Prácticas Laboratorio Biología Informe Final)

LABORATORIO PRÁCTICO
Periodo I - 2019
1
PRÁCTICA LABORATORIO BIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR
Yeimmy Lorena Laverde Suarez
UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA
GUIA DE LABORATORIO
ESCUELA DE CIENCIAS DE LA SALUD
BIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR

Periodo I - 2019
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Durante el proceso de construcción se han realizado mejoramientos académico-pedagógicos y

didácticos con la incorporación de Objetos Virtuales de Aprendizaje. Con el fin de que el
estudiante tenga una preparación previa del material a utilizar y de los Procedimientos a seguir
se incorporaron links a videos demostrativos donde se muestra paso a paso cada uno de los
procedimientos que el estudiante debe realizar en la práctica presencial.
Se diseñó una simulación de microscopía en donde el estudiante puede manipular el microscopio

de manera virtual y de esta manera realizar un entrenamiento previo al desarrollo de los
laboratorios. El link donde está publicado el simulador:
http://canal.unad.edu.co/laboratorio/index/main.html
Periodo I - 2019
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ÍNDICE
Práctica No. 1: Bioseguridad
Práctica No. 2: Microscopía
Práctica No. 3: Célula: Crenación, Hemólisis, Plasmólisis y Turgencia.
Práctica No. 4: Permeabilidad selectiva del eritrocito.
Práctica No. 5: Tejidos vegetales y Aislamiento de cloroplastos.
Práctica No. 6: Acción de lisosomas.
Práctica No. 7: Mitosis y Meiosis.
Bibliografía
Periodo I - 2019
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INTRODUCCIÓN
El estudio de las ciencias biológicas siempre ha estado acompañado del uso del microscopio; su
uso contribuyó en la formulación de la teoría celular. Hooke estudió las células de la superficie
de una hoja, y las paredes celulares del corcho, consideradas por primera vez como unidad del
organismo. Durtrochet escribió que todos los tejidos orgánicos estaban formados por células
globulosas pequeñísimas de adhesión simple. Schleiden dijo: “Todos los organismos están
compuestos de células”; Virchow dijo: “Donde haya una célula, debió haber antes una célula
precursora”. Los detalles microscópicos de la célula se hicieron evidentes al mejorar el diseño
del microscopio, de tal manera que para el siglo XIX se lograron identificar casi todas las
estructuras o componentes de la célula, las cuales actualmente pueden describirse con el uso de
diferentes tipos de microscopios; sin embargo, el microscopio de luz es el más utilizado,
permitiendo observar la estructura básica de la célula. Con el microscopio compuesto, se
pudieron apreciar organismos vivos cuya existencia era desconocida para los primeros
investigadores. Los microscopios están formados por tres sistemas fundamentales: 1) el sistema
mecánico, que es el sostén de los sistemas complementarios y que permite el ajuste del punto
focal y las dioptrías; 2) el sistema óptico, que permite magnificar a diferentes grados la muestra
observada y 3) el sistema de iluminación, que permite iluminar y concentrar los haces luminosos
en el punto de interés, así como regular la intensidad de la iluminación. Esta guía de laboratorio
de “Biología Celular” se incluye experimentos y actividades básicos que por principio debe
conocer el estudiante. La información contenida permite vincular los aspectos teóricos con las
actividades prácticas propuestas. Aunque esta práctica cumple con las actividades propuestas, es
importante que el estudiante profundice sobre algunos temas sugeridos. La biología celular y
molecular es una disciplina básica apoyada en ciencias básicas y dan coherencias al
entendimiento desde la biología, bioquímica y genética a los distintos fenómenos celulares. El
estudio de las propiedades de la célula permite comprender el funcionamiento y la constitución
de las estructuras y las interacciones celulares, las aplicaciones de este conocimiento a desarrollo
de biotecnológicos.
Periodo I - 2019
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OBJETIVO
La guía de prácticas del curso de Biología Celular y Molecular tiene como objetivo dar
herramientas al estudiante para comprender las propiedades, estructura, funciones, orgánulos
celulares y las interacciones bioquímicas, genéticas, con el ambiente y su ciclo vital
desarrollando su pensamiento científico y crítico respecto a las relaciones que se dan en la
Biología celular y Molecular.
Periodo I - 2019
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DESCRIPCIÓN DE LA ACTIVIDAD PRÁCTICA No. 1
“NORMAS DE BIOSEGURIDAD”
Periodo I - 2019
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“MICROSCOPÍA”
Introducción
El microscopio es un instrumento que permite aumentar el tamaño de un objeto un número

determinado de veces. Existen dos grandes tipos de microscopio: el microscopio óptico (que usa
luz) y el microscopio electrónico (que usa electrones). El microscopio óptico fue el instrumento
que llevó al descubrimiento de la célula, mientras que el microscopio electrónico, dado su
enorme poder de resolución, permitió establecer una descripción detallada de las estructuras
subcelulares (como por ejemplo los organelas celulares).
El microscopio óptico funciona en base a lentes de vidrio convergentes, que como su nombre lo
indica, provocan que los rayos de luz converjan en un punto, al cual se le llama foco. Al lograr
que un número de rayos de luz que normalmente veríamos separados, enfoquen en nuestra retina,
podemos interpretar esa imagen (que es una imagen virtual) como una ampliación de la imagen
Periodo I - 2019
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real. Su sistema óptico posee un lente condensador (que concentra la luz proveniente de la
fuente), una serie de lentes objetivos (que recogen los rayos difractados por la muestra), con
diferentes poderes de aumentos (usualmente 4x, 10x, 40x y 100x) y uno o dos lentes oculares
(cerca de los ojos) que generalmente proporcionan un aumento de 10x. Los términos de aumento
se expresan en x, de tal forma que un aumento de 10x (“diez por”) significa que una imagen está
aumentada 10 veces el tamaño original. El aumento total del microscopio es el producto de los
aumentos del lente objetivo más el lente ocular.
Objetivo
Comprender el funcionamiento del microscopio y reconocer los diferentes poderes del

microscopio mediante diferentes montajes.
1. Oculares
2. Revolver
3. Objetivos
4. Platina
5. Diafragma
6. Foco
7. Base o Pie
8. Tornillo Condensador
9. Tornillo Micrométrico
10. Tornillo Macrométrico
11. Pinza
12. Brazo
13. Tubo
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Funciones del Microscopio
Partes del Función

microscopio
Fuente de Luz Dirige los rayos luminosos hacia el condensador, puede tener una especie
de anillo para colocar filtros que facilitan la visualización.
Condensador Lente que concentra los rayos luminosos sobre la preparación situada
bajo la platina.
Diafragma Cortinilla que regula la cantidad de luz que entra en el condensador y esta
situado por debajo de la platina.
Platina y pinza La platina es la lamina horizontal con un orificio central, sobre él se

coloca la preparación qué permite el paso de rayos procedentes de la
fuente de iluminación situada por debajo; la pinza sirve para sostener la
preparación sobre la platina.
Objetivos Lentes que amplían la imagen de la preparación y se sitúan generando

una imagen real o invertida y aumentada, los más utilizados son 4, 10,40
y 100x; este último es llamado de inmersión y se utiliza en aceite sobre la
preparación para observar láminas coloreadas.
Oculares Captan y amplían la imagen del objetivo y se sitúa cerca al ojo
Tornillo Permite enfoque aproximado o grueso que alejar o acercar acercando el

Macrométrico tubo y la platina moviéndola de arriba hacia abajo.
Tornillo Permite dar claridad a la imagen al lograr ajuste fino y preciso.

Micrométrico
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Revolver Pieza metálica situada en la parte inferior del tubo, inserta los objetivos al
girar permite el cambio de los objetivos.
Presentación de resultados
Elaborar los esquemas correspondientes para cada una de las preparaciones, cada esquema debe
incluir: título, aumento y además señalar las distintas estructuras celulares que se observen.
OBJETO AUMENTO DIBUJO ANALISIS Y

OBSERVADO UTILIZADO CONCLUSIONES
Se aumenta el tamaño
de la letra y se logra
ver levemente la
Montaje letra Vista con textura del papel, se
de papel objetivo 4x observa también
invertida, presenta
poca nitidez
Se aumenta aún más

la dimensión de los
trazos que conforman
Vista con la letra, se visualiza el
objetivo 10x contorno de la letra
donde se notan
espacios entre la tinta
y se diferencia más la
textura del papel.
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Vista con Se observa solo un

objetivo 40x fragmento de la letra
que contiene fibras de
colores y puntos

Se aumenta el tamaño
del papel con
referencia al tamaño
Montaje papel Vista con real, se logra ver
objetivo 4x levemente la textura
Milimétrico
del papel, el
sombreado del color,
los cuadros y poca
nitidez.
Se aumenta la imagen
y se reduce el campo
de visión, en el
Vista con contorno de los
objetivo 10x cuadros se ven
espacios entre el color
de la tinta y se
evidencia más la
textura del papel,
parece que estuviera
deteriorado.
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Vista con Se observa solo un

objetivo 40x fragmento de línea
que contiene
filamentos de colores
y puntos consecutivos
de tinta.

Se ve el hilo
deshilachado,
ampliado cambia el
Montaje Vista con grosor y muchas
hebra de hilo objetivo 4x hebras que salen de
la hebra expuesta a la
observación
Vista con Se aumenta el grosor

objetivo 10x del hilo y en las
hebras deshilachadas,
se ven partículas
diminutas
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Vista con Se observa un solo hilo

objetivo 40x de gran tamaño por las
fibras que lo componen
no se ve deshilachado y
aumenta su grosor

Observamos la
materia a gran escala,
pero con pocos
Montaje Agua Vista con indicios de organismo
Estancanda objetivo 4x
Pudimos observar la
presencia de
organismos en los
Vista con cuales se destacaban
objetivo 10x los: ciliados,
paramecios, flagelos
etc
Periodo I - 2019
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Inmediatamente
pudimos observar
Vista con
varios tipos de
objetivo 40x
organismos que se
alimentaban de Micro,
algas tales como
Glaucomas,
Vorticelas, Euglifas,
Euglemas, etc

Se evidencia un color
rojo traslúcido sin
mucha textura ni
Montaje Gota Vista con diferenciación de
de Sangre objetivo 4x componentes
Se observan puntos
rojos oscuros en un
medio de color rojo
Vista con más pálido; se nota la
objetivo 10x formación de
estructuras haciendo
referencia de las
formaciones color
rojo oscuro.
Periodo I - 2019
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Vista con Este aumento permite

objetivo 40x diferenciar y delimitar
las circunferencias
que conforman la
mezcla, se aprecian la
estructura fenotípica
de los glóbulos rojos

Se observan cuadros
que conformar el
Montaje tela Vista con
material donde no se
de cuadros objetivo 4x
puede evidenciar la
textura de la fibra de
manera definida
Vista con Se observa amplia la

objetivo 10x textura y se observa
espacios entre las
fibras de la tela.
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Vista con Las fibras pierden su

objetivo 40x nitidez los espacios se
observan más grandes
y su grosor hace
diferenciar el orden.
Cuestionario
1 ¿Qué organismos pueden observarse en la gota de agua estancada?
- En la gota de agua estancada encontramos partículas y microorganismos que se

encuentran ampliamente distribuidos.
2¿Son todos de igual tamaño y forma?
- Se observan de diferentes formas y tamaños en los cuales no se identifica algún

organismo pero si se podían ver diferentes formas ovaladas y alargadas.
3¿Se observan organismos móviles o estáticos?

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- Los organismos observados presentan movimientos leves, al agruparse en algunos
sectores.
4. Para las muestras de la letra, la hebra de hilo observadas determine:
A ¿Cómo se manifiesta el poder de resolución?
- En el caso del hilo podemos ver el entrelazado que hay entre las hebras y las partículas
alojadas en cada hebra que desprende del hilo. Con la letra podemos ver los espacios
blancos entre la tinta, además de puntos que conformaban cada imagen aspectos que no
se ven a simple vistita también los colores negros eran más teñidos.
B. ¿Cómo se manifiesta el poder de aumento?
- El poder del aumento está determinado por el grado de curvatura de superficie además
que gracias a las lentes convexas permiten mejorar la calidad de la imagen en la
observación de diferentes láminas en la observación de la letra y el hilo, se entiende que
a menor distancia el poder del aumento permite apreciar mejor la imagen que se obtiene.
C. ¿Cómo se manifiesta el poder de definición?
- Es la calidad de la visualización de la imagen es la definición que presentan los

diferentes objetivos a simple vista apreciamos la definición de baja calidad pero con el
aumento y la resolución podemos observar la calidad en alta definición, el entrelazado de
las hebras del hilo y la textura del papel donde está impresa la letra hacen parte de este
resultado.
D. ¿Cómo se manifiesta el poder de penetración o profundidad?
- Revela la capacidad de visualizar la agudeza que presenta cada material que se da con el
ajuste de precisión que se logra con el tornillo micrométrico, al observar que las hebras
de hilo más pequeñas también se conformaban de más minihebras y en la letra que la
impresión de la tinta sobre el papel no era consecutiva sino que tenía espacios.
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DESCRIPCIÓN DE LA ACTIVIDAD
PRÁCTICA No. 3
CÉLULA: CRENACIÓN, HEMÓLISIS, PLASMÓLISIS Y TURGENCIA”
Introducción
La membrana plasmática de las células vegetales y animales es muy permeable al agua, siendo
pocas las sustancias que la atraviesan con igual facilidad, esto ocasiona que cuando exista
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entrada y salida de ella, la célula también se altere en su forma, ya que ésta, en parte está
determinada por el estado de hidratación de los coloides celulares.
Objetivo
Observar los fenómenos de hipotonía, isotonía e hipertonía en células animales y vegetales.
Material
Microscopio compuesto, 6 portaobjetos y 6 cubreobjetos, vasija con agua destilada, pipeta

Pasteur, Solución de NaCl al 0.6%, Solución de NaCl al 0.9%, Solución de NaCl al 1.2%,
Solución de NaCl al 10%. No realice las preparaciones al mismo tiempo, para obtener resultados
satisfactorios es muy importante que concluya con la observación de una muestra antes de
preparar la siguiente.
Células sanguíneas
Empleando una lanceta estéril obtenga una gota de sangre, colóquela en un portaobjetos limpio
y seco, ponga el cubreobjetos y realice la observación correspondiente al microscopio 4x, 10x y
40x.
Nota 1. Evite cualquier tipo de contaminación de su muestra, por ejemplo, con alcohol, agua, etc.
Repita el paso 1 pero ahora agregando a su muestra de sangre 2 gotas de agua destilada. Repita el
paso 1, y adicione a la muestra 2 gotas de las siguientes soluciones: NaCl al 0.6% NaCl al 0.9%
NaCl al 1.2% NaCl al 10%.
Células vegetales
Seleccione una hoja de Elodea en buen estado y colóquela sobre un portaobjetos limpio y seco,
y con el envés de la hoja hacia arriba. Adicione gotas de agua de su medio, suficientes para
cubrir la hoja totalmente y ponga con cuidado el cubreobjetos. Realice las observaciones
correspondientes al microscopio en objetivo 4x, 10x y 40x. Repita el paso 1, pero ahora
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agregando gotas de agua destilada. Repita el paso 1 y adicione a la muestra en lugar de agua,
gotas de las siguientes soluciones: NaCl al 0.6% NaCl al 0.9% NaCl al 1.2% NaCl al 10%.
Célula Sanguínea

Célula Sanguínea 4x Partículas diminutas de

en su estado sangre que no se alcanzan
normal a divisar bien
Célula Sanguínea 10x Son visibles partículas de

en su estado sangre en la célula que se
normal compone de agua
Célula Sanguínea 40x Se hacen más pequeñas

en su estado evidentes partículas de
normal sangre en la célula
Cédula Sanguínea 4x Color rosado que no

más agua permite visualizar las
destilada partículas de sangre
Célula Sanguínea 10x Hacía la parte central se

más agua evidencia un color
destilada amarillento asimilando
que es allí donde están las
partículas del agua
destilada
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Célula Sanguínea 40x Las partículas de sangre ya
más agua no son rojizas dado a la
destilada aplicación del agua
destilada
Célula Sanguínea 10x A lo lejos se evidencia las

con NaCl 0.6% partículas de sangre sin su
color rojo habitual
Célula Sanguínea 10x Las partículas sanguíneas

con NaCl 0.9% se visualizan de color
rosado y se expanden por
toda la célula
Célula Sanguínea 10x Se evidencia que por la

con NaCl 1.2% solución de NaCl las
partículas sanguíneas se
juntan por eso se ve un
color anaranjado
Célula Sanguínea 40x Se torna en color rosado y

con NaCl 0.6% muy unidas las partículas
de sangre
Célula Sanguínea 40x Las partículas siguen

con NaCl 0.9% tornándose en un todo
rosado y se inclinan hacia
las 3
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Célula Sanguínea 40x Con la solución de NaCl
con NaCl 1.2% seguimos notando que no
deja visualizar como tal
las partículas mostrando
un tono anaranjado
Célula Sanguínea 40x No se logra una

con NaCl 10% observación clara con el
objetivo 40x
CÉLULA VEGETAL
Sin solución NaCl 0.6% NaCl 0.9% NaCl 1.2% NaCl 10%
10X Sol. Hipotónica Sol. Isotónica Sol. Hipertónica Sol. Hipertónica

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Sin solución NaCl 0.6% NaCl 0.9% NaCl 1.2% NaCl 10%
40X Sol. Hipotónica Sol. Isotónica Sol. Hipertónica Sol. Hipertónica

Elodea con 4x Se hace evidente el

agua del medio tallo de la hoja de
elodea
Elodea con 10x El tallo de la Elodea se

agua del medio visualiza más grande y
se evidencian
partículas muy
diminutas
Elodea con 40x Ya no se evidencia el

agua del medio tallo y se ven
partículas vegetales
entre las 3 y las 6
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Elodea con 4x Se evidencia un color
agua destilada verde claro se
evidencia que el agua
destilada aclara el
color natural de la
Elodea
Elodea con 10x Se evidencia el mismo

agua destilada tono verde claro
Elodea con 40x Se evidencian unas

agua destilada partículas en
simulación a ladrillos
pequeños por el
acercamiento se
evidencia un tono
amarillo
Cuestionario
Mencione las diferencias observadas entre el comportamiento de la célula vegetal y animal,

explique.
- No existe alguna diferencia trascendentalmente notoria entre los comportamientos de los

dos tipos de células, ya que ambas actúan de la misma forma frente a los medios a los
que fueron expuestas, en lo único que cambian es en el nombre del fenómeno que
presentan para cada tipo de célula con el tipo de medio en que se encuentran, y que la
célula vegetal posee pared celular y la hace más resistente contra la exposición a la que
se sometieron.
- Describe lo que sucede en una célula cuando se coloca en un medio:
a) Hipotónico: En la célula animal ocurre el fenómeno de hemolisis, la célula se infla; en la

célula vegetal ocurre el fenómeno de turgencia la célula, se hincha.
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b) Isotónico: Ambas células, la animal y la vegetal se encuentran en un medio contaste y su
estructura no cambia.
c) Hipertónico: En la célula animal ocurre el fenómeno de creación, este es cuando la

célula se deshidrata y se observa de forma arrugada; en la célula vegetal ocurre el fenómeno
de plasmólisis, este es cuando la célula se deshidrata.
Explique en qué consisten los fenómenos de ósmosis y de difusión.
- Consiste en que las sustancias concentradas que contiene una célula se trasladan a otra,
esto es de una mayor concentración se trasladan a una de menor concentración, evitando
así el gasto de energía. Aunque también mediante este fenómeno se pueden desplazar
sustancias dentro de la misma célula.
¿Por qué los sueros fisiológicos que se aplican a pacientes intravenosamente deben ser
isotónicos?
- Para que el suero fisiológico hidrate, regule y reponga lo que la célula necesita y esta no
altere el medio en que se encuentra, ya que si se le añade una solución ya sea hipotónica
o hipertónica alterara el tamaño de las células sanguíneas y esto puede tener
consecuencias sobre la salud.
“PERMEABILIDAD SELECTIVA DE LA MEMBRANA DEL ERITROCITO”
Introducción
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Cuando un eritrocito es colocado en una solución isotónica, que contiene moléculas que pueden
atravesar la membrana, la molécula penetrante entra en la célula ocasionando que ésta estalle.
Este estallamiento de los eritrocitos es llamado hemólisis y puede ser detectado por medio de un
espectrofotómetro, que mide el cambio en la absorción de la luz, debido al paso de la
hemoglobina hacia el exterior.
Objetivo
Visualizar y determinar el porcentaje de hemólisis en eritrocitos causada por diferentes

moléculas.
Material
4 vasos de precipitados de 100 ml, 6 vasos de precipitado de 250 ml, una pipeta de 1 ml, 6
pipetas de 10 ml, un agitador de vidrio, una pizeta con agua destilada, espectrofotómetros y
celdas para espectrofotómetro.
Reactivos
Solución de NaCl 0.17 M Solución de Glicerol 0.32 M, solución de Metanol 0.32 M, solución
de Butanol 0.32 M, solución de Oxalato de amonio 0.12 M, solución de Fructuosa 0.25 M,
solución de ácido cítrico 0.26 M, material biológico Sangre desfibrinada (10 ml) por grupo de
trabajo, sangre humana con anticoagulante EDTA.
Procedimiento
Preparar una solución “STOCK” de la siguiente manera: Coloque con una pipeta 5 ml de sangre
desfibrinada en un vaso de precipitados, adicione 45 ml de solución isotónica de NaCl 0.17 M.
Se agita levemente para homogenizar. Para preparar la solución al 100% de HEMOLISIS,
coloque en un vaso de precipitados 0.5 ml de solución “STOCK” y agregue 3 ml de agua
destilada; y luego adicione 26.5 ml de solución de NaCl 0.17 M. Agite.
Para preparar la solución de 0% de HEMOLISIS, coloque en un vaso de precipitados 0.5 ml de

solución “STOCK” y 29.5 ml de solución de NaCl 0.17 M. Se agita ligeramente.
Para calibrar el espectrofotómetro primero ajuste a 0% de Transmitancia a una longitud de onda

de 525 nm, y luego llene una celda con la solución de 100% de HEMOLISIS y calibre a 100%
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de Transmitancia a la misma longitud de onda. Una vez calibrado el espectrofotómetro, se
obtiene la lectura de Transmitancia para la solución de 0% de HEMOLISIS.
Nota: Los datos obtenidos servirán para realizar la curva estándar para Hemólisis de la sangre,
graficando % de Transmitancia contra % de Hemólisis.
*Posteriormente en un vaso de precipitados coloque 29.5 ml de una de las soluciones
(Oxalato de amonio, Metanol, Fructosa, Butanol, Glicerol o Ácido cítrico), en seguida adicione
0.5 ml de solución “STOCK”, agitando suavemente y llenando una celda con la mezcla. Ponga la
celda en el espectrofotómetro calibrando de antemano y tome las lecturas cada 60 segundos hasta
los 5 minutos o bien hasta obtener una lectura de 100% de Transmitancia.
Cuando haya terminado con la primera solución problema repita el último paso (*) utilizando las
soluciones problemas restantes.
Utilizando su curva estándar para Hemólisis, obtenga los valores equivalentes de hemólisis de
cada una de las lecturas de Transmitancia de las soluciones problema. Para cada solución
problema realice gráficas.
Segundos Glicerol Metanol Ácido Fructosa

Toma 1 Toma 2 cítrico Toma 4
Toma 3
30 68,4 71,21 40,00 19,9
60 70,81 73,96 40,00 36,0
90 71,2 73,94 39,4 40,8
120 71,92 73,93 39,3 41,8
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PORCENTAJE TRAMITANCIA
120
100
80
Series1
60
Series2
40 Series3
Series4
20
0
Segundos Glicerol Metanol Ácido Fructosa
Toma 1 Toma 2 cítrico Toma 4
Toma 3
%Hemolisis 0 100
%Trasmitancia 1,5 68,6
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120
100
80
%Hemolisis
60
%Trasmitancia
40
20
0
1 2
De acuerdo a tus resultados presenta el ordenamiento de las diferentes moléculas según su

velocidad de penetración al interior de los eritrocitos.
- Fructosa, glicerol, metanol, ácido cítrico.
Cuestionario
Describa en detalle la estructura de la membrana plasmática según el modelo actual.

Esquematícelo.
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30
Explique las características que debe presentar una molécula para que pueda atravesar fácilmente
la membrana plasmática.
- Las sustancias liposolubles pueden atravesar fácilmente las membranas hasta que el
soluto se equilibre a ambos lados de la bicapa.
Con qué finalidad se usa sangre desfibrinada en los experimentos.
- Se usa sangre desfibrinada ya que esta no llega al estado de coagulación.
Si hubiéramos utilizado sangre de otro animal mamífero, ¿esperaríamos los mismos resultados?,
explíquelo en función de la permeabilidad de la membrana.
- En los experimentos que involucran la necesidad de utilizar sangre, regularmente utilizan

sangre de corderos; pero a nivel general la membrana plasmática de células animales, sea
del tejido que sea, es muy permeable a medios acuosos.
“Acción de lisosomas”
Introducción
Las sustancias que penetran en la célula por fagocitosis o pinocitosis van a experimentar la
acción de las enzimas digestivas intracelulares, contenidas en orgánulos llamados lisosomas.
Periodo I - 2019
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Estos orgánulos son corpúsculos esféricos que miden aproximadamente 0.5 micrómetros, están
delimitados por una unidad de membrana y contienen enzimas hidrolíticas. Se han encontrado
lisosomas en todas las células animales y vegetales.
Los lisosomas promueven la digestión intracelular, tanto del material exógeno que penetra en la
célula por pinocitosis, como también el material endógeno. Este último puede estar constituido
por orgánulos degenerados o por productos de desasimilación del metabolismo celular.
Objetivo
Que el alumno observe la función de los lisosomas de manera análoga en ciliados.
Material
Microscopio compuesto Porta y cubreobjetos, pipeta de un ml, mechero de Bunsen, 6 tubos de

ensaye 15 x 150 mm, gradilla, pinzas, tela de asbesto, tripie recipiente para baño María, pipeta
pasteur con goma, termómetro, hoja de papel aluminio.
Reactivos
Solución de Rojo Congo al 0.4%, Material biológico, Cultivo de levaduras de pan. (30 ml.),
Cultivo de ciliados (Paramecium spp.) por cada equipo.
Procedimiento
1.- En tres tubos de ensayo, coloque en cada uno de ellos un mililitro del cultivo de levaduras.
Un tubo se pone en el refrigerador durante 10 minutos. Otro se coloca en el baño María a 30ºC, y
el último se tapa con papel aluminio y se pone en un baño María hirviendo durante 10 minutos.
2.- Al término de la exposición de cada temperatura, se coloca de inmediato en cada tubo 0.5 ml
de rojo de Congo al 0.4%. Agite cada tubo y deje en reposo durante 5 minutos. Realice las
observaciones al microscopio de cada uno de los tubos, poniendo atención al grado de tinción
que se presenta.
3.- En base en sus observaciones seleccione el cultivo de levaduras para cumplir mejor el
objetivo de su práctica. Coloque sobre un portaobjetos unas gotas del cultivo de levaduras con
gotas del cultivo de ciliados. Observe al microscopio y realice un esquema inicial. Siga
Periodo I - 2019
32
observando cuidadosamente hasta visualizar de manera análoga la función de los lisosomas en
ciliados (cambio de color).
Presentar los siguientes esquemas:
a).- Cultivo de levaduras a 0-4°C
b).- Cultivo de levaduras a 30°C
c).- Cultivo de levaduras a 100°C
d).- Esquema inicial del cultivo de ciliados con levaduras.
e).- Esquema final del cultivo de ciliados con levaduras.

Periodo I - 2019
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Cuestionario
1.- Tomando en cuenta tus observaciones experimentales, ¿Qué ocurre con las células de
levadura dentro de los ciliados y porque?
- Se identifica el movimiento de los cilios situados cerca y dentro del citostoma, creándose
de esta manera una corriente de agua y partículas de las levaduras hacia su interior. La
levadura tras penetrar el citoplasma se localiza en las vacuolas fagocitarias que se
fusionan con los lisosomas para producir la digestión de estas.
2.- Discuta el mecanismo que ocurre al calentar las levaduras y al agregar el colorante.
- En el tubo de ensayo al unir las levaduras con rojo congó presenta un color rojo,
necesitando presencia del color para este proceso de tinción.
3.- Realice en esquemas, el origen y las funciones de los diversos tipos de lisosomas.
- Los lisosomas primarios son aquellos que sólo contienen las enzimas digestivas, poseen
una variedad de enzimas hidrolíticas capaces de degradar casi todas las moléculas
orgánicas; estas hidrolasas se ponen en contacto con sus sustratos cuando los lisosomas
primarios se fusionan con otras vesículas.
Los lisosomas secundarios por haberse fundido con una vesícula con materia orgánica
contienen también sustratos en vía de digestión, además de enzimas, son de mayor
tamaño y contenido heterogéneo.
Periodo I - 2019
34
Existen diversas formas de lisosomas secundarios, según el origen de la vesícula que se
fusiona con el lisosoma primario:
- Fagolisosomas: Se originan de la fusión del lisosoma primario con una vesícula

procedente de la fagocitosis, denominada fago soma. Se encuentran, por ejemplo, en los
glóbulos blancos, capaces de fagocitar partículas extrañas que luego son digeridas por
estas células.
- Endosomas tardíos: Surgen en la unión de los lisosomas primarios con materiales
provenientes de los endosomas tempranos; los endosomas tempranos contienen
macromoléculas que ingresan por los mecanismos de endocitosis inespecífica y
endocitosis mediada por receptor.
- Autofagolisosomas: Es el producto de la fusión entre un lisosoma primario y una
vacuola autofágica o autofagosoma; algunos orgánulos citoplasmáticos son englobados
en vacuolas, con membranas que provienen de las cisternas del retículo endoplasmático
para luego ser reciclados cuando estas vacuolas autofágicas se unen con los lisosomas
primarios.
Funciones lisosomales:
Los lisosomas participan en la muerte celular y contribuyen a la desintegración de células de

desecho quedando entonces un espacio que puede ser ocupado por otra célula nueva; no
participan en el desarrollo embrionario, pero si intervienen en el proceso de diferenciación de
órganos durante la ontogenia, ejemplo, desaparición de la cola del embrión.
DESCRIPCIÓN DE LA ACTIVIDAD PRÁCTICA No 6
“Tejidos vegetales: Aislamiento de cloroplastos intactos”
Introducción
Periodo I - 2019
35
La célula es la unidad básica de la vida que contiene una amplia variedad de distintos tipos de
orgánulos. Si se requiere estudiar la función particular de los cloroplastos u otro orgánulo resulta
de gran valor poder aislar en estado puro el orgánulo que interesa. La separación de un orgánulo,
por lo general se hace mediante la técnica de centrifugación diferencial, la cual depende del
principio de que las partículas de tamaño diverso se desplazan hacia el fondo del tubo de
centrifuga a diferentes velocidades cuando se les coloca en un campo centrífugo.
Una suspensión de material de células rotas se somete al principio de la fuerza centrífuga muy
baja durante un corto período de tiempo, de modo que solo los núcleos y las células íntegras se
sedimentan formando un precipitado. Con fuerzas centrífugas cada vez mayores se pueden
separar los cloroplastos y las mitocondrias en suspensión, luego los microsomas y para finalizar
los ribosomas. Este último paso requiere de una ultracentrífuga, la cual genera velocidades que
producen hasta 100 000 veces la fuerza de la velocidad.
Los cloroplastos cuando son aislados cuidadosamente son capaces de reducir el colorante 2,6-
Diclorofenol-Indo fenol (DCPIP), lo cual debe ser medido espectrofotométricamente comparado
con una muestra control. La reducción se debe a que capta los electrones en lugar del
NADPox en la parte no cíclica de la fotosíntesis.
Objetivo
Ensayar un método de aislamiento de cloroplastos y observar su funcionamiento en condiciones

óptimas y con “SHOCK” osmótico.
Materiales y Reactivos
Lámpara con foco. Mortero y pistilo, pipeta de 10 ml, pipeta de un ml, vaso de precipitados de
100 ml. Tijeras, 6 tubos de ensaye 15mm X 150 mm, gradilla, embudo, bolsa de hielo, sobre de
gasas, papel milimétrico, charola metálica, pipeta pasteur con goma, cubeta con agua destilada, 3
espectrofotómetros, 6 celdas para espectrofotómetro, una centrífuga clínica, 6 tubos para
Periodo I - 2019
36
centrífuga, solución de NaCl 0.35 M en Buffer de fosfatos 0.02 M, pH 8. (buffer salino),
solución de DCPIP 0.3 M.
Material biológico
Hojas de espinacas o de acelgas (3 o 4 por equipo)
Procedimiento
Enfrié con anticipación el mortero con hielo, agregué 20 ml de buffer salino frío y las partes
verdes de sus hojas de espinacas.
Tritúrelas durante 5 minutos como máximo y en seguida filtre el homogenizado a través de gasa
doble previamente humedecida con 10 ml de buffer salino.
El filtrado se distribuye de manera equitativa en dos tubos de ensayo y se centrifuga a 1000 rpm.
Durante tres minutos (recuerde que los tubos deben tener la misma cantidad de líquido al
centrifugar por lo que hay que agregarle solución buffer si es necesario para igualarlos), se
obtienen dos fases:
El sobrenadante: que contiene los cloroplastos en suspensión. El precipitado: que tiene células
intactas y núcleos.
El sobrenadante obtenido se coloca en tubos de ensaye fríos. Se desecha el precipitado. Se coloca

de nuevo el sobrenadante en tubos de centrífuga y se centrifuga a 3000rpm durante 5 minutos.
Al final de este tiempo se descarta el sobrenadante y el precipitado se suspende en buffer salino

frío utilizando en total 2 ml por cada tubo.
De esta manera se tiene preparada la suspensión de cloroplastos intactos.
Para preparar la suspensión de cloroplastos con “SHOCK” osmótico:
Se coloca en un tubo 1 ml de la suspensión de cloroplastos intactos y 4 ml de agua destilada.

Periodo I - 2019
37
Envuelva 4 tubos de ensaye con papel aluminio, y después se preparan los tubos de la siguiente
manera:
3
4
(este tubo no
Tubo 1 2
se expone a la (Blanco)
luz)
Solución de DCPIP
0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml
0.3 M.
Buffer Salino 9.5 ml 9.5 ml 9.5 ml 9.5 ml
Suspensión
cloroplastos con 0.2 ml __ __ __
SHOCK osmótico
Suspensión de
__ 0.2 ml 0.2 ml __
Cloroplastos intactos
Antes de proceder a tomar las lecturas correspondientes debe agitar perfectamente bien todos los
tubos.
Para calibrar el espectrofotómetro primero ajuste a 0% de absorbancia a una longitud de onda de

450 nm, luego llene una celda con el contenido del tubo No. 4 (TUBO BLANCO) y calibre a 0%
de absorbancia a la misma longitud de onda. Una vez calibrado el espectrofotómetro obtenga las
lecturas de absorbancia a 450 nm de los tubos 1, 2 y 3 al tiempo de 0 minutos de exposición a la
luz.
Enseguida exponga los tubos 1, 2 y 4 a la luz, colocándolos a una distancia aproximada de 15 cm

del foco durante un minuto. Al término de este tiempo tápelos nuevamente con papel aluminio y
proceda a realizar las lecturas de absorbancia a 450 nm de los tubos 1, 2 y 3 en el
espectrofotómetro ya calibrado como en el paso 4.
Periodo I - 2019
38
Repita el paso 5, cuatro veces más, es decir, los tubos son expuestos a la luz por un tiempo total
de 5 minutos, en intervalos de un minuto de exposición.
1.- Presente en la siguiente tabla los datos experimentales obtenidos.
Tubo/Tiempo de
0 min 1 min 2 min 3 min 4 min 5 min
exposición
Tubo 1. Suspensión
cloroplastos con 0,511 0,499 0,531 0,549 0,527 0,155
SHOCK osmótico
Tubo 2. Suspensión
de Cloroplastos
2,058 1,839 1,862 1,867 1,881 1,880
intactos (expuesto a
la luz)
Tubo 3. Suspensión
de Cloroplastos
1,581 1,611 1,602 1,615 1,612 1,615
intactos (no expuesto
a la luz)
Tubo 4. Blanco
0 0 0 0 0 0
Realice una gráfica de absorbancia (450 nm) contra tiempo de exposición a la luz en papel
milimetrado.
Periodo I - 2019
39
LECTURA DE ABSORBANCIA
2.5
1.5
Series1
1 Series2
0.5 Series3
Series4
0
Series5
Series6
Cuestionario
Explique porque durante el aislamiento de cloroplastos se trabaja a bajas temperaturas y además

porque se utiliza una solución buffer salina.
- Se trabaja a bajas temperaturas con la finalidad de retrasar la degradación de los

componentes celulares y se utiliza la solución de buffer salina ya que es uno de los más
utilizados gracias a sus características de isotonía y no toxicidad para las células, además
de emplearse como vehículo neutro para células, ya que no modifica el perfil de
expresión y funcionamiento celular normal. El uso de esta solución es muy común para
lavar células a través de centrifugación.
Analice en detalle los resultados obtenidos para cada tubo.

Periodo I - 2019
40
- Tubo 1: Inicia con un grado de absorbancia relativamente bajo, aumenta en el primer
minuto, disminuye durante los siguiente dos minutos para terminar en un punto
cuantitativo similar al con el que empezó.
- Tubo 2: Con un grado de absorbancia más alto que el primer tubo, mantiene una
frecuencia cercana entre los valores obtenidos desde el minuto cero de exposición hasta
el quinto minuto.
- Tubo 3: Con el paso de los minutos aumentan los valores descritos.
- Tubo 4: Usado para la calibración del espectrómetro.
Describir brevemente otra técnica para determinar fotosíntesis.
- Los métodos basados en la porometría, son los más modernos y rápidos para medir
fotosíntesis y transpiración a campo, con control de temperatura, CO2, H20 y radiación
PAR. Todos estos equipos son portátiles y cuentan con DataLog, lo cual permite el
almacenamiento de información y posterior descarga a una PC. En la página siguiente se
pueden apreciar dos modelos de equipos disponibles en el mercado, y de uno un detalle
del censor (cubette) que apreta un disco de un cm de hoja donde realiza la medición. En
el mismo se pueden visualizar las flechas de circulación del aire que atraviesa la hoja. Las
medidas directas que arrojan estos equipos y sus unidades son las siguientes:
Nombre la materia prima y los productos para cada fase de la fotosíntesis.
- Fase Luminosa: en esta fase participa la luz solar, se produce en los tilacoides del
cloroplasto. La clorofila capta la luz solar y esta rompe la molécula de agua (H2O),
separando el hidrógeno (H) del oxígeno (O), el oxígeno se libera a la atmósfera y la
energía no utilizada es almacenada en moléculas especiales llamadas ATP.
- Fase Oscura: Esta fase se llama así porque no requiere de la energía de la luz solar, se
produce en el estroma del cloroplasto; el hidrógeno resultante de la fase anterior se suma
Periodo I - 2019
41
al dióxido de carbono (CO2) generando la producción de compuestos orgánicos,
principalmente carbohidratos (glucosa). Este proceso se desencadena gracias a la energía
almacenada en moléculas de ATP, durante la fase anterior. Luego de la formación de
glucosa, mediante otras reacciones químicas se forma almidón y varios carbohidratos
más.
Periodo I - 2019
42
DESCRIPCIÓN DE LA ACTIVIDAD PRÁCTICA No 7
“Meiosis y Mitosis”
Objetivo
Aprender a diferenciar los periodos del ciclo celular.
Material
Microscopio, aceite de inmersión, acetocarmín, metanol, bisturí, micropreparados que ilustran

los procesos de mitosis y meiosis.
Procedimiento
Con ayuda de una pinza retire la capa externa marronacea o rosácea y lave con abundante agua,
esto se realiza para eliminar restos de sustancias con las que frecuentemente han sido tratadas
para inhibir o retardar la germinación de las raicillas.
Llene un vaso de precipitados con agua y coloque un bulbo de cebolla sujeto con dos o tres
palillos de manera que la parte inferior quede inmersa en el agua.
Póngalo a germinar a 25°C o a temperatura ambiente durante 3 días, al cabo de estos aparecerán
numerosas raicillas en crecimiento de unos 3 o 4 cm. de longitud.
Revise diariamente y procure que la corona no se deseque para lo cual es necesario rellenar con
agua cada 24 horas.
Cuando las raíces tengan entre 0.5 y 1 cm de longitud, realice cortes de raíz de aproximadamente
2 – 3 mm a partir del ápice.
Colóquelas en una lámina portaobjetos. Adiciona una gota del colorante acetocarmín.
Coloque el cubreobjetos con mucho cuidado sobre la raíz. Con ayuda de la punta de una lanceta,
de unos golpecitos sobre el cubre objetos sin romperlo, de modo que la raíz quede extendida.
Periodo I - 2019
43
Use papel absorbente para retirar el exceso de colorante realice una suave presión, evitando que
él cubre objetos resbale. Si la preparación está bien asentada no hay peligro de rotura por mucha
presión que se realice.
Selle todos los bordes del cubre objetos con esmalte transparente, para evitar que se seque y de
esta manera conservar la preparación durante varios días.
Coloque la preparación al microscopio e inicie la observación con el objetivo de 10x e

identifique las células.
Cambie al objetivo de 40X para detallar las células. Observe los núcleos y cromosomas en color
rosáceo – morado.
Ubique el objetivo de 100 x y escriba sus observaciones anotando las diferencias en cada uno de
los aumentos mencionados.
Trate de observar detenidamente las preparaciones y distinga células en interfase y células en

división y dentro de estas, las diferentes etapas de la mitosis.
Realice dibujos de todas las fases observadas.

Periodo I - 2019
44
Cuestionario
¿Qué etapas de la meiosis y mitosis observo?
- Anafase, metafase, telofase.
¿Qué proceso se está desarrollando en las etapas observadas?
- Se observan el proceso de meiosis y mitosis correspondientes a los pasos de separación

presentes en la reproducción de las células bien sea en reproducción vegetal o
reproducción animal.
¿Qué tipo de células se están observando?
- Animal y vegetal enfatizando en su tipo de reproducción donde cabe mencionar que la

mitosis es común en todo organismo viviente sea unicelular o multicelular posee células
que realizan mitosis. La meiosis es única de los organismos multicelulares. (Las bacterias
no hacen meiosis y esta se realiza solo a partir de los protistas pluricelulares)
¿Cuántos cromosomas poseen las células en mitosis?
- Una celular madres tiene cuarenta y seis cromosomas no sexuales o veintitrés pares estas
células dan lugar a dos células hijas con cuarenta y seis cromosomas cada una.
Periodo I - 2019
45
¿Cuántos cromosomas poseen las células en meiosis?
- Una célula madre germinal bien da lugar a cuatro células hijas cada una con la mitad de
cromosomas que la célula progenitora.
CONCLUSIÓN
Periodo I - 2019
46
Basados en el conocimiento adquirido sobre Bioseguridad y buenas prácticas en el laboratorio se
desarrollaron de forma segura cada una de las prácticas expuestas en la guía.
En La manipulación del microscopio se reconocieron las diferentes partes y su funcionamiento al

comprobar sus poderes mediante la observación de los diferentes montajes
Con el componente práctico se logró obtener varios conocimientos, donde se pudo observar y
estudiar las células con cada uno de los objetivos del microscopio expuestos por la tutora durante
la práctica (4x, 10x, 40x, y 100x). Allí se logró observar las partes estructurales de cada célula
con las que trabajamos, como la célula vegetal (elodea) donde se observa en una forma
hexaédrica (en celdas) y alargada. En la célula animal (glóbulos rojos) se observa el
comportamiento de estas células en los estados hipertónica, isotónica e hipotónica.
En la tramitancia (porcentaje de hemolisis) se observa la reacción de los eritrocitos ante los

medios que fueron expuestos (solución salina, agua destilada, metanol, fructosa, ácido cítrico y
metanol).Mediante el proceso de levaduras en medio de contraste (Rojo Congo) a diferentes
temperaturas y al exponer cada muestra a una gota de cultivo de ciliados, se evidencia la
interacción de los ciliados con la levadura. Al realizar el procedimiento para aislar los
cloroplastos y realizar las preparaciones con las diferentes soluciones se notó el grado de
absorbancia al exponer cada preparación en el espectómetro. Gracias a la observación de las
láminas proporcionadas por parte de la tutora, se observaron algunas de las fases de reproducción
celular animal y vegetal.
Periodo I - 2019
47
REFERENCIAS
Pérez, J., Valenciaga, J. L., Acosta, A., Nicolau, O., Turcios, S. & Navaroli, F. (2012).
Mecanismos De Acción Hormonal A Través De Receptores Ubicados En La Membrana Celular.
Recuperado de: http://www.cpicmha.sld.cu/hab/pdf/vol11_1_05/hab08105.pdf
Bruce, A., Lewis J., Raff, M., Roberts K. & Walter P. (2004). Biología Molecular De La Célula.
Editorial Omega. 4 Edición
Campbell, Neil A., Reece Jane B. (2007). Biología. España:Ed. Médica Panamericana.
Curtis, H. (2009). Biología Educación Media. Editorial Panamericana.
De Robertis, E., Hib, J. & Ponzio, R. (2009).Biología Celular y Molecular. Buenos Aires. Ed. El
Ateneo.
Freeman, Scott. (2009). Biología. Pearson Ediciones. 3 edición. Pierce B.A. 2005. Genética: Un
enfoque conceptual. México. Editorial Médica Panamericana.
Wayne N. Becker, Lewis J. Kleinsmith Y Jeff Hardin. (2006). El Mundo De La Célula. Pearson
Educación. 6 edición.

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LABORATORIO PRÁCTICO

PRÁCTICA LABORATORIO BIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR

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UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA

ESCUELA DE CIENCIAS DE LA SALUD

BIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR

Durante el proceso de construcción se han realizado mejoramientos académico-pedagógicos y

Se diseñó una simulación de microscopía en donde el estudiante puede manipular el microscopio

Práctica No. 1: Bioseguridad

Práctica No. 2: Microscopía

Práctica No. 3: Célula: Crenación, Hemólisis, Plasmólisis y Turgencia.

Práctica No. 4: Permeabilidad selectiva del eritrocito.

Práctica No. 5: Tejidos vegetales y Aislamiento de cloroplastos.

Práctica No. 6: Acción de lisosomas.

Práctica No. 7: Mitosis y Meiosis.

DESCRIPCIÓN DE LA ACTIVIDAD PRÁCTICA No. 1

DESCRIPCIÓN DE LA ACTIVIDAD PRÁCTICA No. 2

El microscopio es un instrumento que permite aumentar el tamaño de un objeto un número

Comprender el funcionamiento del microscopio y reconocer los diferentes poderes del

10. Tornillo Macrométrico

Funciones del Microscopio

Partes del Función

Platina y pinza La platina es la lamina horizontal con un orificio central, sobre él se

Objetivos Lentes que amplían la imagen de la preparación y se sitúan generando

Tornillo Permite enfoque aproximado o grueso que alejar o acercar acercando el

Tornillo Permite dar claridad a la imagen al lograr ajuste fino y preciso.

OBJETO AUMENTO DIBUJO ANALISIS Y

Se aumenta aún más

Vista con Se observa solo un

OBJETO AUMENTO DIBUJO ANALISIS Y

Vista con Se observa solo un

OBJETO AUMENTO DIBUJO ANALISIS Y

Vista con Se aumenta el grosor

Vista con Se observa un solo hilo

OBJETO AUMENTO DIBUJO ANALISIS Y

OBJETO AUMENTO DIBUJO ANALISIS Y

Vista con Este aumento permite

OBJETO AUMENTO DIBUJO ANALISIS Y

Vista con Se observa amplia la

Vista con Las fibras pierden su

1 ¿Qué organismos pueden observarse en la gota de agua estancada?

- En la gota de agua estancada encontramos partículas y microorganismos que se

2¿Son todos de igual tamaño y forma?

- Se observan de diferentes formas y tamaños en los cuales no se identifica algún

3¿Se observan organismos móviles o estáticos?

4. Para las muestras de la letra, la hebra de hilo observadas determine:

A ¿Cómo se manifiesta el poder de resolución?

B. ¿Cómo se manifiesta el poder de aumento?

C. ¿Cómo se manifiesta el poder de definición?

- Es la calidad de la visualización de la imagen es la definición que presentan los

D. ¿Cómo se manifiesta el poder de penetración o profundidad?

CÉLULA: CRENACIÓN, HEMÓLISIS, PLASMÓLISIS Y TURGENCIA”

Observar los fenómenos de hipotonía, isotonía e hipertonía en células animales y vegetales.

Microscopio compuesto, 6 portaobjetos y 6 cubreobjetos, vasija con agua destilada, pipeta

OBJETO AUMENTO DIBUJO ANALISIS Y

Célula Sanguínea 4x Partículas diminutas de

Célula Sanguínea 10x Son visibles partículas de

Célula Sanguínea 40x Se hacen más pequeñas

Cédula Sanguínea 4x Color rosado que no

Célula Sanguínea 10x Hacía la parte central se

Célula Sanguínea 10x A lo lejos se evidencia las

Célula Sanguínea 10x Las partículas sanguíneas