Trabajo Práctico Nº3: Cultivo Batch

Resumen:
La base de este trabajo práctico fue el estudio de coeficientes estequiométricos mediante la
realización de un cultivo batch. Para esto, se utilizó el microorganismo K. lactis para conocer
acerca de su crecimiento y corroborar su naturaleza crabtree negativa. Una vez obtenidos
los resultados buscados, y luego de la realización de las ecuaciones y gráficos pertinentes
se obtuvo a través de balance de carbonos, perfiles de consumo de oxígeno y cálculo de
coeficientes respiratorios, que K. lactis, contrario a lo esperado, es un crabtree positivo
generando como producto un posible azúcar o ácido basado en su valor de grado de
reducción (yP/S: 0,4 cmol p/cmol s y 𝛾P: 3,85). A su vez, se estudiaron las características de
un cultivo batch en un fermentador de pequeño tamaño, y todos los aspectos a tomar en
cuenta para la realización de un medio de cultivo.

Introducción:
El cultivo en batch es ampliamente utilizado en el laboratorio para el estudio de parámetros
básicos de crecimiento, tales como la respuesta a distintos medios y condiciones de cultivo
para obtener consecuentemente las cinéticas de crecimiento, entre otros datos. La
simplicidad del sistema y la practicidad con que se obtienen los resultados buscados ha
vuelto de éste una potente herramienta para el estudio y el desarrollo de cualquier
bioproceso que pueda concebirse. Este sistema de cultivo a diferencia de otros, mantiene el
volumen constante debido a que no hay entrada ni salida de un flujo como componentes
para el medio, por lo que el cultivo batch permite evaluar el crecimiento a una velocidad
específica de crecimiento máxima obteniendo la mayor cantidad de biomasa generada. Sin
embargo, este medio de cultivo tiene las limitaciones de no poder controlar la velocidad
específica de crecimiento (ya que se trabaja siempre a μmax) y tampoco definir cuál se quiere
que sea el sustrato limitante (ya que en batch, el sustrato limitante es el primero que se
termina).
Otra de las ventajas de este medio de cultivo, es que se pueden observar los distintos
perfiles de crecimiento para un cultivo. Los perfiles de crecimiento presentan distintas fases,
tal como se puede observar en la Imagen Nº1. Al comienzo del crecimiento, se muestra una
fase lag o de latencia donde no hay división celular pero sí un aumento de la masa
individual de los microorganismos. Cabe destacar que esta fase depende de la fase de
crecimiento en que se encuentran las células en el momento de ser sembradas y de la
composición del medio de cultivo en que fueron crecidas. Luego le sigue la fase de
crecimiento exponencial donde el crecimiento ocurre a una velocidad específica (μ) máxima
y constante, en esta fase se alcanza la máxima concentración de biomasa. Al final de esta
fase, se encuentra una etapa de desaceleración donde la velocidad específica de
crecimiento se torna cero, y le permite entrar a la fase estacionaria que acontece cuando
alguno de los sustratos esenciales del crecimiento se agota. A su vez, durante esta fase, el
crecimiento se mantiene constante. Finalmente ocurre una etapa de muerte donde la
concentración de biomasa disminuye por autolisis o como consecuencia del metabolismo
endógeno (Modelo de Herbert). En algunos organismos, frente a ciertas condiciones de
crecimiento, los perfiles varían significativamente ya que éstos dependen del
microorganismo y del medio de cultivo en el cual se lleva a cabo el ensayo.
Debido a las características del cultivo batch, tal como se planteó anteriormente, luego de
cierto tiempo de cultivo, algunos sustratos comienzan a terminarse, tal como el oxígeno en
el medio entre otros. En estos casos, hay ciertos microorganismos que tienen la capacidad
de generar productos en estas etapas que le permitan la continuación de su crecimiento.
Esta capacidad se denomina “efecto crabtree”. En el caso de los microorganismos crabtree
positivos, el crecimiento exponencial se ve asociado a la formación de un cierto producto
que, más tarde, será utilizado como sustrato para la obtención de carbono y energía. Dichos
organismos una vez alcanzada la fase estacionaria (que puede considerarse como una fase
lag secundaria) reinician su crecimiento. Sin embargo, el microorganismo utilizado, K. lactis,
es crabtree negativo, por lo que no se espera la generación de un producto en la fase
exponencial.

Imagen Nº1: Fases del crecimiento microbiano en un cultivo batch.

En el presente trabajo, se propuso evaluar el crecimiento de Kluyveromyces lactis en

condiciones de cultivo similares, con el objeto de comparar no solo sus perfiles de
crecimiento sino también su rendimiento en biomasa, consumo de oxígeno, formación de
dióxido de carbono y eficiencia respiratoria. Se analizó además el pH de cada uno de los
cultivos y su relación con el perfil de crecimiento. Tomando todos estos datos en cuenta, se
corroboró si este microorganismo tiene efecto crabtree negativo o positivo.

Materiales y Métodos:
Microorganismo: K. lactis
Medio de cultivo:
Glucosa .............................................................................. 8,00 g/l
Urea ................................................................................... 1,50 g/l
K2HPO4 ............................................................................. 1,00 g/l
MgSO4.7H2O ..................................................................... 0,60 g/l
CaCl2.2H2O ........................................................................ 0,10 g/l
ácido cítrico ........................................................................ 0,45 g/l
H3BO3 ................................................................................. 0,10 mg/l
CuSO4 ................................................................................. 0,10 mg/l
KI ........................................................................................ 0,10 mg/l
FeCl3 ................................................................................... 0,10 mg/l
Na2MoO4 ............................................................................. 0,10 mg/l
inositol ................................................................................. 6,00 μg/l
biotina .................................................................................. 6,00 μg/l
ácido fólico .......................................................................... 6,00 μg/l
pantotenato de calcio ............................................................ 0,80 mg/l
tiamina .................................................................................. 0,80 mg/l
ácido nicotínico ..................................................................... 0,80 mg/l
ácido p-amino benzoico ......................................................... 0,40 mg/l
riboflavina ............................................................................. 0,40 mg/l
piridoxina .............................................................................. 1,60 mg/l
antiespumante ....................................................................... 3 gotas
pH 5,50 (ajustado con HCl o H2SO4 1N)
Volumen de cultivo: 4,0 l

Los fosfatos se esterilizaron por calor húmedo (autoclave), fraccionados en un erlenmeyer

con salida lateral, disolviendo la cantidad necesaria para preparar 3,6 l de medio de cultivo,
en 500 ml de H2O y se ajustó el pH en 5,50. El resto de los componentes (excepto la urea y
la solución de vitaminas) se disolvieron en 3,1 l de H2O y se ajustó el pH en 5,50. Los
microelementos se agregaron en solución concentrada 1000 veces a razón de 1 ml/l, se
ajustó el pH en 5,50 y se esterilizaron, en autoclave, en el biorreactor. El tiempo de
esterilización fue en ambos casos de 15 minutos. La urea se esterilizó por filtración. Se
preparó una solución madre con 500 g/l de urea y se esterilizó con membrana absoluta.
Esta solución se adicionó en proporción de 6,0 ml por litro de medio de cultivo. Las
vitaminas se prepararon en solución concentrada 1000 veces, se esterilizaron por filtración y
se adicionaron a razón de 1 ml/l de medio.
En cuanto al inóculo, se consideró el uso de 400ml por los 4 l finales en el biorreactor. Por lo
que se utilizaron dos erlenmeyers de 1000 ml conteniendo 200 ml de medio de cultivo
diluido 2,5 veces y se esterilizaron por calor durante 10 min. Para mayor simplicidad se
esterilizó el medio de cultivo completo (excepto la urea y las vitaminas que se adicionaron
en proporción de 0,5 ml y de 0,1 ml de las soluciones madres). Los erlenmeyers fueron
sembrados el día anterior a la realización de trabajo práctico con células de levaduras
provenientes de un cultivo en agar inclinado. Las mismas se resuspendieron en agua. La
temperatura de incubación fue en todos los casos de 30°C.

Procedimiento:
1.- Se termostatizó el biorreactor a 30°C
2.- Se conectó el sistema de aireación al filtro estéril del biorreactor.
3.- Se conectó el sistema de agitación del biorreactor. Y se fijó la agitación en 600 rpm.
4.- Se adicionaron en forma estéril los fosfatos, la urea y las vitaminas al resto del medio de
cultivo contenido en el biorreactor.
5.- Se calibró el electrodo para medir O2 disuelto haciendo pasar por el biorreactor. Primero
una corriente de nitrógeno y ajustando la lectura a 0% de saturación (ajuste del cero) y
luego
aire a un caudal de 1 l/min, ajustando con la perilla de calibración a 100% de saturación. En
ambos casos, antes de realizar los ajustes, se dejaron transcurrir 10 a 15 minutos. Los
gases que ingresen al biorreactor deberán pasar por el filtro estéril. A las 2,25 horas se
modificó el caudal a 1,4 l/min.
6.- Se calibraron los instrumentos de medida para efectuar el análisis de los gases a la
salida del biorreactor (analizador de O2 y de CO2).
7.- Se trasvasaron, en forma estéril, los tres erlenmeyers de inóculo a otro con salida lateral.
8.- Se sembró el biorreactor y se esperaron 2 a 3 minutos
9.- Se tomaron 15 ml de muestra (descartando antes aproximadamente 10 ml) y se tomó el
tiempo 0. Se anotaron en cada caso el volumen de muestra y el de descarte.
10.- Se midió el porcentaje de O2 y CO2 en lo gases de salida del biorreactor.

Para el análisis de las muestras:

11.- Se centrifugaron 10 ml, por 10 minutos. Se guardó el sobrenadante para determinar
concentración de FCE. Se lavó una vez con agua destilada al pellet de levaduras, se
centrifugó, se resuspendieron las células con más agua destilada y se realizó la medida de
peso seco a 105°C. Habiendo previamente tarado el vaso de precipitado donde se realizaría
la medición de peso seco.
12.- Al resto de la muestra se le midió:
12.1.- pH
12.2.- DO a 600nm. La muestra fue diluida de forma tal de obtener lecturas entre 0,2 y 0,6.
13.- Se repitieron los pasos 9 a 12 cada 45 minutos.
14.- Una vez finalizado el cultivo, se midió el volumen remanente. Con este dato y los de
volumen de muestra y lavado se calculó el volumen de cultivo. El volumen obtenido en cada
caso fue el utilizado para el cálculo de rO2 y rCO2 a los correspondientes tiempos.
15.- Con los resultados obtenidos se realizaron:
I.- Gráficos de ln x vs. t. y DO vs. t. Con estos gráficos, se calculó Rmax .
II.-1 Se verificó si YX/S se mantuvo constante durante el cultivo.
II-2 Se calcularon YX/S e yX/S globales.
II-3 Se calculó el consumo global de O2 y el CO2 total producido. Con estos valores se
calculó b e yCO2/S respectivamente.
III- Se verificaron si se cumplen los balances de carbono y de grado de reducción.
e + h + x = 1
yX/S + yCO2/S = 1

Resultados y Discusión:
Los resultados obtenidos fueron plasmados en la Tabla Nº1 a partir de la cual se realizaron
los gráficos y análisis correspondientes.
 Tabla 1: Datos obtenidos a partir del cultivo en biorreactor cada 45 minutos a 30 °C. Cabe
destacar que el flujo de aire hasta las 1,5 hs fue de 1 l/min. A partir de las 2,25 hs, se
aumentó el flujo a 1,4 l/min manteniéndose hasta el final del ensayo.

Gráfico Nº1: Curva de Calibración realizada a partir de los datos de Glucemia.

A partir de las dos curvas de calibración del Gráfico N°1 y los valores de absorbancia
medidos por duplicado obtenidos se calcularon las concentraciones de glucosa (g de
sustrato/l) de cada tiempo, tal como se puede observar en la Tabla Nº1. Las
concentraciones de glucosa disminuyen en el tiempo debido a su consumo por el
microorganismo para su crecimiento. A medida que aumenta el tiempo, mayor es el
consumo de glucosa, debido a la alta concentración de biomasa en el medio. Al final del
ensayo, se obtiene un valor final de sustrato de 3,002 gS/l. Si se compara con el valor
inicial, que tenía un valor de 6,837 gS/l, se plantea que se consumieron 3,835 gS/l.
 Gráfico Nº2: Variación de OD (600nm) corregida en función del tiempo.

Gráfico Nº3: Variación del Ln de la biomasa (X) en función del tiempo.

En el Gráfico Nº2 se puede observar el crecimiento exponencial de la biomasa en función

del tiempo. Se observa también una leve fase lag que dura menos de 0,5 hs, a partir de las
0,75hs se observa un aumento exponencial de la absorbancia lo que se condice con un
aumento de la biomasa. Dadas las condiciones de cultivo y los tiempos medidos, no se
esperaba la aparición de las fases estacionarias y de muerte. Por otro lado, los resultados
obtenidos en el Gráfico N°2 se condicen con los del Gráfico N°3, principalmente en lo que
concierne a las fases de crecimiento, ya que el pico mínimo generado en las primeras 0,5hs
puede corresponderse con la fase lag. A su vez, se pudo obtener la μmax a partir del gráfico,
que se corresponde con la pendiente de la recta, y tiene un valor de 0,4512 h-1.

Gráfico Nº4: Variación de la velocidad de transferencia de oxígeno (rO2) en función del

tiempo. Se obtuvo un área bajo la curva de 0,02966 moles de O2/l.
En este gráfico se puede observar que hasta las 2,25hs no se muestra un aumento en la
velocidad de transferencia de oxígeno. Esto se pudo deber a que el crecimiento de biomasa
fue muy lento hasta las 3 hs aproximadamente. Basado en los resultados que se iban
obteniendo, se comenzó a sospechar de una limitación de oxígeno por lo que se aumentó el
caudal de 1l/min a 1,4 l/min a partir de las 2,25hs. Luego de esta variación en el caudal, se
observó que el rO2 comenzó a responder de de manera lineal, lo que se condice también
con el aumento exponencial de la biomasa en el Gráfico Nº2. Esta variación de velocidad de
transferencia se basa en el consumo de oxígeno por la biomasa que se encuentra
creciendo, por lo que a mayor crecimiento de biomasa a una misma velocidad de
crecimiento específica (μmax), mayor es el consumo de oxígeno lo que se condice con el
aumento de rO2. Si se compara el Gráfico Nº2 con los resultados obtenidos de rO2, se
podría plantear que el ensayo se llevó a cabo sin una limitación en oxígeno ya que el
crecimiento de biomasa se mantuvo exponencial durante todo el ensayo.
 Gráfico Nº5: Variación de la velocidad de dióxido de carbono (rCO2) en función del
tiempo.Se obtuvo un área bajo la curva de 0,03761 moles de CO2/l.

En este gráfico se puede observar un aumento en la velocidad de producción de CO2, hasta

llegar a un pico a las 1,5hs. Sin embargo, se muestra una descenso que se pudo deber al
cambio de flujo a las 2,25 hs donde, a partir de este tiempo, se muestra un aumento lineal
en función del tiempo. Esto se condice con el crecimiento de biomasa y la consecuente
producción de CO2.
Basado en los resultados del rO2 y rCO2, se obtienen los coeficientes respiratorios (CR)
cuyos valores se observan en la Tabla Nº1. Se puede observar que, a medida que pasa el
tiempo, el CR aumenta su valor paulatinamente, obteniendo un valor final mayor a 1. Esto
implica que el proceso es altamente fermentativo condiciéndose con el metabolismo del
microorganismo, ya que es una levadura, por lo que su metabolismo principal es la
fermentación para el crecimiento y generación de biomasa.

A partir de los datos obtenidos se procedió a calcular los rendimientos y realizar los
balances de carbono y energía para confirmar que K. lactis es crabtree negativo.

Balance de Carbono
Suponiendo crabtree negativo,
yX/S + yCO2/S = 1 + a

Con los valores yX/S: 0,306 cmol x/cmol s y yCO2/S: 0,294 cmol CO2/cmol s y a: 0,06 cmol
FN/cmol s.
yX/S + yCO2/S = 0,539

Con este resultado, se supone la generación de un producto con un yP/s de

aproximadamente 0,461 cmol p/ cmol s, contrario a lo esperado teóricamente.

Balance de gamma cuyos niveles de referencias son CO2, urea y H2O

Suponiendo crabtree negativo,
𝛾s + (-4)b = yx/s . 𝛾x
Con los valores 𝛾s: 4, 𝛾x: 4,2, yX/S: 0,306 cmol x/cmol s y b: 0,235 moles O2/cmol s
4 e-/cmol s + (-4 e-/moles O2) . 0,235 moles O2/cmol s = 0,306 cmol x/cmol s . 4,2 e-/cmol x
3,07 e-/cmol s ≠1,28 e-/cmol s
Esto se condice con lo encontrado en el balance de carbono, comprobando la presencia de
producto. Para estimar su naturaleza se calculó el 𝛾P.
𝛾s + (-4)b = yx/s . 𝛾x + yP/s . 𝛾P
𝛾P: 3,85

Para poder corroborar que la presencia de producto cumple con los balances, se recurre al
siguiente balance:
Y para que el balance se cumpla:

Obteniéndose los siguientes valores:

E= 4b/𝛾s
E= 0,235
N=yx/s𝛾x /𝛾s
N=0,3213
E=yp/s𝛾P/𝛾s
E=0,4437
Si se realiza la suma E+N+E=1
Se corrobora que=
0,235+0,3213+0,4437=1,0000
De esta manera se plantea, que es necesaria la presencia del producto para que se puedan
cumplir los balances.

Basándose en el valor obtenido para el grado de reducción del producto, se sugiere que,
este producto puede tener dos posibles naturalezas. Por un lado, debido a que tiene un
valor menor a 4, se podría suponer que el producto es un ácido. Sin embargo, debido a que
su valor es muy cercano a 4, también se podría sugerir que puede ser un azúcar. Esto
difiere completamente de los esperado para este microorganismo ya que inicialmente se
planteó que K. lactis es crabtree negativo. Por lo que estos resultados estaría planteando
que eso no es cierto y que existe la generación de un producto en la fase exponencial de
crecimiento pero que para poder definir la naturaleza del mismo, se debería purificar el
producto y caracterizarlo. Basado en el segundo balance de energía llevado a cabo, se
plantea que hay electrones que están siendo destinados hacia el producto en cuestión, ya
que si ellos, no se cumpliría el balance. Todos estos resultados difieren de la teoría de que
K.lactis es crabtree negativo. Por lo que se plantea que, debido a la producción de un
producto durante la fase exponencial, este microorganismo es crabtree positivo en las
condiciones ensayadas.

Conclusión:
Basado en los resultados obtenidos para el microorganismo estudiado, se puede plantear
que la ecuación de crecimiento donde se plantea que K.lactis no genera producto es
incorrecta, al menos para las condiciones llevadas a cabo en este trabajo. Esto se debe a
los valores obtenidos de los rendimientos de biomasa y de producción de CO2 y de los
respectivos balances de carbono y de grado de reducción ya que los mismos no se
cumplen. Por lo que se decidió evaluar la presencia de un producto, donde se obtuvo que
su naturaleza puede ser ambivalente, ya que, debido a que su grado de reducción es menor
a 4, pero muy cercano al mismo se plantea que para poder corroborar si este producto es
un ácido o un azúcar se debería poder caracterizarlo. Basado en la presencia de un
producto generado en la fase exponencial, se plantea entonces que este microorganismo
tiene la capacidad de generar un producto en las condiciones de cultivo utilizadas, lo que
difiere de la teoría. Debido a esto, también se puede sugerir que el rendimiento de biomasa
es menor, ya que parte de la FCE fue destinada a la generación del producto desconocido.
Otro de los aspectos estudiados es el tipo de metabolismo llevado a cabo por K. lactis, este
razonamiento es obtenido de los valores de los coeficientes respiratorios (CR), que, al tener
un valor mayor a 1, se condice con el metabolismo fermentativo del microorganismo en
cuestión. A su vez, esto se complementa con los valores obtenidos de rO2 y rCO2, ya que
la producción de dióxido de carbono aumenta en mayor medida que la del consumo de O2.
A modo de síntesis final, se plantea que el cultivo Batch es un sistema de cultivo que
permite obtener los parámetros básicos de crecimiento, tal como la velocidad específica de
crecimiento, entre otros. Este sistema de cultivo también permite el crecimiento del
microorganismo a su μmax , pudiendo obtener los valores de rendimiento de biomasa,
producción de dióxido de carbono y de producto. Basado en los resultados que difieren de
la teoría, tal como la producción de un producto, se debería repetir el ensayo para poder
corroborar si efectivamente la generación de producto es latente del microorganismo o fue
generado por una variación del medio de cultivo, o de las condiciones del mismo. A su vez,
en el caso que nuevamente haya generación del producto, se deberá caracterizarlo y
llevarlo a un posterior análisis para estudiar qué aspectos metabólicos y de cultivo son los
causantes de este producto, a pesar del planteo que este microorganismo es crabtree
negativo.