Objetivos

Analizar por la técnica de cromatografía en capa delgada (CCD) los componentes de Cúrcuma
comercial

Determinar RF de las distintas manchas observadas en la cromatografía de capa delgada

Observar y aislar carotenos y clorofilas a partir del extracto de espinaca mediante la técnica de
cromatografía en columna.

Introducción

La cromatografía se define como la separación de una mezcla de dos o más compuestos por
distribución entre dos fases, conocidas como fase móvil y fase estacionaria. Diferentes tipos de
cromatografía son posibles de elaborar dependiendo de la composición intrínseca de las fases
involucradas siendo estas: solido/liquido (CCD, cromatografía en Columna, Papel), liquido/liquido, y
gases/liquido.

La CCD es una de las técnicas más utilizadas en química orgánica puesto que permite separaciones
por partición, adsorción y separación iónica sin afectar la muestra en escalas de tiempo muy rápidas.
Durante este trabajo practico se realizó la separación basada en el concepto de adsorción donde la
fase estacionaria es un sólido polar (Silica gel) y la fase móvil es un líquido mezcla de solventes.
Todos los sólidos pulverizados tienen la capacidad de adsorber en mayor o menor medida sobre su
superficie, de igual modo todas las muestras pueden ser adsorbidas, unas con más facilidad que
otras, esto en estrecha relación con las interacciones que se puedan presentar entre las moléculas
propias de la fase estacionaria y las muestra. (fig. 1). En particular, el fenómeno de adsorción en
esta práctica se explica por la interacción de la muestra a evaluar y la fase estacionaria a través de
la formación de interacciones dipolo-dipolo y puentes de hidrogeno. La placa de silica gel contiene
un indicador Fluorescente que permite el revelado.

Fig. 1. Estructura de fase estacionaria y muestra de curcumina

La cromatografía en columna utiliza una columna de vidrio vertical sostenida por un soporte
metálico, la columna de vidrio se llena con una solución compuesta por fase estacionaria adsorbente
(usualmente Silica gel) y solvente de armado previamente elaborado. posteriormente se realiza la
siembra de la muestra objeto de análisis y con base en las interacciones entre la muestra y fase
estacionaria, y haciendo uso de la diferencia de polaridad entre esta última y los solventes de elución
se puede lograr la observación y separación por fracciones de los diferentes componentes de la
muestra. Hay dos maneras útiles de realizar la siembra de la muestra sobre la columna, si no es
posible realizar la solución antes descripta, se puede realizar una pastilla a partir de la muestra,
utilizando un solvente volátil y un proceso de evaporación del mismo.

Para la realización de cromatografía en columna es esencial que el solvente de armado sea de igual
o menor polaridad que el solvente de elución.

Los componentes principales objeto de análisis con la técnica de cromatografía en columna serán
carotenoides y clorofilas presentes en extracto de espinaca, aunque también es posible observar
otro tipo de compuestos como las feofitinas. Compuestos que migran a diferentes polaridades de
solvente de elución.

Métodos y Materiales.

Para ambas prácticas, tanto análisis por CCD de componentes de cúrcuma comercial, así como para
la observación y separación de carotenos y clorofilas por cromatografía en columna, se siguió el
procedimiento establecido en la guía de trabajos prácticos así:

CCD de Cúrcuma.

1. Pesar 0.4g de cúrcuma comercial.

2. Depositarla en un tubo de ensayo y agregar 2ml de diclorometano (CH2CL2)
3. Agitar 10 minutos y dejar decantar.
4. Utilizando un embudo y un algodón filtrar el contenido del tubo de ensayo.
5. Plaquear la muestra obtenida y el patrón de curcumina utilizando capilares
6. Realizar la corrida en solvente orgánico (cloruro de metileno/metanol 95:5) previamente
depositado en una cuba.
7. Revelar la placa con lampara UV 254 nm y posteriormente revelar utilizando H2SO4.

Cromatografía en Columna

Extracción de la muestra

1. En un recipiente colocar 20g de espinaca. 150 ml de etanol y procesar con un minipimer o

licuadora.
2. Filtrar la solución utilizando un algodón
3. Evaporar el etanol colocando la muestra en un balón, llevando el mismo al rotavapor,
obteniendo un aceite.
4. Depositar la solución obtenida en una ampolla, y realizar extracción de la muestra con
acetato de etilo. (la fase orgánica queda arriba). Obtener la muestra en un vaso de
precipitados.
5. Agregar a la muestra el desecante sulfato de sodio (Na2SO4)
6. Filtrar el desecante
7. Realizar CCD en solventes de distintas polaridades (Hexano, Hexano/AcoEt (9:1, 8:2, 7:3),
AcoEt)
8. Evaporar y reservar la muestra.
Cromatografía en columna: Aislamiento de carotenos y clorofilas

1. fijar una columna vertical a un soporte metálico.

2. colocar un algodón mojado con solvente de armado.
3. agregar un poco más de solvente de armado.
4. Elaborar una suspensión que contenga la fase estacionaria (silica gel) y solvente de armado
(éter de petróleo). verterla en la columna vertical con ayuda de un embudo. Girar el
robinete y permitir la salida paulatina de solvente.
5. Golpear suavemente la columna con una perita de goma para lograr compactación de la
columna.
6. Disolver la muestra en el mínimo solvente de armado posible.
7. Realizar la siembra con una pipeta. posteriormente agregar suficiente solvente de armado
para evitar constantemente que se seque la columna.
8. Dejar eluir y cambiar el solvente de elución aumentando la polaridad a medida en que se
vayan obteniendo las fracciones de componentes de la muestra.
9. Realizar CCD de las muestras obtenidas, en los solventes adecuados.

Con objeto de conocer en que solvente de armado se prepararía la columna, antes de evaporar la
muestra, y posterior a la filtración del desecante Na2SO4 (utilizado para extraer la mayor cantidad
de moléculas de H2O) se realizaron diferentes siembras de la muestra en placas de silica gel.
Posteriormente se realizó la corrida de las mismas en solventes con diferente polaridad.
Procedimiento a partir del cual, si infiere que es el solvente Hexano el adecuado para realizar la
preparación de la columna de armado, solvente en el cual se observa una separación de compuestos
mínima de la muestra comparativamente con el resto de CCD tal como se observa en la tabla 2.

Para la realización de la cromatografía en columna, en lugar de Hexano, se utilizó éter de petróleo,

compuestos con polaridad similar.

Los solventes de elución se lograron a partir de soluciones de Éter de petróleo/AcoEt diluciones 9:1,
8:2 y 7:3 respectivamente.

Resultados

 CCD: Análisis de cúrcuma comercial

Frente de solvente 3.4 cm RF

Mancha 1 1.1 cm 0.32
Mancha 2 1.4 cm 0.41
Mancha 3 1.7 cm 0.5
Mancha 4 2.6 cm 0.76
Patrón curcumina 2.5 cm 0.74
Tabla 1. Corrida en solvente orgánico de cúrcuma comercial y patrón de curcumina
 Con la CCD se logró la separación de los componentes de la cúrcuma comercial, los cuales
migran a diferentes longitudes cuando la placa que contiene la fase estacionaria es puesta
en contacto con el solvente orgánico (diclorometano/metanol 95:5) dentro de la cuba de
corrida.
La migración del patrón de curcumina es muy similar a la mancha 4, la diferencia observada
es apenas 1 mm. La diferencia con las otras 3 manchas observadas es comparativamente
mayor (0.7mm, 1.1mm, 1.4mm para las manchas 1,2 y3 respectivamente)
 Cromatografía en columna
Con objeto de conocer el mejor solvente de armado en la preparación de la columna se
analizó el extracto de la muestra a analizar realizando CCD en solventes con diferente
polaridad. Los resultados se muestran en la tabla 2. De la cual se infiere que el solvente con
menor polaridad es el hexano pues es con este solvente donde la CCD presenta menor
diferenciación de compuestos observada.

Solvente Frente de solvente Recorrido de la RF

(cm) muestra (cm)
Hexano 3.3 1er mancha - 0.9 0.27
Hexano/AcoEt 9:1 3.8 1er mancha - 0.7 0.18
2da mancha - 3.8 1
Hexano/AcoEt 8:2 4.1 1er mancha - 0.2 0.04
2da mancha - 0.6 0.14
3er mancha -1.7 0.34
4ta mancha - 3.4 0.83
Hexano/AcoEt 7:3 3.8 1er mancha - 1 0.26
2da mancha -1.7 0.44
3er mancha - 2.4 0.63
4ta mancha - 3.6 0.92
AcoEt 3.9 1er mancha -1.5 0.39
2da mancha - 1.9 0.48
3er mancha - 2.6 0.66
4ta mancha - 3.5 0.89
Tabla 2. CCD de muestra de espinaca corrida en diferentes solventes con distinta polaridad.

Posteriormente se logró la observación y aislamiento de los componentes de la muestra de

espinaca, los cuales fueron colectados en diferentes tubos de ensayo. Numerados del 1 al 8

Los carotenos fueron aislados cuando se utilizó solvente éter de petróleo/AcoEt en proporción 9:1,
Las feofitinas fueron aislados cuando se utilizó solvente éter de petróleo/AcoEt en proporción 8:2 y
finalmente las clorofilas fueron aisladas cuando se utilizó solvente éter de petróleo/AcoEt en
proporción 7:3.
 Solventes Migración Frente de RF
muestras (Cm) solvente (cm)
Eterpetroleo/AcoEt Carotenos Tubo 2: 0.9 3.4 0.26
9:1
Eterpetroleo/AcoEt Feofitinas tubo 4: 1.7 3.3 0.51
8:2 tubo 5: 1.7
Eterpetroleo/AcoEt Clorofilas tubos 7: 1,5 3.4 0.44
7:3 tubo 8: 0.9 0.26

Tabla 3. Migración en CCD de componentes aislados por cromatografía en columna

Con los datos obtenidos en la tabla 3 podemos inferir que los compuestos obtenidos son los listados
en la misma (carotenos, feofitinas, clorofilas), pues hay una migración coherente de muestras en las
CCD de acuerdo al solvente utilizado. Es preciso también mencionar que el los tubos 1, 3, y 6 no se
observó presencia de manchas debido a ser tubos de transición con menor concentración de
componentes en la solución muestra obtenida.

Conclusiones

 Utilizando la técnica de CCD es posible caracterizar los componentes de una muestra dada,
en esta práctica se analizó la cúrcuma comercial, se observó la diferenciación de diversos
compuestos, lo cual indica que la cúrcuma comercial no tiene alto grado de pureza. Aun en
definitiva se puede inferir que si contiene curcumina el cual es un compuesto esencial de la
cúrcuma.
 La cromatografía en columna es un método útil para aislar diferentes componentes de una
muestra dada, tomando como base la adsorción de la muestra en la fase estacionaria y
diferencia de polaridad de los solventes de elución.
 Las pruebas con CCD luego de la cromatografía en columna confirman adecuadamente la
presencia de determinados componentes de acuerdo a la interacción con el solvente
utilizado. Además de acuerdo a la CCD se determinan los componentes de armado inicial de
la columna, en ese orden de ideas la CCD y la cromatografía en columna son técnicas que
se pueden utilizar complementariamente.

Bibliografía

 http://www.ub.edu/oblq/oblq%20castellano/cromatografia_tipus.html#columna
 https://www.textoscientificos.com/quimica/cromatografia/capa-fina
 Guía de practica de laboratorio, Química Orgánica. FCEN 2019
 TRABAJO PRÁCTICO Nº 1

MÉTODOS SEPARATIVOS: CROMATOGRAFÍA EN CAPA DELGADA Y EN COLUMNA.

David leudo

LU 608/18

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ORGÁNICA

FCEN 2019