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INVESTIGACIÓN ORIGINAL
publicado: 14 noviembre
2017 doi:

10.3389/fcimb.2017.00473

Un nuevo determinante de la
virulencia de Candida
glabrata: El exportador de
acetato CgDtr1
Daniela Romão 1, 2†, Mafalda Cavalheiro 1, 2†, Dalila Mil-Homens 1, 2 , Rui Santos 1, 2 ,
Pedro Pais 1, 2 , Catarina Costa 1, 2 , Azusa Takahashi-Nakaguchi 3, Arsénio M. Fialho 1, 2,
Hiroji Chibana 3* y Miguel C. Teixeira 1, 2*
1
Grupo de Investigación en Ciencias Biológicas, Departamento de Bioingeniería, Instituto Superior Técnico, Universidad
de Lisboa, Lisboa, Portugal, 2 Instituto de Bioingeniería y Biociencias, Grupo de Investigación en Ciencias Biológicas,
Instituto Superior Técnico, Lisboa, Portugal, 3 Medical Mycology Research Center, Chiba University, Chiba, Japón

Publicado: 14 noviembre 2017

Citación:
Romão D, Cavalheiro M, Mil-Homens D, Santos R, Pais P, Costa C, Takahashi-Nakaguchi A, Fialho AM,
Chibana H y Teixeira MC (2017) Un nuevo determinante de la virulencia de Candida glabrata: El Acetato
Exportador CgDtr1. Delantero. Celular. Infect. Microbiol. 7:473. doi: 10.3389/fcimb.2017.00473

Editado
por:
David
Kadosh, University of Texas
Health Science Center San
Antonio, Estados Unidos
Revisado por:
Derek
Thomas, Universidad Estatal
de Grand Valley,
Estados
Unidos Soo
Chan Lee,
Universidad de Texas en San Antonio,
Estados Unidos

*Correspondencia:
Hiroji
Chibana
chibana@faculty.chiba-u.jp
Miguel C. Teixeira
mnpct@tecnico.ulisboa.pt
†
Estos autores han contribuido
igualmente a este trabajo

Recibido: 05 julio 2017

Aceptada: 30 de octubre de 2017
www.frontiersin.org Artículo 473
1
La persistencia y glabrata para proliferar en la hemolinfa de G. mellonella y tolerar la acción de los
virulencia de las hemocitos. Se evaluó el posible papel de CgDtr1 en la resistencia a varios factores
infecciones por Candida de estrés que subyacen a la muerte inducida por fagocitosis. Se encontró que el
glabrata son fenómenos CgDTR1 confiere resistencia al estrés oxidativo y al ácido acético.
multifactoriales, cuya Consistentemente, se encontró que CgDtr1 era un exportador de ácido acético de
comprensión es crucial membrana plasmática, aliviando el estrés inducido sobre las células de C. glabrata
para diseñar estrategias dentro de los hemocitos, y permitiendo así una mayor proliferación y virulencia
terapéuticas más contra
adecuadas. En este Larvas de G. mellonella.
estudio, el supuesto Palabras clave: Cándida glabrata, CgDtr1, virulencia, Galleria mellonella, resistencia al ácido acético
transportador
multimedicamentoso
INTRODUCCIÓN
CgDtr1, codificado por
ORF CAGL0M06281g, Las infecciones causadas por especies de Candida son reconocidas como la cuarta causa más
se identifica como común de infecciones nosocomiales (Wisplinghoff et al., 2004). Se considera que la candidiasis es
responsable de más de 400.000 infecciones potencialmente mortales en todo el mundo cada año
determinante de la (Denning y Bromley, 2015). La Candida glabrata es la segunda causa más común de candidiasis
virulencia de C. glabrata invasiva, con una tasa de mortalidad estimada del 40-50% (Tscherner et al., 2011). Las infecciones
causadas por esta levadura patógena han aumentado en todo el mundo (Rodrigues et al., 2014;
en el modelo de Yapar, 2014), lo que probablemente se deba a la prevalencia relativamente alta de resistencia a los
infección Galleria medicamentos antimicóticos entre los aislados clínicos de C. glabrata (Tscherner et al., 2011;
mellonella. Se ha Pfaller et al., 2014). También puede ser el resultado de su capacidad para sobrevivir en
condiciones de estrés, como las que impone el sistema inmunológico del huésped ( Pfaller et al.,
demostrado que la 2014). Además, C. glabrata es capaz de sobrevivir en superficies inanimadas durante más de 5
supresión del CgDTR1 meses, mientras que C. albicans sólo puede soportar unos 4 meses y C. parapsilosis sólo 2
semanas (Kramer et al., 2006). Por lo tanto, es crucial entender completamente estos fenómenos
disminuye la capacidad relacionados con la patogénesis para diseñar mejores formas de prevenir y controlar la candidiasis
de matar larvas de G. superficial e invasiva causada por C. glabrata.
mellonella al disminuir la En este trabajo, la predicción de C. glabrata Drug:H+ antiporter (DHA) CgDtr1, codificada por
el ORF CAGL0M06281g, ha demostrado jugar un papel en la virulencia y la formación de
capacidad de C. biofilm. ORF CAGL0M06281g se predice que codifica un ortólogo de la proteína Dtr1 de S.
cerevisiae, que fue caracterizado

Fronteras en Microbiología Celular y de Infecciones | Noviembre de 2017 | Volumen 7 |

www.frontiersin.org 2 Artículo 473
Romão et
al.
como transportador de ditirosina necesario para la síntesis de la
pared esporádica (Felder et al., 2002). Se demostró además que
el Dtr1 confiere resistencia al medicamento antipalúdico
quinina, al antiarrítmico quinidina y a los ácidos débiles (Felder
et al., 2002). Dentro de la familia DHA en C. glabrata, se han
caracterizado hasta ahora otros siete transportadores homólogos
(Costa et al., 2014a), y se ha determinado que confieren
resistencia a los fármacos y otros factores de estrés, como
azoles, flucitosina, benomilo, ácido acético y poliaminas,
principalmente al contribuir a la disminución de la acumulación
intracelular de esas moléculas (Chen et al., 2007; Costa et al.,
2013a,b, 2014b; Pais et al., 2016a,b). Curiosamente, se
descubrió que los transportadores de C. albicans DHA CaMdr1,
CaNag3, CaNag4 y, más recientemente, CaQdr1, CaQdr2 y
CaQdr3 juegan un papel importante en su virulencia, aunque
los mecanismos moleculares que subyacen a esta observación
aún están por dilucidarse completamente (Becker et al., 1995;
Yamada-Okabe y Yamada-Okabe, 2002; Shah et al., 2014). Más
recientemente, se descubrió que los transportadores de DHA
CgTpo1_1 y CgTpo1_2 también contribuyen a aumentar la
virulencia de C. glabrata, al aumentar la resistencia a los
péptidos antimicrobianos y la tolerancia a la fagocitosis,
respectivamente (Santos et al., 2017).
En este estudio se estudió el impacto de la expresión de
CgDtr1 en el contexto de la virulencia, utilizando la Galleria
mellonella como modelo de infección. La influencia de CgDtr1
en la proliferación de C. glabrata en este huésped y en la
presencia de hemocitos de G. mellonella fue evaluada más a
fondo. Además, la actividad del CgDtr1 contra el estrés
relacionado con la fagocitosis, incluyendo el estrés oxidativo y
el ácido.
estrés, fue inspeccionado.
MÉTODOS
Cepas, plásmidos y medio de crecimiento
En este estudio se utilizaron cepas de Candida glabrata
CBS138 (prototrófica), KUE100 (prototrófica) (Ueno et al.,
2007) y L5U1 (cgura3O0; cgleu2O0) (Chen et al., 2007).
Las células de C. glabrata se cultivaron en un medio rico en
YEPD,
RPMI 1640 medium o BM minimum medium. YEPD medio
contenido por litro: 20 g de D-(+) glucosa (Merk), 20 g de
peptona bacteriana (LioChem) y 10 g de extracto de levadura
(Difco); mientras que el medio RPMI 1640 (pH 4) contenía 10,4
g de RPMI 1640 (Sigma), 34,5 g de MOPS (Sigma) y 18 g de
glucosa (Merck) por litro. Los medios de BM contenían 20 g/L
de D-(+)-glucosa (Merck), 1.7 g/L de base de levadura-
nitrógeno, sin aminoácidos o sulfato de amonio (Difco) y 2.65
g/L de sulfato de amonio (Merck). La cepa L5U1 fue cultivada
en medio de BM complementada con 60 mg/L de leucina
(Sigma). Saccharomyces cerevisiae cepa BY4741 (MATa,
ura3O0, leu2O0, his3O1, met15O0) y el mutante de supresión
único derivado BY4741_∆dtr1 se obtuvieron de la colección
Euroscarf y se cultivaron en medio de BM complementados con
20 mg/L de metionina, 20 mg/L de histidina, 60 mg/L de leucina
y 20 mg/L de uracil (todos de Sigma). El medio sólido contenía
adicionalmente 20 g/L de Bactoagar (Difco).
Clonación del gen CgDTR1 de C.
glabrata (ORF CAGL0M06281g)
El plásmido pGREG576 de la colección Drag & Drop (Jansen et
al., 2005) se utilizó para clonar y expresar el C. glabrata
CgDtr1 Actividad en C. glabrata
Virulencia
ORF CAGL0M06281g en S. cerevisiae, como se describió
anteriormente (Costa et al., 2013b). El ADN de
CAGL0M06281g fue generado por PCR, utilizando ADN
genómico extraído de la cepa secuenciada CBS138 C. glabrata,
5′-
y los siguientes primers específicos: G
AATTCGATATCAAGCTTTATCGATACCGTCGTCGACAAT
GAG CACCTCCAGAGAGAGACACACACACAC-3′ y 5′-
GCGTGACATAACATAACTAAT
T
ACATGACTCGGAGGACTGACTGACTGACTGACGACTGGA
AACTGGGTTTTTTTAACCC
3′.
Los primers diseñados contienen, además de una región con
homología a los primeros y últimos 20 nucleótidos del
CAGL0M06281g
región codificante (cursiva), secuencias de nucleótidos con
homología al sitio de clonación que flanquea las regiones del
vector pGREG576 (subrayado). El fragmento amplificado fue
co-transformado en la cepa parental S. cerevisiae BY4741 con el
vector pGREG576, previamente cortado con la enzima de
restricción SalI, para obtener el plásmido pGREG576_CgDTR1.
Para permitir la expresión génica en C. glabrata, el
promotor GAL1 presente en el plásmido
pGREG576_CgDTR1 fue sustituido por el promotor MTI
inducible por cobre de C. glabrata, dando lugar al plásmido
pGREG576_MTI_CgDTR1. El ADN del promotor del MTI fue
generado por la PCR con los primers específicos: 5′- T
TAACCCTCACTAAAGGGGAACAAAAGCTGGAGCTGCTGCT
GTA CGACACGCATCATTTGGCAATC-3′ y 5′-
GAAAAGTTTTTTTTTTTTGTTTTTTTTTTGTA
TGTGTTTGTGG-3′. Las cartillas diseñadas contienen,
además de un
región con homología a los primeros y últimos 27 nucleótidos
de los primeros 1.000 pb de la región promotora del MTI
(cursiva), secuencias de nucleótidos con homología a las
regiones laterales del sitio de clonación del vector pGREG576
(subrayado). El fragmento amplificado fue co-transformado en
la cepa parental BY4741 con el plásmido pGREG576_CgDTR1,
previamente cortado con enzimas de restricción SacI y NotI para
eliminar el promotor GAL1 y generar el plásmido
pGREG576_MTI_CgDTR1. Los plásmidos recombinantes
pGREG576_CgDTR1 y pGREG576_MTI_CgDTR1 se verificaron
mediante secuenciación de ADN.
Alteración del gen CgDTR1 de C. glabrata
(ORF CAGL0M06281g)
La eliminación del gen CgDTR1 se llevó a cabo en la cepa
parental KUE100, como se describió anteriormente (Ueno et al.,
2007). Los genes diana fueron reemplazados por un cassette de
ADN que incluía el gen CgHIS3, mediante recombinación
homóloga. El casete de reemplazo fue preparado por PCR
5′-
utilizando los siguientes primers: T
TTTGATTTTTTTTTTACCATAATTTTTTTTAAGATTATTT
ACC
A TAATAGCAGTAACGGGGGGCCGCTGCTGATCACG-3′ y 5′-
ACA
C
TAAATTTTAAACTTAAATTCATTGAAGCCCCTTAGAAAAAA
AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
A ATTATAAGTTTCACATCGTGAGGAGCTGG-3′. El
pHIS906
se utilizó como plantilla un plásmido que incluía CgHIS3 y se
realizó la transformación tal y como se describió anteriormente.
Las secuencias de 3′ de los primers, GGCCGCTGATCACG y
Romão et CgDtr1 Actividad en C. glabrata
al. Virulencia
CAT CGTGAGAGGCTGGGGG fueron adjuntadas a la región 5′-CAGCTTTTATCTCA
utilizando como primers: GAAAACCAG-3′,
de flanqueo de CgHIS3. Las 56 secuencias bp subrayadas eran que es complementario de una región del cassette; y 5′-
secuencias de flanqueo de cada gen. La sustitución del GCTAAGAGAGATTGGCTGCTGAGAGAGAG-_
3′, que es complementario de
CgDTR1 por el cassette CgHIS3 fue verificada por la PCR,
una región posterior al final del CgDTR1 3′.
Además, la supresión de genes fue verificada por la PCR
utilizando los siguientes pares de primers: 5′-
CAACACTAGCGGGTTGTGTTGTG-3′
y 5′-CTGCCTCTTTTATCTGCGA-
3′. No se
identificó ningún producto de PCR a partir de la plantilla de
ADN del mutante, mientras que los productos de PCR claros se
identificaron a partir de la plantilla de ADN de la cepa parental
KUE100.
Galleria mellonella Ensayos
de Supervivencia y
Proliferación
Las larvas de Galleria mellonella fueron criadas en nuestros
insectarios de laboratorio, con una dieta de granos de polen y
cera de abeja en 25◦C en la oscuridad. En los ensayos de
matanza se utilizaron larvas con un peso de 250 ± 25 mg y la
infección de las larvas se basó en el protocolo descrito
anteriormente (Cotter et al., 2000; Mil-Homens y Fialho, 2012;
Santos et al., 2017). Las cepas de C. glabrata se cultivaron en
YEPD hasta la fase estacionaria, cosechadas por centrifugación
y resuspendidas en PBS (pH 7,4). 3,5 µL de suspensión de
células de levadura, que contiene ∼5 × 107 células, se inyectaron
en cada oruga a través del último proleg izquierdo. Para cada
condición, se utilizaron 10 larvas para seguir la supervivencia de
la larva durante un período de 72 h. Las larvas testigo fueron
inyectadas con PBS (pH 7,4). Para los ensayos de proliferación,
tres larvas vivas a las 1, 24 y 48 horas después de la inyección
fueron perforadas en el abdomen con una aguja estéril y se
recolectó hemolinfa.
Ensayos de Fagocitosis de C. glabrata en
G. mellonella Hemocitos
Se aislaron los hematíes de G. mellonella como se describió
anteriormente (Brivio et al., 2010). Hemocitos suspendidos en
medio de insectos Grace (GIM) (Sigma) complementados con
10% de suero fetal bovino, 1% de glutamina y 1% de antibiótico
(10,000 U de penicilina G, 10 mg de estreptomicina).
Se cultivaron células de C. glabrata hasta la fase exponencial
media (OD600 nm = 0,4-0,6) y se recogió el volumen adecuado
para obtener 7 × 102 células/ml en PBS. El medio monocapa de
hemocyte de Galleria fue reemplazado con GIM sin
antimicóticos, y luego las células fueron infectadas con las
suspensiones de levadura con una multiplicidad de infección
(MOI) de 1:5. Después de 1 hora de infección en 37 ◦C, los
hemocitos fueron lavados cuidadosamente dos veces con medio
de cultivo celular. Se midieron células de levadura intracelular
viables después de 1, 4, 24 y 48 h de infección, en la lisis de
hemocitos con 0,5% de Triton X-100.
Ensayos de Susceptibilidad en C.
glabrata y
S. cerevisiae
La susceptibilidad de las células de C. glabrata o S. cerevisiae a
las concentraciones tóxicas de los fármacos seleccionados y del
ácido acético se evaluó como antes, mediante ensayos de
manchas o cultivo en medio de crecimiento líquido (Costa et al.,
2013a,b). Los medicamentos probados incluían los siguientes
compuestos, utilizados en los rangos de concentración
especificados: fluconazol (10- 200 mg/l), ketoconazol (10-50 mg/l),
clotrimazol (1-20 mg/l),
tioconazol (0,2-1 mg/l) y miconazol (0,2-1 mg/l), el
polietileno antifúngico anfotericina B (0.1-0.5 mg/l), y el
fluoropirimidina 5-flucitosina (0,02-5 mg/l).
Evaluación de localización
subcelular CgDtr1
La localización subcelular de la proteína CgDtr1 se determinó en
base a la observación de células BY4741 S. cerevisiae o L5U1 C.
glabrata transformadas con los plásmidos pGREG576- CgDTR1 o
pGREG576-MTI-CgDTR1, respectivamente.
Las suspensiones celulares de S. cerevisiae fueron preparadas
por cultivo en medio BM-U, conteniendo 0.5% de glucosa y
0.1% de galactosa, en 30◦C, con agitación orbital (250
rev/min), hasta que se alcanzó un cultivo estándar de OD600 nm
(Densidad Óptica a 600 nm) = 0.4 ± 0.04. En este punto, las
células fueron transferidas al mismo medio que contenía 0,1%
de glucosa y 1% de galactosa, para inducir la expresión de
proteínas. Las suspensiones celulares de C. glabrata se
prepararon en medio BM-U, hasta que se alcanzó un cultivo
estándar OD600 nm = 0,5 ± 0,05, y se transfirieron al mismo
medio complementado con 50 µM CuSO4 (Sigma), para inducir
la sobreexpresión de proteínas. Después de 5 h de incubación, la
distribución de la proteína de fusión CgDtr1_GFP en S.
cerevisiae o en C. glabrata fue detectada por microscopía de
fluorescencia en un microscopio Zeiss Axioplan (Carl Zeiss
MicroImaging), usando longitud de onda de excitación y
emisión de 395 y 509 nm, respectivamente, e imágenes
capturadas usando una cámara CCD enfriada (Cool SNAPFX,
Roper Scientific Photometrics).
Ensayo de acumulación de acetato 14C
Se realizaron ensayos de acumulación utilizando acetato[ 14C]
radiomarcado, tal y como se ha descrito anteriormente (Costa et
al., 2013a). Para estimar la acumulación de compuesto
radiomarcado (Intracelular/Extracelular) en células de levadura,
se cultivaron células en medio de BM, resuspendidas en medio
de BM, para obtener suspensiones celulares densas (OD600 nm
= 5,0 ± 0,1, equivalente a ∼2,2 mg/(peso seco) ml). El
compuesto radiomarcado se añadió a las suspensiones celulares
(3,5 µM de ácido[14C]-acético (American Radiolabeled
Chemicals; 0,1 mCi/ml) y 65 mM de ácido acético no marcado)
y se siguió la acumulación del compuesto radiomarcado durante
30 minutos hasta alcanzar el equilibrio. La radiactividad se
midió en un contador de centelleo Beckman LS 5000TD.
Medición de la expresión génica
Los niveles de transcripción de CgDTR1 se determinaron
mediante PCR cuantitativa en tiempo real (RT-PCR). El ARN
total se extrajo de células cultivadas en presencia de ácido
acético o peróxido de hidrógeno, y también cuando se
internalizó dentro de los hemocitos de las larvas. Al final de
cada período de incubación, el total de ARN obtenido del
La población de células de C. glabrata se extrajo utilizando el
método del fenol caliente (Köhrer y Domdey, 1991). El ARN
total fue convertido a cDNA para la PCR de transcripción
inversa en tiempo real (RT- PCR) utilizando el kit de
transcriptasa inversa MultiScribe (Applied Biosystems) y el
bloque termociclador RT-PCR 7500 (Applied Biosystems). El
paso de PCR en tiempo real se realizó utilizando cebadores
5′-GGAGCCAAAATGA
adecuados (CgDTR1 Forward:
GAATGATATGTC-3′; CgDTR1 Reverse: 5′-ACCACCTTGAA
ATCGGTGATG-3′; CgACT1 Forward: 5′-AGAGCCGTTCTTC
CCTTCCAT-3′; CgACT1 Reverse: 5′-TTGACCCATACCGACC
ATGA-3′), SYBR reactivos (Applied Biosystems) y
Green§R
el bloque termociclador 7500 RT-PCR (Applied Biosystems).
Se siguieron los parámetros por defecto establecidos por el
fabricante, y
 El instrumento detectó la fluorescencia y la trazó en un gráfico
de amplificación (7500 Systems SDS Software, Applied
Biosystems). Se utilizó el nivel de transcripción del gen
CgACT1 como referencia interna. Para evitar señales positivas
falsas, la ausencia de amplificación no específica con los
primers elegidos fue confirmada por la generación de una curva
de disociación para cada par de primers.

RESULTADOS de C. glabrata que se encuentran dentro del

CgDtr1 es un Determinante de la
Virulencia de C. glabrata contra el
Modelo de Infección por G.
mellonella
Utilizando larvas de G. mellonella como modelo de infección, se
evaluó el posible efecto de la deleción del CgDTR1 en la
capacidad de C. glabrata para ejercer su virulencia. La
supervivencia de las larvas fue seguida durante 72 h mediante la
inyección de 5 × 107 células. El tipo salvaje KUE100
Se encontró que la cepa C. glabrata es capaz de matar un 30%
más de larvas que la mutante de supresión derivada ∆cgdtr1
(Figura 1A). Además, la sobreexpresión de CgDTR1 en el
L5U1
Se encontró que el tipo silvestre de C. glabrata conduce a una
disminución del 50% en la tasa de supervivencia de G.
mellonella, en comparación con las células L5U1 que albergan
el vector de clonación pGREG576 (Figura 1B). Curiosamente,
también fue posible observar que la cepa silvestre L5U1 parece
ser mucho menos virulenta que la cepa silvestre KUE100. Estos
datos sugieren fuertemente que el transportador CgDtr1 está
involucrado en la patogénesis de C. glabrata.

La expresión CgDTR1 aumenta la

proliferación celular de C. glabrata en la
hemolinfa
FIGURA 1 | La expresión de G.la virulencia
de CgDTR1 aumenta mellonellade C. glabrata contra la
Modelo de infección por G. mellonella. (A) La supervivencia de las larvas inyectadas con ∼5 × 107 CFU/larvae de KUE100 C. glabrata silvestre (línea completa), o derivada de ∆cgdtr1 mutante de supresión (línea d
Dada la observación de que la expresión de CgDtr1 aumenta la
capacidad de las células de C. glabrata para matar larvas de G.
mellonella, se realizó un análisis más profundo de los
mecanismos subyacentes. Luego se evaluó la proliferación de
células de C. glabrata dentro de este modelo de infección. La
hemolinfa de las larvas inyectadas se recuperó 1, 24 y 48 horas
después de la inyección y se evaluó el número de células viables
de C. glabrata. Después de 1 y 24 horas de inyección, se
encontró que el número de células de tipo silvestre y de
∆cgdtr1 era indistinguible (Figura 2). Sin embargo, a las 48 h
de inyección, momento en el que se detectó una mayor
diferencia en la tasa de supervivencia de las larvas, se encontró
que la concentración de células silvestres era 4,5 veces mayor
que la de la población mutante (Figura 2). Esta diferencia en
términos de proliferación celular puede explicar muy bien la
diferente capacidad de matar al huésped, especialmente si se
tiene en cuenta que el mutante no presenta ningún defecto de
crecimiento in vitro.
La razón exacta por la que el mutante ∆cgdtr1 no puede
proliferan tanto como el tipo salvaje dentro de la G. mellonella
hemolymph fue entonces perseguido. En primer lugar, se
exploró la hipótesis de que las dos cepas presentan diferencias
en el nivel de resistencia a los péptidos antimicrobianos (AMP).
Se evaluó la resistencia de ambas cepas a la histatina 5 del
AMP, sin embargo, no se observaron diferencias (no se
mostraron resultados). En segundo lugar, se inspeccionó la
resistencia de cada cepa a la fagocitosis por hemocitos, el
insecto equivalente a los macrófagos de los mamíferos. Las
células de C. glabrata fueron expuestas a un cultivo celular de
G. mellonella hemocytes. La concentración de células viables
 del co-cultivo. Después de 1, 4 y 24 h de fagocitosis, se
encontró que el número de células viables de tipo silvestre
internalizadas dentro de los hemocitos era indistinguible del
número de células internalizadas dentro de los hemocitos
(Figura 3A). Después de 48 horas de inyección, se encontró
que la población de células silvestres encontradas dentro de las
células hemocíticas era tres veces mayor que la de las células
mutantes (Figura 3A). Un experimento similar se llevó a cabo
utilizando las células silvestres de L5U1 C. glabrata que
albergan el pGREG576_MTI_CgDTR1, lo que condujo a la
sobreexpresión de CgDTR1 en el momento de la inducción de
CuSO4, o el vector de clonación pGREG576. De acuerdo con
los resultados anteriores, se encontró que la sobreexpresión de
CgDTR1 conduce a un aumento del 25% en la proliferación
celular dentro de los hemocitos (Figura 3B).

CgDtr1 confiere resistencia al ácido débil

y al estrés oxidativo, pero no a los
medicamentos antimicóticos
Dada su función prevista como transportador de resistencia a
múltiples fármacos, junto con los resultados descritos
anteriormente, pareció razonable plantear la hipótesis de que el
papel de CgDtr1 en
La proliferación de C. glabrata en G. mellonella hemocytes está
relacionada con la defensa de la célula de levadura contra los
factores de estrés encontrados.
se midieron los hemocitos después de 1, 4, 24 y 48 h después
dentro de las células hemocíticas. Considerando la identificación
de los
El gen DTR1 de S. cerevisiae como determinante de la
resistencia ácida débil, se evaluó el papel final del CgDTR1 en
este contexto, especialmente considerando que los fagolisosomas
de los macrófagos de mamíferos son altamente ácidos y ricos en
ácido acético (Peleg et al., 2010). Basado en ensayos puntuales,
la eliminación de CgDTR1
FIGURA 2 | La eliminación de CgDTR1 disminuye la proliferación de C. glabrata en
G. mellonella hemolinfa. Se muestra la concentración de células viables de tpo silvestre (gris claro) y Ocgdtr1 (gris oscuro) de C. glabrata KUE100 evaluadas dentro de la hemolinfa total recupe
FIGURA 3 | La expresión de CgDTR1 aumenta la proliferación de C. glabrata en los hemocitos de G. mellonella. La concentración de células silvestres viables de KUE100 C. glabrata (gris claro) y O
disminuyó moderadamente la tolerancia al ácido acético y
benzoico en la cepa KUE100 C. glabrata (Figura 4A). Dada la
importancia de las especies reactivas de oxígeno (ROS) en la
destrucción de las células de levadura fagocitadas, se evaluó
más a fondo el efecto de la expresión de CgDTR1 en la
resistencia al peróxido de hidrógeno. Significativamente,
también se encontró que la eliminación del CgDTR1 afectaba
severamente el crecimiento en presencia de 20 mM de H2O2
(Figura 4A). Basándose en el análisis de las curvas de
crecimiento de las mismas poblaciones en medio líquido, es
posible ver que la supresión del gen CgDTR1 de C. glabrata
aumenta drásticamente la susceptibilidad de la levadura al ácido
acético, aumentando en aproximadamente 20 h el período de la
fase de retardo inducido por la exposición al estrés (Figura 5).
Al exponerse al ácido benzoico 2 mM, se encontró que las
células de tipo silvestre experimentaban un período de 40 h de
fase de retardo, antes de que se pudiera reanudar el crecimiento
exponencial, pero en estas condiciones se encontró que la
población mutante de eliminación no podía reanudar el
crecimiento ni siquiera después de 80 h de la fase de retardo
(Figura 5). De acuerdo con los resultados anteriores, se
encontró que la sobreexpresión del gen CgDTR1 en la cepa
silvestre L5U1 C. glabrata aumentaba su resistencia al estrés de
los ácidos acético y benzoico, así como al H2O2 (Figura 4B).
Curiosamente, también fue posible observar que la cepa silvestre
L5U1 parece ser mucho más susceptible al estrés oxidativo y
ácido débil que la cepa silvestre KUE100. Además, se encontró
que la expresión heteróloga del gen CgDTR1 aumenta
ligeramente la resistencia del tipo salvaje de S. cerevisiae y de
las cepas mutantes contra ácidos débiles y H2O2 (los resultados
no se muestran).
Dada la función prevista del CgDtr1, como miembro del
drug:H+ antiporter family, en resistencia al estrés
farmacológico/químico, se evaluó adicionalmente la
susceptibilidad a los fármacos antifúngicos. Los medicamentos
probados incluyen los azoles miconazol, tioconazol,
 FIGURA 4 | CgDTR1 confiere resistencia a los ácidos débiles y al peróxido de hidrógeno en C. glabrata. (A) Comparación de la susceptbilidad al ácido acétco, al ácido benzoico o al H2O2, en las

FIGURA 5 | CgDTR1 confiere resistencia a los ácidos débiles de C. glabrata. Comparación de la susceptbilidad de KUE100 C. glabrata Wild-type ( ◆) y Ocgdtr1 (□), cepa de eliminación mutante al cultvo en presenc

Las células de C. glabrata que albergan el plásmido

clotrimazol, ketoconazol, itraconazol y fluconazol, la pGREG576_MTI_CgDTR1 se cultivaron hasta la fase
anfotericina B de polietileno y la fluoropirimidina 5-flucitosina. exponencial media en un medio mínimo, y luego se transfirieron
Sin embargo, no se observó ninguna diferencia en cuanto a la al mismo medio que contiene
susceptibilidad de las drogas cuando se comparó la proliferación
de las drogas de tipo silvestre con la de las de tipo silvestre.
∆cgdtr1 eliminación de cepas mutantes (resultados no
mostrados).
CgDTR1 es un exportador de acetato de
membrana de plasma

50 µM CuSO4, para inducir la expresión de la proteína de
fusión. En un OD600nm estándar de 0.5 ± 0.05, obtenido
después de alrededor de 5 h de incubación, las células fueron
inspeccionadas a través de microscopía de fluorescencia. En las
células de C. glabrata, se encontró que la proteína de fusión
CgDtr1_GFP está predominantemente localizada en la periferia
celular (Figura 6A). Las células de S. cerevisiae que albergan
el plásmido pGREG576_CgDTR1 también fueron probadas para
la localización subcelular de CgDtr1, para verificar que en estas
células, el transportador de C. glabrata estaba localizado de
manera similar. En un OD600nm estándar de 0.5 ± 0.05,
obtenido después de alrededor de 5 h de incubación con 1%
de galactosa para inducir la expresión de proteínas, la
fluorescencia fue
 FIGURA 6 | CgDtr1 es un exportador de acetato de membrana plasmátca en células de C. glabrata. (A) Fluorescencia de células L5U1 C. glabrata en fase exponencial o BY4741
Células de S. cerevisiae que albergan los plásmidos pGREG576_MTI_CgDTR1 o pGREG576_CgDTR1, después de 5 h de producción de proteína recombinante inducida por cobre o galactosa, res

que se encuentra principalmente en la periferia de la célula transcripción durante la internalización en los hemocitos. Se
(Figura 6A). También se observa una tinción intracelular de registró un dramático aumento de la expresión de CgDTR1
Dtr1-GFP, posiblemente correspondiente a agregados de durante la internalización de las células de C. glabrata por parte
proteínas mal localizados que resultan de una sobreexpresión de G. mellonella hemocytes (Figura 7A). Curiosamente, al cabo
exagerada. En conjunto, estos resultados sugieren fuertemente de 1 h de co-cultivo con hemocitos, C. glabrata
la localización de la membrana plasmática, a diferencia de lo
que se observó para su homólogo de S. cerevisiae, Dtr1, que
demostró estar localizado sólo en la membrana prosporal
(12).
Dada la localización registrada de la membrana plasmática,
se analizó el posible papel de CgDtr1 como exportador de
acetato. La acumulación de ácido acético[ 14C]-etiquetado en
ácido acético no adaptado
Las células de C. glabrata súbitamente expuestas a la presencia
de 65 mM de ácido acético frío, que induce una leve inhibición
del crecimiento tanto en la cepa parental como en las células
∆cgdtr1, fueron probadas. Se encontró que la acumulación
intracelular de acetato radiomarcado es dos veces mayor en
células sin CgDTR1 que en células KUE100 parentales
(Figura 6B). En conjunto, las pruebas presentadas señalan a
CgDtr1 como exportador de acetato de membrana plasmática.

Los niveles de transcripción de CgDTR1

son
Actualizado durante la
Internalización en Hemocitos y en
Presencia de Estrés de Peróxido de
Hidrógeno
Considerando la importancia de CgDtr1 para la proliferación
dentro de los hemocitos, se siguieron sus niveles de
Las células que no fueron internalizadas por los hemocitos
ya exhiben una regulación cuádruple de los niveles de
transcripción del CgDTR1. Tras 24 o 48 h de
internalización de las células de C. glabrata en los
hemocitos, se encontró que los niveles de transcripción de
CgDTR1 eran 100 veces más altos, lo que pone de relieve la
importancia de este gen en el contexto de la adaptación de
este patógeno al crecimiento dentro de los macrófagos. Para
evaluar cuáles podrían ser los estímulos que conducen a este
aumento de la regulación, se evaluaron los cambios en los
niveles de transcripción del CgDTR1 que se producen en
las células de C. glabrata al cabo de 1 hora de exposición al
ácido acético o al peróxido de hidrógeno. De las dos
tensiones, sólo el peróxido de hidrógeno indujo un aumento
significativo de la expresión de CgDTR1, mientras que
sorprendentemente la exposición al ácido acético llevó a la
disminución de la expresión de CgDTR1 (Figuras 7B,C).
DISCUSIÓN
En este estudio, se demostró que el transportador
multimedicamentoso CgDtr1 desempeña un papel en la
patogénesis de C. glabrata, protegiendo a estas células de los
agentes de estrés presentes en las células macrófagas.
Se descubrió que la eliminación del CgDTR1 aumentaba la
supervivencia de las larvas en el momento de la infección,
disminuyendo en un 30% la capacidad de eliminación de las
células de C. glabrata. El uso de G. mellonella como modelo,
había sido previamente explotado para el estudio de la virulencia
de Candida albicans (Jacobsen, 2014) y C. glabrata (Santos et
al., 2017), y parece ser particularmente útil en este contexto ya
que es difícil causar mortalidad inducida por C. glabrata en
ratones, incluso cuando se enfrentan a la neutropenia (Jacobsen
et al., 2010). Además, el sistema inmunológico innato de la
larva tiene una fuerte similitud con el
 FIGURA 7 | El nivel de transcripción del gen CgDTR1 aumenta durante la internalización en los hemocitos y al exponerse al estrés oxidatvo. Comparación de la variación de los niveles de transcr
(C) 20 mM de peróxido de hidrógeno durante 1 h, en comparación con las células de C. glabrata en crecimiento exponencial. Los niveles de transcripción presentados se obtuvieron por niveles
RT-PCR y son niveles de CgDTR1mRNA/CgACT1mRNA, relatvos a los valores registrados en células exponenciales silvestres cultvadas en condiciones planctónicas. Los valores indicados son pro

El sistema inmunológico innato de los mamíferos, al., 2007). La expresión de una serie de genes que codifican los
especialmente si se considera la respuesta celular dependiente DHAs tienen
de los hemocitos, muy similar a la que muestran los
macrófagos mamíferos (Ribeiro y Brehélin, 2006), en la que
C. glabrata es capaz de sobrevivir y replicarse durante un
tiempo muy prolongado (Seider et al., 2011). Estas
características hacen que el uso de larvas de G. mellonella
sea un modelo interesante y simplificado para entender mejor
lo que ocurre dentro del huésped humano.
Aunque informes anteriores habían mostrado que algunos
genes DHA de la Candida (Yamada-Okabe y Yamada-Okabe,
2002; Shah et al., 2014; Santos et al., 2017), homólogos del
CgDTR1, juegan un papel en la virulencia, los mecanismos
exactos subyacentes a estas observaciones seguían siendo poco
claros. En este trabajo, se encontró que la supresión del gen
CgDTR1 disminuye la capacidad de C. glabrata para matar
larvas de G. mellonella. Se encontró que esta disminución de la
capacidad de matar se correlacionaba con la disminución de la
proliferación de G. mellonella hemolinfa. Nuestros resultados
de la interacción in vitro entre las células de levadura y los
hemocitos parecen apoyar la hipótesis de que CgDtr1 contribuye
a la proliferación celular dentro de los macrófagos. Está claro
que las células ∆cgdtr1 son más susceptibles a los factores de
estrés que se encuentran dentro de las células fagocíticas,
incluyendo el estrés ácido y oxidativo. Además, el dramático
aumento de los niveles de transcripción de CgDTR1 en las
células de C. glabrata tras la internalización en los hematocitos
de G. mellonella, que se correlaciona con el aumento de la
expresión de CgDTR1 inducida por la exposición al estrés
oxidativo, sugiere además que CgDtr1 es un factor importante
para la adaptación a la proliferación dentro de los macrófagos
del huésped.
Consistente con un papel en la resistencia débil a la tensión
ácida, en este estudio se encontró que CgDtr1 es un exportador
de acetato de membrana plasmática. Los ácidos débiles tienen
un impacto en la organización y función de las membranas,
mientras que su acumulación intracelular puede conducir a un
mayor estrés oxidativo, agregación de proteínas, inhibición del
tráfico de membranas y cambios en la organización espacial del
plasma y la membrana vacuolar (Piper et al., 2001; Teixeira et
se ha comprobado que contribuyen a la débil tolerancia a los
ácidos en S. cerevisiae, incluyendo AQR1 y AZR1 (Tenreiro
et al., 2000, 2002), TPO2 y TPO3 (Fernandes et al., 2005) y
TPO1 (Godinho et al., 2017). Curiosamente, CgDtr1 comparte
con su homólogo Dtr1 de S. cerevisiae un papel en la
tolerancia débil al estrés ácido. Sin embargo, dada la
localización de la membrana plasmática y la incapacidad de C.
glabrata para someterse a la esporulación, es poco probable
que CgDtr1 comparta el papel de Dtr1 como transportador de
ditirosina en la membrana prosporal de S. cerevisiae (Felder et
al., 2002). La tolerancia contra los ácidos débiles es importante
para que al menos C. albicans, así como probablemente otras
especies patógenas de Candida, prosperen dentro del huésped,
ya que se han encontrado concentraciones significativas de
ácidos acético y láctico en el tracto vaginal (Davis, 2009), y
dentro del fagolisoma de los macrófagos humanos (Peleg et al.,
2010). Además, se encontró una acción sinérgica entre algunos
medicamentos y el ácido acético, lo que refuerza la importancia
de los mecanismos débiles de resistencia a los ácidos en el
contexto de la terapia antifúngica (Costa et al., 2013a).
En conjunto, los resultados del presente estudio sugieren que
el CgDtr1 desempeña un papel importante en la virulencia de las
infecciones por C. glabrata, posiblemente como un factor de
aptitud física (Kasper et al., 2015), facilitando su proliferación
dentro del huésped al protegerlo contra el estrés ácido débil.
CONTRIBUCIONES DE AUTORES
DR y MC hicieron la mayor parte del trabajo experimental y
redactaron el manuscrito. RS, PP y CC contribuyeron al
trabajo experimental. DM-H y AF diseñaron y realizaron los
experimentos de infección. AT-N y HC diseñaron y llevaron
a cabo la biología molecular de las cepas de C. glabrata. HC
es co-autor correspondiente de este manuscrito. MT diseñó el
flujo de trabajo experimental, supervisó el trabajo
experimental y escribió el manuscrito.
FONDOS
Este trabajo fue apoyado por "Fundação para a Ciência e
a Tecnologia " (FCT) (Contrato PTDC/BBBB-
BIO/4004/2014; becas de doctorado para MC
(PD/BD/116946/2016) y PP (PD/BD/113631/2015) y RECONOCIMIENTOS
becas postdoctorales para CC (SFRH/BPD/100863/2014) y
DM-H (SFRH/BPD/91831/2012). Financiación recibida por el
iBB-Instituto de Bioingeniería y Biociencias del FCT-Fundación
Portuguesa para la Ciencia y la Tecnología
(UID/BIO/04565/2013)
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y del Programa Operacional Regional de Lisboa 2020 (Proyecto
N. 007317). Este estudio fue parcialmente apoyado por un
Programa de Uso Conjunto/Investigación del Centro de
Investigación en Micología Médica de la Universidad de Chiba.
Agradecemos a John Bennett, del National Institute of Allergy
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aportación de la cepa L5U1.
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Declaración de Conflicto de Intereses: Los autores declaran que la
investigación se llevó a cabo en ausencia de relaciones comerciales o financieras
que pudieran interpretarse como un potencial conflicto de intereses.
Copyright © 2017 Romão, Cavalheiro, Mil-Homens, Santos, Pais, Costa,
Takahashi- Nakaguchi, Fialho, Chibana y Teixeira. Este es un artículo de acceso
abierto distribuido bajo los términos de la Creative Commons Atribution License
(CC BY). Se permite el uso, distribución o reproducción en otros foros, siempre
que se acredite al autor o autores originales o al licenciante y que se cite la
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aceptada. No se permite el uso, distribución o reproducción que no cumpla con
estos términos.
1 Artículo 473
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