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Deuxième année pharmacie Biologie moléculaire NAJIB Meryem

 QE 1 : Le rôle de chaque carbone dans un nucléotide :


C1 : Permet de tenir la base azotée.
C2 : Différencier entre ADN et ARN (présence ou non de OH).
C3 : Liaison avec un autre nucléotide (sans 3’OH, il n’y aura pas de PCR, transcription,
polymérisation).
C4 : Porte C5
C5 : Porte le phosphate.
 QE 2 : L’utilisation du carbone 3 dans le ciblage thérapeutique :
Ciblage moléculaire de l’HIV : contrer l’action de la reverse transcriptase par des analogues
structuraux de nucléotides avec perte du 3’OH, donc blocage de polymérisation donc de
transformation de l’ARN viral en ADN viral. On cite :
AZT : Azidothymine
DDC : Dideoxycytidine
DDI : Dideoxynisosine
 QE 3 : Quelle est la différence entre gène, exon et cadre de lecture ?
Exon : Partie de la séquence d’un gène transcrite et conservée dans la structure de l’acide
ribonucléique messager après l’épissage jusqu’à la traduction.
Un exon code le plus souvent pour un domaine fonctionnel de la protéine ou une partie d’un tel
domaine.
Intron : Partie non codante d’un gène.
Gène : Séquence de nucléotides de l’ADN contenant l’information nécessaire pour la synthèse d’un
ARN ou d’une protéine.
Cadre ouvert de lecture : Séquence qui se trouve à l’intérieur de l’exon. Commence par ATG et se
termine par un codon stop. Il code pour une protéine.
 QE 4 : Relation entre réplication, cycle cellulaire, erreur, réparation d’erreur, et oncogenèse :
Le cycle cellulaire traverse quatre phases :
La phase G1 : c’est la phase de préparation à la synthèse d’ADN, la chromatine est accessible aux
ARN polymérases qui transcrivent les gènes en messagers qui seront traduits par la suite.
La phase S : La transcription est inhibée. C’est la phase de réplication de l’ADN, en d’autres termes,
la synthèse d’acide désoxyribonucléique qui reproduit exactement le génome d’une cellule afin de
préparer la division de cette cellule. Cette synthèse se produit grâce à l’activité de l’ADN
polymérase. Elle est semi-conservatrice et bidirectionnelle.
- La réplication : les ADN polymérases commencent leur synthèse en de nombreux points de
réplication sur des amorces d’ARN constituées par l’ADN primase. La réplication se poursuit
dans la direction du brin avancé, qui est parcouru par l’enzyme dans le sens 3’---5’. L’ADN
ligase assure ensuite la liaison entre les différents fragments de l’ADN nouveau. La synthèse
de l’autre brin retardé est plus complexe : l’ADN primase synthétise des amorces de
quelques nucléotides en avant de la zone de réplication, l’ADN polymérase construit à la
suite des petits fragments d’ADN (fragments d’Okazaki) dans le sens 5’---3. Ces fragments
seront ensuite reliés entre eux par l’ADN ligase.
- Les erreurs : La fidélité de réplication est très grande et elle est en très grande partie due à
l'ADN polymérase, qui incorpore les bases nucléiques en fonction de la complémentarité. En
cas d'erreur, l'ADN polymérase la corrige au moyen de son activité exonucléase 3' → 5'. Ceci
permet à la polymérase de reculer d'un cran en éliminant le nucléotide incorrect qui est
hydrolysé, pour ensuite reprendre la synthèse du brin d'ADN. Cependant, la probabilité de
produire des mauvais appariements ou des petites insertions ou délétions pendant la
réplication est loin d’être négligeable.
Certains agents chimiques ou physiques peuvent conduire à des interactions stables entre
les deux brins d’ADN ou entre les protéines ou les brins d’ADN (formation de ponts). Les
radiations ionisantes peuvent conduire à des coupures d’un brin d’ADN ou à des cassures
des deux brins.
Phase G2 : c’est la phase de réparation des mutations et d’erreurs. Plusieurs mécanismes de
réparations sont mis en œuvre.
Mitose : division cellulaire.
Oncogenèse : La survenue dans un organisme d'une tumeur cancéreuse est liée à l'émergence d'un
clone cellulaire échappant aux lois qui régissent la prolifération et la cohabitation cellulaire
normales. L'anomalie responsable de la transformation cancéreuse est transmissible par division
cellulaire et consiste en une altération majeure de l'information génétique, c'est à dire une
mutation de l'ADN.
 QE 5 : Les différents types de mutations :
- Les macrolésions : Les délétions, les duplications, les inversions, les amplifications, les
fusions de gènes, les insertions de séquences d’ADN.
- Les microlésions : mutations ponctuelles de l’ADN :
1. Substitution : Remplacement d’un nucléotide par un autre dans la structure primaire
d’un acide nucléique. On distingue :
 La transition : remplacement d’une base purique par une autre base purique,
ou une base pyrimidique par une autre base pyrimidique.
 La transversion : remplacement d’une base purique par une base pyrimidique.
o Délétion : Suppression d’un ou de plusieurs nucléotides dans la séquence primaire
d’un acide nucléique.
 1 ou 2 nucléotides : décalent le cadre de lecture.
 3 nucléotides : suppression d’un acide aminé dans la protéine exprimée.
 Grande longueur : supprimer l’expression d’un ou de plusieurs exons.
o Insertion : Addition d’un ou de plusieurs nucléotides dans la séquence primaire d’un
acide nucléique.
 1 ou 2 nucléotides : décalent le cadre de lecture.
 3 nucléotides : addition d’un acide aminé dans la protéine exprimée.
 Grande longueur : modifier la traduction de l’exon.
 QE 6 : Système de réparation :
Permet la réparation des erreurs émises en cours de la réplication de l’ADN.
La protéine MutS reconnaît des erreurs d’appariements mais aussi des insertions ou des
délétions de quelques nucléotides.
La protéine MutL stabilise le complexe formé entre MutS et la portion de l’ADN double brin qui
présente le mauvais appariement.
La protéines MutH va être activée par ce complexe et va couper le brin nouvellement synthétisé.
Le brin nouvellement formé est alors partiellement dégradé et resynthétisé correctement par
l’ADN polymérase III.
La soudure finale est assurée par l’ADN ligase.
 Syndrome de Lynch : mutations dans les gènes des enzymes de réparation des erreurs
d’appariements.
- Excision-réparation de base : éliminer les bases incorrectes ou les bases transformées par
des agents alkylants. Souvent les mutations ponctuelles de l’ADN concernent ces cytosines
méthylées, on parle de points chauds de mutation.
1. Elimination de la base incorrecte par une ADN N-glycosylase avec apparition d’un site
AP.
2. Coupure du brin d’ADN endommagé en 5’ du site AP créant ainsi un OH-3’ adjacent
au site AP.
3. Extension à partir de cet OH-3’ par une ADN polymérase est réalisée avec excision du
site AP.
4. Soudure finale par une ADN-ligase.
- Excision-réparation de nucléotides :
1. Reconnaissance du dommage sur l’ADN.
2. Liaison d’un complexe multiprotéique avec le site endommagé.
3. Double excision du brin endommagé suit avec coupure plusieurs nucléotides en 5’ et
en 3’ de celui-ci.
4. La lacune présente est comblée par une ADN polymérase.
5. Soudure finale est assurée par une ADN-ligase.
 Syndrome de BLOOM ou la maladie de Fanconi : anomalies génétiques du système de
réparation.
- Le système S.O.S : Représente la dernière chance de réparation. La protéine de
recombinaison RecA joue un rôle central dans un tel mécanisme de sauvegarde. La synthèse
de cette protéine est normalement réprimée par une protéine appelée LexA ou répresseur.
Si un besoin important de protéine RecA apparaît, la répression est levée grâce à une
propriété particulière de la RecA capable de cliver son répresseur.
 QE 7 : Etapes de la régulation de l’expression génétique :
1) Régulation de la double hélice d’ADN.
2) Régulation pré-transcription.
3) Régulation de l’élongation de la transcription.
4) Régulation post transcription (maturation de l’ADN).
a. Chapeau : structure qui protège l’extrémité 5’ de l’ARNm.
b. Edition : modification de certaines bases (système de réparation).
c. Epissage – excision : les parties non codantes (introns) de la structure primaire sont
coupées, et les parties codantes (exons) son réassemblée.
 QE 8 : principes et schémas de la PCR, PCR en temps réel, séquençage :
PCR : réaction en chaîne par polymérase, est une méthode
de biologie moléculaire d'amplification génique in vitro.
Elle permet de dupliquer en grand nombre une séquence
d'ADN ou d'ARN connue, à partir d'une faible quantité
d'acide nucléique et d'amorces spécifiques constituées
d'oligonucléotides de synthèse de 20 à 25 nucléotides.
Outil crucial en diagnostic moléculaire. Permet une
détection sensible et spécifique des cibles d’acides
nucléiques.
PCR en temps réel : technique moléculaire de génotypage
en temps réel, permet l’accélération, une simplification des
procédures de laboratoires, la quantification, amplification
et détection des mutations au niveau des séquences cibles
(grâce à des agents se liant à l’ADN double brin et aux
sondes fluorescentes)
Séquençage : Consiste à déterminer l’ordre d’enchaînement des nucléotides pour un fragment
d’ADN donné.
- Méthode de Sanger : Le principe de cette méthode consiste à initier la polymérisation de
l’ADN à l'aide d'un petit oligonucléotide (amorce) complémentaire à une partie du fragment
d’ADN à séquencer. L’élongation de l’amorce est réalisée par le fragment de Klenow et
maintenue par des ADN polymérases thermostables, celles qui sont utilisées pour la PCR.
Les quatre désoxyribonucléotides sont ajoutés, ainsi qu’une faible concentration de l'un des
quatre didésoxyribonucléotides. Ces didésoxyribonucléotides agissent comme des « poisons
» terminateurs de chaîne : une fois incorporés dans le nouveau brin synthétisé, ils
empêchent la poursuite de l’élongation.
- Méthode de Gilbert et Maxam : procédé chimique. Cette méthode est basée sur une
dégradation chimique de l'ADN et utilise les réactivités différentes des quatre bases A, T, G
et C, pour réaliser des coupures sélectives.
 QE 9 : HBV, HCV, HIV :
HBV : Virus de l’hépatite B, c’est un virus à ADN, le génome est :
- Double brin partiel.
- Génome circulaire.
- Complémentarité partielle à l’extrémité 5’ des deux brins.
- Gènes chevauchants permettent à un petit génome de coder pour plusieurs protéines.
- Une séquence à 3 cadres ouverts de lecture transcrit 3 ARN et traduit 3 protéines.
La réplication : sans intégration dans l’ADN de la cellule hôte.
La détection : analyse du sang et détection de l’antigène HBs avec l’anticorps anti HBs. Détection
de l’ADN viral par PCR. La prévention : vaccins.
HCV : Virus de l’hépatite C, virus à ARN monobrin, ARN génomique brin codant. Les gènes codent
pour les protéines structurales, nucléocapside, l’enveloppe, les protéines transmembranaires et
pour la réplicase.
La détection tardive se fait par la détection de l’anticorps anti HCV, la détection précoce se fait par
PCR.
HIV : Virus à ARN (rétrovirus). L’ARN donne l’ADN par la reverse transcriptase. L’ADN viral intègre
l’ADN de la cellule hôte (CT4 = CTD4+).
Gènes codants de l’HIV : 3 gènes de structures et 6 gènes régulateurs.
Etapes d’intégration :
1- Reconnaissance et affinité pour les protéines de surface de la cellule hôte.
2- Injection de l’ARN viral dans la cellule hôte.
3- L’ARN viral donne l’ADN viral par reverse transcriptase.
4- Intégration de HIV dans l’ADN de la cellule hôte par les bouts LTR.
5- Latence virale séronégatif.
Expression de l’ADN viral :
1- Dimérisation de l’ARN viral.
2- Sortie des particules virales par bourgeonnement.
3- Poursuite de la maturation des particules virales.
4- Période de primo-invasion sujet séropositif.
5- HIV augmente l’apoptose T4, augmentation de DNAse donc de fragmentation de l’ADN.
6- HIV diminue l’immunité de l’organisme.
Détection de l’HIV (QE10) :
- Test ELISA : détection tardive, détecte la présence d’anticorps anti HIV.
- PCR : détection précoce, détecte l’ADN viral.
- PCR en temps réel : détection précoce, détecte l’ARN viral.
 QE 11 : Eléments importants pour les vecteurs, endonucléases, enzymes de restriction :
 QE 12 : Les oncogènes, et les gènes suppresseurs de tumeur :
- Les oncogènes apparaissent comme des homologues de gènes cellulaires
physiologiquement impliqués dans le contrôle des processus de maturation, de division et
de différenciation cellulaire et dont l’altération peut entraîner la transformation d’une
cellule normale en une cellule maligne.
Les oncogènes rétroviraux sont répartis en 4 grandes classes en fonction des oncoprotéines
pour lesquels ils codent : les facteurs de croissance, GTP binding proteins, Tyrosine specific
proteins kinases, Les protéines à activité nucléaire.
Le résultat de l’activation d’un oncogène est la production d’une protéine oncogénique qui
est anormale. Cela est dû à une altération qualitative (mutation des séquences codantes
entraînant l’apparition d’une protéine mutée), ou quantitative (mutation des séquences
régulatrices non codantes du gène et entraînant la production de quantités anormales
d’une protéine).
- Les gènes suppresseurs de tumeur : Les gènes suppresseurs de tumeurs agissent soit en
inhibant des mécanismes qui favorisent l'oncogenèse, soit en activant des mécanismes qui
empêchent l'oncogenèse. Les gènes suppresseurs de tumeurs sont inactivés au cours de
l'oncogenèse.
1. Le gène Rb : chef de file des gènes suppresseurs de tumeur, appartient au système
de contrôle de la prolifération cellulaire. Il code pour des protéines qui sont des
éléments clé du freinage exercé en permanence par la cellule pour contrôler sa
division, sa maturation et sa différenciation normale. Au cours du cycle cellulaire, le
gène suppresseur de tumeur Rb est la dernière barrière s'opposant à une
prolifération incontrôlée.
Son inactivation permet aux cellules mutantes d’échapper aux systèmes de
réparation et contrôle de la division cellulaire ce qui induit à une croissance
tumorale.
2. P53 : C’est un gène localisé dans le chromosome 17, c’est un facteur clef de la
régulation du cycle cellulaire. Lorsque des dommages surviennent sur l'ADN, comme
des mutations ou des cassures, les mécanismes de signalisation des dommages de
l'ADN avertissent de ces dégâts pour qu'ils soient corrigés par les systèmes de
réparation de l'ADN. Le gène suppresseur de tumeurs p53 occupe une position
centrale dans la signalisation des dommages de l'ADN, ce qui lui vaut le surnom de «
gardien du génome ». Si ces dommages peuvent être réparés et qu'un cycle cellulaire
est engagé, p53 active les points de contrôle du cycle cellulaire ce qui provoque
l'arrêt du cycle cellulaire jusqu'à ce que les mutations ou cassures de l'ADN soient
réparés.
Si les dommages de l'ADN sont graves, p53 provoque la mort programmée de la
cellule par apoptose qui est un mécanisme sophistiqué de suicide de la cellule.
En revanche, les cellules tumorales présentant une mutation du gène p53 ne sont
plus capables d’assurer ce maintien. La cellule ne reçoit plus de signal d’arrêt de
division, son génome devient moins stable et susceptible d’accumuler des mutations
diverses permettant l’émergence de clones cellulaires de malignité accrue.