MONTAJE MÉTODO

FOTOCOLORIMÉTRICO:
ROJO DE PIROGALOL - MOLIBDATO

Integrantes: - Valentina Alvarado Casanova

- Nicolás Díaz Rosas
- Maximiliano Gil Valenzuela
- Alejandro López Ibáñez
- Jorge Martínez Rodríguez
- María José Rosales Jaramillo
- Priscila Scheffer Ruiz
- Scarlett Sepúlveda Parada
- Francisco Trujillo Pérez
- Mauricio Uribe Fierro
- Katherine Velásquez Velásquez

Profesor encargado: Carlos Oyarzún

Asignatura: Diagnóstico Bioquímico
BIMI 241
Contenido
ROJO DE PIROGALOL - MOLIBDATO............................................................................................................ 1
Contenido................................................................................................................................................ 2
Introducción ................................................................................................................................................ 4
Método y Fundamento ............................................................................................................................... 6
Montaje de Método .................................................................................................................................... 6
Preparación de reactivos ...................................................................................................................... 6
Preparación del stock ........................................................................................................................... 7
Procedimiento preparación del stock: ............................................................................................. 7
Cálculos: ................................................................................................................................................ 8
Espectro de Absorción ................................................................................................................................ 9
Procedimiento: ..................................................................................................................................... 10
Discusión .............................................................................................................................................. 12
Estabilidad del Reactivo ............................................................................................................................ 12
Procedimiento...................................................................................................................................... 13
Reactivo en presencia de luz con variable de temperatura ......................................................... 13
Reactivo en ausencia de luz con variable de temperatura ........................................................... 14
Discusión .......................................................................................................................................... 16
Curva de Calibración ................................................................................................................................. 17
Procedimiento: .................................................................................................................................... 17
Cálculos: .............................................................................................................................................. 17
Discusión .............................................................................................................................................. 18
Sensibilidad ............................................................................................................................................... 18
Procedimiento...................................................................................................................................... 18
Resultados de Concentraciones bajas ............................................................................................... 19
Discusión .............................................................................................................................................. 21
Precisión .................................................................................................................................................... 22
Procedimiento...................................................................................................................................... 22
Cálculos: .............................................................................................................................................. 22
Discusión .............................................................................................................................................. 24
Exactitud ................................................................................................................................................... 25
Resultados ............................................................................................................................................ 25
Cálculos: .............................................................................................................................................. 26

2
 Discusión .............................................................................................................................................. 26
Recuperación ............................................................................................................................................ 27
Resultados ............................................................................................................................................ 28
Cálculos: .............................................................................................................................................. 28
Discusión .......................................................................................................................................... 30
Valores de Referencia ............................................................................................................................... 31
Procedimiento...................................................................................................................................... 31
Cálculos: .............................................................................................................................................. 33
Discusión .............................................................................................................................................. 34
Valores patológicos ................................................................................................................................... 34
Discusión .............................................................................................................................................. 35
Conclusión ................................................................................................................................................. 36
Bibliografía ................................................................................................................................................ 39

3
 Introducción

El riñón es el órgano encargado de filtrar la sangre, como proteínas de bajo peso

molecular y algunos electrolitos que se le eliminan mediante la orina. Cuando el riñón no
cumple su función, no filtrará la sangre en la forma en que debería, es decir, las proteínas no
se reabsorben y son excretadas por la orina. En consecuencia, a lo descrito anteriormente, los
avances científicos del último tiempo han sido de gran importancia para detectar patologías
renales, que cada vez son más comunes por los factores de riesgo que influyen en la
enfermedad renal, como la diabetes, la hipertensión arterial y enfermedades hereditarias de
este tipo. Debido a estos factores, que son comunes en países desarrollados y en vías al
desarrollo, han ido en aumento las patologías renales y del mismo modo se han creado nuevos
métodos para detección temprana de proteínas en la orina, consiguiendo de este modo
establecer el diagnóstico y estado de la función del riñón.

Una de las técnicas que se han desarrollado ha sido el método fotocolorimétrico Rojo
de Pirogalol – Molibdato (PR – Molibdato), método que se fundamenta en la medición de
variación del espectro de absorción al unirse el pigmento con la proteína a medir en la
orina. (Watanabe et al. 1986)

El método PR- Molibdato se puede utilizar tanto de forma manual como

automatizada, esto ha llevado que tenga éxito en la cuantificación de proteínas urinarias.
Además, a diferencia de otros métodos posee gran estabilidad del colorante y este no se
adhiere a la pared de la cubeta al medir la absorbancia, evitando dar valores incorrectos y que
el método sea aplicable a un analizador automático de tipo discreto. Para realizar una
medición con este método se utiliza una muestra de orina de 24 hrs o una muestra de orina
de la mañana. Resultados elevados pueden deberse a causas fisiológicas o benignas como el
ejercicio violento, fiebre, hipotermia o embarazo, pero hay otros casos en el que su elevada
concentración es por condiciones patológicas por disfunción glomerular o tubular como
Síndrome nefrítico, Síndrome nefrótico, nefropatía diabética, infecciones del tracto urinario
(Wiener Laboratorios S.A.I.C., 2000). Otra ventaja del método, es que no posee mayores
interferentes al usar la orina como muestra. También cabe mencionar que se puede utilizar
este método para la cuantificación de proteínas en líquido cefalorraquídeo. El método puede

4
diagnosticar como también evaluar el seguimiento de enfermedades relacionadas con la
proteinuria.

Los estudios de reproducibilidad demostraron que este método es adecuado para uso
clínico, especialmente en nuestra área, por lo cual trabajaremos en el montaje del método
PR-Molibdato guiándonos por el paper antes mencionado, pero modificando el método a las
condiciones que se tiene en el laboratorio, cuidando la eficiencia de la técnica y de esta
manera, verificar su exactitud y precisión.

5
 Método y Fundamento

El método Rojo Pirogalol Molibdato se basa en medir la variación del espectro de

absorción cuando el complejo PR-Molibdato, en un medio ácido de pH 2.5, se une a las
proteínas. En esta reacción se produce un cambio en los peaks de absorbancia que varían de
480 a 600 nm, correspondiente al peak del reactivo y al peak del reactivo unido a proteínas,
respectivamente.

Montaje de Método

Preparación de reactivos

De acuerdo con nuestros requerimientos utilizamos un litro de solución reactiva.

❖ Solución Rojo de Pirogalol (PR) (1.5 mmol/L): se disuelven 30 mg de rojo de

pirogalol en 50 mL de metanol.
❖ Solución de molibdato (10 mmol/L): se disuelven 0,24 g de molibdato de sodio en
100 mL de agua destilada.
❖ Reactivo PR-molibdato: se disuelven 5,9 g de ácido succínico, 0,14 g de oxalato de
sodio, y 0,5 g de benzoato sódico en 900 mL de agua destilada. Luego, se agrega 40
mL de solución PR y 4 mL de solución de molibdato, posterior se ajusta a pH 2,5 con
solución de HCL al 0,1 M, y se afora a 1 L con agua destilada.

Procedimiento preparación de reactivo:

1. Adicionar solución de Rojo de Pirogalol (1.5 mmol/L) y solución de Molibdato (10

mmol/L)
2. Luego se agrega 5.9 g de ácido succínico, 0.14 g de oxalato de sodio y 0.5 g de
benzoato sódico.
3. En una probeta de un litro, se agregan 900 ml de agua destilada y se adicionan los
distintos componentes del reactivo.

6
 4. Se cubre el extremo superior con un parafilm, y se mezcla por inversión hasta
homogenizar la solución.
5. Llevamos la solución a un vaso precipitado de 1000 ml, agregamos HCl 2M y con un
pH-metro medimos hasta llegar un pH de 2.5.
6. Aforar a 1L con agua destilada.

Preparación del stock

❖ BSA stock (10 g/L y 5 g/L): se disuelven 0,2 gramos de albúmina cristalizada en 20
ml de agua destilada, se mezcla suavemente para no formar espuma, de esta manera,
se obtiene una solución de BSA de concentración 10 g/L. Posteriormente, se extraen
10 ml de la solución y agregar a esta, 10 ml de agua destilada para obtener una
solución BSA 5 g/L.

Procedimiento preparación del stock:

1. Se pesan 0,2 gramos de Bovine Serum albumin- Fraction V (Immunoglobulin and

protease free) Code# BSA -50 Lot# 41918 Rockland antibodies & assays y se colocan
en un vaso precipitado.
2. Se le agregan 20 ml de agua destilada de forma de alcanzar una concentración de 10
g/L
3. Se colocan los imanes en la solución y se mezclan con el agitador magnético de
manera suave, para no generar espuma.
4. Del vaso precipitado se extraen 10 ml de la solución BSA 10 g/L, y se agregan a otro
vaso precipitado.
5. A uno de los vasos precipitados se diluye con 10 ml de agua destilada para llegar a
una concentración de 5 g/L.
6. Se extraen 100 ul del BSA 10 g/L y se agregan a una cubeta de cuarzo, además se le
adhieren 900 ul de agua destilada y se mide su absorbancia para obtener la
concentración real del BSA, en 280 nm. Se usa como referencia que 1 g/L=0,660.
7. Este mismo procedimiento se hace con el BSA 5 g/L, pero se extraen 200 ul del
respectivo vaso precipitado y se introduce en la cubeta de cuarzo, más 800 ul de agua,

7
 y se mide al espectrofotómetro a 280 nm, y se calcula la concentración real con la
misma proporción del anterior.

Cálculos:

1. Se requiere preparar 10 g/L de BSA en 20 ml

10 g/L es equivalente a 0,01g/ml por conversión de unidades, llevando a cabo la

relación de que, si hay 0,01g en 1 ml, en 20 ml son:

20 𝑚𝑙 × 0,01 𝑔/𝑚𝑙 = 0,2 g de Albúmina cristalizada necesaria para obtener la

concentración anteriormente mencionada.

10 g/L → 0,01 g/ml

0,01 gramos → 1 ml

(20 𝑚𝑙×0.01 𝑔𝑟)

X gramos → 20 ml ⇨ ⇨ 0,2 gramos de albúmina
1 𝑚𝑙

2. Se prepara una solución de BSA concentración 10 g/L en 20 ml, y se debe diluir a 5

g/L.
𝑽𝒊 𝒙 𝑪𝒊 = 𝑽𝒇 𝒙 𝑪𝒇

10 𝑚𝑙 𝑥 10 𝑔/𝐿 = 𝑉𝑓 𝑥 5 𝑔/𝐿

20 𝑚𝑙 = 𝑉𝑓 𝑑𝑒 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 𝑓𝑖𝑛𝑎𝑙

Según los cálculos anteriores, se necesita 20 ml de la solución final de BSA a

5g/L, que corresponden a 10 ml de BSA a 10 g/L, más 10 ml de agua destilada, ya
que la diferencia entre el volumen final y el inicial (20 ml - 10 ml) nos entrega el
valor de volumen que debemos agregar, el cual es 10 ml de agua destilada.

8
 Espectro de Absorción

El espectrograma es útil para determinar la fracción de la radiación electromagnética

incidente que un material absorbe dentro de un rango de frecuencias. El espectro de luz
visible se encuentra entre el rango de 400 nm y 700 nm, la utilidad del espectrograma es la
información que proporciona para determinar las longitudes de onda donde la sustancia
absorbe más luz. Dependiendo de las necesidades del método, es la longitud de onda que se
escogerá para realizar las determinaciones. Se debe considerar los espectros que se forman
del reactivo como el espectro del complejo formado con la Albúmina.

Utilizamos un rango de 300 nm a 700 nm con intervalos de 5 nm.

La primera medición fue del reactivo Rojo Pirogalol Molibdato que alcanzó la mayor
absorbancia a 470 nm.

Continuamos con la medición del complejo del reactivo más la Albúmina, donde se
midió en cuatro concentraciones diferentes; 9,4 mg/dl, 4,8 mg/dl, 2,4 mg/dl y 1,2 mg/dl.

El espectrograma considera la medición de la absorción de ambas sustancias, del

reactivo como de la Albúmina junto al reactivo. El paper “Urinary Protein as Measured with
a Pyrogallol Red-Molybdate Complex, Manually and in a Hitachi726 Automated Analyzer”,
9
indicaba que el peak de absorción del reactivo PR-Molibdato alcanzaba a 467 nm mientras
que el complejo junto al reactivo su peak era de 598 nm.

Procedimiento:
1. Rotular 5 tubos de ensayo. 1, 2, 3, 4 y el blanco.
2. En los tubos 1, 2, 3 y 4 agregar 4 cantidades diferentes de estándar, para que la
concentración de dentro del rango de linealidad del método. La concentración del
primer tubo será de 9.4 g/L, la del segundo tubo 4.8 g/L, la del tercero 2.4 g/L y por
último el cuarto tubo tendrá una concentración de 1.2 g/L.
3. En el tubo blanco colocar agua destilada.
4. En los tubos 1, 2, 3 y 4 añadir 1 ml de reactivo PR.
5. Programar el espectrofotómetro para medir en un rango entre 300 nm y 700 nm a
intervalos de 1 o 5 nm.
6. Leer en el espectrofotómetro el tubo blanco con agua destilada, posteriormente leer
los 4 tubos con estándar. Imprimir la tabla y el gráfico.
7. Interpretar el espectrograma, donde se observarán peaks de absorción.

La absorbancia del complejo junto a la albúmina de concentración de 9,4 g/L dio una
absorbancia de 595 nm.

10
 La misma absorbancia de 595 nm se alcanzó con el complejo junto a albúmina con
concentración de 4,8 g/L.

La absorbancia alcanzada en el complejo con albúmina de 2,4 g/L disminuyó a 590

nm.

11
 585 nm

A concentración más baja de 1,2 g/L de albúmina, el complejo tuvo un peak más alto que el
peak del complejo con albúmina, tuvo una absorbancia de 585 nm.

Discusión
Los máximos de absorbancias de las concentraciones del reactivo PR-Molibdato +
Albúmina de 9,4 g/L y 4,8 g/L fue de 595 nm. Mientras que para las concentraciones de 2,4
g/L y 1,2 g/L las absorbancias dadas fueron distintas, ya que presentaron dos peaks, las cuales
se descartaron para la determinación, puesto que las concentraciones fueron bajas y no se
logró formar el complejo esperado con un solo peak bien marcado.

Debido que las concentraciones de 9,4 g/L y 4,8 g/L resultaron con una absorbancia
similar a la del artículo y se logra formar un complejo cuantificable, se utilizó esta longitud
de onda de 595 nm para las siguientes determinaciones.

Estabilidad del Reactivo

El estudio de la estabilidad del reactivo se utiliza para observar su comportamiento

en el tiempo y a distintas condiciones como temperatura, luz/oscuridad, pH, entre otras. Para

12
este estudio se utilizaron 3 variables: Tiempo, temperatura y efecto de la luz, las cuales se
estudiaron en conjunto.

Procedimiento

1. Se
preparan 4 tubos
con 1 ml de
reactivo de Rojo
Pirogalol -
Molibdato y 20
ul del estándar
BSA 4,8 g/L.
2. En los 2
primeros tubos se
mide la
absorbancia a
temperatura ambiente, uno en oscuridad y otro en luz. Los dos tubos restantes se
miden a 37°C y al igual que los tubos anteriores se agrega la condición de luz-
oscuridad.
3. Se mide la absorbancia durante los primeros 5 minutos cada 1 minuto y posterior a
esto se mide cada 5 minutos por una hora.
4. Luego de obtenidos los resultados se graficaron las condiciones medidas
5. Se realizan dos gráficos para cada temperatura evaluada graficando la absorbancia
vs tiempo

Reactivo en presencia de luz con variable de temperatura

13
Reactivo en ausencia de luz con variable de temperatura

14
15
Discusión

A partir de los resultados, se logra apreciar en las gráficas la influencia de la

temperatura en el tiempo inicial de incubación desde el tiempo cero a los primeros 10
minutos, pues a 37°C se alcanza con mayor rapidez la estabilidad de la reacción, a diferencia
del reactivo expuesto a temperatura ambiente, el cual demoró más tiempo en alcanzar la
estabilidad. Dentro de los 10 y 30 minutos de reacción la absorbancia se mantiene estable,
tanto en presencia como en ausencia de luz. La temperatura dentro del rango anteriormente
mencionado no influye en la continuidad de la absorbancia, sin embargo, luego de los 30
minutos de reacción, el reactivo expuesto a 37°C muestra un decaimiento considerable, por
lo que pierde su estabilidad.

En el caso del reactivo a temperatura ambiente, si bien éste no decrece en alta

cantidad, pierde su continuidad en el tiempo. En relación al efecto de la luz, este no influye
en la estabilidad del reactivo. Comparando los datos entregados por el paper del método, éste
menciona que se debe esperar antes de medir fotocolorimétricamente 20 minutos luego de
introducir y mezclar la muestra, por lo que demuestra que el reactivo preparado es útil para
realizar los procedimientos posteriores para evaluación del método. Además, como consenso
se decidió iniciar la medición fotocolorimétrica después de 15 minutos del inicio la reacción
de la muestra a determinar con el reactivo y a temperatura ambiente, debido a que se mantiene
estable por 40 minutos y no requiere de incubación, lo cual es más práctico. A 37°C la
reacción es estable más rápido, pero se mantiene estable por menos tiempo, por 30 minutos.

16
 Curva de Calibración

La curva de calibración es un gráfico tipo, en la cual se relacionan distintas

concentraciones de sustancias conocidas con sus lecturas de absorbancias respectivas. Este
debe abarcar un rango lineal del método, para así poder interpolar en la curva, o con la
pendiente (K) utilizando la Ley de Lambert-Beer (𝐴 = 𝐴 𝐴 𝐴) obteniendo las
concentraciones reales de la sustancia que se quiere determinar. Hay que tener en cuenta que
estas curvas deben ser reproducibles y son comprobables por la pendiente.

Procedimiento:

1. Se dispone del estándar 4,8 g/L

2. Se realizan diluciones entre 0.5 g/L hasta 2.5 g/L
3. A cada dilución se agregó un 1ml de reactivo
4. Se dejó por 15 minutos a temperatura ambiente para que reaccione y se midió la
absorbancia a 595 nm

Cálculos:

Ejemplo tubo 3: 𝑉𝑖 𝑥 𝐶𝑖 = 𝑉𝑓 𝑥 𝐶𝑓

𝑋 𝑥 4.8𝑔/𝐿 = 20𝜇𝐿 𝑥 1.5𝑔/𝐿

𝑋 = 6.3𝜇𝐿

Cálculo de la K 𝐴=𝐾𝑥𝐶

0.4875 = 𝐾 𝑥 1.5𝑔/𝐿

𝐾 = 0.325

17
Discusión

A partir de los datos obtenidos de las absorbancias de cada punto se calculó la

constante (K) o pendiente de la curva calculando el promedio de las K que se obtuvo 0.3395,
se determinó el coeficiente de correlación o el 𝑅 2 , que nos dio como resultado 0,990, lo
anterior indica que hay un grado de asociación lineal entre los puntos de absorbancia versus
los de concentración, mientras más cercano al valor 1 hay mayor asociación lineal.

Sensibilidad

La sensibilidad del método corresponde a la evaluación del método respecto a su

capacidad de responder a concentraciones extremas, es decir, concentraciones muy bajas o
altas.

Procedimiento

1. Disponer del estándar de albúmina de 4,8 g/L y 9,6 g/L

2. Diluir el estándar de albúmina de 4,8 g/L, para medir concentraciones muy bajas,
específicamente desde 1,5 g/L a 0,1 g/L. Y para concentraciones altas desde 2,5 a
3,9 g/L
3. Diluir el estándar de albúmina de 9,6 g/L, para medir concentraciones muy altas,
desde 4 a 6,8 g/L
4. Luego de preparar las muestras, esperar 15 minutos, de esta manera la reacción es
estable.
5. Medir la absorbancia a 595 nm
6. Inferir el rango de sensibilidad del método

18
Resultados de Concentraciones bajas

19
Resultados de Concentraciones altas

20
Discusión

Según los resultados obtenidos, la linealidad del método PR-molibdato es de 0,7 g/L
hasta 2,9 g/L, se evidencia en la curva y en los datos de la tabla. Entre este rango se cumple
el principio de linealidad, por debajo de la concentración de 0,7 se pierde este principio,
mientras que por encima de 2,9 g/L el cambio de la curva es evidente.

El cambio de pendiente más allá de esos puntos (concentración 0,7 g/L y 2,9 g/L)
nos permite evidenciar que se distancia de la pendiente de la curva tipo, lo que nos otorga un
criterio para poder decir desde cuando es sensible y hasta cuando pierde la linealidad.

21
 Precisión

La precisión es la variación de los resultados obtenidos con cierto método, se

determina analizando con él reiteradamente la misma muestra en un día o durante un cierto
tiempo (día a día). En este montaje se utilizaron 4 muestras y se repitieron 30 veces cada una.
El resultado se expresa en función a la desviación estándar y se presenta como coeficiente de
variación, si el método tiene una buena precisión el coeficiente de variación estará bajo un
5%.

Procedimiento
1. Ocupamos 4 muestras distintas:

Muestra 1: 4,8 g/L de BSA

Muestra 2: 2,4 g/L de BSA

Muestra 3: 1,2 g/L de BSA

Muestra 4: Orina

2. Por cada muestra se usaron 30 tubos, en los cuales se introdujeron 20 uL de muestra

y 1 ml de reactivo PR - molibdato.
3. Se esperan 15 minutos para que la reacción sea estable.
4. Se mide la absorbancia a 595 nm.

Cálculos:

Ejemplos cálculos:

muestra 1:4.8𝑔/𝐿 𝑥 𝑋𝜇𝐿 = 20𝜇𝐿 𝑥 4.8𝑔/𝐿

𝑥 = 20𝜇𝐿 𝑑𝑒 𝐵𝑆𝐴

muestra 2:4,8𝑔/𝐿 𝑥 𝑋𝜇𝐿 = 20𝜇 𝑥 2,4𝑔/𝐿

𝑥 = 10𝜇𝐿 𝑑𝑒 𝐵𝑆𝐴

muestra 3:4,8𝑔/𝐿 𝑥 𝑋𝜇𝐿 = 20𝜇𝐿 𝑥 1,2𝑔/𝐿

𝑥 = 5𝜇𝐿 𝑑𝑒 𝐵𝑆𝐴
22
 0,12
muestra 4: 𝐶𝑜𝑟𝑖𝑛𝑎 = 0,3395 = 0,35 g/L

calculo 4,8 g/L

𝑎𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 1,04
concentración = = 0.3395 = 3,06 𝑔/𝐿
𝐾

𝑠𝑢𝑚𝑎 𝑎𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎𝑠 30.181

Media = = = 1,04
𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑑𝑒 𝑡𝑢𝑏𝑜𝑠 29

∑(𝑋−𝑚𝑒𝑑𝑖𝑎)2
Desviación estándar= √ 𝑛−1
= 0,035

𝒅𝒆𝒔𝒗𝒊𝒂𝒄𝒊𝒐𝒏
Coeficiente de variación= 𝑥100 = 3,38%
𝒎𝒆𝒅𝒊𝒂

Cálculo 2,4 g/L

𝑎𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 0,79
Concentración= = 0.3395 = 2,32 𝑔/𝐿
𝐾

𝑠𝑢𝑚𝑎 𝑎𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎𝑠 22,225

Media= = = 0,79
𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑡𝑢𝑏𝑜𝑠 28

∑(𝑋−𝑚𝑒𝑑𝑖𝑎)2
Desviación estándar=√ 𝑛−1
=0,024

𝑑𝑒𝑠𝑣𝑖𝑎𝑐𝑖𝑜𝑛 𝑒𝑠𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑟
Coeficientes de variación= 𝑥100 = 3,1%
𝑚𝑒𝑑𝑖𝑎

Calculo 1,2 g/L

𝑎𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 0,54
Concentración= = 0,3395 = 1,5 𝑔/𝐿
𝐾

𝑠𝑢𝑚𝑎 𝑎𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎𝑠 15,207

Media = = = 0,54
𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑡𝑢𝑏𝑜𝑠 28

∑(𝑋−𝑚𝑒𝑑𝑖𝑎)2
Desviación estándar=√ 𝑛−1
=0,035

𝒅𝒆𝒔𝒗𝒊𝒂𝒄𝒊𝒐𝒏 𝒆𝒔𝒕𝒂𝒏𝒅𝒂𝒓
Coeficiente de variación= x100 = 6,48%
𝒎𝒆𝒅𝒊𝒂

Calculo orina 0,35 g/L

𝑎𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 0,12
Concentración= =0,3395 = 0,35 𝑔/𝐿
𝐾

𝑠𝑢𝑚𝑎 𝑎𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎𝑠
Media = = 0,12
𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑡𝑢𝑏𝑜𝑠
23
 ∑(𝑋−𝑚𝑒𝑑𝑖𝑎)2
Desviación estándar =√ 𝑛−1
= 0,01

𝑑𝑒𝑠𝑣𝑖𝑎𝑐𝑖𝑜𝑛 𝑒𝑠𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑟
Coeficiente de variación = 𝑚𝑒𝑑𝑖𝑎
= 8,33%

Los resultados se expresan en la siguiente tabla:

Concentración Estándar Orina H20 Reactivo de N Media Desviación Coeficiente de

(g/L) (uL) (uL) (uL) Pirogalol(ml) aritmética estándar variación
4,8 20 0 0 1 29 1,04 0,035 3,38
2,4 10 0 10 1 29 0,79 0,024 3,1
1,2 5 15 0 1 29 0,54 0,035 6,48
0,36 0 20 0 1 29 0,12 0,01 8,33

Discusión

Los resultados se interpretaron según el coeficiente de variación de cada muestra,

donde se puede ver que las concentraciones altas, 4,8 g/L y 2,4 g/L tienen un coeficiente de
variación menor a 5% por lo que se considera preciso, y las otras dos muestras están fuera
del 5%, concluyendo que entre más baja la concentración, la precisión disminuye. En la
muestra estándar 1,2 g/L se piensa que podría ser un falso coeficiente de variación, puesto
que por disminuir los tiempos la medición de la absorción se realizó en dos
espectrofotómetros distintos y con dos cubetas distintas. En conclusión, el ensayo montado
entre más alta la concentración, más preciso es el método.

24
 Exactitud

La exactitud del método describe si el resultado obtenido coincide o se acerca a un

valor real conocido determinado por un “Gold Standar”. Este estudio se realiza en base a un
suero comercial valorado que informa el valor del analito a controlar y su desviación
estándar. De preferencia se utilizan sueros en diferentes rangos, altos y bajos, para saber
cómo se comporta el método simulando valores patológicos y valores sanos.

Procedimiento

1. Se prepararon triplicados del nivel 1 y nivel 2 del suero control.

2. Se realizó el método Rojo Pirogalol de molibdato.
3. Se agregaron 20µl del suero control con 1ml de reactivo.
4. Se puede medir las absorbancias luego de 15 min a temperatura ambiente, a una
longitud de onda de 595 nm.
5. calcular la concentración obtenida a partir de la absorbancia

Resultados

Absorbancia 595 nm

Mediciones Nivel 1 Nivel 2

1 0.140 0.315

2 0.137 0.331

3 0.130 0.320

Promedio 0.136 0.322

25
Cálculos:

Constante: Se obtuvo a partir de la curva de calibración k=0.34

𝑁𝑖𝑣𝑒𝑙 1 Nivel 2:

𝐴=𝐾𝑥𝐶 𝐴=𝐾𝑥𝐶

0.136/0.34 = 𝐶 0.322/0.34 = 𝐶

0.4𝑔/𝐿 = 𝐶 0.947𝑔/𝐿 = 𝐶

𝟒𝟎𝒎𝒈/𝒅𝒍 = 𝑪 𝟗𝟓𝒎𝒈/𝒅𝒍 = 𝑪

Control 1 Rango magnitud 1 Control 2 Rango magnitud 2

36.6 mg/dl 27,4-45.7mg/dl 108mg/dl 81-135mg/dl

Discusión
Aplicando el método a dos controles comerciales de distinta magnitud, obtuvimos un
promedio de valores de absorbancia para cada nivel de control. El control nivel 1 corresponde
a valores bajos y el control nivel 2 a valores altos.

La K de la curva de calibración es de 0.34, con esto y el valor de la absorbancia

obtuvimos el valor de la concentración para cada control. Para el control nivel 1 la
concentración es de 40 mg/dl y para el control nivel 2 es de 95 mg/dl. Ambos valores de
concentración se acercan al valor medio y se encuentran dentro del rango.

Podemos concluir que el método es exacto ya que los valores se encuentran dentro
del rango otorgado por los sueros controles.

26
 Recuperación

Se evalúa el grado de pérdida o ganancia del analito a determinar en una muestra, durante
todo el proceso del método. comparando la concentración teórica del analito con la
concentración práctica obtenida.

Procedimiento

1. Se debe disponer de un pool de muestras biológicas.

2. Calcular su concentración con el método de estudio y seleccionar una muestra
3. Diluir la muestra seleccionada, de modo de obtener una concentración final igual al
tubo más diluido de la curva de calibración.
4. Preparar 6 tubos en duplicado.
5. Del tubo 1 al 5 agregar 10 ul de distintas diluciones de orina.
6. Al tubo 1 agregar 10 ul de agua destilada.
7. Del tubo 2 a 5 agregar cantidades crecientes de estándar BSA 4,8 g/L hasta completar
el volumen
8. al tubo 6 agregar la misma cantidad de estándar que al tubo 5 y 10 ul de agua destilada.
Este tubo sirve para medir la concentración de proteínas experimentalmente.
9. Se miden las concentraciones según el método de estudio.
10. Se calculan las concentraciones teóricas y se comparan estos valores con los
obtenidos experimentalmente.

27
Resultados

Concentración del estándar g/L 4,8

Concentración de orina g L 0,04

Pendiente 0,2825

Cálculos:

Se midió la absorbancia de la muestra según el procedimiento del método:

absorbancia orina: 0,014

pendiente: 0,3395

𝑨=𝑲𝒙𝑪
𝑪 = 𝑨/𝑲

0,014/0,3395 =0,04

28
Concentración de 10 ul de orina

𝑽𝒊 𝒙 𝑪𝒊 = 𝑽𝒇 𝒙 𝑪𝒇
10𝜇𝑙 𝑥 0,04 = 20 𝜇𝑙 𝑥 𝐶𝑓
𝐶𝑓 = 0,02

Ejemplo de cálculo: Tubo 2

Concentración teórica del estándar

𝑉𝑖 𝑥 𝐶𝑖 = 𝑉𝑓 𝑥 𝐶𝑓

10μL x 4.8g/L =20μL x Cf

𝐶𝑓 = 2,4

a esto se le agrega la concentración de los 10 uL de orina:

𝐶𝑓 = 2,4 + 0,02 = 2,42

Concentración experimental

Pendiente tubo 6:
𝑨=𝑲𝒙𝑪
𝐾 = 𝐴/𝐶
𝐾 = 0,679/2,4𝑔/𝐿
𝐾 = 0,2825

𝑨=𝑲𝒙𝑪
𝐶 = 𝐴/𝐾
𝐶 = 0,638/0,2825
𝐶 = 2,26

29
Porcentaje de recuperación:

𝐶𝑂𝑁𝐶𝐸𝑁𝑇𝑅𝐴𝐶𝐼𝑂𝑁 𝑇𝐸𝑂𝑅𝐼𝐶𝐴
x 100 =
𝐶𝑂𝑁𝐶𝐸𝑁𝑇𝑅𝐴𝐶𝐼Ó𝑁 𝐸𝑋𝑃𝐸𝑅𝐼𝑀𝐸𝑁𝑇𝐴𝐿

2,42
x 100 = 93%
2,26

Discusión

De acuerdo con los porcentajes de recuperación obtenidos que son 93%, 96%, 100%
y 103% se observa que en la realización del método no se pierden altas cantidades de
proteínas en la orina, incluso se obtiene un tubo en el cual no hay pérdida de proteína. Esto
se debe a que este método tiene una sola etapa, no es un método en el cual se requiere de
varios pasos como centrifugar, o precipitar, es solo un paso, mezclar el reactivo con la
muestra problema y medir al espectrofotómetro, luego interpolar la absorbancia obtenida.
Por lo tanto, en método no hay mayor pérdida de proteínas.

30
 Valores de Referencia

Los valores de referencia se obtienen a través de la medición de un determinado número de

muestras que pertenecen a cierto estado de salud. Este concepto abarca tanto rangos normales
(correspondiente a individuos sanos), como individuos en situación de riesgo patológico o
grupos clínicos relevantes. Los valores de referencia estarán basados en estudios realizados
a una población determinada que consta de un grupo de personas bien definido.
Los valores obtenidos, podrán ser utilizados para comparar los valores individuales de un
paciente y de esta manera, llegar a contribuir en el posterior diagnóstico.

Procedimiento

1. Se utilizaron 40 muestras de orina de 24 hr de individuos sanos, se centrifugaron a

5000 rpm por 5 min y se midieron las absorbancias.
2. Luego se calcula la concentración, en el parámetro de mg/ 24 h
3. Se determina la media y la desviación estándar
4. Se determina un rango con la media y dos desviaciones estándar.

∑(𝑋−𝑚𝑒𝑑𝑖𝑎)2
Desviación estándar = √ 𝑛−1

31
32
Cálculos:

Muestra 1
ejemplo cálculo

𝑨 = 𝒌𝒙𝑪
𝐴
𝐶=
𝑘
0,05
𝐶=
0,3395
𝐶 = 0,15 𝑔/𝐿
𝐶 = 147 𝑚𝑔 / 𝐿

suma de los valores obtenidos (mg)

Media = n° de determinaciones

4779 (𝑚𝑔)
Media= 40

Media= 119,475 mg

∑(𝑋−𝑚𝑒𝑑𝑖𝑎)2
Desviación estándar = √ 𝑛−1

Desviación Estándar: 90,16

Valores de referencia= 𝑀𝑒𝑑𝑖𝑎 + 2 𝐷𝑆

119,475 + (2 𝑥 90,160) =
119,475 + (180,32) =
299,795 𝑚𝑔
300 𝑚𝑔 − 24 ℎ𝑟𝑠

33
Discusión

Luego de medir las 40 muestras y obtener los resultados, se calculó la media la cual
es 119,475 mg/24 hrs y la desviación estándar que es 90,160. Ningún resultado escapa de
cuatro desviaciones estándar, por lo que todos estos se consideran para el cálculo final. Con
estos resultados se obtuvo un rango de 0 a 300 mg/24 h que son los valores de referencia.
Estos resultados difieren de lo que indica Watanabe et al., en el que los valores de referencia
van de 28-141 mg por 24 hrs. Esta diferencia en los resultados se debe a que en este método
la población elegida no es representativa de toda la población. Los individuos a los que se le
realizó la medición de proteínas en orina tenían un rango etario reducido que va desde los
20- 26 años aproximadamente, excluyendo a los otros grupos etarios, como adultos mayores
y niños.

Valores patológicos

La importancia clínica de los valores patológicos radica en la evaluación del

comportamiento del método frente a concentraciones altas.

Procedimiento:

1. Se debe obtener 4 muestras de orina 24 hrs de individuos con patologías renales, ya

que estos tienen altas concentraciones de proteínas.
2. Se mide la absorbancia según el método descrito.

Resultados

34
Cálculos:

Muestra patológica 1:

Absorbancia: 0,265
k: 0,3395
Diuresis: 0,68 L

𝑨 = 𝒌𝒙𝑪
𝐴
𝐶=
𝑘
0,265
𝐶=
0,3395
C=0,781 g/L
𝐶 = 781 𝑚𝑔 / 𝐿

Concentración en 24 hrs:

781 𝑚𝑔/𝐿 𝑥 0,68 = 531 mg/ 24 H

Discusión

Estos resultados nos permiten observar el comportamiento del método en muestras

de orina frente a concentraciones elevadas de proteínas. Esto nos indica que con este método
se pueden identificar individuos con alta concentración de proteínas en orina, lo cual tiene
importancia clínica debido a que podrían padecer o estar desarrollando una patología renal.

35
 Conclusión

Basado en el paper “Urinary Protein as Measured with a Pyrogallol Red-Molybdate

Complex, Manually and in a Hitachi726 Automated Analyzer” (Watanabe et. Al 1986)
realizamos un montaje del método modificándolo a nuestras condiciones de laboratorio,
tratando de conservar la eficacia y evaluando su exactitud y precisión.

Para la evaluación del fundamento del método realizamos espectros de absorción a

distintas concentraciones en las cuales las concentraciones altas de 9,4 g/L y 4,8 g/L se
comportaron de manera similar al método del artículo, logrando formarse el complejo y la
albúmina a un peak de 595 nm, en el paper esto sucedía a 598nm.

En las pruebas de estabilidad, vimos tres variantes que eran: temperatura, tiempo y
luz. El método se mantuvo estable tanto en presencia de luz como en ausencia de ésta,
mientras que la temperatura a 37 °C influyó luego de pasados 30 minutos. Como la reacción
fue estable desde los 10 minutos hasta los 30 minutos, se decidió iniciar la medición
fotocolorimétrica después de los 15 minutos del inicio de la reacción con la muestra, con una
temperatura ambiente ya que no influía dentro de nuestro tiempo de estabilidad, no
necesitando así incubación del reactivo. El método del artículo nos dice que el tiempo antes
de medir y desde la reacción con la muestra, se realiza después de los 20 minutos, con el
montaje realizado en nuestro laboratorio disminuimos el tiempo a 15 minutos.

Al realizar la curva de calibración tipo nos dio una constante (K) promedio de 0.3395,
con un coeficiente de correlación 𝑅 2 con un resultado de 0,9901 indicando un grado de
asociación lineal entre los puntos de absorbancia versus los de concentración, acercándose al
valor 1. Al evaluarse la sensibilidad del método resultó lineal desde las concentraciones de
0,7 g/L hasta 2,9 g/L guiándonos por los resultados de las distintas concentraciones y por la
linealidad de la curva tipo.

En comparación a la precisión del método, el paper presenta un coeficiente de

variación de menor al 3.3%, en nuestro montaje el coeficiente de variación presentó un
porcentaje menor al 5%, lo que indicaría que es preciso el método en concentraciones altas
de 4,8 g/L y 2,4 g/L, en concentraciones más bajas como 1,2 g/L se escapa del 5% del
coeficiente de variación, lo que indicaría que no es preciso a concentraciones bajas.

36
 Evaluamos la exactitud de nuestro método comparándolo con dos controles
comerciales de distintas magnitudes, donde obtuvimos un promedio de valores de
absorbancia para cada nivel de control. Con la pendiente de la curva de calibración (K) que
es de 0,34 y junto a los valores de absorbancia se obtuvo la concentración para cada control,
los valores de concentración se encontraban dentro de cada rango. El control 1 con
concentración de 40 mg/dl se encontraba dentro del rango de 27,4 - 45,7 mg/dl, mientras que
el control 2 con concentración de 95 mg/dl se encontraba dentro del rango de 81 - 135 mg/dl,
ambos valores caen dentro de sus rangos respectivamente, por lo tanto, el método trabajado
es exacto.

Según el artículo la recuperación del método es de un 97- 102% en los valores

calculados para albúmina, y de un 71,5% para ℽ-Globulina. En la realización de nuestro
método no se pierden proteínas con resultados de 93% 97% 100% y 103% como resultados
de la recuperación del método, indicando que no existe grandes pérdidas de proteínas, esto
se debe a que dentro de la parte práctica del método solo cuenta con una etapa y por lo tanto
existen pérdidas mínimas.

Para obtener valores representativos como valores de referencias se utilizaron

muestras de una cantidad considerable de personas, 46 muestras de orina de 24 horas. Con
estas muestras se consiguió tener un rango que va de 0 a 300 mg/24 horas como valores de
referencia, existe una discrepancia con lo indicado en el paper, donde los valores de
referencia son de un rango de 28-141 mg/24 horas, esta diferencia se debe a que en este
método la población control elegida no es representativa para una población total. Al realizar
los valores patológicos, se pudo determinar que el método identifica a individuos con
concentraciones de proteínas altas en orina, por lo tanto, esto es representativo en el
laboratorio clínico como método diagnóstico para la detección de patologías de índole renal
y/o su posible desarrollo por algún factor predisponente para cursar enfermedades renales.

Finalmente, el método PR - Molibdato es una buena herramienta diagnóstica para

los laboratorios clínicos, ya que posee una estabilidad suficiente para llevar a cabo el
procedimiento, además, es un método exacto tanto en concentraciones altas y bajas. Sin
embargo, el método posee un amplio rango de sensibilidad a concentraciones altas, pero no
sucede lo mismo en concentraciones bajas, lo mismo sucede con la precisión. En cuanto a
la recuperación, las pérdidas de proteínas a cuantificar son mínimas en el procedimiento.
37
Por lo anterior, este método es ampliamente utilizado en los laboratorios clínicos de la
actualidad, además, es fácil de realizar y automatizar.

38
 Bibliografía

1. Instituto de Bioquímica y microbiología UACH. (2017). Guía de trabajos prácticos

diagnostico bioquímico BIOQ 241. PDF, Valdivia.
2. Watanabe, N., KameI, S., Ohkubo, A., Yamanaka, M., Ohsawa, S., Maklno, K., &
Tokuda, K. (1986). Urinary Proteinas Measured with a PyrogallolRed-Molybdate
Complex, Manually and in a Hitachi726 Automated Analyzer. Retrieved from
https://pdfs.semanticscholar.org/4d00/bb79febfdc23019b021a31ef9e6c8a988a0d.pd
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3. Wiener Laboratories S.A.I.C. (2000). Método colorimétrico cuantitativo para la
determinación de proteínas en orina y líquido cefalorraquídeo. Argentina.
Retrieved from https://www.wiener-
lab.com.ar/VademecumDocumentos/Vademecum%20espanol/proti_u_lcr_sp.pdf

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