Química Analítica

Los withanolidos aislados de Nicandra physaloides protegen a las células del hígado
contra el daño inducido por el estrés oxidativo
Rentería Castelán Arturo; Durán Escobedo José Andres; Martínez Guzmán Mariel Izbeth 4FV2
Prof. Pescador Piedra Juan Carlos.

● Introducción

Nicandra physaloides es una planta herbácea

perteneciente a la famila de las Solanaceae y se distribuye
en Yunnan, Guangxi, Guizhou y otros lugares de China. Se
ha informado que Su fruto es rico en proteínas,
carotenoides, vitamina A y vitamina C y son también una
buena fuente de antioxidantes. Estudios fitoquímicos
mostraron que la N. physaloides contiene grandes
cantidades de withanolidos y amidas fenólicas con efecto
farmacológico antitumoral, antiinflamatorio, insecticida y de
protección a las células nerviosas.

El hígado desempeña un rol vital en el metabolismo, excreción y desintoxicación en el

cuerpo humano. Su fuerte actividad metabólica es usualmente acompañada por la
generación de especies de oxígeno reactivas (ROS). En un estado patológico las
generaciones de grandes cantidades de ROS no pueden ser limpiadas a tiempo, lo que
produce un estrés oxidativo. La respuesta a esto puede ser un mediador importante al
daño a las estructuras celulares como membranas y DNA. El estrés oxidativo está
relacionado estrechamente con la lesión hepática, por lo tanto, su prevención y deterioro
pueden ser un blanco para la hepatoprotección.

El factor nuclear Eritroide-2 (Nrf2) es un activador de la transcripción que se une a los

elementos de respuesta antioxidante. En condiciones de estrés Nrf2 puede ser
translocado en el núcleo para activar la expresión de genes que responden a los
antioxidantes e inducir enzimas destoxificantes. La hemooxigenasa-1 (Ho-1), es una
enzima limitante de la velocidad en el hemocatabolismo, se ha identificado como un
importante factor protector endógeno inducido en muchos tipos de células por diversos
estimulantes. La vía Nrf2 y Ho-1 constituye un sistema de defensa para eliminar las ROS.

Los withanolidos son un tipo de derivados esteroideos del tipo criostato de origen natural,
con un anillo delta o gama-lactona o lactol en la cadena. En el siguiente estudio químico
en las cálices y frutas se condujo al aislamiento de algunos withanolidos representativos,
midiendo sus efectos en células LO2 tratadas con H2O2.
 ● Materiales y métodos.

Materiales
Gel de sílice GF254 preparado para TLC y gel de sílice (malla 200–300) para la
cromatografía en columna (CC) se obtuvo de Qingdao Marine Fábrica de productos
químicos (Qingdao, China). ODS (60–80 μm, YMC, Japón) fue utilizado para
cromatografía en columna (CC). Sephadex LH-20 era un producto de Pharmacia
(Amersharm, Uppsala, Suecia). Octadecil gel de sílice (10 mm) fue comprado de Merck
Chemical Company Ltd (Darmstadt, Alemania). Todos los reactivos para extracción y
aislamiento fueron comprados de Tianjin Damao Chemical Company (Tianjin, China). El
peróxido de hidrógeno (H2O2, 30%) se adquirió de Sinopharm Group Reactivo químico
Co., Ltd (Shanghai, China). Especies de oxígeno reactivas (ROS), superóxido dismutasa
(SOD), catalasa (CAT), glutatión (GSH) y los kits de ensayo de proteínas se obtuvieron de
Nanjing Jiancheng Instituto de Bioingeniería (Nanjing, China). Los anticuerpos primarios
de conejo Nrf2, HO-1 se adquirieron de Abcam (Cambridge, Reino Unido).

Métodos generales
Se utilizó un polarímetro Perkin-Elmer 241 para rotaciones ópticas, un espectrofotómetro
Shimadzu UV para los registros UV, un espectrómetro Bruker IFS para los registros IR,
los ensayos NMR se realizaron en espectrómetros ARX-300 y AV-600, los HRESIMS se
obtuvieron en un espectrómetro de masas Agilent 6210. Las separaciones de RP-HPLC
se realizaron utilizando un cromatógrafo de líquidos LC-6AD y las manchas se detectaron
en placas de TLC bajo luz UV.

● Extracción y aislamiento.

Los cálices y frutos de N. physaloides se extrajeron con 70% EtOH. El extracto resultante
se suspendió con H2O y se repartio equitativamente en PE, EtOAc, n-BuOH. El extracto
PE se llevó a cromatografía por columna y se purificó con TLC para obtener el
componente 9. El extracto de EtOAc se llevó a cromatografía por columna, se obtuvieron
9 fracciones(E1-E9) la fracción E5 obtenida se llevó a una columna de ODS y se
obtuvieron E51 y E510, la primera se llevó a una columna de ODS y separó por HPLC,
para dar el componente 2. La fracción E510 se sometió a una columna de Sephadex y
luego se purificó Por HPLC para dar el componente 3. La fracción E6 se sometió a una
columna de ODS para producir E61, E62, E63, E65 y el componente 11. La fracción E61
se llevó a cromatografía sobre una columna Sephadex y luego se purificó por HPLC para
obtener el componente 8. E65 se llevó a cromatografía sobre columna Sephadex, y la
fracción E654 se purificó por HPLC para obtener el componente 1. La fracción E7 se
sometió a una columna ODS para producir 7 fracciones (E71-E77). La fracción E71 fue
dividido en 9 fracciones (E711-E719) mediante un gel de sílice CC. La fracción E720 se
llevó a cromatografía sobre una columna Sephadex para proporcionar E7203, esta fue
separado por HPLC para generar el componente 4. La fracción 8 se llevó a una columna
de ODS para producir 7 fracciones (E81-E87). La fracción E86 se llevó a cromatografía
sobre una columna Sephadex para obtener 3 fracciones (E861-E863). La fracción E862
fue separada por HPLC para producir el componente 6. El extracto n-BuOH fue llevado a
cromatografía sobre una columna de sílice para obtener 9 fracciones (B1-B9). La fracción
B3 fue sometida a una columna de sílice para obtener 7 fracciones (B31-B37). La fracción
B36 fue llevada a cromatografía sobre una columna Sephadex para obtener 8 fracciones
(B361-B368). La fracción B368 fue separada por HPLC para obtener el componente 10.
La fracción B6 fue separada por TLC para obtener B651 y el componente 7. La fracción
B7 fue sometida a una columna de sílice para obtener 5 fracciones (B71-B75). La
fracción B72 fue sometida en una columna de ODS para producir 5 fracciones (B721-
B725). La fracción B724 fue llevada a cromatografía sobre una columna de Sephadex
para tener 5 fracciones (B7241-B7244). Finalmente el componente 5 se purificó por HPLC
a partir de B7243. (Fig. 1)

● Resultados y discusión

Los efectos protectores sobre la lesión por estrés oxidativo inducida por H2O2 en
células hepáticas de humano normales (LO2)

LO2 células fueron expuestas a H2O2 a diferentes concentraciones (0, 10, 50, 100, 200 y
500 μM) durante 12 h. la viabilidad celular se midió mediante el método CCK-8. Como se
muestra en la Fig. 2A, la viabilidad celular se redujo significativamente de una manera
dependiente de la dosis y el valor alcanzó el 49,11% en 200 μM tratados con H2O2 en
células LO2 en comparación con el grupo no tratado. Por lo tanto, el tratamiento con 200
μM de H2O2 para 12 h se usó para establecer un modelo celular de lesión oxidativa.

Los efectos protectores de los compuestos 1 – 11 contra la lesión oxidativa inducida por el
estrés en las células LO2 también fueron evaluados por el método CCK-8. Las células
fueron incubadas con diferentes concentraciones (0, 10, 25, 50 y 100 μM) de los
compuestos 1 – 11 por 24 h. Entre ellos, el compuesto 11 mostró una actividad de
protección significativa en las células dañadas LO2 con la CE50 de 83,78 ± 0,30 μM como
se muestra en la Fig. 2B y 2C. La relación de estructura-actividad preliminar para todos
los compuestos aislados revela que la mayoría de los withanólidos aromáticos del anillo-D
no expresaban una actividad biológica significativa. Y withanólidos con anillo-D de cinco
miembros mostraron efectos protectores más fuertes que aquellos con anillo-D aromático.
Es de destacar que los anillos de 5 miembros oxigenados (como el compuesto 11) es
necesario para las bioactividades sobre la base de resultados preliminares de cribado.

El compuesto 11 inhibió la generación de ROS inducidos por H2O2.

La respuesta del estrés oxidativo a menudo se acompaña con la producción de grandes

cantidades de ROS. El desequilibrio de la producción y destrucción de ROS en las células
LO2 inducidas por H2O2 conducirá a una lesión por estrés oxidativo, especialmente en la
enfermedad hepática.

Para examinar si el efecto protector del compuesto 11 estaba realmente mediado por la
atenuación de la generación de ROS, la sonda fluorescente DCFH-DA se utilizó para
evaluar el nivel de ROS intracelulares en las células LO2 inducidas por H2O2. La
intensidad de fluorescencia del DCF en el grupo tratado con H2O2 aumentó
significativamente en comparación con el grupo de control. Mientras, el tratamiento con
100 μM del compuesto 11 eliminó ROS intracelulares en lesiones por estrés oxidativo
inducidos por H2O2 (Fig. 3A), lo que implica que el compuesto 11 podría proteger las
células LO2 del daño excesivo de ROS.
El compuesto 11 mejoró las actividades de las enzimas antioxidantes (SOD y CAT) y
el nivel de glutatión (GSH) en las células LO2 tratadas con H2O2

Generalmente, el tratamiento con H2O2 puede aumentar los niveles de ROS

intracelulares y provocar daños por estrés oxidativo. Sin embargo, los ROS excesivos
pueden ser eliminados por mecanismos tanto enzimáticos como no enzimáticos en
sistemas de defensa antioxidante. SOD y CAT son dos enzimas antioxidantes que
desempeñan un papel importante en la prevención de daño oxidativo. GSH, un importante
antioxidante de tejido, se mantiene en la forma reducida por glutatión reductasa y
proporciona equivalentes de reducción para la glutation peroxidasa (GPs).

Para evaluar los efectos del compuesto 11 en los sistemas de defensa antioxidante, se
detectaron las actividades de SOD y CAT, así como el nivel de GSH en las células LO2
inducidas por H2O2. Los resultados demostraron que las actividades de SOD y CAT, así
como el nivel de GSH en el grupo tratado con H2O2 se redujeron notablemente en
comparación con las del grupo de control. Sin embargo, el tratamiento con compuesto 11
mejoró significativamente en comparación con el grupo tratado con H2O2 (Fig. 3B).
Juntos, estos datos sugirieron que el compuesto 11 exhibió potentes efectos anti-
oxidativos en las células LO2 tratadas con H2O2.

Compuesto 11 aumenta la regulación de la expresión génica antioxidante mediada

por Nrf2

Nrf2 es un activador de la transcripción sensible al estrés que protege las células de la

lesión oxidativa. Bajo estrés oxidativo, Nrf2 se separa de Keap1 y se trasloca en el núcleo
para inducir la expresión de HO-1. Por lo tanto se examinó los efectos del compuesto 11
en los niveles de expresión de Nrf2 y HO-1, y el resultado mostró que el tratamiento con
50 y 100 μM de compuesto 11 podría aumentar significativamente la expresión de Nrf2 y
HO-1 de una manera dependiente del tiempo por análisis de Western Blot. (Fig. 4).

● Conclusión

Un total de siete nuevos withanolides (1-7) y cuatro conocidos (8-11) fueron aislados de
los cálices y frutas de Nicandra physaloides. Entre ellos, el compuesto 11 mostró el efecto
de protección más potente sobre el daño por estrés oxidativo inducido por H2O2 en células
LO2. El compuesto 11 mejora la supervivencia celular mediante la reducción de la
producción de ROS y la mejora de las actividades de SOD, CAT y GSH, que podría inhibir
el deterioro oxidativo de las células LO2 inducido por H2O2. Además, el compuesto 11
regula los niveles de expresión de Nrf2 y HO-1 en las células LO2 tratadas con H2O2. En
resumen, el compuesto 11 mostró efectos antioxidantes sobre la lesión hepática, lo que
indica su potencial para ser desarrollado en una medicina protectora y terapéutica para el
hígado.
Anexo

Fig. 1. Estructuras aisladas de withanolidos proveniente de Nicandra physaloides

Fig. 2. Efectos protectores del componente 11 contra el daño por estrés oxidativo inducido por
H2O2 en células LO2. (A) Células que fueron tratadas con concentraciones crecientes H 2O2 por 12
h. (B) Células tratadas con diferentes concentraciones del componente 11 y 200 μM de H2O2 por
24 horas. (C) El EC50 del componente 11 en células inducidas por H2O2.
Fig. 3. El compuesto 11 redujo los niveles intracelulares de ROS restaurando la actividad de SOD,
CAT y el nivel de GSH en células LO2 tratadas con H 2O2.(A) Células tratadas con 100 μM del
componente 11 y 200 μM de H2O2 por 6 h. (B-D) Células tratadas con diferentes concentraciones
del componente 11 y 200 μM de H2O2 por 12 h.

Fig. 4. Efectos del componente 11 sobre la expresión del Nrf2 y HO-1 in células LO2. (A) Los
niveles de expresión de las proteínas antioxidantes mediadas por Nrf2 se detectaron por el análisis
Western blot. (B-C) Cuantificación de la expresión de la proteína Nrf2 y OH-1. (D) Los niveles de
expresión de las proteínas antioxidantes mediadas por Nrf2 después de que las células fueran
incubadas con 100 μM del componente 11 por el periodo de tiempo indicado. (E-F) Cuantificación
de la expresión de Nrf2 y OH-1.