază este prima etapă în
procesul de degradare, în care glucoza este eliberată din glicogen, în formă activată
(fosforilată), fără consum de ATP. Acidul fosforic este utilizat pentru clivarea legăturii α-
1,4-glicozidice cu formarea glucozo-1-fosfatului. Această reacţie se produce la unu sau
mai multe capete terminale, nereducătoare, ale porţiunii liniare din molecula glicogenului
(Fig.12.33).
CH2-OH CH2-OH CH2 -OH CH2 -OH CH2 -OH
O O O O O
4
+ H3PO4
OH OH OH OH + OH
HO O O O HO OPO3 H2 HO O
OH OH OH OH OH
Glicogen (structură partială) α-D-Glucozo-1-fosfat Glicogenn-1
6 H3PO4 6 glucozo-1-P
P
glicogen fosforilaza
enzima de deramificare
(transferază)
glucoză H2 O
enzima de deramificare
(glucozidază)
305
Prin activitatea sa transferazică, enzima detaşază un fragment de maltotrioză din
porţiunea de patru resturi de glucoză anterioară unui punct de ramificare şi îl mută,
ancorându-l la capătul nereducător al altei porţiuni lineare; se expune astfel restul de
glucoză legat α-1,6-glucozidic. Prin activitatea sa hidrolazică, enzima detaşază restul de
glucoză legat α-1,6 rămânând o porţiune lineară, care devine susceptibilă la atacul
fosforilazei. Restul detaşat hidrolitic se desprinde ca glucoză liberă (Fig. 12.34). In
muşchi activitatea hexokinazei este aşa de mare încât glucoza liberă este imediat
fosforilată şi metabolizată pe calea glicolizei.
12.10.3.Reglarea glicogenolizei
a.Glicogen fosforilaza, enzima reglatoare a procesului de glicogenoliză, poate fi
reglată covalent (prin fosfo-defosforilare) şi alosteric. Activatorul alosteric al enzimei
este AMP în timp ce concentraţii mari de glucoză şi ATP sunt inhibitori alosterici ai
enzimei. Activarea prin AMP se manifestă în mod deosebit în ţesutul muscular, unde
concentraţia AMP creşte în eforturi intense.
Glicogen fosforilaza se găseşte în ţesuturi în două forme interconvertibile prin
fosforilare-defosforilare, desemnate drept “a” şi respectiv “b”. Glicogen fosforilaza “b”
este un dimer de subunităţi identice, fiecare subunitate putând fi fosforilată la un singur
rest de serină. Prin fosforilare, dimerii se asociază pentru a forma glicogen fosforilaza “a”
tetramerică, mult mai activă.
Interconversia celor două forme ale glicogen fosforilazei este realizată prin
acţiunea antagonistă a două enzime (Fig.12.35): fosforilaz-kinaza şi fosforilaz-
fosfataza.
b.Fosforilaz-kinaza este constituită din patru tipuri de subunităţi fiecare
prezentă în patru copii (α, β, γ, δ)4. Subunitatea δ care funcţionează ca subunitate
catalitică, este reprezentată de calmodulină, proteină care fixează calciu şi care, funcţie de
concentraţia citosolică a acestuia, îşi modifică conformaţia. Subunităţile
α, β şi γ îndeplinesc roluri reglatorii.
306
ATP ADP
Fosforilaz kinaza
Glicogen
(glucoză)n
Glucozo-1-P +
Fosfoprotein fosfataza-1 (glucoză)n-1
P H2O