PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO Y EVALUACION DE

DIFERENTES TIPOS DE ESTERILIZACIÓN

Mileidys J. Rada-Mena1, Jesica Y. Carrascal-Cantillo2, Eider Florez-Castro3

Biotecnología industrial y ambiental; Ingeniería Agroindustrial, Facultad de Ingeniería,

Departamento de Química, Universidad de Antioquia, Sede de estudios ecológicos y
agroambientales, Jesica.carrascal@udea.edu.co; Mileidys.rada@udea.edu.co;
Eider.florez@udea.edu.co.

Angelly Patricia Martínez Rodríguez

RESUMEN

En los laboratorios los diferentes medios de cultivos y esterilización son ampliamente

implementados, ya que son necesarios para poder realizar muchos estudios a
microorganismos. En la preparación del medio de cultivo, se implementará caldo extracto de
malta, de la cual se preparará 200 ml. Posteriormente el medio de cultivo se someterá a un
proceso de esterilización húmedo. Para la evaluación de diferentes tipos de esterilización, se
utilizara tres métodos; calor húmedo, calor seco y esterilización química (hipoclorito de sodio
al 15%), donde primeramente se realizó conteo de células viables, utilizando como
microorganismo Escherichia coli. Finalmente se pudo evidenciar la efectividad de los tres
métodos de esterilización empleados.

Palabras claves: Escherichia coli, esterilización, medios, microorganismo, caldo.

INTRODUCCIÓN
Medio de cultivo encuentran desecados en forma de polvo
fino o granular antes de ser preparados; ya
Un medio de cultivo está constituido por
preparados pueden encontrarse en estado
una mezcla de agua y sustancias que en
sólido, semisólido o líquido.
conjunto proporcionan los requerimientos
nutricionales para el desarrollo de los
microorganismos. La composición de los
Todos los medios de cultivo han de estar
medios de cultivo varía en función del
perfectamente estériles para evitar la
grupo microbiano que se pretende
aparición de formas de vida que puedan
estudiar, y la preparación del medio
alterar, enmascarar o incluso impedir el
depende de la complejidad química
crecimiento microbiano normal del o de
(composición), el estado físico y otras
los especímenes inoculados en dichos
condiciones requeridas (pH,
medios.
concentración, etc.). Generalmente se
Esterilización cantidad de medio de cultivo calculado
fue de 3,4 g como se muestra en la
Hace aproximadamente 150 años que se (Figura 1).
comenzaron a utilizar técnicas para Posteriormente se mezclo la cantidad y se
controlar el crecimiento microbiano, disolvio bien con un poco de agua en un
desde los primeros estudios de Pasteur Erlenmeyer y luego agregamos la
hasta Chamberland, quien en 1884 cantidad de agua restante, después se
inventó la autoclave que se basa en el uso colocó en una plancha de calentamiento
de calor húmedo a presión. Actualmente con magneto para disolver bien el medio
en los laboratorios se utilizan de manera (Figura 2). Finalmente se colocó el tapon
rutinaria diversos procesos físicos, de gasa y la cinta de esterilidad antes de
químicos y mecánicos para controlar el llevar al autoclave para la esterilización
del medio. Al terminar con el proceso de
crecimiento microbiano. El concepto de
esterilizacion se dejó enfriar a
esterilización en microbiología implica la
temperatura ambiente y se guardó en
eliminación de todas las formas vivas. refrigeracion con su adecuada rotulación.
Otras metodologías, como desinfección,
pasteurización, etc., conllevan una
eliminación parcial de los
microorganismos existentes. En el sector
salud es muy importante destruir a los
patógenos para prevenir su transmisión,
mientras que en diversas industrias,
incluyendo la alimentaria, es importante
eliminar microorganismos para conservar
su calidad.
Todos los medios de cultivo han de estar
perfectamente estériles para evitar la
aparición de formas de vida que puedan Figura 1 Pesaje de la cantidad de Caldo
alterar, enmascarar o incluso impedir el extracto de malta
crecimiento microbiano normal del o de
los especímenes inoculados en dichos
medios.
MATERIALES Y MÉTODOS

PARTE A. Preparación de medios

Para desarrollar la preparacion del medio

de cultivo, se realizó una previa
formulacion según la etiqueta del frasco
del caldo extracto de malta donde por
cada litro se deben usar 17 g de este.
Como deseabamos preparar 200 ml se Figura 2 Montaje en plancha para
utilizó una regla de tres simple y la disolver el medio de cultivo
PARTE B. Evaluación de diferentes
tipos de esterilización
1. Conteo de células viables
Para el conteo de células viables se
utilizó la cepa Escherichia coli en
caldo nutritivo. Se inició marcando 3
tubos de agua peptonada al 0,1 % con
el nombre de la diluciones seriadas
(10-1, 10-2, 10-3), luego se adicionaron
en el tubo de la dilución 10-1 de agua
peptonada 1 ml de cepa pura, todo esto
en presencia del mechero. Además se
hicieron las otras diluciones seriadas,
utilizando 1 ml en cada dilución con su
respectiva agitación. Posteriormente se
marcaron y se rotularon 2 cajas de
Agar nutritivo previamente
suministrado por la docente y se
sembró la dilución 10-3 en ambas cajas
mediante la siembra en superficie,
donde para cada caja se adicionaron
100 µL de esta dilución, utilizando la
asa de Driglasky esterilizándola con
alcohol encendido por segundos para
esparcir la muestra en la totalidad de la
superficie de la caja. Por último se dejó
reposar 5 min y se incubaron las cajas
a 37 °C x 43 h para luego realizar el
conteo de las UFC.
a) Calor húmedo
Para desarrollar este tipo de esterilización
se utilizó la dilución 10-1. Esta dilución se
llevó al autoclave y luego de esterilizado
el tubo de ensayo, se esperó a que enfriara
para poder realizar la siembra en superficie
usando 100 µL de la dilución en 1 sola caja
de Agar nutritivo, utilizando el asa
Driglasky para distribuir la muestra,
previamente flameada con alcohol.
Finalmente se llevó a incubación a 37 °C x
43 h para luego realizar el conteo de las
UFC.
b) Esterilización química
Para este procedimiento se utilizó la
dilución 10-2, en presencia del mechero se
adicionó 1 ml de cloro al 15% al tubo de
ensayo, este se cerró y se dejó actuar por
20 minutos. Después realizamos la
siembra en superficie en 2 cajas de Agar
nutritivo agregando 100 µL de la dilución
en cada caja, utilizando el asa Driglasky
para distribuir la muestra, previamente
flameada con alcohol. Finalmente se llevó
a incubación a 37 °C x 43 h para luego
realizar el conteo de las UFC.
c) Calor seco
Se utilizó la dilución 10-3 para este tipo de
esterilización. Primero se colocó la cinta
de esterilidad para llevar al horno a 100 °C
durante 2 horas, luego se retiró el tubo de
ensayo con la dilución del horno y se dejó
reposar a temperatura ambiente hasta que
se enfriara. Después se realizó la siembra
en superficie en 2 cajas de Agar nutritivo
usando 100 µL de dilución para cada caja,
utilizando el asa Driglasky para distribuir
la muestra, previamente flameada con
alcohol. Finalmente se llevó a incubación
a 37 °C x 43 h para luego realizar el conteo
de las UFC.
RESULTADOS
Tabla 1 Resultado de métodos de
esterilización
Métodos de esterilización
Calor Esterilización Calor
húmedo química seco
-1 -2
Dilución 10 10 10-3
UFC 1998 1998 1998
iniciales
UFC finales 110 2 4

Figura 3 Conteo inicial de UFC
Figura 4 Conteo final de UFC de la
esterilización por Calor húmedo.
Figura 5 Conteo final de UFC para
esterilización química
Figura 6 Conteo final de UFC de la
esterilización por Calor seco.
Análisis de resultados
Esterilización Química
De acuerdo a los resultados de los
diferentes métodos de esterilización se
pudo observar que la esterilización
química (Figura 5) tuvo mayor efecto
como agente esterilizante (Tabla 1), ya
que el recuento de la población
microbiana fue mucho menor en
comparación de los otros dos métodos de
esterilización. Esto se debe a que dicho
compuesto químico tiene característica
desinfectadora, es decir, tiene la
capacidad de eliminar agentes patógenos,
logrando una reducción significativa de la
cantidad de microorganismos presentes
en un medio, sin embargo, no se garantiza
la eliminación total de éstos (Vignoli,
2002).
Esterilización por calor seco
Se pudo evidenciar que este método tuvo
una desarticulación en la actividad
metabólica del microorganismo (Figura
6) ya que en el aumento de su temperatura
óptima de crecimiento del 37° C a 100°C
se pudo obtener una efectividad del
método al igual que la esterilización BIBLIOGRAFÍA
química, casi del 100% (Tabla 1).
Esterilización calor húmedo (Vignoli, 2002) Esterilización y
desinfección. Agosto 29, 2019.
En este método se obtuvo un mayor
crecimiento microbiano de E. coli debido Departamento de procesos y tecnología
a que no arrojó los resultados esperados (2016). Manual de práctica de
como en el caso de los otros dos métodos microbiología básica. Universidad
de esterilización. Sin embargo, la autónoma metropolitana.
población microbiana disminuyó en gran
medida (Figura 4). Cuando el método es Guía del laboratorio de biotecnología
efectivo se debe a que el efecto final de la
esterilización por calor húmedo a 121ºC
es la desnaturalización y coagulación de
las proteínas. Un aumento de temperatura
y presión, durante 20 min, el primer efecto
letal sería la producción de rupturas de
cadena única en el ADN que provocan la
muerte celular por activación o liberación
de enzimas con actividad de
endonucleasas (Vignoli, 2002).

CONCLUSIÓN
● Bajo las condiciones del experimento
y de las muestras utilizadas en esta
práctica, la implementación de los
diferentes métodos de esterilización
tuvo una eficiencia casi del 100%.
Evidenciando en la disminución de las
UFC iniciales.
● En el método de esterilización húmedo
no fue lo esperado ya que en el conteo
de UFC final se tuvo una considerable
población microbiana, haciendo que el
método no haya tenido un mayor
efecto.
● Se pudo realizar la preparación del
medio de cultivo y las diferentes
diluciones.