Catedra Chimie farmaceutică şi toxicologică RED.

: 01
09.3.1-12
DATA: 06.07.2009
Elaborare metodică pentru studenţi şi profesori
(Analize instrumentale moderne) Pag. 1 / 13

INSTITUŢIA PUBLICĂ UNIVERSITATEA DE STAT DE MEDICINĂ ŞI FARMACIE

„NICOLAE TESTEMIŢANU”

FACULTATEA FARMACIE

CATEDRA CHIMIE FARMACEUTICĂ ŞI TOXICOLOGICĂ

Aprobat la şedinţa catedrei

Proces verbal № ______ din ______________
Şef de catedră, d.h.f., profesor universitar
_____________ Vladimir Valica

METODE DE SEPARARE

Indicaţii metodice pentru studenţii anului III la Analize instrumentale moderne

CHIŞINĂU 2018
 Catedra Chimie farmaceutică şi toxicologică RED.: 01
09.3.1-12
DATA: 06.07.2009
Elaborare metodică pentru studenţi şi profesori
(Analize instrumentale moderne) Pag. 2 / 13

INTRODUCERE
Analiza substanţelor active, şi a substanţelor auxiliare atît în stare pură cît şi într-o formă
farmaceutică este o etapă importantă în luarea deciziilor despre calitatea şi siguranţa
medicamentelor. Utilizarea metodelor de separare în analiza medicamentelor este foarte actuală,
aceste metode fiind accesibile exacte şi sensibile, permit determinarea calitativă şi cantitativă după
partea activă a moleculei de substanţă, de asemenea se pot determina impurităţile prezente în
medicament.

METODE DE SEPARARE
În analiza farmaceuticcă a amestecurilor multicomponente se utilizează extracţia, metodele
cromatografice, electroforeza. Metodele de cromatografiere sunt foarte apreciate, deoarece prin
utilizarea unui utilaj relativ simplu se pot identifica, purifica şi determina cantitativ practic toate
substanţele chimice.
Clasificarea în funcție de mecanismul separării:
- Cromatografie de adsorbție
- Cromatografie de repartiție
- Cromatografie de schimb ionic
- Cromatografie de excluziune
- Cromatografie de afinitate
Clasificarea în funcție de natura fazelor cromatografice:
- Cromatografie de gaze
o Gaz-lichid (GLC)
o Gaz-solid (GSC)
- Cromatografie de lichide
o Lichid-lichid (LLC)
o Lichid-solid (LSC)
- Cromatografie cu fluide supercritice (SFC)

Clasificarea în funcție de configurația sistemului cromatografic:

- Cromatografie pe coloana
o Pe coloane clasice (cu umplutura)
o Pe coloane capilare
- Cromatografie planară
o În strat subțire
o Pe hârtie

CROMATOGRAFIA PE STRAT SUBŢIRE

Aparatură Plăci cromatografice din sticlă sau din alte materiale, de dimensiuni diferite, cu
lungimea, de obicei, de 20 cm şi lăţimea variabilă, pe care se aplică un strat subţire de adsorbant de
puritate cromatogra-fică (silicagel, kieselgur, celuloză microcristalină, oxid de aluminiu etc), la care
se pot adăuga lianţi (sulfat de calciu, amidon, carboximetilce-luloză etc.) sau agenţi fluorescenţi.
Vase cromatografice din sticlă, cu posibilitatea de închidere etanşă, de dimensiuni
convenabile, pentru a asigura menţinerea plăcilor în poziţie aproape verticală.
Micropipete, microseringi sau alte dispozitive.
 Catedra Chimie farmaceutică şi toxicologică RED.: 01
09.3.1-12
DATA: 06.07.2009
Elaborare metodică pentru studenţi şi profesori
(Analize instrumentale moderne) Pag. 3 / 13

Tehnica de lucru. Dacă nu se prevede altfel, înaintea determinării cromatografice

respective, vasul cromatografie se saturează cu vaporii developantului prin următorul procedeu: se
căptuşesc cu hîrtie de filtru trei pereţi ai vasului şi se introduce developantul, astfel încît acesta să
formeze, de obicei, un strat cu grosimea de 10 mm, se acoperă vasul şi se lasă, dacă nu se prevede
altfel, timp de 30 min pentru saturare.
Saturarea vasului cromatografic şi determinarea cromatografică se efectuează la o temperatură
cuprinsă între 20 °0 şi 25 °0. O diferenţă de temperatură între pereţii vasului cromatografic conduce
la perturbări ale procesului de migrare în stratul adsorbant. În cazul substanţelor fotosensibile,
developarea trebuie efectuată la întuneric. În cazul în care faza staţionară este formată dintr-un
adsorbant impregnat cu un lichid care îmbibă adsorbantul, înainte de aplicarea soluţiilor-probă şi a
soluţiilor-etalon pe placa cromatografică, aceasta este introdusă într-un vas cromatografic în care se
află un strat cu grosimea de aproximativ 10 mm din lichidul de impregnare (eventual diluat cu un
solvent volatil, dacă se prevede astfel în monografia respectivă) şi se lasă pînă cînd acesta a parcurs
distanţa prevăzută în monografia respectivă.
Natura adsorbantului, solventul sau amestecul de solvenţi care constituie developantul (în
mililitri), modul de preparare al soluţiilor de aplicat (probă, etalon), volumele aplicate pe placa
cromatografică şi distanţa parcursă de developant sînt prevăzute în monografia respectivă.
Linia de start trebuie situată la o distanţă de 2 cm de marginea plăcii. Distanţa dintre două
puncte de aplicare a soluţiilor trebuie să fie de cel puţin 1,5 cm, distanţa dintre punctele marginale şi
laturile plăcii trebuie să fie de cel puţin 2 cm.
Soluţiile se aplică pe placa cromatografică în pete circulare, cu diametrul de 2 — 6 mm, sau
în benzi, conform prevederilor din monografia respectivă. Dacă este cazul, soluţia se aplică în
fracţiuni, aşteptînd de fiecare dată evaporarea solventului, eventual cu ajutorul unui curent moderat
de aer. După evaporarea solventului, placa cromatografică se introduce în vasul cromatografic cu
developant, pe cît posibil în poziţie verticală. Petele de pe linia de start nu trebuie să atingă suprafaţa
stratului de developant. După ce developantul a parcurs distanţa prevăzută, de obicei 10 — 15 cm,
placa cromatografică se scoate din vasul cromatografic, se usucă şi se pun în evidenţă petele,
conform prevederilor din monografia respectivă.
De obicei, punerea în evidenţă a petelor de pe cromatogramă se efectuează prin examinarea
acestora ca atare sau după tratare cu reactivi potriviţi, în lumina vizibilă sau în lumina ultravioletă la
254 nm sau la 366 nm.
Pentru identificarea substanţelor, se compară pe aceeaşi cromatogramă valoarea Rf şi
culoarea sau fluorescenta petei obţinute cu soluţia-probă, cu valoarea Rf şi culoarea sau fluorescenta
petei obţinute cu soluţia-etalon; cele două pete trebuie să fie asemănătoare.
Compararea vizuală a dimensiunii petelor şi a intensităţii coloraţiei sau fluorescentei se
foloseşte pentru evaluarea semicantitativă a impurităţilor.
Dozarea substanţelor separate pe cromatogramă se efectuează, după răzuirea petelor
respective şi eluarea substanţelor de pe adsorbant cu un solvent potrivit, prin spectrofotometrie sau
direct pe placă, de obicei, prin densitometrie.
Adsorbanţii, lianţii şi solvenţii folosiţi trebuie să fie de puritate cromatografică.

Alegerea fazelor mobile pentru cromatografia pe strat subţire trebuie să ţină seama de
aceleaşi reguli ca şi în cazul cromatografiei pe coloană. Timpul de developare este de 10-60 min,
deci mai mic decît pe hîrtie şi mai ales pe coloană, iar reproductibilitatea este mai mare. Mărimea
probei ce se aplică cu microseringi Hamilton, cu micropipete automate cu memorie sau cu simple
 Catedra Chimie farmaceutică şi toxicologică RED.: 01
09.3.1-12
DATA: 06.07.2009
Elaborare metodică pentru studenţi şi profesori
(Analize instrumentale moderne) Pag. 4 / 13

tuburi capilare gradate în 5, 10, 25, 100 μl, este de 10-100 μg/spot, în 1-10 μl soluţie 1%. Diametrul
spotului unei probe nu trebuie să fie mai mare de 5 mm, dar nici mai mic de 2 mm.

front eluent Rf =H1 1

H2
Rf = t1t2  1

H1 = distanţa parcursă de
analit
H2 = distanţa parcursă
H1 H2 de solvent (faza mobilă)
a) t1 = timpul necesar pentru
eluarea analitului
t2 = timpul necesar pentru
ca eluentul să ajungă la
front

start

b) (c)
Figura 1. Developarea unidimensională (a), bidimensională (b) şi calcularea Rf (c)

Pentru detecţia spoturilor incolore sau nefluorescente, acestea se expun acţiunii vaporilor de
iod care reacţionează cu componenţii separaţi prin developare, dînd compuşi coloraţi. Se pot utiliza
plăci gata preparate al căror strat subţire conţine un colorant fluorescent, spoturile datorate analiţilor
apărînd prin expunerea plăcilor la radiaţii UV, sub forma unor pete de culoare închisă,
nefluorescente.
Detecţia compuşilor organici se poate face şi prin pulverizarea cu acid sulfic a plăcii,
urmată de încălzire. Se pot pulveriza de asemenea diverşi reactivi de culoare sau se pot răzui
spoturile, iar după eluţie să se facă măsurătorile necesare prin metode instrumentale adecvate. Prin
urmare, în procedeele cromatografice pe strat subţire trebuie să se parcurgă mai multe etape, după
cum urmează:
- tratamentul pregătitor, deci activarea stratului subţire;
- aplicarea probei şi a soluţiilor de standarde;
- developarea care produce separarea propriu zisă (unidimensională şi/sau bidimensională);
- revelarea sau vizualizarea spoturilor de analiţi;
- interpretarea rezultatelor analitice, atît pentru detecţie, cît şi pentru determinările cantitative.
Componenţii se dispun de jos în sus sub forma unor spoturi. Pentru o separare mai netă a
componenţilor se poate face şi o developare bidimensională, una pe înălţime cu o anumită fază
mobilă (a) şi apoi pe orizontală (b), cu o altă fază mobilă (de fapt şi în acest caz developarea este pe
verticală, deoarece se roteşte placa cu 90˚, figura 1 ).
Pentru determinări cantitative se utilizează un fotodensitometru care măsoară densitatea
optică a spoturilor, parametru care este proporţional cu concentraţia fiecărui analit. Se poate măsura
fluorescenţa sau se poate măsura transmiţia fiecărui analit. Instrumentele moderne înregistrează
spectrul complet al substanţei, iar cele cu detector cu diode în serie pot scana placa cu lungimi de
undă multiple.
 Catedra Chimie farmaceutică şi toxicologică RED.: 01
09.3.1-12
DATA: 06.07.2009
Elaborare metodică pentru studenţi şi profesori
(Analize instrumentale moderne) Pag. 5 / 13

CROMATOGRAFIA LICHIDĂ DE ÎNALTĂ PRESIUNE (HPLC)

Cromatografia lichidă de înaltă presiune (HPLC) se deosebeşte de cromatografia de gaze prin
utilizarea în calitate de fază mobilă a unui lichid, care trece prin coloana umplută cu un adsorbant
solid cu o viteză mare în urma unii presiuni aplicate. HPLC permite separarea amestecurilor
multicomponente. Metoda este selectivă şi sensibilă, rapidă şi reproductivă.
Identificarea medicamentelor se face după timpul de retenţie a fiecărui component.
Dozarea se efectuează după aria picului, care este proporţională cu cantitatea de medicament în
probă.

Figura 2. Schema aparatului HPLC.

`HPLC (High Performance Liquid Chromatography) cromatografie lichidă de înaltă
performanță, metodă de analiză calitativă utilizată în biochimie și chimie analitică pentru
separarea, identificarea şi cuantificarea compuşilor.
Etapele de lucru cu aparatul HPLC:
1. Documentarea: presupune acumularea informaţiei despre parametrii fizico-chimici
ale substanţei analizate prin studiul monografiilor farmacopeice, documentaţiei
analitice de normare a calităţii (DAN), articolelor ştiinţifice, manualelor de
specialitate etc.
2. Prepararea probelor : include operaţiunile de pregătire a probelor pentru analiză
conform metodologiei selectate, cu respectarea rigorilor DAN.
Proba standart: se pregăteşte din substanţă standardă conform prevederilor monografiei
farmacopeice.
Proba de analizat: se pregăteşte din substanţă de analizat conform prevederilor monografiei
farmacopeice.
*Rolul probei standart : de a oferi valori precise ai parametrilor cromatografiei, care sunt
specifice fiecărei substanţe. Aceasta va da posibilitatea de a interpreta corect rezultatele.
3. Realizarea măsurărilor: se efectuiază la aparatul HPLC şi include:
o Conectarea aparatului HPLC;
o Setarea parametrilor (presiune, temperatură, viteză de curgere);
 Catedra Chimie farmaceutică şi toxicologică RED.: 01
09.3.1-12
DATA: 06.07.2009
Elaborare metodică pentru studenţi şi profesori
(Analize instrumentale moderne) Pag. 6 / 13

o Calibrarea aparatului (aducerea la nivelul zero, după ce sistemul de eluenţi a

parcurs intreaga coloană şi a fost ). Astfel are loc determinarea timpului mort (t m);
o Injectarea probei;
o Înregistrarea rezultatelor;
o Purificarea coloanei (pregătirea pentru următoarea analiză);
o Deconectarea aparatului.
4. Interpretarea rezultatelor: la această etapă se face concluzii despre identitatea,
puritatea şi cantitatea substanţei în proba de analizat

Caracteristici Cromatografia de lichide clasică HPLC

Dimensiunea particulelor 100-300 µm 3-10 µm

-2 -1
Viteza de curgere 10-30 ml cm-2 h-1 100-300 ml cm h
Presiunea de operare <5 bar >50 bar
Timpul de separare 24 h, sau chiar mai mult 0.1-3 h
Volumul probei Variabil (ml-litri) Mic (µl-ml)
Rezoluţia Bună Poate fi excelentă
Neajunsuri Timp de procesare lung Cost ridicat al aparaturii,
al solvenţilor, al
coloanelor

Dintre toate tehnicile HPLC, RP-HPLC este cea mai utilizată. Cel puţin 60% din separările
analitice se realizează prin această tehnică. Într-un astfel de sistem de partiţie, metodologia
convenţională, care utiliza o fază staţionară, polară şi o fază mobilă, mai puţin polară a fost
inversată, faza mobilă devenind mai polară decât cea staţionară.
RPC (Reversed phase chromatography) diferă de majoritatea celorlalte tehnici cromatogra-
fice în care forţele atractive dintre faza staţionară şi faza mobilă sunt dominante. În RPC, faza
staţionară este, în general, de natură hidrocarbonată, inertă, şi singurele interacţii cu solutul sunt
cele hidrofobe, selectivitatea fiind dominată de efectele solventului. Faza mobilă, în RPC, este
formată fie din apă (singură), fie din apă plus un modificator organic, fie dintr-un solvent neapos.
Aceste faze mobile diferite au dus la utilizarea de diferite acronime pentru variantele RPC: PARP =
plain aqueous reverse phase; MARP = mixed aqueous RP; NARP = non-aqueous RP.
În RPC, faza staţionară este, în mod uzual, formată dintr-o matrice din particule sferice de
silicagel pe care s-au imobilizat covalent liganzi n-octadecil. Alţi liganzi mult utilizaţi sunt n-octil
şi fenil. Pentru separări analitice, diametrul sferelor de silicagel este mai mic de 25 µm. Fazele
staţionare sunt, de obicei, împachetate în coloane de oţel inoxidabil, cu diametrul de 4-5 mm şi
lungimea de 50-300 mm. Tendinţa actuală este de a se folosi coloane cu diametre mai mici de 4 mm
(4 - 1 mm)(norow bore column) împachetate cu sfere cu diametre mai mici de 5 µm. Cele mai
utilizate faze mobile sunt soluţiile apoase (tamponate) în amestec cu diferite procente de metanol
şi/sau acetonitril. Fazele mobile sunt pompate la viteze volumetrice între 0,5 şi 2 mL·min–1.
Popularitatea RPC este de înţeles având în vedere numeroasele avantaje şi marele său
potenţial. Cel mai mare avantaj al RPC este stabilitatea şi inerţia fazei staţionare, care permite
 Catedra Chimie farmaceutică şi toxicologică RED.: 01
09.3.1-12
DATA: 06.07.2009
Elaborare metodică pentru studenţi şi profesori
(Analize instrumentale moderne) Pag. 7 / 13

utilizarea unei game largi de solvenţi: adăugarea de săruri, modificarea pH-ului şi a temperaturii,
etc.
Fazele staţionare utilizate în cromatografia în fază inversată
Cele mai comune faze staţionare utilizate în RPC sunt cele ce conţin grupări octadecilsilan
(ODS sau C18) legate covalent de matricea de silicagel. Aşa cum s-a amintit deja, destul de utilizate
sunt şi suporturile ce prezintă liganzi octil sau fenil. Ca matrice, pe lângă silicagel se mai utilizează
kieselguhr-ul, alcoolul polivinilic (PVA), sticla, oxizi metalici, etc. Diametrul perlelor utilizate ca
matrice variază între 3 şi 10 µm.
Modificarea gelurilor de silice se realizează prin fixarea pe suprafaţa lor a unor grupări cu
caracter hidrofob. Ca o regulă generală, gruparea hidrofobă se leagă de silicagel printr-o legătură
siloxan stabilă. Ea este formată în reacţia dintre alchil (aril) clorosilan (agentul modificator) cu
grupările silanol de pe suprafaţa silica-gelului. Grupările hidrofobe ataşate matricei de silicagel pot
fi de tipul etil (C2H5), octyl (C8H17), octadecil (C18H37) şi fenil (C6H5). În loc de monoclorsilani
se pot utiliza pentru modificarea silica-gelului şi di- şi triclorsilani, ultimul fiind cel mai eficient.
Împiedicările sterice fac ca modificarea suprafeţei matricei, prin reacţiile cu clor-silani să nu
depăşească 40% din aria sa. În general, densitatea grupărilor hidrofobe este în jur de 2,9 - 3,4
–2
µmoli·m–2, în timp ce densitatea grupărilor silanol iniţial prezente este de 8-9 µmoli·m .
Grupările silanol neprotejate pot duce la adsorbţii necontrolabile ale proteinelor sau ale unor
molecule mici (în aşa numita cromatografie "perechi ionice" - ion-pair chromatogrphy - ionii pot fi
adsorbiţi) ducând la o descreştere a puterii de rezoluţie şi la nereproductibilitatea procesului
cromatografic. Pentru a evita aceste fenomene negative, silica gelul este tratat cu modificatori
hidrofobi cu masă moleculară mică, cum ar fi trimetil-clor-silanul.
Grupările ionice ale solutului, cum ar fi cele prezente pe suprafaţa proteinelor, sunt puternic
hidratate şi interferă cu liganzii hidrofobi. Prin alegerea convenabilă a pH-ului aceste grupări
ionizate pot fi aduse într-o formă neionică, astfel încât interacţiile hidrofobe să crească. La
modificările pH-ului mediului, trebuie ţinut cont de faptul că matricea de silicagel este stabilă pe
domeniul de pH 2 - 7,5 şi se solubilizează treptat la valori alcaline ale pH-ului.
 Catedra Chimie farmaceutică şi toxicologică RED.: 01
09.3.1-12
DATA: 06.07.2009
Elaborare metodică pentru studenţi şi profesori
(Analize instrumentale moderne) Pag. 8 / 13

CROMATOGRAMA: ELEMENTELE ACESTEIA ŞI MĂRIMI FUNDAMENTALE

În orice tip de cromatografie detectorul dă un semnal proporţional, uneori cu concentraţia,
alteori cu masa componentului aflat în celula de măsură, semnal ce poate fi înregistrat în funcţie de
timp. Diagrama semnal, funcţie de timp sau de volumul de eluent se numeşte cromatogramă. Pe
cromatogramă distingem o serie de maxime, numite picuri (peak = vîrf în l. engleză), care se produc
deasupra liniei de bază sau a porţiunii orizontale a curbei, paralelă cu axa timpului. Aceasta apare
ori de cîte ori în detector nu apare nici un component, în afara eluentului evident.(Fig. 2)

Oricare pic are, în cazul ideal, forma distribuţiei normale Gauss. Să considerăm cea mai simplă
cromatogramă posibilă: cazul introducerii unui singur component, într-un gaz, C, care conţine urme
de aer - aerul fiind un component inert. Aspectul acestei cromatograme este cel prezentat în fig. 1.
Pe axa absciselor s-a considerat timpul (sau volumul) de eluent scurs, cu debit cunoscut, de la
introducerea (injectarea) probei, iar pe cea a ordonatelor, semnalul detectorului - în unităţi arbitrare.
Distingem următoarele elemente de bază:
 Picurile cromatografice. În cazul prezentat în fig.2, cele două semnale sau vîrfuri sunt
denumite picuri. Acestea sunt semnalele valorificabile în analiza calitativă şi cantitativă în toate
metodele cromatografice. Primul pic, mai mic, corespunde unui component inert (aerul de exemplu
în CG) - care nu este reţinut de loc - iar cel de-al doilea, notat cu C, corespunde componentului (unic
în cazul de faţă) al probei considerate şi este datorat moleculelor care se distribuie pe parcursul
migrării prin coloană între faza mobilă şi cea staţionară şi care, în consecinţă, ies mai tîrziu din
coloană.
 Timpul mort, tM - este timpul în care un component, complet nereţinut de către faza
staţionară, parcurge coloana şi tuburile de legătură pînă la detector. Acesta nu poate fi zero. În cazul
CG timpul mort, de exmplu, este egal cu timpul de retenţie al aerului: tM = tR (R = Retenţie). Deci,
cu alte cuvinte, reprezintă timpul scurs de la injectarea (introducerea) probei în coloană şi apariţia
maximului de concentraţie în detector, pentru componentul nereţinut.
 Timpul de retenţie, tR - o mărime caracteristică pentru fiecare component al amestecului
separat de coloană - reprezintă timpul scurs de la injectarea probei şi apariţia maximului de
concentraţie în detector. De exemplu, în cazul prezentat anterior în fig. 1, acesta este distanţa de la
axa ordonatelor (începutul cromatogramei) pînă la verticala prin vîrful picului C. Acest timp, pentru
un component şi o coloană (plus condiţii experimentale) date este constant, indiferent dacă
componentul respectiv este singur sau în amestec.
 Volumul de retenţie, VR este volumul de eluent corespunzător timpului de retenţie (legat de
timpul tR prin intermediul debitului eluentului, Fe):
 Catedra Chimie farmaceutică şi toxicologică RED.: 01
09.3.1-12
DATA: 06.07.2009
Elaborare metodică pentru studenţi şi profesori
(Analize instrumentale moderne) Pag. 9 / 13

VR = tR·Fe (1)
 Timpul de retenţie ajustat, tR'- introdus în cromatografie pentru a se putea compara timpii
măsuraţi pe coloane diferite, în cazul aceluiaşi component - este dat de diferenţa:
tR' = tR - tM (2)
 Corespunzător există şi un volum de retenţie ajustat, VR' = VR - VM unde VM este volumul
mort; acest volum mort este legat de debitul eluentului coloanei, Fe, prin produsul: VM = tM·Fe, şi
reprezintă volumul golurilor din coloană plus volumul tuburilor de legătură de la coloană la detector.
Eficacitatea coloanei
O importanţă deosebită în prezentarea teoretică a procesului cromatografic de separare o au
două teorii. Teoria „Talerului teoretic” şi teoria cinetică.
Teoria „talerului teoretic” a fost propusă de Martin şi Synge. Conform acestei teorii coloana
cromatografică se împarte imaginar într-un şir de segmente elementare – talere – şi se presupune, că
pe fiecare taler se realizează un act elimentar de echilibru la distribuţia substanţei în faza staţionară
şi faza mobilă. Fiecare porţie nouă de fază mobilă purtătoare (gaz sau lichid) provoacă o deplasare a
acestui echilibru, în urma căruia o parte de substanţă se deplasează pe următorul taler, pe care la
rândul său, se stabileşte un nou echilibru distributiv şi are loc trecerea substanţei pe următorul taler.
În urma acestor procese substanţa supusă cromatografiei se distribuie pe câteva talere. Concentraţia
substanţei pe talere din mijloc este maximă în comparaţie cu talerele invecitate.
Talerul teoretic poate fi definit ca un segment imaginar din coloana cromatografică în care se
realizează un echilibru elementar complet de distribuţie a componentului dintre cele două faze
nemiscibile, care vin în contact în procesul separării cromatografice.
Talerul teoretic din coloana cromatografică este analogic talerului teoretic dintr-o coloană
pentru distilare fracţionată. Deosebirea constă în aceea, că componenţa amestecului, care ese de pe
coloana cromatografică încontinuu se schimbă dar în procesul de extracţie ori distilare se poate de
obţinut pe parcursul întregului proces una şi aceeaşi substanţă.
Numărul talerelor teoretice pentru componentul dat şi pentru lungimea coloanei date diferă
de numărul talerelor teoretice pentru alţi componenţi în aceleaşi condiţii. Numărul talerelor teoretice
este direct proporţional cu lungimea şi diametrul coloanei.
Numărul de talere N este un număr adimensional şi se numeşte eficienţa coloanei
cromatografice, H şi n – parametrii teoretici, care caracterizează eficacitatea de separare a coloanei
cromatografice şi determină dispersia zonelor de component.
Cu cât coloana va avea mai multe talere teoretice pe o unitate de lungime şi cu cât înălţimea
echivalentă unui taler teoretic va fi mai mică, cu atât mai efectivă va fi coloana pentru separare în
condiţiile date. Aşa dar, condiţiile eficacităţii de separare pe coloana cromatografică sunt :
H să obţină valori cât mai mici şi N – cât mai mari.
Dacă vom raporta lungimea stratului de fază staţionară (L) în care s-a produs separarea
amestecului de substanţe la înălţimea talerului teoretic, vom obţine numărul de talere teoretice (N)
necesare pentru separarea amestecului dat de coloana dată (formula 12).
L
N=
H
Teoria talerelor teoretice presupune realizarea procesului cromatografic în trepte, dar în
realitate procesul decurge incontinuu. Această teorie ne permite să se calculeze parametrului
cantitativi importanţi pentru caracterizarea procesului cromatografic de separare. Aceşti parametri
îşi menţin importanţa şi în teoria cinetică a cromatografiei, care ţine cont de viteza de migrare a
substanţei, difuzie şi alţi factori cinetici, care caracterizează cantitatea procesului
 Catedra Chimie farmaceutică şi toxicologică RED.: 01
09.3.1-12
DATA: 06.07.2009
Elaborare metodică pentru studenţi şi profesori
(Analize instrumentale moderne) Pag. 10 / 13

CROMATOGRAFIA ÎN FAZĂ GAZOASĂ

Cromatografia în fază gazoasă (CG) este o tehnică foarte răspîndită, primele ei aplicaţii
datînd de la începutul anilor 1940, cu aplicabilitate în separarea fracţiunilor uşoare în rafinăriile
petroliere. Dezvoltarea sa ulterioară s-a datorat unor avantaje pe care le prezintă:
• sensibilitate mare
• aplicabilitate pe scară largă
• elaborarea rapidă a unei proceduri analitice
• posibilitatea automatizării procesului analitic
CG este o variantă a cromatografiei pe coloană în care separarea componentelor dintr-un
amestec complex se realizează între o fază mobilă gazoasă şi o fază staţionarălichidă
(cromatografie gaz-lichid, CGL) sau solidă (cromatografie gaz-solid, CGS).
în CGL faza staţionară este un suport solid inert, ce poate fi chiar peretele coloanei cromatografice,
impregnat cu un lichid. Cromatografia gaz-solid se realizează cu faze staţionare solide poroase de
tipul carbon - grafit, silicagel sau alumină.
Tehnica cromatografiei de gaze
Un gaz-cromatograf cuprinde schematic (figura 3) trei module specifice:
• un injector
• coloană
• un detector
Faza mobilă care antrenează proba în coloană este un gaz numit graz vector. Debitul controlat
cu precizie permite o mare repetabilitate a timpilor de retenţie.

Figura 3. Schema unui gaz cromatograf

Analiza începe în momentul în care o cantitate foarte mică din proba de analizat este introdusă
sub formă lichidă sau gazoasă în injector care are un rol dublu: transformarea probei probei lichidă
(cromatografie gaz-lichid, CGL) sau solidă (cromatografie gaz-solid, CGS).
În CGL faza staţionară este un suport solid inert, ce poate fi chiar peretele coloanei
cromatografice, impregnat cu un lichid. Cromatografia gaz-solid se realizează cu faze staţionare solide
poroase de tipul carbon - grafit, silicagel sau alumină. Coloana este plasată într-o incintă cu
temperatură reglabilă. Moleculele componente ale probei, ajungînd în contact cuf a staţionară din
coloană, vor interacţiona în funcţie de tăria forţelor ce se stabilesc între componente şi adsorbanţi
(CGS) sau în funcţie de repartiţia lor între faza mobilă şi lichidul staţionar (CGL).
 Catedra Chimie farmaceutică şi toxicologică RED.: 01
09.3.1-12
DATA: 06.07.2009
Elaborare metodică pentru studenţi şi profesori
(Analize instrumentale moderne) Pag. 11 / 13

Viteza de deplasare a componentelor de-a lungul coloanei este diferită, fapt care duce la
separarea şi eluarea lor din coloană într-o anumită ordine. La ieşirea din coloană componentele
eluate succesiv de gazul vector sunt decelate de un detector care p va sesiza proprietăţile ce
deosebesc componentele de gazul vector şi produc un semnal care se înregistrează şi care este apoi
transformat în cromatogramă. Vîrful cromatografic sau „picul" corespunde componentului separat în
coloană şi trecut prin detector iar înălţimea lui este proporţională cu concentraţia acestuia în fază
gazoasă, întocmai ca la cromatografia de lichide pe coloană.
În gaz-cromatografie se defineşte, de asemenea, „linia de bază a cromatogramei", linia trasată
la baza ei atunci cînd, în condiţii stabilite de lucru, din coloană iese numai gazul vector, fără
componente.
în cromatografia în fază gazoasă, există patru parametri operaţionali pentru o fază staţionară dată:
• lungimea coloanei L
• viteza fazei mobile u (care condiţionează numărul de talere teoretice)
• temperatura în coloană T
• raportul fazelor (care condiţionează k")
Aparatul permite reglarea temperaturii şi a vitezei fazei mobile, putîndu-se acţiona astfel
asupra eficacităţii şi a factorilor de retenţie.
A. Gazul vector
Se utilizează ca fază mobilă, cel mai adesea, unul din gazele vectoare: heliu (He), azot (N2),
hidrogen (H2), fie provenind din cilindri sub presiune, fie obţinute pe loc pornind
de la un generator de gaz (N2, H2) care are şi avantajul de a furniza un gaz foarte pur. Mai rar se
utilizează Ar, Ne.
Gazul vector trebuie să fie lipsit de urme de hidrocarburi, de vapori de apă sau de oxigen,
prezenţa acestora reducînd sensibilitatea unor detectori. Dacă gazul vector are provenienţă
industrială, este indicată ataşarea unui filtru dublu (deshidratant şi reducător) la intrarea acestuia în
injector.
Natura gazului vector nu modifică într-o manieră semnificativă valorile coeficienţilor de
distribuţie a compuşilor analizaţi datorită absenţei interacţiunilor între gaz şi solut, temperatura este
singurul factor de modificare important.
Vîscozitatea şi viteza gazului într-o coloană influenţează dispersia compuşilor în fază
staţionară şi difuzia acestora în fază mobilă (vezi curba van Deemter), prin urmare acţionează asupra
parametrilor de efidacitate N şi asupra sensibilităţii detecţiei (figura 4). Curbele tipice van Deemter
demonstrează că dintre cele 3 gaze studiate, hidrogenul este cel care permite separarea cea mai
rapidă. Se constată, de asemenea, o creştere a vîscozităţii cu temperatura, heliul fiind mai vîscos
decît azotul la aceeaşi temperatură.
 Catedra Chimie farmaceutică şi toxicologică RED.: 01
09.3.1-12
DATA: 06.07.2009
Elaborare metodică pentru studenţi şi profesori
(Analize instrumentale moderne) Pag. 12 / 13

În cromatografia de gaze, faza mobilă fiind compresibilă, debitul măsurat la ieşirea din coloană
trebuie corectat prin factorul de corecţie de compresie J care ţine cont de suprapresiunea în partea de
sus a coloanei.
Dacă pe cromatogramă apare un pic datorat unui compus nereţinut, este posibilă calcularea
vitezei medii de înaintare a gazului vector în coloană, u. Pe de altă parte adaptînd un debitmetru cu
bulă de săpun la ieşirea din coloană, cunoscîndu-i diametrul se poate deduce viteza gazului vector u0
la ieşirea din aparat, la presiunea atmosferică Do- Raportul între cele două viteze este egal cu J, factorul
de compresie, raportat la presiunea relativă p/p0 (p presiunea în capul coloanei):

B. Introducerea probei şi camera de injectare

Proba sub formă de soluţie, de un volum foarte mic (de exemplu, 0,5 \i\), este introdusă în
aparat cu ajutorul unei nicroseringi existente sub forma a numeroase modele adaptate diverselor
injectoare şi coloane. Pentru probele gazoase se utilizează injectoare cu bucle asemănătoare celor din
cromatografia de lichide.
Injectorul este poarta de intrare a probei în cromatograf avînd în acelaşi timp şi alte funcţii:
vaporizează şi antreneazi amestecul probă - gaz vector în capul coloanei. Caracteristicili njectoarelor
ca şi modul de injectare diferă în funcţie de coloanele cu care sunt asociate. Calitatea separărilor
depind de această fază a analizei.

C. Incinta termostatată
Gaz-cromatograful este dotat cu o incintă încălzită, . termostatabilă, cu dimensiuni
adecvate pentru instalarea injectorului, coloanei şi detectorului.
D. Detectorii
Se subîmpart în două clase:
o universali - sensibili practic la toate componentele eluate
o specifici - sensibili numai la un tip particular de molecule, grupări funcţionale sau legături
chimice
La baza detecţiei stă, în principiu, orice proprietate care deosebeşte componenta de detectat de
eluent, răspunsul depinzînd de concentraţia molară sau masică a solutului în gazul vector. După
 Catedra Chimie farmaceutică şi toxicologică RED.: 01
09.3.1-12
DATA: 06.07.2009
Elaborare metodică pentru studenţi şi profesori
(Analize instrumentale moderne) Pag. 13 / 13

modul în care înregistrează răspunsul se disting: detectori diferenţiali - indică concentraţia

compusului în eluent în momentul intrării acestuia în detector detectori integrali - indică
concentraţia compusului în eluent la momentul t R
Detector de conductibilitate termică. Detectorul de conductibilitate termică sau catarometru este un
detector universal care se bazează pe măsurarea diferenţei de conductibilitate termică între eluentul
care conţine componenţii de analizat şi eluentul pur (H2, N2, He). Este un detector cu sensibilitate
medie.

PARTEA PRACTICĂ
Problema 1. Să se efectueze dozarea medicamentelor prin metode fizico-chimice conform
tehnicilor de lucru :

Bibliografie
1. Conspectul prelegerilor
2. Farmacopea română. Ediţia X-a –Bucureşti: Editura medicală, 1993.-1315 p.
3. Государственная фармакопея СССР: Вып. 1, ХI изд., – М.: Медицина, 1987. – 336 с.
4. Государственная фармакопея СССР: Вып. 2, ХI изд., – М.: Медицина, 1989. – 400 с.
5. Bojiţă M., Roman L., Săndulescu R., Oprean R. Analiza şi Controlul medicamentelor.Vol. I. -
Cluj-Napoca: Editura Intelcredo, 2003. – 495 p.
6. Bojiţă M., Roman L., Săndulescu R., Oprean R. Analiza şi Controlul medicamentelor.Vol. II. -
Cluj-Napoca: Editura Intelcredo, 2003. –768 p.
7. Вabilev F.V. Chimie farmaceutică, Chişinău: Universitas, 1994.- 675 р.
8. Беликов В.Г. Фармацевтическая химия.- М.: Медицина, 1985. – 768 с.