AISLAMIENTO DE TRICHODERMA PARA EL

8-10-2019 CONTROL FITOPATOGENO DEL HONGO

RHIZOCTONIA SOLANUM

PRESENTADO POR:
YEFERSON HARVEY CRISTANCHO CÁRDENAS
MIGUEL CAMARGO BÁEZ

INSTRUCTORA:
ANDREA PAMELA CAMACHO BARRERA

AGROBIOTECNOLOGÍA
BOYACÁ
DUITAMA
AISLAMIENTO DE TRICHODERMA PARA EL CONTROLFOTOPATOGENO DEL
HONGO RHIZOCTONIA SOLANUM
2 Alcance
Va dirigido a todos los grandes, medianos y pequeños agricultores,
independientemente del cultivo que posean; Arroz, sorgo, café, maíz, tabaco, flores,
frutales, hortalizas, papa, y demás cultivos que tengan la enfermedad Rhizoctonia
solani en sus plantaciones.

- Disponer de bio-funguicida a base de cepa nativa de Trichoderma spp, colectado

en diferentes ambientes, que cuente con buena agresividad, para el control de
enfermedades.

- Posibilitar la producción de alimentos más sanos y de mayor calidad.

3. características generales del hongo trichoderma
Trichoderma spp., tiene diversas ventajas como agente de control biológico, pues
posee un rápido crecimiento y desarrollo. Aparte de esto produce una gran cantidad
de enzimas, inducibles con la presencia de hongos fitopatógenos. Puede
desarrollarse en una amplia gama de sustratos, lo cual facilita su producción masiva
para uso en la agricultura. Su gran tolerancia a condiciones ambientales extremas
y a hábitats donde los hongos causan enfermedades, le permiten ser un eficiente
bio-agente de control. De igual forma, puede sobrevivir en medios con contenidos
significativos de agrodefensivos y otros químicos. Aparte, su gran variabilidad se
constituye en un reservorio de posibilidades de control biológico, bajo diferentes
sistemas de producción y cultivo.
Se ha demostrado que el Trichoderma spp. Actúa contra un amplio rango de hongos
fitopatógenos transmitidos por suelo y aire. Ha sido usado contra pudriciones en un
amplio rango de especies, causadas por Fusarium, Rhizoctonia, Pythium; y
patógenos formadores de esclerocios como Sclerotinia y Sclerotium. Según
(Gomez, 2005)
4 insumos
Azul de Lactofenol.
Aceite de inmersión.
Coloración Gram.
Agar PDA
Agua destilada
Cascarilla de arroz

5. Herramientas y equipos
Autoclave.
Cabina de Flujo laminar
Selladora Eléctrica
Shaker
Vortex.
Destilador.
Balanza.
Incubadora
Pipetas
Pipetas Automáticas
Microscopio
Micropipetas
PH metro
Asa de siembras
Pipeteador
Pipetas Pasteur
Portaobjetos
Cubreobjetos
Cajas de Petri
Embudo de polietileno.
. Espátula
Mechero
Termómetro
Malla de asbesto, el asbesto es buen aislante del calor.
Escobillas O Churruscos Para el lavado del material de vidrio.
Matraz Erlenmeyer
Frasco de rosca

6. Infraestructura

Laboratorio SENA-CEDEAGRO. También un cultivo que este infectado con

Rhizoctonia solani, y parcelas experimentales.
7. Elementos de protección personal (EPP)
Ropa protectora, fácilmente ajustable y confortable, así como:
Bata, Guantes, gorros, tapabocas, gafas, botas de seguridad y overol
7.1 Reglamento que se debe tener en cuenta en el laboratorio

Está rigurosamente prohibido pipetear con la boca. Se realizará pipeteo automático

con material adecuado y cada trabajador será instruido para manejarlo
debidamente.
- En la zona de trabajo no debe colocarse material de escritorio ni libros ya que el
papel contaminado es de muy difícil esterilización.
- No deberán usarse lentes de contacto.
- El personal con el cabello largo debe llevarlo recogido.
- Comer, beber, fumar y aplicarse cosméticos esta formalmente prohibido en el área
de trabajo del laboratorio, así como el almacenamiento de comida o bebida.
8. Preparación en kilogramos
990 gramos de cascarilla de arroz molida
10 gramos de trichoderma

PRODUCTO FORMULADO EN KILOGRAMOS

El producto formulado en kilogramos puede ser aplicado al sustrato de las macetas

en dosis de 250g/m3 o directamente en las proximidades de las raíces de las plantas
en parcelas establecidas, en una dosis de 8 a 10 g/planta.

8.1 Preparación en litros

50 gramos de cascarilla pulverizada disueltos en 950 ml de agua destilada

9. Procedimiento

PROTOCOLO DE PRODUCCIÓN EN LABORATORIO DE LA SUSPENSIÓN DE

ESPORAS DEL HONGO

En la finca donde se produce la especie en el cual se desea controlar enfermedades,

se toman muestras de suelo y se busca en ellas llevar el hongo Trichoderma spp.
En el laboratorio, se realiza la identificación, el aislamiento, investigación y posterior
multiplicación del hongo, utilizando arroz para el efecto. Luego, se traslada a otra
sección del laboratorio para la cosecha, ocasión en que se separan las esporas del
hongo del arroz y se realiza una mezcla con agua, para lograr la “suspensión de
esporas del hongo Trichoderma spp.”, que contiene 100 millones de esporas por ml.
El agua permite distribuir las esporas en el campo.

Una vez que se obtienen grandes cantidades de hongos por efecto de su

multiplicación, se realiza la cosecha de esporas. Finalmente se efectúa la
formulación del producto, que llega al agricultor en la cantidad requerida, conforme
a la superficie cultivada y a la frecuencia de su aplicación.

La cantidad de esporas se ajusta con un equipo llamado cámara de Neubauer

(cámara de conteo), que permite saber cuántas esporas tiene la suspensión

El control de la cantidad de esporas se hace con el microscopio, para tener la

certeza de entregar siempre la misma calidad del producto. El hongo necesita un
alimento para su multiplicación, lo cual se realiza sobre arroz estéril, si las cepas
son buenas. Al arroz se le agrega un poco de cada hongo y comienza a
multiplicarse. Cuando alcanza un crecimiento avanzado, pasa al área de cosecha.
El proceso de extracción de la suspensión de esporas de Trichoderma spp., consiste
básicamente en agregar agua (al arroz con Trichoderma spp.) a los envases
Erlenmeyer de vidrio donde crecieron, y se agita. Después se pasa por un colador
grueso y con el agua que filtra, van las esporas del hongo. A continuación, se hace
un colado fino; luego el ajuste de la cantidad de esporas y se envasa para entregar
al productor. En la cosecha de esporas, el arroz con restos de esporas que queda
en el colador, es distribuido en las parcelas experimentales, donde se prueba el
producto.
 10. Diagrama de flujo

Cepa certificada del

hongo de interés.
Medios de cultivo,
reactivos y material de
laboratorio. Destilador,
Sustrato Arroz
neveras

Multiplicación de la cepa
para inocular. Agua.

Incubadoras.
Preparación del sustrato
(Lavado y escurrido)
Bolsa de
Incubación de la Polipropileno,
Medios de cultivo, reactivos, 5 Algodón.
cepa, 5 días, 22 ºC
días, 22 ºC. Cabina flujo Balanza
laminar, Balanza analítica,
Microscopio, Cámara de
Newbauer, Cuenta colonias,
Empacado en bolsas
pH metro, Neveras
Control de Calidad de Cepa. plásticas de 1Kg.
6 a 8 días (Análisis
microbiológico y
fisicoquímico).
Autoclaves

Esterilización en
autoclave
Agua destilada,
Cepa
Rechazada. Cepa Cabina de flujo
aceptada. laminar, destilador
Autoclave pipeta.
Inoculación de la
cepa de interés al
Auto clavar y sustrato
Desechar
Hipoclorito de
sodio, Timsen.
Distribución al
cuarto de incubación

Bolsas con
producto
Periodo de Incubación. contaminado
10 a 12 días. Tº,
Agitación. Autoclaves
Auto clavar
y desechar
 Secado
Bolsa calibre 2, (Reducción de la
Bolsa metalizada. humedad).
Balanza, Selladora Molino
eléctrica pulverizador

Molienda del
Muestra del 5% del producto
Medios de cultivo,
lote del producto
reactivos, Cabina flujo
terminado.
laminar, Balanza
analítica, Microscopio, Empaque en bolsas
Cámara de Newbauer,
Transparentes y en
Cuenta colonias, pH
metro, Neveras. Control de calidad del Metalizadas.
producto terminado. 5 a
6 días (Análisis
microbiológico y
fisicoquímico) Producto apto para la

Venta.
Neveras, Aire
Lote NO Lote acondicionado
Aceptado. Aceptado.
Almacenamiento del

Producto.

Procesos de control de calidad

Proceso de producción
Materiales, reactivos, insumos, equipos
 11. Características organolépticas que determinan la calidad del producto
terminado

Color: amarillo claro

Olor: característico de la cascarilla

12. Factores que determinan la inocuidad del producto (Reyes, 2004)

1. Salmonella sp.: Ausentes en 25 gramos de producto final;

2. Enterobacterias totales: Menos de 1000 UFC/g de producto final.

Carga Microbiana. Si el producto presenta contenidos de microorganismos

benéficos debe declararse el recuento de microorganismos mesófilos aerobios,
mohos y levaduras.

Toma de muestras y criterio de aceptación o de rechazo

Las muestras deben ser tomadas de acuerdo con lo indicado en las NTC – ISO
8633, NTC – ISO 8634 y NTC 3795. Si la muestra no cumple con uno o más de los
requisitos indicados en esta norma, el lote debe ser rechazado. En caso de
discrepancia, se tendrán que repetir los ensayos sobre la muestra reservada para
tales efectos. Cualquier resultado no satisfactorio en este segundo caso, será
motivo para rechazar el lote.

Muestras para el Control de Calidad.

Una vez el producto es inventariado y almacenado en las condiciones adecuadas

se toma una muestra aleatoria, la cual es enviada al laboratorio externo que realiza
los correspondientes análisis de control de calidad del producto (ICA), adicional a
esto se guardara como contra muestra una dosis del mismo lote, como material de
referencia o soporte, para cualquier eventualidad que se pueda presentar con
respecto a lote producido. Adicional a esto, a nivel interno de laboratorio se realizará
un control de calidad a la misma muestra para poder tener un patrón de referencia
y comparación con los resultados emitidos por el laboratorio del ICA. Este
procedimiento lo realiza la persona encargada del área de Control de Calidad, la
cual posee conocimientos teóricos y prácticos para llevar a cabo dicha tarea.
Los análisis que se realizan son los siguientes:

• Concentración de Esporas: Se determina mediante recuento de esporas en

cámara de Neubauer.

• Germinación de Esporas: Se determina mediante la siembra de muestra en

Agar-Agar y su posterior lectura en el microscopio de esporas germinadas y no
germinadas, se utiliza el colorante Azul de Lactofenol para la tinción de las esporas.

Resultados del Control de Calidad del producto terminado. El laboratorio

externo contratado para realizar el control de calidad respectivo al producto, emitirá
los resultados de los análisis, a los diez (10) días hábiles, después de recibida la
muestra.
 13. Uso y aplicaciones

PROTOCOLO DE APLICACIÓN DE LA SUSPENSIÓN DE ESPORAS

- Se debe agitar la suspensión de Trichoderma spp, Antes de su utilización.

- Se recomienda utilizar la dosis de un (1) litro por cada 19 litros de agua.

- El equipo de aplicación debe estar limpio de residuos de fungicidas.

- El agua utilizada debe ser limpia y libre de desinfectantes.

- Se recomienda que se aplique inmediatamente en horas de la tarde, al ocultarse

el sol. O en horas de la mañana

- Es adecuado para la germinación de las esporas, que se efectúe un riego antes

o después de la aplicación de Trichoderma spp.

- Con cuatro (4) litros de la suspensión, se puede llegar a cubrir específicamente,

una hectárea.
14. Recomendaciones

Recomendaciones generales para el uso de microorganismos benéficos:

Hay que aplicarlo tan pronto como se adquiere. De no ser posible, debe refrigerarse
a temperaturas entre 1º y 10º C. Puede conservarse por cuatro meses.

• Los fungicidas convencionales afectan al Trichoderma spp., por lo que es preferible

evitar su uso o aplicarlos con varios días de anticipación, pero no simultáneamente.

• Se aplica por primera vez de 6 kg/ha (dosis inundativa). En las siguientes

aplicaciones (dosis inoculativa) se utiliza de 3 a 8 kg/ha. Para enfermedades de
follaje, se aplica cada dos a cuatro semanas, para enfermedades de raíz, se aplica
semanal o quincenalmente.

• En sitios donde hay infección, se puede, en caso que el producto está disponible
en el mercado de insumos agrícolas, aplicar el producto en kilogramos y
posteriormente se irriga.

» Si se está iniciando en el uso de estos productos, es conveniente consultar con

otras personas con experiencia para conocer los resultados que han obtenido.

» Pueden emplearse junto con otros métodos naturales y de bajo impacto de control
de plagas.

» Cuando se va a iniciar con el uso de microorganismos benéficos en la finca, lo

recomendable es experimentar primero para saber cómo funcionan.

» No hay restricciones de clima o altitud para su uso exitoso, aunque pueden ser
más efectivos cuando hay humedad en el suelo.

» Como regla general, se recomienda no aplicar los productos cuando esté

lloviendo.

Es de señalar que con el uso de este bio-insumo a base de Trichoderma spp.,

disminuye la intensidad de la enfermedad pero no es capaz de eliminarla por
completo. Por ello es recomendable el uso preventivo.
15. Normatividad

Entidad encargada de la vigilancia y control de este tipo de empresas, el Instituto

Colombiano Agropecuario ICA.

 (icontec, 2011) La NTC 40 Establece las condiciones para empaque,

identificación de productos y metodologías de ensayos de caracterización.
 Anexo 2 del artículo 698 del 04 de febrero de 2011 (ICA, RESOLUCIÓN 698
DE 2011, 2011)
 Resolución 00375 (ICA, RESOLUCIÓN No. 00375 , 2004)
16. Bibliografía

Bibliografía

Gomez, G. (12 de 07 de 2005). trichoderma spp. para el control biológico de enfermedades.

Obtenido de trichoderma spp. para el control biológico de enfermedades:
http://repositorio.iica.int/bitstream/11324/2647/1/BVE17038725e.pdf

ICA. (27 de 02 de 2004). RESOLUCIÓN No. 00375 . Obtenido de RESOLUCIÓN No. 00375 :
https://www.ica.gov.co/normatividad/normas-ica/resoluciones-oficinas-
nacionales/resoluciones-derogadas/resolucion-375-de-2004.aspx

ICA. (04 de 2 de 2011). RESOLUCIÓN 698 DE 2011. Obtenido de RESOLUCIÓN 698 DE 2011:
http://legal.legis.com.co/document/Index?obra=legcol&document=legcol_9ab213e9e826
0020e0430a0101510020

icontec. (20 de 06 de 2011). icontec. Obtenido de icontec:

http://www.tecnicana.org/pdf/2006/tec_v10_no17_2006_p31-38.pdf

Reyes, J. R. (31 de 05 de 2004). Materiales Orgánicos Utilizados como Fertilizantes o

acondicionadores del suelo . Obtenido de Materiales Orgánicos Utilizados como
Fertilizantes o acondicionadores del suelo :
http://www.tecnicana.org/pdf/2006/tec_v10_no17_2006_p31-38.pdf
17 participantes (autores)

Yeferson Harvey cristancho cárdenas

Miguel Alonzo Camargo Báez

18 como citar este artículo

Cristancho, Y., y Camargo, M (2019) Aislamiento de trichoderma para el control

fitopatógeno del hongo Rhizoctonia solani. Bio insumos 1, 2-16.