CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNA EN MUESTRAS BIOLÓGICAS Y COMERCIALES

OBJETIVO:

Emplear algunos métodos de determinación cuantitativa de proteínas y comparar los resultados obtenidos entre
algunas muestras biológicas entre sí y con lo reportado en la literatura.

FUNDAMENTO:
La cuantificación exacta de proteínas, es esencial para todos los experimentos relacionados con proteínas en una
multitud de temas de investigación. Se han desarrollado diferentes métodos para cuantificar proteínas totales, o alguna
en particular. Los métodos de cuantificación de proteínas totales incluyen métodos tradicionales tales como la medición
de la absorbancia a 280 nm, los ensayos de Bradford y el ácido bicinconínico, así como métodos alternativos como el
de Lowry o novedosos ensayos desarrollados por los proveedores comerciales. Normalmente, los proveedores
comerciales venden estuches bien diseñados y prácticos para cada tipo de ensayo. Los métodos para cuantificar
proteínas individuales incluyen el ELISA, el Western blot y, más recientemente, la espectrometría de masas, entre
otros. En la presente práctica, utilizaremos uno de los métodos espectrofotométricos tradicionales

Método de Biuret

La reacción del Biuret sirve para analizar proteínas, ya que los compuestos que contienen dos o más enlaces peptídicos
entre ellos péptidos y proteínas dan un color rosado o lila característico, cuando se tratan con sulfato de cobre diluido
en solución alcalina. El color se debe al complejo de coordinación que se forma entre el átomo de cobre y cuatro
átomos de nitrógeno provenientes de enlaces peptídicos (dos de cada péptido). Los espectros de absorción de los
complejos de cobre formados con diferentes proteínas, son similares, aunque no idénticos. Por consiguiente, es posible
utilizar cualquier proteína como patrón de coloración.

Esta técnica es bastante reproducible para una proteína dada, aunque, para obtener coloración, se requieren
cantidades relativamente grandes de proteína (1 a 20 mg/ml). Por otra parte, no es necesario hacer digestión previa de
la muestra. Compuestos como glicerol, amoniaco, trihidroxirnetil-amino-metano (tris), presentan interferencia.

PROCEDIMIENTO:

1. Coloque una clara de huevo (pato, pavo, gallina criolla y de criadero, codorniz, según se haya acordado con el
profesor) en un vaso de precipitados de 100 ml previamente pesado. Determine el peso por diferencia y agréguele 3
volúmenes de agua destilada (en ml) este peso en gramos, y un volumen de NaOH 1N; agite hasta lograr una
solución total de la muestra. Si la solución presenta sedimento, filtre sobre papel filtro normal. Reserve esta
solución para realizar la cuantificación de la proteína.

2. Pese aproximadamente 1 g de leche descremada comercial en un vaso de precipitados de 50 ml y agréguele

sucesivamente 20 ml de agua destilada y 5 ml de NaOH 1N; agite hasta completa disolución. Filtre si es
necesario eliminar algún sedimento.

Para determinar la concentración de proteínas de las muestras elegidas, se recurre a un patrón en solución acuosa de
proteína en concentración de 5 mg/ ml. (usualmente caseína o albúmina de huevo).

La concentración que tienen las muestras problema se determina por interpolación de los valores de absorbancia en
la curva patrón o por regresión lineal de la curva de calibración. El tubo B, que sólo contiene agua destilada y los
reactivos, sirve de blanco para el ajuste del espectrofotómetro a cero de absorbancia.

Para ello disponga de varios tubos de ensayo rotulados según se indica en la siguiente tabla y disponga los siguientes
reactivos (en ml) en el orden indicado.

Componente B 1 2 3 4 5 6 7 8* 9*
Solución patrón ─ 0.1 0.3 0.5 0.7 0.9 1.2 1.5 ─ ─
de proteína
Extracto/problema ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ 0.5 1.0
Agua destilada 2.0 1.9 1.7 1.5 1.3 1.1 0.8 0.5 1.5 1 1.0
Reactivo de Biuret 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0
* 8 y 9: ejemplo de muestra para analizar a doble concentración. Tenga en cuenta la dilución para reportar el contenido
de proteína de cada muestra particular.
Mezcle bien y deje en reposo por 30 minutos a temperatura ambiente, para permitir el desarrollo del color o coloque los
tubos en el baño termostatado a 37ºC durante 10 minutos. Lea la absorbancia correspondiente a cada tubo a 540 nm.
Previamente el aparato se ajusta a Absorbancia a 0 (cero) con el blanco (tubo B).