MATERIALES Y MÉTODOS

Reactivos

 Muestras de aceite de Crude Oil Indian Corporation Pvt

 Caldo R2B
 Medio de sal mineral
 Caldo Bushnell Haas
 N-hexano
 Sulfato de sodio anhidro

Materiales

 Bolsas de polietileno estériles

 Placa petri
 Matraces erlenmeyer
 Embudo
 Vasos precipitados

Equipos

 Evaporador rotatorio

PROCEDIMIENTO

COLECCIÓN DE MUESTRA: La muestra de suelo se usó para analizar los

parámetros físico-químicos y para aislar las bacterias.

Las muestras se recolectaron a una profundidad de 5 cm de la superficie del

suelo.

Se recogieron en bolsas de polietileno estériles y se empaquetaron

herméticamente. Luego se transfirieron cuidadosamente al laboratorio para el
análisis y se almacenaron a 4 ° C de forma aséptica antes del procesamiento.

MEDIOS: caldo R2B, medio de sal mineral, caldo Bushnell Haas -> para
detección y aisalmiento de bacterias del petróleo crudo.
MÉTODO DE SELECCIÓN:

DETECCION.- Se inocularon 5 g de muestra de suelo en caldo R2B y se

incubaron a 37 ° C durante 2 días. Después de la incubación, se colocaron en
placa 0,1 ml de caldo de cultivo en medio de sal mineral utilizando una técnica
de placa de extensión. Una solución etérea de aceite crudo (10% p / v) se
pulverizó uniformemente sobre la superficie de la placa de agar. El éter se
evaporó de inmediato y quedó una capa delgada de aceite en toda la superficie.
Las placas se incubaron a 25ºC durante 2 días. Los organismos que formaron
zonas claras alrededor de las colonias se consideraron como degradadores del
petróleo crudo.(Una placa de agar es una placa de Petri que contiene un medio
de cultivo usada en microbiología para cultivar microorganismos o pequeñas
plantas.

AISLAMIENTO Y ENNUMERACIÓN.- se realizaron mediante la técnica de placa

de dilución del suelo utilizando medios de agar Bushnell Haas. Un gramo de
suelo seco se disolvió en 9 ml de agua destilada y se agitó vigorosamente. Se
aplicaron diferentes diluciones acuosas 10-1, 10-2 ... 10-10 de la suspensión
sobre placas y se le agregaron 20 ml de medio fundido a aproximadamente 50 °
C. Después de rotar suavemente, las placas se incubaron a 37ºC durante 24
horas. La enumeración de diferentes aislados se llevó a cabo. Las colonias
seleccionadas de bacterias se transfirieron de las placas de cultivo mixtas a las
placas de agar respectivas y se incubaron a 37 ° C durante 24 horas. Las placas
que contenían cultivos puros se almacenaron a 4 ° C hasta el examen.

DEGRADACIÓN DEL PETRÓLEO.- Para examinar la degradación del aceite, se

utilizó medio Bushnell Haas (BHM) suplementado con 5 g / l de aceite crudo. Se
dispensaron aproximadamente 50 ml de medio en matraces cónicos de 250 ml.
Los medios se inocularon con 0,1 ml de bacterias que degradan el petróleo crudo
(bacterias obtenidas mediante la selección de bacterias degradantes del petróleo
crudo) y se incubaron a 28 ° C durante 7 días en un batido rotatorio a 175 rpm.

ESTIMACIÓN DEL CRECIMIENTO Y LA PROTEÍNA DE CÉLULAS ENTERAS.-

Estimación del crecimiento y la proteína de células enteras

 Para estimar el crecimiento en términos de proteína celular completa [10],

se centrifugaron 0,5 ml de medio a 3000 rpm durante 10 minutos. El
 sedimento celular se lavó dos veces con solución de Ringer y los
sedimentos se resuspendieron en 1,0 ml de NaOH 4,6 M a temperatura
de ebullición durante 10 minutos para obtener una concentración de
proteína de extracto libre de células en extractos libres de células fue
estimado por un método [11]. El crecimiento también se monitorizó
midiendo la densidad óptica a 620 nm.

EXTRACCIÓN DE PETRÓLEO CRUDO.- Para la estimación de las tasas de

degradación del aceite por análisis gravimétrico, se agregaron 5 ml de n-hexano
a los matraces anteriores. Los contenidos se transfirieron a un embudo de
separación y se extrajeron. La extracción se lleva a cabo dos veces para
asegurar la completa.

-Recuperación del petróleo: El extracto se trató con 0,4 g de sulfato de sodio

anhidro para eliminar la humedad y se decantó en un vaso de precipitados
dejando atrás sulfato de sodio. Esta se evaporó a sequedad en un evaporador
rotatorio a presión reducida.

ANÁLISIS GRAVIMÉTRICO: [12] La cantidad de aceite residual se midió

después de la extracción de aceite a partir del medio y evaporando a sequedad
en el evaporador rotatorio a 40 ° C bajo presión reducida. El volumen de aceite
extraído se dedujo del vaso de precipitados previamente pesado.

El% de degradación se calculó:

Peso residual de petróleo crudo = Peso del vaso con el petróleo extraído -
Peso vaso vacío

Cantidad de petróleo crudo degradado = Peso de petróleo crudo (añadido

en los medios) - Peso residual de petróleo crudo

% De degradación = (Cantidad de petróleo crudo degradado / Cantidad de

petróleo crudo añadió en los medios) x 100

IDENTIFICACIÓN DE LOS AISLAMIENTOS.- Las características de la colonia y

la morfología celular de la aislado, su pigmentación, reacciones de tinción,
fisiológico y características bioquímicas fueron examinados por métodos
estándar y se identificaron los aislados
REFERENCIAS:

[10.] Stanley GA, Juhasz A, Britz ML, J.Ind. Microbiol. Biotechnol., 2000, 24,
277.

[11.] Lowry OH, Rosenbrough NJ, Farr AL, Randall RJ, J. Biol. Chem., 1951, 193,
265.

[12.] Saxena MM, Environmental analysis: Water, soil and air. 1990.