UNIVERSIDADE ESTADUAL DO PIAUÍ

CENTRO DE CIÊNCIAS DA NATUREZA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA
DISCIPLINA: Genética Toxicológica
PROF. Dr. Fabrício Amaral

RELATÓRIO DE GENOTOXICIDADE:
ENSAIO COMETA

ALUNA: Vanessa Borges Vieira

Teresina
Dezembro- 2017
 1. INTRODUÇÃO
O aparecimento de mutações ocorre em todos os seres vivos, é um
processo fundamental para a evolução e diversidade das espécies. O genoma
de todos os organismos vivos está constantemente sob o efeito de agentes
exógenos ou endógenos que modificam a integridade química do DNA,
alterando seu conteúdo de informações genéticas. No entanto, nem sempre,
mutações são vantajosas e os impactos no fenótipo podem incluir má
formação, câncer, envelhecimento e morte.
Embora essas mutações possam ocorrer de forma espontânea, muitas
são induzidas por agentes físicos, químicos ou biológicos, aos quais o homem
e outros organismos podem ser expostos. Essas alterações incluem
anormalidades cromossômicas, amplificações gênicas e aquisição de novas
mutações que são responsáveis pela instabilidade genômica. Entre os efeitos
que mais despertam preocupação dos investigadores da área de saúde
ambiental e saúde ocupacional, encontram-se aqueles relacionados aos danos
genéticos. (PAGES E FUCHS, 2002, KESHAVA E ONG, 1999).
Das diferentes substâncias químicas, apenas uma pequena parcela vem
sendo testada para se identificar seus reais efeitos nos seres vivos
(PANAVELLO, 2000). O uso de biomarcadores de genotoxicidade é uma
ferramenta importante nos 13 estudos de exposição às substâncias
mutagênicas e a aplicação de técnicas analíticas para determinar os
parâmetros biológicos decorrentes da exposição às substâncias químicas,
tornando possível o esclarecimento da relação entre os agentes químicos e a
sua toxicidade ao material genético.
Uma das técnicas mais utilizadas para detecção de genotoxicidade tem
sido o Teste Cometa, devido a sua capacidade de detectar lesões pré-
mutagênicas (KAMMANN et al., 2001). O Teste Cometa é uma técnica rápida,
simples e sensível, de baixo custo para mensurar, analisar as lesões, monitorar
o dano e detectar efeitos de reparo no DNA em células individuais expostas a
agentes genotóxicos. Os danos mais facilmente detectados no DNA são
quebras (simples ou duplas), danos álcali-lábeis, crosslinks e quebras
resultantes de reparo por excisão (SINGH et al., 1988; TICE, 1995; SILVA et
al., 2000; HARTMANN et al., 2003; PAVÃO et al., 2007).
 Apresenta algumas vantagens sobre os testes bioquímicos e
citogenéticos, uma vez que pode ser utilizado para qualquer tipo de célula
(qualquer tecido em que se possa extrair células nucleadas), sendo necessário
apenas um pequeno número delas e por não necessitar de células em divisão
(HARTMANN; SPEIT, 1994). Este teste não é utilizado para detectar mutações,
mas sim lesões genômicas, que podem ser reparadas e, se não reparadas,
podem resultar em mutação.

2. OBJETIVO
Realizou-se uma visita ao Serviço Escola do Centro de Ciências da Saúde
da UESPI (Antiga Escola Amazonas) na Rua Lucídio Freitas, 2791. Bairro
Porenquanto – Teresina, com o objetivo da observação prática realizada em
camundongos de uma das técnicas mais utilizadas para a avaliação da
genotoxicidade que é o Ensaio Cometa.

3. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
Animais
Foram utilizados 12 camundongos, sendo 6 machos e 6 fêmeas, com
peso entre 25 - 30g.

Grupos Experimentais
Todos os animais receberam injeções intra-peritoniais do extrato de
Bromelina, no entanto, 2 machos morreram.

Amostras
Foram coletadas amostras de sangue da cauda dos animais 8h, e ao
final do período experimental (24h), e colocado em tubos tipo Eppendorf para
avaliação da atividade genotóxica pelo teste cometa.

Ensaio Cometa
O ensaio consiste na preparação anteriormente das lâminas com células
em gel agarose 1,5%, e na preparação da agarose “low melting” que precisa
ser fervida e colocada em banho 37°C. Em seguida, misturou-se 5 µl das
amostras de sangue coletado com 75 µl de agarose low melting, necessitando
colocar imediatamente sobre a lâmina com pré- cobertura e sobre esta camada
uma lamínula, fazendo com que esta se espalhe.
Posteriormente, as lâminas são colocadas em lise gelada das células
para a liberação do DNA, após um determinado tempo. Transcorrido o tempo,
deve-se colocar as lâminas em cuba horizontal de eletroforese, verter o tampão
de eletroforese sobre estas, deixar descansando por 20 min, em seguida iniciar
eletroforese: 25V e 300 mA por 15 min. Encerrada a eletroforese retirar as
lâminas e lavá-las 2 vezes com água destilada. Em seguida, esperar secar as
lâminas e corá-las em solução fixadora de Gelred. Por fim, as lâminas foram
analisadas por microscópio de fluorescência com luz ultravioleta e classificados
conforme o tamanho e intensidade. (DA SILVA, 2007)

4. CLASSIFICAÇÃO DOS COMETAS

Os cometas podem ser avaliados pela medição do comprimento da cauda
do cometa por microfotografia. Dessa maneira, a escala útil do ensaio; pela
classificação dos cometas por inspeção visual, tipicamente em cinco classes: 0
(zero) representa células sem dano (cometas sem cauda ou com caudas pouco
detectáveis), e de 1 a 4 representam um aumento relativo na intensidade das
caudas. Pela análise de imagens, através de uma câmera acoplada a um
computador com programa apropriado as imagens do cometa são,
selecionadas pelo operador; e por sistemas automatizados, os quais procuram
os cometas e realizam a análise com mínima intervenção humana (Figura 1;
COLLINS et al. 2008; BAGATINI e MALUF, 2011).

Figura1:Ensaio cometa
 5. RESULTADOS
O resultado deste procedimento é que o DNA ocupa o espaço da célula no
gel em uma estrutura semelhante ao núcleo, recebendo o nome de nucleóide,
ou seja, o nucleóide é composto por alças superenoveladas de DNA
(desprovido de histonas), aderidas à matriz nuclear residual. A lesão genômica
é percebida quando há quebras na molécula de DNA ocasionando o
desenovelamento das alças de DNA, formando um halo, desta forma,
percebem-se mudanças na estrutura do nucleóide. Após a lise das membranas
celulares, o DNA embebido em agarose é exposto à indução eletroforética,
quando ocorre dano no DNA, observa-se um aumento na migração de DNA
cromossomal do nucleóide em direção ao ânodo, que se assemelha à forma de
um cometa, isto é, com cabeça (região nuclear) e cauda (GONTIJO e TICE,
2003; COLLINS et al. 2008).

6. CONCLUSÃO
O ensaio cometa tem amplas aplicações em toxicologia por meio de testes
de genotoxicidade “in vitro”, “in vivo”. Esse procedimento auxilia na visualização
direta do dano ao DNA, cujos resultados mostram imagens com a aparência de
um cometa e sua cauda, a qual podia ser utilizada para determinar a extensão
o dano, dessa forma, o teste cometa possui grande importância no
monitoramento da exposição humana a agentes tóxicos.
REFERÊNCIAS

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JULIANA DA SILVA. O uso do ensaio cometa para o ensino de genética

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PAVÂO, P. R. G. et al. Ausência de efeito genotóxico induzido por esteróides

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SILVA, J.; FREITAS, T. R. O.; MARINHO, J. R.Alkaline single-cell gel

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TICE, R. R. The single cell gel/ comet assay: a microgel electrophoretic

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1995.