CÁLCULO DE LA KM Y DE LA Vmax DE UN ENZIMA

La representación gráfica de la ecuación de

Michaelis-Menten (v0 frente a [S]0) es una
hipérbola (Figura de la izquierda). La
Vmax corresponde al valor máximo al que
tiende la curva experimental, y la
KM corresponde a la concentración de sustrato
a la cual la velocidad de la reacción es la mitad
de la Vmax.

Para determinar gráficamente los valores de KM y

Vmax es más sencillo utilizar la representación doble
recíproca (1/v0 frente a 1/[S]0), ya que es una línea
recta. Esta representación doble recíproca recibe el
nombre de representación de Lineweaver-
Burk (Figura de la derecha). Es una recta en la cual:

 La pendiente es KM/Vmax
 La abscisa en el origen (1/v0 = 0) es -1/KM
 La ordenada en el origen (1/[S]0 = 0) es 1/Vmax

De esta forma, a partir de los datos experimentales se

puede calcular gráficamente, los valores de KM y
Vmax de un enzima para diversos sustratos.
 ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
Se define la unidad de actividad enzimática (U) como la cantidad de enzima que cataliza la
conversión de 1 µmol de sustrato en un minuto. La actividad específica es el número de unidades de
enzima por miligramo de proteína (U/mg prot) o por mililitro de disolución (U/ml).

Recientemente, el Sistema Internacional de unidades (SI) ha definido la unidad de actividad enzimática

como la cantidad de enzima que transforma 1 mol de sustrato por segundo. Esta unidad se
llama katal (kat). Como 1 mol son 106 µmoles y 1 minuto son 60 segundos, resulta que 1 katal
equivale a 60 x 106 U. Esta unidad es muy grande, de forma que se utilizan frecuentemente los
submúltiplos como el microkatal (µkat, 10-6 kat) o el nanokatal (nkat, 10-9 kat).

Cuando se conoce el peso molecular del enzima puro y el número de centros activos por molécula de
enzima, las medidas de actividad enzimática permiten calcular el número de recambio del enzima, o
sea, el número de reacciones elementales que realiza el enzima por cada centro activo y por unidad de
tiempo.
¿Cómo calcular la actividad enzimática?

En la práctica nº1, en la que se ensaya la actividad beta-galactosidasa

de una preparación enzimática he obtenido los siguientes resultados
:

La tabla adjunta Tiempo Enzima Enzima

recoge los valores de (min) concentrada diluida
absorbancia a 420nm
medidos en cada uno 0 0 0
de los tubos en
sendos ensayos 5 1.3 0.32
realizados en primer
lugar con una 10 1.8 0.62
preparación de
enzima concentrada y 15 2.3 0.86
más tarde con una
preparación de
enzima diluida (1:5).
La mezcla de reacción
contiene 590 µl de
buffer Z,
120 µl de sustrato
 y 10 µl de preparación
enzimática. La
reacción se detiene
añadiendo
300 µl de carbonato
sódico, de modo que
el volumen final de
reacción es Vf = 1’02
ml

Rápidamente voy al aula de ordenadores a meter los datos en una

página Excel para dibujar las gráficas correspondientes.

Al representar, en la gráfica de la izquierda, los datos del ensayo con

la enzima concentrada veo que los puntos no se ajustan a
una linea recta, sino más bien a una hipérbola. Sin embargo con la
enzima diluida, parece que los datos se ajustan a una linea recta.
Como he utilizado la misma escala para ambas series de datos, la
recta correspondiente a la enzima diluida no la veo muy bien, así que
hago una nueva representación sólo con los datos correspondientes
al ensayo con la enzima diluida (gráfica de la derecha) y ahora,
después de ampliar la escala, ya veo mejor el
comportamiento cinético de la reacción. Aprovecho para
incorporar a la gráfica la ecuación de la recta (y = 0.0576x + 0.018) y
el valor de la regresión (r2= 0.996).
¿Cuál es el significado del coeficiente de extinción molar o
absortividad molar ?

El guión de la práctica especifica que el coeficiente de extinción

molar del o-nitrofenol en carbonato es 4’5 mM-1cm-1.

¿Esto qué significa? La interpretación de ese dato es la siguiente: Si

ponemos en la cubeta del espectrofotómetro una disolución de o-
nitrofenol cuya concentración sea 1 mM, entonces el valor de
absorbancia que mediría el aparato sería 4’5.
Es muy fácil si aplicas correctamente la ley de Lambert-
Beer A=εxbxc
donde A = absorbancia ; ε = Coeficiente de extinción molar ; b =
paso de luz (en la cubeta) ; c = concentración de analito
entonces A = 4’5 mM-1cm-
1
x 1 cm x 1 mM y el resultado es A = 4’5

De aquí deducimos un dato muy importante para los cálculos de

esta práctica: Un valor de absorbancia de 4’5 corresponde a una
concentración 1 mM de o-nitrofenol en la cubeta del
espectrofotómetro. Esto es, un valor de 4’5 unidades de absorbancia
corresponde a una disolución de o-nitrofenol que contiene 1 mmol x
L-1, o lo que es lo mismo 1 µmol x ml-1.

Con esta relación entre la absorbancia y la concentración de o-

nitrofenol, ya estamos en condiciones de convertir nuestros
resultados experimentales en concentraciones y en consecuencia
determinar la actividad de la preparación enzimática.

¿Cuál es el significado del coeficiente de extinción molar o

absortividad molar ?

El guión de la práctica especifica que el coeficiente de extinción

molar del o-nitrofenol en carbonato es 4’5 mM-1cm-1.

¿Esto qué significa? La interpretación de ese dato es la siguiente: Si

ponemos en la cubeta del espectrofotómetro una disolución de o-
nitrofenol cuya concentración sea 1 mM, entonces el valor de
absorbancia que mediría el aparato sería 4’5.
Es muy fácil si aplicas correctamente la ley de Lambert-
Beer A=εxbxc
donde A = absorbancia ; ε = Coeficiente de extinción molar ; b =
paso de luz (en la cubeta) ; c = concentración de analito
entonces A = 4’5 mM-1cm-
1
x 1 cm x 1 mM y el resultado es A = 4’5

De aquí deducimos un dato muy importante para los cálculos de

esta práctica: Un valor de absorbancia de 4’5 corresponde a una
concentración 1 mM de o-nitrofenol en la cubeta del
espectrofotómetro. Esto es, un valor de 4’5 unidades de absorbancia
corresponde a una disolución de o-nitrofenol que contiene 1 mmol x
L-1, o lo que es lo mismo 1 µmol x ml-1.

Con esta relación entre la absorbancia y la concentración de o-

nitrofenol, ya estamos en condiciones de convertir nuestros
resultados experimentales en concentraciones y en consecuencia
determinar la actividad de la preparación enzimática.

¿Cómo calculo la actividad enzimática?

Para empezar vuelvo a la gráfica del ensayo cinético con la enzima

diluida. Tomo un valor cualquiera de tiempo, por ejemplo 7 min., que
no tiene por qué ser ninguno de los utilizados en el ensayo
experimental (5, 10 y 15 min), y aplicando la ecuación de la recta,
calculo la absorbancia correspondiente. (Puedes intentarlo con los
valores de tiempo que tú quieras, por ejemplo 3 min, 13 min, etc…).

Recordamos la ecuación de la recta y = 0.0576x +

0.018 donde y = Absorbancia x = Tiempo

La aplicamos a nuestro valor de “x”= (7 min)

y = 0.0576 x 7
+ 0.018 resulta y = 0’42.
YA SABEMOS LA ABSORBANCIA.
Ahora utilizamos la ecuación A = ε x b x c para calcular la
concentración de o-nitrofenol en la cubeta.

Sustituyendo los valores resulta 0’42 = 4’5 mM-1cm-

1
x 1 cm x “c” mM

Despejando “c” y haciendo operaciones resulta c (mM) = 0’093

Esto significa que la concentración de o-nitrofenol en la cubeta
es 0’093 mM, o lo que es lo mismo 0’093 mmol x L-1, que equivale
a 0’093 µmol x ml-1.

YA SABEMOS LA CONCENTRACIÓN DE PRODUCTO EN LA CUBETA

(Y EN EL TUBO DE REACCIÓN)

Teniendo en cuenta que el volumen final del tubo de reacción es

de Vf = 1’02 ml
podemos calcular la cantidad de producto (o-nitrofenol) generado
por la enzima en 7 minutos (nuestra “x”)
simplemente multiplicando c x Vf  cantidad de producto
= 0’093 µmol x ml-1 x 1’02 ml = 0’095 µmoles de o-
nitrofenol generados en 7 min.

Y para referirlo a la unidad de tiempo, dividimos 0’095 µmoles de o-

nitrofenol : 7 minutos = 0’0136 µmoles de o-nitrofenol x min-1

YA SABEMOS LA CANTIDAD DE PRODUCTO GENERADO POR

UNIDAD DE TIEMPO EN UN TUBO DE REACCIÓN

Por definición 1 unidad de actividad enzimática es una cantidad de

enzima que genera 1 µmol de producto en 1 minuto en condiciones
óptimas de reacción. Para la enzima que nos ocupa, una unidad
de β-galactosidasa es la cantidad de enzima que genera 1 µmol de o-
nitrofenol x min-1 en condiciones óptimas de ensayo. Como en
nuestra reacción se han generado 0’0136 µmoles de
o-nitrofenol x min-1 tendremos 0’0136 unidades de enzima en el
tubo de reacción.

YA SABEMOS LAS UNIDADES DE ENZIMA EN EL TUBO DE

REACCIÓN

Para calcular la concentración de enzima, tenemos que referir las

unidades de enzima al volumen de preparación enzimática diluida. Si
recuerdas, el ensayo se realiza añadiendo10 µl de preparación
enzimática, luego, toda la enzima del tubo de reacción procede de un
volumen de 10 µl. Y por ello para referirlo a la unidad de volumen (1
ml) tendremos:

0’0136 unidades x 1000 µl = 1’3

-1
6 Unidades x ml
10 µl 1 ml
Por lo tanto, YA SABEMOS LA CONCENTRACIÓN DE ENZIMA EN LA
MUESTRA DILUIDA

Ahora sólo nos queda corregir el efecto de la dilución (1:5) para saber
la concentración de enzima en la preparación original (muestra
concentrada). Para ello multiplicamos la concentración de enzima en
la muestra diluida por el factor de dilución:

1’36 Unidades x ml-

1
x 5 = 6’80 Unidades x ml-1

De modo que la concentración de enzima en la muestra original

es 6’80 Unidades x ml-1

Si haces los cálculos para los tres tiempos experimentales (5, 10 y

15 min) y promedias, el resultado es 6’78 +/- 0’14 Unidades x ml-1

http://www.bioqss.byethost15.com/PRACTICAS_DE_LABORATORIO/p1.htm
PRACTICAS DE BIOQUIMICA
¤ Las prácticas se realizan en el Laboratorio de Bioquímica y Biología
Molecular, en horario de 15 a 18h. Durante una semana tendrás tres
horas diarias de clases prácticas, así que procura aprovecharlas al
máximo y no pienses en terminar cuanto antes.

¤ Es conveniente que antes de venir al laboratorio hayas leído y

analizado con detalle los distintos apartados del guión de la práctica.
Esto es fundamental para entiendas lo que vas haciendo durante el
desarrollo del experimento.

¤ Por favor, deja tus prendas de abrigo, carpetas, bolsos, etc… en tu

taquilla y trae al laboratorio sólo los accesorios que sean
estrictamente necesarios para el desarrollo de la práctica: bata de
laboratorio, espátula, gafas de protección y un pequeño cuaderno o
libreta para tomar notas.

¤ Las prácticas están supervisadas por un profesor y en la poyata

dispondrás de un protocolo que describe el desarrollo experimental
diario.

¤ Cada alumno debe elaborar un cuaderno de prácticas, escrito a

mano, en el que recoja toda la información que estime conveniente
para la evaluación de su participación en esta actividad. En el enlace
correspondiente hay información adicional sobre los contenidos y
formatos de un buen cuaderno de laboratorio.

¤ Los enlaces siguientes te dan acceso a información adicional sobre

el desarrollo de las prácticas:
[Micropipetas] [Espectrofotometría] [Cuaderno de Prácticas] [Grupos] [Notas]

¤ Accede al guión de cada práctica pinchando en las figuras:

 Práctica 1. Ensayo de actividad enzimática. [Cálculos]
 Práctica 2. Separación de moléculas mediante cromatografía
de exclusión molecular [Fundamentos básicos]
 Práctica 3. Determinación cuantitativa de la concentración de
proteína. [Cálculos]
 Práctica 4. Aislamiento y purificación de ADN bacteriano.