Sunteți pe pagina 1din 2

LP. 5.

Reacţiile antigen-anticorp şi tehnicile de biologie moleculară în laboratorul de


microbiologie.

Obiective: La sfârşitul acestei lucrări practice studenţii trebuie:


1. să cunoască noţiunile de antigen şi anticorp, zona de echivalenţă, fenomen de prozonă
şi aplicaţiile practice ale reacţiilor antigen-anticorp.
2. să cunoască principalele tipuri de reacţii antigen-anticorp utilizate în laboratorul de
microbiologie (clasificare, principiu, indicaţii, exemple).
3. să cunoască noţiuni legate de tehnicile de biologie moleculară, ca instrument modern
de diagnostic.

1. Antigen  substanţă străină care, pătrunsă într-un organism competent, determină


răspuns imun (imunogenitate) şi reacţionează specific cu efectorii imunitari apăruţi ca
rezultat al acestui răspuns (specificitate).
Anticorp  imunoglobulină produsă în organism sub acţiunea unui antigen şi care are
proprietatea de a reacţiona specific cu antigenul corespondent.
Legarea antigen-anticorp:
- necesită complementaritatea situsurilor de legare Ag-Ac
- este specifică şi reversibilă
- este stabilă în zona de echivalenţă (cantităţile celor doi reactivi sunt aproximativ egale).
Fenomen de prozonă = absenţa reacţiei în prezenţa unui exces de anticorpi  rezultat fals
negativ.
Aplicaţiile practice ale reacţiei antigen-anticorp
- identificarea unui antigen necunoscut;
- identificarea unui anticorp necunoscut.
 Se pot obţine:
- relaţii calitative  identificarea unui reactiv
- relaţii cantitative  determinarea titrului reactivului cercetat
Titru  inversul diluţiei maxime a unui reactiv, la care mai este vizibilă reacţia, dacă se
utilizează cantităţi constante şi definite ale reactivului omolog.

2. Principalele tipuri de reacţii antigen-anticorp

A. Reacţiile de precipitare
Principiu: un antigen solubil formează cu anticorpul omolog un complex insolubil
(precipitat).
Clasificare după mediul în care se desfăşoară reacţia:
a. Reacţii în mediu lichid
b. Reacţii în mediu gelificat - ex. imunodifuzia radială dublă (testul Elek → demonstrarea
toxigenezei bacilului difteric).

B. Reacţiile de aglutinare
Principiu  cuplarea unui antigen în suspensie cu anticorpul omolog determină apariţia unui
aglutinat sub formă de mase vizibile, care se depun şi lasă supernatantul limpede.
Clasificare după modul de prezentare a antigenului în reacţie:
a. Reacţii de aglutinare directă
b. Testul Coombs
c. Reacţii de aglutinare pasivă
d. Reacţia de latexaglutinare
e. Reacţia de coaglutinare.
1
C. Reacţia de fixare a complementului
D. Reacţiile de neutralizare
Principiu = sunt implicate antigene virale sau toxine a căror legare de receptori celulari este
urmată de efecte definite
= după reacţia cu anticorpii omologi, aceste antigene nu se mai pot fixa pe
receptorii celulari, deci sunt neutralizate.
Clasificare:
 Neutralizări.
 Reacţii de inhibare a hemaglutinării
E. Reacţiile cu reactivi marcaţi:
 Imunocromatografia
 Imunofluorescenţa
 Reacţiile imunoenzimatice (Enzyme Immunoassay-EIA)
Principiu: sunt reacţii Ag-Ac care folosesc pentru vizualizarea complexului marcajul
enzimatic, cuplat la un element (Ac sau Ag) cunsocut, respectiv care formează conjugatul.
După formarea complexului Ag-Ac şi îndepărtarea reactivului necuplat, pentru estimarea
activităţii enzimatice, se adaugă substratul cromogen al enzimei → reacţia de culoare
dezvoltată este apreciată vizual sau spectrofotometric.
A. ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)
a. direct
b. indirect
c. competitiv
B. Immunoblotting (Western blot)
C. RIBA (Recombinant immunobinding assay)

4. Tehnicile de biologie moleculară


- studiază genomul independent de cultivare si sunt utilizate pentru identificarea rapidă a
microorganismelor direct în produsul patologic, detecţia genelor de rezistenţă, genotipare.
A) Hibridarea cu sonde ADN complementare secvenţei nucleotidice cercetate (southern
blots/ northern blots). Detecţia sondei în hibrid se face cu ajutorul moleculelor reporter.
B) Reacţia de polimerizare în lanţ (polymerase chain reaction-PCR) - constă în
amplificarea unei secvenţe de ADN ţintă cu ajutorul unor primeri, a unei polimeraze şi a unor
amorse. Ampliconul rezultat este apoi evidenţiat prin electroforeză în gel.
PCR pentru evidenţierea ARN necesită o etapă intermediară de revers transcriere a ARN în
ADNc înainte de amplificare (Reverse Transcriptase – PCR sau RT-PCR).
PCR în timp real (qRT–PCR sau Real Time PCR) permite evidenţierea şi cuantificarea
acidului nucleic amplificat pe măsură ce are loc amplificarea.
C) Secvenţierea ADN – determină ordinea în care sunt aşezate bazele azotate în secvenţa
nucleotidică. Tehnica utilizează enzime de restricţie şi detecţie prin electroforeză capilară a
fragmentelor sintetizate.

Bibliografie :
D. Buiuc. Microbiologie medicala, 2003, pg. 80-83, 367-371.

In sala se gasesc:
- trusă aglutinare, test imunocromatografic, placă ELISA, kit PCR
- planse cu reactiile Ag-Ac (principiul reactiei)