Cuantificación de proteínas

Mary Johnson (mary at labome dot com)

Synatom Research, Princeton, New Jersey, United States
Translator
Agustin Carbajal (quiocarbajal at gmail dot com)
Cordoba, Argentina
DOI
http://dx.doi.org/10.13070/mm.es.2.115
Date
fecha : 2016-09-08; original version : 2012-02-29
Cite as
MATER METHODS es 2012;2:115
Resumen
Revisión sobre ensayos para cuantificar proteínas y revisión bibliográfica de 194 publicaciones
sobre dichos ensayos
English Abstract
A review of protein quantitation assays and a survey about the protein assays based on 194
formal publications.
Introducción
La cuantificación de proteínas de manera precisa es esencial para todos los experimentos
relacionados a proteínas en una multitud de temas de investigación. Se han desarrollado
diferentes métodos para cuantificar proteínas totales, o alguna en particular en un ensayo
dado. Los métodos de cuantificación de proteínas totales incluyen métodos tradicionales tales
como la medición de la absorbancia a 280 nm, los ensayos de Bradford y ácido bicinconínico,
así como métodos alternativos como el de Lowry o ensayos novedosos desarrollados por los
proveedores comerciales. Los proveedores comerciales típicamente proveen un kit bien
diseñado y conveniente para cada tipo de ensayo. Los métodos para cuantificar proteínas
individuales incluyen el ELISA, el Western blot y, mas recientemente, la espectrometría de
masas, entre otros.
Aquí discutimos algunos de los métodos comúnmente utilizados para determinar la
concentración de proteínas en solución, resaltando sus utilidades y limitaciones. Es importante
notar que ninguno de estos ensayos para proteínas son, específicos para proteínas, lo que
significa que componentes no proteicos pueden interferir, ni uniformemente precisos y
compatibles con todas las proteínas. Mas aún, las modificaciones de las proteínas pueden
interferir con la estimación de su concentración en algunos de estos ensayos cuando se
comparan con las proteínas no modificadas [1, 2]. Además, algunos ensayos, por ejemplo el
de 3-(4-carboxibenzil)quinolina-2-carboxialdehído (CBQCA), también son eficientes cuando se
utilizan para cuantificar péptidos o proteínas encapsulados o ligados a una superficie [3].
Regulaciones o leyes de agencias gubernamentales o grupos de comercio pueden requerir
métodos específicos para la determinación de proteínas totales. Por ejemplo, la Asociación
Internacional de la Industria del Suero (www.serumindustry.org), un grupo comercial para
proveedores de suero, recomienda el método de Biuret para la determinación del contenido de
proteínas en productos de suero.
Ensayo para cuantificar proteínas
La tabla 1 resume los ensayos para cuantificar proteínas totales mas comunes. Resulta
importante evaluar la compatibilidad de cada ensayo con los tipos de muestra, el rango del
ensayo, el volumen de muestra y la disponibilidad de un espectrofotómetro adecuado, así
como el tiempo y el costo.
ensayo absorción mecanismo límite de ventajas desventajas
detección
absorción absorción 0.1-100 pequeño volumen incompatible
280 nm
UV de tirosina ug/ml de muestra, condetergentes y
 y triptófano rápido, agentes
económico desnaturalizantes,
alta variabilidad
reducción
de cobre compatible con
compatibilidad
(Cu2+ a detergentes y
ácido 20-2000 con agentes
562 nm Cu1+), agentes
bicinconínico ug/ml reductores baja o
Reacción desnaturalizantes,
nula
del BCA baja variabilidad
con Cu1+
formación
de complejo
entre el
Bradford o
colorante compatible con
azul brillante 20-2000 incompatible con
470 nm azul agentes
de ug/ml detergentes
brillante de reductores, rápido
Coomassie
Coomassie
y las
proteínas
reducción
de cobre
por
incompatible con
proteínas,
detergentes y
reducción
10-1000 alta sensibilidad y agentes
Lowry 750 nm de Folin
ug/ml precisión reductores,
Ciocalteu
procedimiento
por el
largo
complejo de
cobre con
proteína
Tabla 1. Ensayos comunes para medir proteínas totales.

Absorbancia ultravioleta (UV) a 280 nm (rango: 0.1-100 ug/ml)

Los aminoácidos aromáticos tirosina y triptófano le dan a las proteínas su característico
espectro de absorción ultravioleta (UV) a 280 nm. Fenilalanina y puentes disulfuro también
pueden contribuir a la absorción en esa longitud de onda, aunque ligeramente. Este método es
simple y requiere de un volumen de muestra extremadamente pequeño ya que los nuevos
espectrofotómetros emplean un sistema de retención de muestra durante la medición. Sin
embargo, la muestra proteica debe encontrarse pura y no contener componentes no proteicos
con el mismo espectro de absorción, tales como ácidos nucleicos contaminantes [4]. Se debe
conocer la secuencia exacta de aminoácidos de la proteína analizada y se debe calcular el
coeficiente de absorción específico de esa proteína previo a la determinación de la
concentración en solución [5, 6]. Este método es el mas rápido, pero propenso a errores.
Ácido bicinconínico (BCA) o ensayo basado en cobre (rango: 20-2000 ug/ml)
El ensayo de ácido bicinconínico (BCA) fue inventado por Paul K. Smith en 1985 en la
compañía Pierce Chemical Company, el mayor distribuidor de este ensayo [7]. Tanto el
ensayo de BCA como el de Lowry se basan en la conversión del Cu2+ a Cu1+ en condiciones
alcalinas. Esta conversión es definida como la reacción de Biuret. Esta reacción es
influenciada por cuatro aminoácidos (cisteína, cistina, tirosina y triptófano) y también por la
cadena peptídica.
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Figura 1. Representación esquemática del ensayo de BCA.

BCA es un reactivo cromogénico específico para Cu1+ y en el segundo paso de la reacción

dos moléculas de BCA reaccionan con una de ión Cu1+. La cantidad de Cu2+reducido es una
función de la concentración de proteínas y ser determinada espectrofotométricamente por un
cambio en el color de la solución a púrpura, el cual absorbe a 562 nm. La absorbancia es
directamente proporcional a la cantidad de proteína presente en la solución y puede ser
estimada por comparación con un estándar de proteína conocido, tal como la albúmina sérica
bovina (ASB) [4, 8, 9].
El ensayo de BCA es mas tolerante a un rango de detergentes iónicos y no iónicos tales como
el NP-40, Triton X-100 y agentes desnaturalizantes como la urea y el cloruro de guanidinio,
que tienden a interferir con otros ensayos proteicos colorimétricos tales como el Lowry (Tabla
2) [9]. Algunas moléculas químicas como: ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) [10],
azúcares reductores [11, 12] y lípidos [13] pueden interferir con el ensayo de BCA. El efecto
de estas interferencias puede ser eliminado o reducido por varias estrategias tales como la
remoción de la substancia interferente por diálisis, cromatografía de exclusión molecular o si la
concentración de la proteína es lo suficientemente alta, diluyendo la muestra. Recientemente,
Reichelt et al (2016) [14], propusieron ajustes simples al método que pueden llevar a mejorías
visibles en la exactitud de la medición, especialmente para soluciones complejas de proteínas
no purificadas, como medios de cultivo. Utilizan un factor de corrección dado por la medición
de ASB agregada a la muestra. Basado en sus estudios la exactitud de la cuantificación de
proteínas por BCA podría ser mejorada 5 veces, “llevando la cuantificación de proteínas por
BCA a niveles de exactitud comparables a otros métodos mas costosos” [14].
Otro factor que interfiere con la exactitud del ensayo de BCA es la presencia de residuos
modificados en las proteínas. En un estudio reciente, Brady y Macnaughtan (2015) [2]
evaluaron el impacto de la metilación de lisinas en los ensayos de Bradford y BCA y
encontraron que para el ensayo de BCA, la concentración de proteínas en la muestra con
proteínas metiladas era sobreestimada de manera consistente.
NP-40 Sacarosa
Emulgen Glicina, pH 2.8
HEPES Glucosa
DTT EDTA
Triton X-100 NaCl
Urea NaOH
Guanidinio HCl Sulfato de Amonio
Acetato de Sodio, pH 5.5 SDS
Tabla 2. Compatibilidad del ensayo de proteínas de BCA.
Thermo Fisher Pierce ha introducido recientemente una nueva versión del clásico ensayo de
BCA para proteínas compatible con agentes reductores tales como el ditiotreitol (DTT), el 2-
mercaptoetanol (BME), el TCEP y otros agentes reductores de puentes disulfuro [7].
Comparado con otros métodos, el ensayo de BCA es uno de los mas sensibles (puede
detectar proteínas en concentraciones tan bajas como 5 ug/mL). Tiene menos variabilidad que
otros (por ej., el ensayo de Bradford), y puede ser utilizado para medir un amplio rango de
concentraciones de proteínas.
Mas aún, su sensibilidad puede incrementarse haciendo el ensayo en presencia de
nanosensores plasmónicos como en el ensayo de SPR-BCA (del inglés, resonancia
plasmónica de superficie - BCA) propuesto por Liu et al [15]. Con este ensayo el límite de
detección fue de 3,4 ng/ml y el rango general de trabajo fue de 0.5 a 1000 μg /ml,
disminuyendo la concentración de proteínas que puede ser determinada por el método
tradicional de BCA.
Ensayo de Bradford o azul brillante de Coomassie (rango: 20-2000 ug/ml)
El ensayo de Bradford, originalmente descripto por la Dr. Marion Bradford en 1976, es una de
los métodos mas populares para la determinación de la concentración de proteínas. Se basa
en la formación de un complejo entre el colorante azul brillante de Coomassie G-250 y las
proteínas en solución. El colorante libre existe en cuatro formas iónicas. La forma azul mas
aniónica se une a proteínas y absorbe a 590 nm. La concentración de proteínas puede ser
evaluada determinando la cantidad de colorante en su forma iónica azul y midiendo la
absorbancia de la solución a 592 nm utilizando un espectrofotómetro [16]. El colorante se une
principalmente a residuos de arginina, triptófano, tirosina, histidina y fenilalanina [4].
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Figura 2. Representación esquemática del ensayo de Bradford.

La mayoría de los investigadores utilizan ASB como estándar proteico ya que es económica y
de fácil disponibilidad pero no siempre es adecuada. De hecho, una de las desventajas de
utilizar ASB es que exhibe una respuesta fuerte al colorante y puede subestimar el contenido
de proteínas. Inmunoglobulina G (IgG) o lisozima, u otro estándar proteico debería ser
utilizado dependiendo del tipo de proteína de la muestra [16].
Entre las ventajas de este método se encuentran su compatibilidad con agentes reductores
utilizados para estabilizar las proteínas en solución, los cuales no son compatibles con el
ensayo de Lowry y en algún grado con el ensayo de BCA, y la posibilidad de medir proteínas
de alto peso molecular ya que el colorante no se une a péptidos de bajo peso molecular
[4, 16].
La principal limitación del ensayo de Bradford es su incompatibilidad con detergentes, los
cuales se utilizan de rutina para solubilizar proteínas de membrana. Solo un nivel de
detergente no iónico muy bajo, tal como Triton X-100 a una concentración final de 0,008 %
(v/v), puede mejorar la sensibilidad y variabilidad del ensayo de Bradford [17]. Los detergentes
pueden ser removidos por cromatografía de exclusión molecular o por diálisis, lo que lleva a la
dilución de la muestra; o por precipitación con fosfato de calcio [16] o acetona, ambos
métodos que permiten recuperar como mucho el 70 % de la cantidad inicial de proteína. En
una publicación reciente Cheng et al [18] describen un método basado en el ensayo de
Bradford que permite la cuantificación de proteínas de manera rápida incluso cuando la
solución de proteínas contiene substancias que interfieren. El método demuestra una tasa de
recuperación de proteínas mejorada luego de tan solo 1 hora de precipitación en acetona
posterior a la adición de sacarosa, un componente que no interfiere con el ensayo de
Bradford.
Ensayo de Lowry para cuantificar proteínas (Rango: 10-1000 ug/ml)
El ensayo de Lowry, propuesto por Oliver H. Lowry en 1951, se basa en dos reacciones
químicas. La primera reacción es la reducción de los iones de cobre en condiciones alcalinas,
los cual forma un complejo con los enlaces peptídicos (reacción de Biuret). La segunda es la
reducción del reactivo de Folin-Ciocalteu por el complejo cobre-enlace peptídico, el cual causa
un cambio en el color de la solución a azulado con una absorción en el rango de 650 a 750 nm
[4]. La cantidad de proteína en la muestra puede ser estimada utilizando una curva de
calibración con una solución de una proteína estándar seleccionada, tal como la ASB.
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Figura 3. Representación esquemática del ensayo de Lowry.

Las ventajas de este ensayo son su sensibilidad, y lo mas importante, su exactitud. Sin
embargo, requiere de mas tiempo que otros ensayos y muchos compuestos comúnmente
utilizados en búferes de preparación de proteínas (tales como detergentes, carbohidratos,
glicerol, tricina, EDTA, Tris) interfieren con el ensayo de Lowry y forman precipitados (Tabla 3)
[4]. No obstante, el efecto de estas substancias puede ser reducido diluyendo la muestra, pero
solo si la concentración de proteínas es lo suficientemente alta [19]. Mas aún, se ha
demostrado que el tiempo para realizar este ensayo puede ser disminuido aumentando la
temperatura o utilizando un horno microondas [19].
Detergentes Compuestos disulfuros
Carbohidratos Fenol
Glicerol Ácido úrico
Tricina Guanina
EDTA Xantina
Tris Calcio y Magnesio
Compuestos de potasio Compuestos sulfidrilos
Tabla 3. Ensayo de Lowry para cuantificar proteínas: substancias que interfieren.
El ensayo de 3-(4-carboxibenzil)quinolina-2-carboxialdehído (CBQCA) (rango 100 ng-1500 μg /ml)
La 3-(4-carboxibenzil)quinolina-2-carboxialdehído (CBQCA) es un reactivo fluorogénico
sensible utilizado para la detección de aminas en las proteínas. Dado que solo puede detectar
aquellas aminas de la proteína en estudio que se encuentran accesibles, este método tiene las
mismas limitaciones que los métodos espectrofotométricos para los cuales el resultado
depende del número de ciertos aminoácidos en la proteína. Sin embargo, la CBQCA es muy
sensible y puede detectar entre 10 ng y 150 microgramos de proteína en un volumen de 100
μl. También, en el lado positivo, el reactivo de CBQCA funciona bien en presencia de
substancias como lípidos que se sabe que interfieren en muchos otros métodos de
determinación de proteínas [20], o cuando se utiliza para cuantificar péptidos o proteínas
ligadas a una superficie o encapsuladas [3].
Ensayo de cuantificación de proteína blanco específica
Un paso crucial en muchos experimentos es la cuantificación de una proteína específica en
solución. Se han utilizado varias técnicas que logran tal cometido. Las mas comunes
son ELISA, Western blot, y espectrometría de masas. El ELISA y el Western blot se discuten
en Aplicaciones de anticuerpos, la espectrometría de masas se discute brevemente aquí, y se
discute en el artículo de revisión de Labome Bioanálisis cuantitativo de proteínas por
espectrometría de masas.
Espectrometría de masas de proteínas
La espectrometría de masas de proteínas es un método de uso creciente para la
cuantificación de proteínas. Un paso importante en el análisis proteómico, además de la
caracterización proteica, es la posibilidad de cuantificar una proteína específica. Se han
introducido e implementado muchas técnicas para la cuantificación de proteínas por
espectrometría de masas. Normalmente, se añaden isótopos estables mas pesados de
carbono (13C) o nitrógeno (15N) a una muestra (péptidos o proteínas) mientras que sus
isótopos livianos correspondientes (12C and 14N) se añaden a una segunda muestra (estándar
interno) que luego se mezclan en el análisis. Debido a la diferencia de masas es posible
analizar la relación entre las intensidad de los picos de las dos muestras por un analizador de
masas la cual se corresponde con la relación de sus abundancias relativas. Un segundo
método para cuantificar proteínas por espectrometría de masas se puede realizar sin marcar
las muestras (esto es, con análisis por desorción/ionización láser asistida por matriz, del inglés
MALDI). Aquí quisiéramos resaltar la posibilidad de utilizar un método universal como la
espectrometría de masas para realizar tanto ensayos cualitativos como cuantitativos en una
sola medición. Por ejemplo, múltiples métodos basados en la espectrometría de masas
desarrollados para la cuantificación de proteínas específicas en muestras biológicas han sido
publicados recientemente. Aquí quisiéramos ejemplificar solo algunos del 2016: un método
para la cuantificación del factor de crecimiento insulínico 1 en el suero [21], un método para la
cuantificación de albúmina en orina [22], y de ubiquinona en suero/plasma [23]. Métodos para
la cuantificación de blancos menos específicos también se pueden encontrar en la literatura
reciente [24-26]. Sin embargo este método requiere de instrumentación que muchos
laboratorios no pueden costear y esto limita su utilidad [8, 27].
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Figura 4. Representación esquemática de la cuantificación de proteínas basada en PQR en células vivas
individuales, de [28].

Cuantificación de proteínas en células vivas individuales

Ligar la expresión de una proteína de interés a la de un reportero fluorescente a través de una
construcción de “reportero para cuantificación de proteína” (del inglés, PQR) [28] puede
asegurar una expresión estequiométrica de la proteína y el reportero; por ende, la cantidad de
proteína puede ser inferida a partir de la intensidad de fluorescencia (Figura 4). Este
ligamiento puede hacerse ya sea por experimentos de transfección o por edición genómica.
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Figura 5. Representación esquemática de la tecnología de la “nariz química”.

Métodos basados en nanopartículas y nanoporos

Las ya mencionadas limitaciones de los métodos convencionales de cuantificación conducen
al desarrollo de nuevas estrategias para la determinación de proteínas en soluciones simples y
complejas. Una de las mas populares se basa en el uso de nanopartículas, debido a sus
propiedades ópticas [29]. Brevemente, una propiedad importante es el cambio de la longitud
de onda a la cual absorben luz cuando su tamaño aumenta por la unión a otras moléculas o
por agregación [30]. Dado que el cambio de absorción de luz es en el rango visible, el cambio
se percibe como un cambio de color. Hasta ahora se han utilizado en conjunto con partículas
de unión a proteínas, por ejemplo anticuerpos, péptidos o aptámeros.
Mas recientemente, Rogowski et al, propusieron un nuevo tipo de sensores nanoparticulados
para la detección y cuantificación de proteínas, los cuales llamaron “nariz química” [31]. Su
sensor consiste de una mezcla de nanopartículas de oro con diferentes formas que se pueden
agregar de manera diferencial cuando interactúan con diferentes proteínas (Figura 5). En base
a su espectro de absorción lumínico, las partículas permiten la detección y cuantificación de
proteínas purificadas en soluciones acuosas o proteínas no purificadas en soluciones
complejas.
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Figura 6. Diagrama esquemático de moléculas de ADN portadoras translocando a través de un nanoporo (tal
como presentado en [32] ) (a); Pico de disminución de corriente causado por la translocación del ADN y caída
secundaria indicando ADN “cargado” (b); eventos de translocación del ADN en concentraciones crecientes de
proteína (c, d y e).

Un segundo método que ha sido desarrollado recientemente se basa en el uso de nanoporos

en estado sólido. Kong et al (2016) [32] utilizaron moléculas largas de ADN como portadoras y
nanoporos de vidrio para medir la concentración de proteínas en solución en el rango
nanomolar. En este método, las moléculas de ADN, capaces de unir proteínas en sitios
específicos, translocan a través de los nanoporos con la ayuda de una corriente eléctrica.
Cuando transloca, el ADN causa una caída en la señal de la corriente. Una segunda caída se
registra cuando la proteína se une al ADN. Mientras mas alta es la concentración de proteínas,
mas cargado se encuentra el portador. La frecuencia de los picos de las caídas secundarias
de corriente también incrementan con la concentración de proteínas (Figura 6).
Ensayos para medir proteínas en literatura
Labome analizó 250 publicaciones revisadas por pares seleccionadas al azar que citaban
ensayos para medir proteínas totales, al 4 de septiembre de 2016. Se identificó que Thermo
Fisher Pierce y Bio-Rad Laboratories son los principales proveedores de kits de ensayos para
medir proteínas totales (Tabla 4). Los métodos utilizados mas frecuentemente son los de BCA
y Bradford.
Ensayo Núm Proveedor Núm
BCA 140
Thermo Fisher Pierce 112
Sigma 8
Beyotime 2
otros 2
no especificado 10
Bradford 78
Bio-Rad 52
Thermo Fisher Pierce 9
Sigma 1
no especificado< 10
Lowry / ensayo modificado DC 21
Bio-Rad 17
Sigma 1
no especificado 2
Detección UV a 280 nm 12
Thermo Scientific (Nanodrop) 3
no especificado 8
Tabla 4. Estadísticas de la revisión bibliográfica sobre los ensayos para medir proteínas totales y sus
principales proveedores. Núm es el número de publicaciones que citan el ensayo o el proveedor.

Ensayo de BCA
Prácticamente todos los ensayos para proteínas totales citados en el grupo de publicaciones
revisadas fueron provistos por Pierce, compañía en donde uno de los científicos inventó el
ensayo hace muchos años. Thermo Fisher compró a Pierce hace unos años. Los ensayos de
BCA de Thermo Fisher Pierce se utilizaron para estudiar la carcinogénesis tiroidea [33], el rol
de VLDLR en la división celular [34], las modificaciones postraduccionales de S100A4 [35], las
proteínas humanas RNP H y RNP F como silenciadoras del receptor 2 del factor de
crecimiento de fibroblastos [36], el mecanismo subyacente al incremento de la actividad StAR
y aromatasa en la endometriosis [37], el efecto de la heparanasa en la adhesión y extensión
celular [38], la regulación y el rol de la expresión de NAG-1 en células PC-3 de cáncer de
 próstata humanos tratadas con VES [39], el rol del receptor de IGF-1 en la función
fotoreceptora [40], el rol de Dlx5 en el acoplamiento entre osteoblastos y osteoclastos [41], y
en muchos otros [35, 40-108]. Sus kits de micro ensayos de BCA fueron utilizados para
estudiar la localización inmunohistoquímica de osteopontina en la glándula de la cáscara del
huevo, y en la cáscara del huevo de aves [109], para estudiar la recuperación tras injuria por
impacto cortical controlado en ratas [110], y la localización en membrana de la nucleoproteína
del virus de la hepatitis C y la propagación del virus [111] y otros [112].
El reactivo de BCA de Sigma [113] y el kit de BCA de Bio-Rad también fueron citados.
Ensayo de Bradford
Thermo Fisher Pierce también es uno de los principales proveedores de kits de ensayos de
Bradford. Los kits de ensayos de Coomassie/Bradford de Pierce fueron utilizados para evaluar
la expresión de la proteína chaperona ERp29 [114], el rol de YKL-40 en la modulación de la
actividad biológica del factor de crecimiento de fibroblastos básico [115], entre muchos otros
tópicos de investigación [85, 99, 116-122].
Los reactivos de ensayos de Bradford de Bio-Rad fueron citados en numerosas publicaciones
[123-155].
Otros proveedores también proporcionaron kits de ensayo de Bradford, por ejemplo, Sigma
[156, 157] y Expedeon [158].
Ensayo de Lowry
El ensayo de Lowry de Pierce (número de catálogo 23240) fue utilizado para cuantificar la
concentración de proteínas [159] y el de Bio-Rad Laboratories fue utilizado en [160] y [161]. El
ensayo de proteínas totales DC de Bio-Rad es una versión modificada del ensayo de Lowry.
Es uno de los ensayos más populares para proteínas dado que es compatible con
detergentes. Este kit ha sido utilizado para determinar la concentración de proteínas para
estudiar la estructura y función de la proteína humana de cuatro pasos transmembrana CD81
[162], el efecto de la ablación específica en músculo esquelético de actina (cito) gama en el
fenotipo mdx [159], entre otros [56, 163-174].
Preguntas frecuentes
¿Es ASB un buen estándar?
El mejor estándar para la cuantificación de una proteína es la misma proteína que se está
cuantificando. Sin embargo, esto es improbable en la mayoría de los casos. ASB (albúmina
sérica bovina) es el estándar de proteínas utilizado con mas frecuencia. Tiene limitaciones. En
el ensayo de Bradford es mas sensible que otras proteínas, y por ende la concentración de las
proteínas en la muestra probablemente sean subestimadas [175]. Además, la ASB , como
proteína sérica, no puede ser obtenida/preparada con gran pureza, ya que se une a muchos
otros factores. Otras proteínas, tales como la inmunoglobulina G y la lisozima también han
sido utilizadas como estándares de proteínas.
La medición de mi muestra se encuentra fuera del rango de la curva de calibración, ¿se puede
extrapolar la curva de calibración?
No. Es de suma importancia que las mediciones caigan dentro del rango de la curva de
calibración. Se debe ajustar la dilución de la muestra o de la ASB, o de ambos.
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