Universidad de Guadalajara

Universidad
Centro de Ciencias Exactas ede Guadalajara
Ingenierías
Centro Universitario de Ciencias Exactas e
Ingenierías
Verónica Maria Quezada Rodríguez
217754181
Lic. Químico Farmacéutico Biólogo
Práctica 1:
MICROBIOS DE IMPORTANCIA
Laboratorio de Microbiología
M. en C. Olga Deli Vázque
CLÍNICA

Verónica Maria Quezada Rodríguez

217754181
Lic. Químico Farmacéutico Biólogo

Laboratorio de Microbiología
Objetivo: M. en C. Olga Deli Vázquez Paulino
OBJETIVO(S):
En esta práctica el alumno aprenderá a:

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  Preparar los medios de cultivo necesarios para la caracterización de una bacteria en una
muestra clínica.
 Aislar una cepa mediante el uso de una técnica de siembra adecuada.
 Interpretar las características morfológicas y de crecimiento de una bacteria.
 Hacer uso de pruebas bioquímicas para la caracterización de una bacteria.

INTRODUCCIÓN:
Las especies bacterianas son grupos de cepas (clones) con muchas características en común, y
notables diferencias con otras especies; las taxoespecies presentan una gran similitud fenotípica; las
especies genómicas un alto porcentaje común en las bases de su ADN, y las genotípicas gran homología
en las secuencias de sus genes.

Los caracteres fenotípicos se extraen de:

 La morfología bacteriana
o Tamaño o Esporas
o Aspecto o Cápsulas
o Inclusiones o Flagelos
o Tipo de tinción
 Aspecto en los medios de cultivo
o Morfología o Textura
o Márgenes o Opacidad
o Elevación o Pigmentación
o Superficie
 Propiedades fisiológicas: Margen de crecimiento a distintas temperaturas, pH y cloruro sódico, y
atmósfera de O2 libre.
 Propiedades bioquímicas
o Metabolismo de nitrógeno
o Utilización de hidratos de carbono
o Degradación de macromoléculas
o Tipo de enzimas respiratorias
 Necesidades nutricionales
 Características quimiotaxonómicas
o Tipo de pared celular o Proteínas
o Membrana celular o Lipopolisacáridos
 Inhibición por diversas sustancias
o Colorantes o Fagos
o Antibióticos o Bacteriocinas
 Pruebas serológicas
 Genómica
La identificación de bacterias tiene sus etapas, procedimientos y grado. Una vez llegada la muestra al
laboratorio se examina directamente, en fresco o por medio de tinciones generales o específicas, luego,
las bacterias aisladas en los distintos cultivos se identifican por diversos métodos para conocer género,
especie y biotipos, y luego, si procede, se hacen con ellas otras pruebas, entre ellas la de sensibilidad
antibiótica.

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Una vez obtenidos los resultados de las pruebas bioquímicas y otras, la identificación final puede
efectuarse por medio de los sistemas de esquemas clásicos como el de matriz de cuadrículas y los
diagramas de flujo ramificados. En la matriz de cuadrículas se expresan las pruebas bioquímicas
positivas frente a diferentes sustratos, y el porcentaje de positividad para distintas especies bacterianas.
La precisión es bastante alta, pero la interpretación es tediosa hasta llegar a un patrón determinado para
identificar la especie y el biotipo. Los diagramas de flujo reducen la complejidad de la lectura de toda la
matriz, utilizando algoritmos, pero un fallo en uno de los puntos puede originar interpretaciones erróneas
finales.

PROCEDIMIENTO:
1. Preparación de los medios de cultivo
1) Determinar los medios de cultivo necesarios para la tipificación.
a. Nutritivos:
i. Agar Sangre: Crecimiento de microorganismos exigentes y visualización de hemólisis.
ii. Agar MacConkey: Aislamiento de bacilos gram negativos.
b. Selectivos y/o diferenciales:
i. Agar Salmonella Shigella: Aislamiento de Salmonella spp. y Shigella sp.
ii. Agar Manitol Salado: Aislamiento y diferenciación de estafilococos.
iii. Medio T.C.B.S.: Aislamiento de Vibrio spp.
iv. Agar Cetrimida: Aislamiento de Pseudomonas aeruginosa.
v. Agar Bilis Esculina: Aislamiento de estreptococos del grupo D.
2) Preparar el medio según las instrucciones impresas en el marbete.
3) Esterilizar en autoclave.
4) Vaciar sobre cajas Petri previamente rotuladas.
5) Dejar que solidifique.
6) Almacenar en ambiente de refrigeración.

2. Aislamiento y siembra: Aislamiento por agotamiento de estrías.

1) Crear un ambiente estéril posicionando un mechero frente al área de trabajo.
2) Tomar con un asa de nicromo el cultivo problema.
3) Abrir y sostener con una mano la caja Petri con el medio de cultivo a trabajar.
4) Hacer una descarga haciendo estrías sucesivas que abarquen alrededor de 1/3 de la placa.
5) Hacer tres estrías desde la pared de la caja Petri hasta un nuevo cuadrante.
6) Esterilizar el asa.
7) Estriar de manera sucesiva a partir de las tres estrías hechas con anterioridad.
8) Hacer tres estrías partiendo desde el área recién estriado hasta un nuevo cuadrante.
9) Esterilizar el asa.
10) Estriar de manera sucesiva a partir de las últimas tres estrías hasta agotar el espacio
disponible en la caja, teniendo cuidado de no tocar ninguna estría previamente hecha.
11) Cerrar caja y almacenar en una incubadora por al menos 24 horas a 35ºC.
12) Observar crecimiento.

3. Tinción de Gram

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 1) Preparar el frotis:
a) Colocar una gota de solución salina sobre un portaobjetos limpio.
b) Tomar con el asa una pequeña cantidad de cultivo.
c) Mezclar con la gota de solución salina y distribuirlo sobre la placa hasta conseguir una
capa delgada.
d) Dejar que seque al aire (Secarlo con calor podría deformar la bacteria)
e) Fijar el frotis pasando el portaobjetos rápidamente sobre el mechero tres veces.
2) Empapar la muestra con cristal violeta, y esperar de 30 a 60 segundos.
3) Enjuagar suavemente con agua.
4) Empapar la mancha con lugol, y dejar reposar por al menos 60 segundos.
5) Enjuagar suavemente con agua.
6) Agregar alcohol-cetona por no más de 15 segundos, hasta que el residuo deje de
observarse de color.
7) Enjuagar rápida pero suavemente con agua.
8) Empapar la mancha con safranina, y esperar de 30 a 60 segundos.
9) Enjuagar suavemente con agua.
10) Secar el portaobjetos al aire.
11) Observar con el objetivo de 100X.

4. Pruebas bioquímicas
1) Elegir las pruebas bioquímicas a utilizar.
a) MIO (Movilidad Indol Ornitina): Diferenciación por movilidad, producción de indol y
actividad enzimática ornitina descarboxilasa.
b) Ureasa: Diferenciación por hidrólisis de urea por la enzima ureasa.
c) FAD (Fenilalanina desaminasa): Diferenciación por desaminación de la fenilalanina.
d) TSI (Triple Sugar Iron): Diferenciación por fermentación de glucosa, lactosa y sacarosa
y producción de ácido sulfhídrico.
e) LIA (Lisina Hierro Agar): Diferenciación por descarboxilación y desaminación de la
lisina y producción de ácido sulfhídrico.
2) Inocular cada tubo según el medio que contenga.
a) MIO: Picadura.
b) Ureasa: Agitación.
c) FAD: Estría sin picadura.
d) TSI: Picadura y estría.
e) LIA: Picadura y estría.
3) Incubar de 24 a 40 horas a 35ºC.
4) Observar características de crecimiento, cambio de coloración, formación de gas y turbidez.
5) Añadir reactivo revelador a los medios que lo necesiten (FAD y MIO).
6) Interpretar resultados.

5. Otras pruebas
o Catalasa:
1) Untar con un aplicador de madera estéril una pequeña cantidad de colonia sobre un
portaobjetos.

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 2) Colocar una gota de peróxido de hidrógeno sobre el área untada.
3) Observar si hay o no formación de burbujas.
o Oxidasa:
1) Untar con un aplicador de madera estéril una pequeña cantidad de colonia sobre una tira
de papel filtro estéril.
2) Colocar una gota de reactivo de Kovacs sobre el área untada.
3) Observar si hay o no cambio en la coloración.

RESULTADOS:
 Observación microscópica: Cocos Gram+.
 Observación macroscópica: Sobre el agar sangre: colonias puntiformes, con un diámetro
menor a 1 milímetro. Incoloras, ligeramente blanquecinas. Elevación imperceptible. Margen
entero.
 Agar Sangre: Crecimiento sin hemólisis.
 Agar MacConkey: Sin crecimiento.
 Agar Salmonella Shigella: Sin crecimiento.
 Agar Manitol Salado: Sin crecimiento.
 Medio T.C.B.S: Sin crecimiento.
 Agar Cetrimida: Sin crecimiento.
 Agar Bilis Esculina: Crecimiento abundante. Colonias pequeñas, incoloras. Medio totalmente
negro después de 72 horas.
 Medio MIO: Desarrollo restringido a la picadura (negativo), color amarillo (desaminación) y
ausencia de color rojo tras añadir el reactivo revelador (negativo).
 Caldo urea: Sin cambios en el color (negativo).
 Medio FAD: Sin cambios de color en el pico de flauta (negativo).
 Medio TSI: Medio totalmente amarillo (A/A), sin producción de gas ni producción de ácido
sulfhídrico.
 Medio LIA: Medio totalmente amarillo (A), sin producción de ácido sulfhídrico y ausencia de color
rojo en la superficie inclinada (negativo).
 Prueba de oxidasa: Sin cambio de coloración (negativo).
 Prueba de catalasa: Sin producción de burbujas (negativo).

DISCUSIÓN:
La simple observación de cocos Gram+ nos indica que la especie a identificar pertenece a uno de los
géneros Staphylococcus, Streptococcus o Enterococcus. La ausencia de crecimiento en el medio
MacConkey tan solo confirma estos dos puntos (que no es bacilo ni es gram-).

El crecimiento y ennegrecimiento del agar Bilis Esculina indica que es una especie perteneciente al
género Enterococcus o un estreptococo del grupo D. Muchos estreptococos del grupo D han sido
reclasificados dentro del género Enterococcus, exceptuando a S. bovis S. bovis y S. equinus. Al no
encontrar reportes de zoonosis de ninguna de estas dos especies, se pueden discriminar del análisis.

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Streptococcus agalactiae presenta un halo de beta-hemólisis, los estreptococos del grupo viridans uno
de alfa-hemólisis y Enterococcus usualmente no presentan hemólisis.

Ninguno de estos cocos presenta movimiento, producción de indol ni descarboxilación de la ornitina

(aunque en algunos es variable), por lo que la prueba de MIO estuvo de más.

Tanto el género Staphylococcus como el género Enterococcus son negativos en la prueba de oxidasa,
mientras que, en cuanto a la catalasa, Staphylococcus spp. da un resultado positivo mientras que
Enterococcus spp. da un resultado negativo.

CONCLUSIONES:
Tras el análisis de los resultados anteriormente discutidos, puedo concluir que mi bacteria pertenece al
género Enterococcus. Pudo haber bastado con la identificación presuntiva del crecimiento en el agar
Bilis Esculina y la observación al microscopio, pero el resto de los resultados lo comprobaron.

BIBLIOGRAFÍA:
 Britania. Hojas de seguridad. Disponibles en:
https://www.britanialab.com/back/public/upload/productos/upl_5a281ad50f34a.pdf
 Gil, M. (2018). Prueba de Oxidasa: Fundamento, Procedimiento y Usos. [Página web]. Disponible
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 Gobernado, M. y López-Hontangas, J. (2003). Identificación bacteriana. Enfermedades
Infecciosas y Microbiología Clínica. Vol. 21. Núm S2. pp. 54-60.
 Koneman, E. et al. (2008). Diagnóstico Microbiológico: Texto y Atlas en Color. 6ª edición. Editorial
Médica Panamericana: Buenos Aires, Argentina.
 Valtek Diagnostics. Hojas de seguridad. Disponibles en: https://andinamedica.com.pe/wp-
content/uploads/2016/08/Medio-LIA.pdf
 Quispe, D. et al. (2004). Cocos Gram Positivos. Revista de Actualización Clínica Investiga. Vol.
49. ISSN 2304-3768.