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FORMULE NUMERATION SANGUINE : FNS

Numération des Globules Rouges :
*Technique :
Le prélèvement est soit veineux et recueilli sur EDTA, soit capillaire et
immédiatement dilue dans des Unopettes.
La numération est soit manuelle : après dilution dans un liquide isotonique, comptage
au microscope des hématies contenues dans une cellule de Malassez mais avec une
marge d erreur importante (7,5 p. 100 au mieux) ; soit automatique : dilution
automatique dans un liquide isotonique et tamponne, dépourvu de particules, puis
aspiration a travers l orifice d une sonde . Le passage de chaque cellule crée une
modification de la résistivité, proportionnelle au volume de la cellule.
*Résultats :
Les valeurs normales sont exprimées dans le système international ( SI )
D unité en milliers de milliards de globules rouges par litre de sang ( 1012/L ) .
Les variation physiologiques sont superposables a celle de la concentration de l
hémoglobine : a la naissance : 5,0 1,0 ; a 3 mois : 4, ; de 3 a 6 ans : 4,8 0,7 ; de 10 a
12 ans : 4,0, ; hommes ( adultes ) : 5,0 0,5 ; femme ( adulte ) :4,5 ,. L’augmentations
du nombre des hématies peut être fictif (hémoconcentration). Dans le cas de
microcytoses on peut trouver une pseudo polyglobulie (thalassémie mineur ) faite de
cellules dont le volume est diminue, peu chargées en hémoglobine. Seule une
augmentation de la masse globulaire totale traduit une polyglobulie vraie, primitive
ou secondaire.
La diminution du nombre des globules rouges est liée a une hémodilution ou a une
diminution vraie de la masse érythrocytaire. Les variations de ces chiffres font
discuter avec les autres données de l hémogramme, le diagnostic des anémies ou des
polyglobulies.

NUMERATION DES GLOBULES BLANCS :

La numération des globules blancs fait partie de tout hémogramme.
*Technique :
Le prélèvement recueilli sur EDTA est capillaire ou veineux. Il n est pas obligatoire
que le patient soit a jeun. Dans la méthode manuelle, la dilution du sang est faite par
un liquide qui lyse les hématies en préservant les leucocytes ; la numérisation est
réalisée au microscope, la dilution étant introduite dans une cellule de Mallasse.
Le principe de la méthode automatique est identique a celui de la numérisation des
hématies (voir n 150 ).
*Résultats :
Chez l adulte (homme ou femme) le nombre des globules blancs est de 7±/l dans
le système international d’unîtes.

Des variations physiologiques ont été observe ( 109/l ) selon l âge : a la naissance =
12 a 26 ; a 3 mois = 6 a 18 ; a 1 an = 6 a 15 ; de 3 a 6 ans = 5 a 15 ; de 10 a 12 ans =
4,5 a 13,5. Pendant la grossesse il existe une légère hyperleucocytose jusqu’au 3eme
mois du post-partum. Diverses circonstances augmentent le chiffre de globules
blancs : effort physique, émotions violentes, menstruations, anesthésies,
accouchement, intervention chirurgicale, exposition au froid, au soleil, aux rayons
UV.
La diminution pathologique du nombre des globules blancs (leucopénie) ou leur
augmentation pathologique ( hyperleucocytose ) ne peut être interprète qu’avec les
données de la formule leucocytaire et les renseignements cliniques.
FORMULE LEUCOCYTAIRE :
C est l établissement du pourcentage des différents éléments nucléés du sans
circulant. La formule est soit manuelle, effectuée au microscope à partir d un frottis
sanguin (on apprécie simultanément la morphologie des globules rouges et des
plaquettes), soit automatique, effectuée par des cymomètres en flux. Ces automates
associent a la mesure du volume cellulaire des réactions cytochimiques (coloration
des myeloperoxydases) ou la mesure d autres paramètres physiques
(conductivité électromagnétique, diffraction d un faisceau laser).
*Technique (méthode manuelle) :
Le prélèvement de sang capillaire ou veineux est recueilli sur EDTA ; une goutte
suffit par frottis. A l aide de lames parfaitement propres, a bords rodes, le frottis est
réalise de la façon suivante : une petite goutte de sang est déposée a l extrémité d une
lame qui sera maintenue d une main sur un plan dure ; de l autre main est amenée une
deuxième lame inclinée a 45 au contact de la goutte ; on laisse le sang diffuser le
long de l arrête et, avant qu il n ait atteint les bords, on tire rapidement la goutte vers
l extrémité de la lame horizontale. Apres séchage rapide et soigneux par agitation a l
air, une coloration de May-Grunwald-Giemsa ou une coloration de Wright est
effectuée. La lecture se fait, après contrôle de la qualité du frottis, en dénombrant au
moins 100 cellules, qui sont reparties dans chaque catégorie.
*Résultats :
Les résultats de la formule leucocytaire et ceux de la numération des globules blancs
sont indissociables : seules sont utilisables les valeurs absolues de chaque type
cellulaire .
(10 /l) En p. 100 Pour un nombre normal de globules blancs
Polynucléaires neutrophiles éosinophiles basophiles Lymphocytes Monocytes 2,0 a
7,5 0,04 a 0,5 0,01 a 0,1 1,5 a 4,0 0,2 a 1,0 40 a 75 1 a 5 1 20 a 45 2 a 10
- Formule leucocytaire normale de l adulte.
Chez le nouveau-né, le nombre des polynucléaires neutrophiles est élève ( 6 a 26 .
109/l ) puis ce sont les lymphocytes qui prédominent durant la petite enfance (a 1 an
= 4 000 a 10 000/µl ; a 4 ans = 2 000 a 8 000/µl). Ces valeurs rejoignent celles de
l adulte vers 10-14 ans. Les nombre des monocytes suit une courbe identique à celle
des neutrophiles. Au cours du dernier trimestre de la grossesse on peut observer une
hyperleucocytose a prédominance de neutrophiles.
Les leucopénies sont de deux ordres : neutropénies et lymphopénies.
Une neutropénies est définie par un nombre de polynucléaires neutrophiles inferieur
a 1500 µl. les étiologies peuvent être regroupes selon le mécanisme responsable de la
neutropénie :
Troubles de production : aplasie médullaire ; envahissement médullaire que qu il soit
; dysmyeopoieses congénitales ;
Destruction exagérée : d origine mécanique (circulation extracorporelle) ;
immunologique ( allo-anticorps, auto-anticorps ) ; immun allergique (médicament) ;
Anomalie de la répartition ( non-mobilisation des réserves médullaires, augmentation
du secteur marginal ) ;
Mécanismes complexes ( maladies virales, neutropénies cycliques, hypersplénisme,
syndrome de Felty ).
Une neutropénie extrême d apparition brutale est qualifiée d agranulocytose.
Elle s observe après absorption de certains médicaments (amidopyrine, phenacetine,
phenylindanedione, sulfamides, etc.).
Une lymphopénie est définie par un nombre de lymphocytes inferieur a 1 000 µ/l
(des lymphopénies sont observées dans certains déficits immunitaires).
Parmi les hyperleucocytose, on distingue, selon le type cellulaire :
Les polynucleoses neutrophiles ( c est a dire plus de 7 500 par µl ) dont les
étiologies sont très nombreuses : infections bactériennes localisées ou généralisées,
syndromes inflammatoires, cancers, maladies métaboliques comme la crise de goutte,
l acidocétose diabétique, les nécroses tissulaires comme les brulures, l infarctus du
myocarde, prés hémorragies aigues et hémolyses, sorties d agranulocytose aigue, lors
de certains traitements comme les corticoïdes, lors du tabagisme, enfin dans les
syndromes myeloproliferatifs ou l on rencontre des éléments immatures.
Une basophilie ( plus de 200 par µl ) est rarement rencontrée en dehors d une
leucémie myéloïde chronique ou elle s accompagne d une myelemie.
Une monocytose ( plus de 1 000 par µl ) se voit dans certain dysmyelopoieses
acquises idiopathique, dans les agranulocytoses aigues mais aussi dans des maladies
infectieuses (brucellose, salmonellose, listériose ), dans certains états inflammatoires
(collagénose, sarcoïdose).
Une lymphocytose correspond a un nombre de lymphocytes circulants supérieurs a 4
000 par˜Â¢Ã‚µl. Il peut s agir de lymphocytes de morphologie normale, dans des
maladies virales ( oreillons, varicelle, hépatite ) ou bactériennes ( coqueluche ) ou
bien dans les syndromes lymphoproliferatifs. Il peut aussi s agir de lymphocytes
hyper basophiles mêles a des éléments mononuclés de grande taille : il s agit alors d
un syndrome mononucleosique rencontre dans la mononucléose infectieuse, la
toxoplasmose, les infections a cytomégalovirus ou d autres viroses (rubéole, hépatite,
varicelle).
La présence dans le sang d’éléments granuleux immatures, avec ou sans présence
d’érythroblastes, est appelée myelemie. Elle s observe quel que soit le nombre de
globules blancs. La myelemie peut être réactionnelle a une sollicitation médullaire
importante (hémorragie aigue, hémolyse, infection sévère, sortie d’agranulocytoses
aigue). Elle peut être associée a une myelofibrose (idiopathique, envahissement
médullaire d un cancer) ou un syndrome myeloproliferatif sans myelofibrose initiale
(leucémie myéloïde chronique essentiellement).
La présence de blastes dans le sang est toujours normale : elle doit faire rechercher,
 avant tout, une leucémie aigue mais se voit dans les leucémies myéloïdes chroniques
en transformation aigue, dans les myelofibroses primitives ou secondaires (voir
indications du myélogramme et de la biopsie osseuse).

Hématocrite :
C est le rapport du volume globulaire au volume sanguin total, exprime en pourcentage.
*Technique :
Deux méthodes sont utilisables : directe ( macro hématocrite de Wintrobe
ou micro hématocrite ) ou indirect ( calcul utilisant le volume globulaire moyen et le nombre
des hématies). Le sang capillaire ou veineux est prélève sur anticoagulant sec L’hématocrite
selon Wintrobe nécessite un volume de sang important ; il est d utilisation délicate et de
précision relative ; il est abandonne au profit du micro hématocrite. Celui-ci nécessite une
centrifugation du sang dans les tubes de verre calibres et une mesure a l aide d un lecteur
spécial. L erreur obtenue est inferieure a 3 P. 100 pour un sang normal.
* Résultats :
Les valeurs normales moyennes chez l adulte sont : 47 7 p. 100 pour les hommes et 42 5 p.
100 pour les femmes. A la naissance, l hématocrite est élève : 56 p. 100, puis il diminue a 3
mois ( 38 6 p. 100 ) pour remonter au taux de l adulte vers la dixième année. Pendant la
grossesse, la diminution progressive de l hématocrite est liée a une hémodilution.
L’hématocrite ne permet d’ apprécier la masse globulaire que si la masse totale sanguine ne
varie pas. Il peut être diminue si le volume globulaire baisse (anémie, hypersplénisme) ou si
le volume plasmatique augmente (ascites cirrhotiques, insuffisance cardiaque, insuffisance
rénale, hyper protidémies). Il est augmente par l hémoconcentration (baisse du volume
plasmatique) ou par l augmentation de la masse globulaire (polyglobulies primitives ou
secondaires).

VITESSE DE SEDIMENTATION ERYTHROCYTAIRE :

La vitesse de sédimentation (VS) des hématies dans le plasma est appréciée in vitro sur un
échantillon de sang prélève sur anticoagulant.

*Technique :
Le prélèvement peut être réalise a n importe quel moment de la journée, même si le sujet n est
pas a jeun. Le sang est recueilli après ponction veineuse rapide, sur une solution de citrate. Le
mélange sang-citrate doit être immédiat dans les proportions de un volume de citrate pour
quatre volumes de sang.
Technique de Westergreen : le mélange sang-citrate doit être utilise dans les deux heures
suivant le prélèvement si l échantillon est garde a température ambiante ( 6 heures après si la
conservation a lieu a 4 ° C ). Apres homogénéisation, il est aspire dans un tube calibre,
gradue en mm et maintenu strictement vertical. Au bout d une heure de sédimentation, on
mesure la hauteur de plasma au-dessus de la colonne d’hématie. La lecture au bout de deux
heures est inutile.

*Résultats :
Les valeurs normales chez l adulte exprimées en mm a la première heure varient chez l
homme de 3 a15 et chez la femme de 7 a 20.
La VS est plus rapide chez l enfant et le sujet age ( 20 mm a la première heure après 60 ans ).
Chez la femme, l accélération de la VS se voit pendant les menstruations, pendant la
grossesse ( a partir de la 10eme semaine et pendant 3 a 4 semaines après l accouchement ).
Le ralentissement pathologique est rare, observe lors de polyglobulies, hémoconcentrations,
hypo- et afibrinogénémies, drépanocytose.
La VS est augmentée dans les maladies rhumatismales, toutes les maladies infectieuses (a
pyogènes, virales, tuberculose, etc.), aigue ou chronique, les syndromes néoplasiques, les
processus nécrotiques (infarctus du myocarde, période poste-radiothérapeute, traumatisme
important), les maladies dégénératives. L accélération peut être considérable ( > 100 mm a la
première heure) lors de dysproteinemies (traduites sur le frottis sanguin par la disposition en
rouleaux des hématies), d affections rénales, hépatiques, de myélome, ou de maladie de
Waldenstrom. Ce test est surtout utile lors de la surveillance d une affection subaigüe ou
chronique.

Détermination du Groupe Sanguin :

*Principe :
La technique est basée sur le principe de l agglutination des hématies humaines normales,
pourvues de l Ag correspondant au réactif utilise, en présence du réactif. Les hématies
dépourvues de l Ag n’agglutineront pas.
Le groupe AB doit être réalise simultanément sur les hématies ( épreuve globulaire ou
de Beth Vincent ) et sur le sérum ou plasma ( épreuve sérique ou de Simonin ), réalisée
en testant le sérum avec hématies de groupes connus A1, A2, B et O.
* Mode opératoire :
Sur une plaque d opaline, a température ambiante ( 15 - 25° ) déposer une goutte d anti
A, d anti B, d anti AB et d anti D.
Ajouter une goutte de sang a cote de chaque goutte de réactif.
Pour chaque test, mélanger réactif et hématies a l aide d une baguette de verre rode de
manière a obtenir un cercle de 2 cm, de diamètre.
Agiter doucement la plaque par des mouvement
d oscillation et lire
L agglutination a 3 mn.
Ne pas interpréter des brins de fibrine comme une agglutination.
*Résultats et interprétation :
Les réactif anti A, anti B et anti D agglutineront les hématies pourvues des Ags A et/ou
B, alors qu ils n agglutineront pas les hématies du groupe O.
Des hématies humaines pourvues de l Ag D seront dites D-

L’épreuve globulaire et l épreuve sérique effectuées simultanément doivent etre

concordantes :
-Agglutination avec l anti D Rh +
-Pas d agglutination Rh -

* Intérêt de la connaissance de groupes sanguins :

La connaissance des groupes sanguins est indispensable sur le plan pratique pour
effectuer une transfusion sanguine, une transplantation dans le respect des regles
immunologiques destinées a obtenir une parfaite sécurité.
En outre, ils sont utilises dans le domaine de l hématologie géographique et dans la
compréhension du fonctionnement génétique.

DETECTION DE L’ANTIGENE HBs :

*But du test :
C est un test immun enzymatique sensible et rapide pour la détection de l Ag de surface
de l hépatite B dans du sérum humain ou du plasma .
*Intérêt Clinique :
L Ag HBs peut être détecte dans le sang des sujets infectes, il est le premier marqueur
sérologique âpres infection par le HBV.
L Ag HBs apparait 1 a 10 semaines après contamination, 2 a 8 semaines avant la début
de l hépatite, il persiste durant la phase aigue et disparait plus tard durant la période de
convalescence. Une absence de chute de l Ag HBs dans les 6 semaines indique un statut
de porteur chronique.
Le sang des individus en phase aigue ou chronique est infectieux et ne doit pas etre
transfuse.
*Principe de la méthode :
Dans ce test, les cupules sont recouvertes d’Acs poly clonaux spécifique de l Ag HBs. L
échantillon est incube dans la cupule simultanément avec un mélange d’Acs
monoclonaux spécifiques de différents epitopes de l Ag HBs, conjugues avec la
peroxydase.
Si l Ag HBs est présent dans l échantillon, il sera lie simultanément par l Acs de cupule
et l Ac conjugue. Ainsi, durant l incubation, l Ag HBs est fixe a la surface de la cupule
dans un complexe Ac-Ag-Ac-enzyme.
Apres lavage des cupules pour éliminer l échantillon et le conjugue non lie, une solution
contenant le 3, 3, 5, 5 - tétra méthyle benzidine (TMB) et du peroxydase d hydrogène est
ajoutée aux cupules. Les cupules qui contiennent de l Ag HBs développent une couleur
violette qui vire a l orange après arrêt de la réaction avec l acide sulfurique. L’intensité
de la coloration peut être déterminée photo métriquement est directement proportionnelle
a la quantité de conjugue lie donc a la concentration de l Ag HBs présent dans l
échantillon.

*Le mode opératoire :

-Préparer la solution substrat et le liquide de lavage.
-Utiliser uniquement le nombre de cupules nécessaire aux tests.
-Ajouter 25 ul de diluant échantillon dans chaque cupule.
-Ajouter 75 ul d’échantillon ou de contrôle. Utiliser 3 cupules de contrôle négatif et une
seule pour le contrôle positif.
-Ajouter 50 ul de conjugue dans chaque cupule.
-Agiter la plaque manuellement.
-Couvrir la plaque avec le couvercle et incuber pendant 90 mn a 37° C en atmosphère
humide.
-Faire 5 cycles de lavage avec une double aspiration. Apres lavage, retourner la plaque et
tapoter sur un papier absorbant pour éliminer le liquide de lavage résiduelle.
-Ajouter immédiatement 100 ul de solution substrat dans chaque cupule.
-Couvrir la plaque et incuber pendant 30 mn a 37° C en atmosphère humide. *Une
coloration violette doit se développer dans les cupules contenant des échantillons réactifs.
-Ajouter 50 ul de solution d arret dans chaque cupule.
Dans les 15 mn, lire l absorbance de chaque cupule a 450 nm en utilisant une longueur d
onde de référence de 620 a 690 nm si disponible.
*Résultats :
Contrôle négatif : calculer l absorbance moyenne des répliquâtes du contrôle négatif.
Valeur seuil : calculer la valeur seuil en ajoutant 0,05 a la moyenne des répliquâtes du
contrôle négatif.
Interprétation des résultats :
Résultat négatif : les échantillons présentant une absorbance inferieur a la valeur seuil
sont considères comme négatif pour ce test.
Résultat positif : les échantillons ayant une absorbance = ou > a la valeur seuil sont
considérées comme initialement réactifs avec ce test. Il doivent etre retestes
en double.
*Limites de la méthode :
Ce test est uniquement destine a l investigation d’échantillon des sérum ou de plasma de
sujets individualisées, pas pour les pools de sérum ou de plasma ou d autres liquides
biologiques.
Un résultat négatif avec un test de détection d’Ag HBs n écarte pas la possibilité d une
infection par le VHB.

>DETECTION DES ANTICORPS ANTI VHC :

*But du test :
C est un dosage immun enzymatique pour la détection des Acs diriges contre le VHC
dans le serum ou le plasma humain.
*Principe de la méthode :
L’ échantillon dilue est incube dans les micro-puits recouverts d’Ags hautement purifie
contenant les séquences des régions coré, Ns3, Ns4 et Ns5 du VHC.
Lors de la 1ere incubation, tout Ac anti VHC se lie aux Ags immobilises. Apres lavage
pour éliminer le matériel non lie, les Acs antiVHC captures sont incubes avec l Ac IgG
anti humain monoclonal conjugue a la peroxydase.
Lors de la 2eme incubation, le conjugue se lie a l Ac immobilise pendant la 1ere étape.
Apres avoir élimine le conjugue en excès, l enzyme lie est détecte par addition d une
solution contenant de la TMB et de l eau oxygène. Les puits qui contenaient des
échantillons positifs, développent h_ca
de contrôle dans les puits.
Il est recommande d utiliser deux puits de contrôle négatif pour plus de sécurité.
-Recouvrir les puits d un couvercle et incuber pendant une heure a 37° C dans les
conditions d’humidité.
-Laver la plaque, effectuer 5 cycles de lavage et s assurer qu il ne reste pas de liquide
dans les puits (faire une double aspiration).
-Immédiatement après lavage de la plaque, ajouter 100 ul de conjugue dans chaque puits.
-Recouvrir le puit d un couvercle et incuber pendant 30 mn a 37° C dans les conditions
d’humidité.
-A la fin du temps d incubation, laver a plaque comme décrit précédemment.
-Ajouter 100 ul de solution de substrat dans chaque puits.
-Recouvrir les puits d un couvercle et incuber pendant exactement 30 mn a 37° C. Tenir
a l abri de la lumière. Une couleur pourpre devrait apparaitre dans les puits contenant des
échantillons positifs.
-Ajouter 50 ul de solution d’arrêt dans chaque puits.
-Lire la densité optique dans les 15 mn a 450 nm.

*Résultats :
Contrôle négatif : calculer la moyenne.
Valeur seuil : calculer en ajoutant 0,6 a la moyenne des répliquâtes du contrôle négatif.
*Interprétation des résultats :
Les échantillons fournissant une D.O > ou = a la valeur seuil sont considérées comme
initialement réactifs, et doivent être ré-analyser en double.
* Limites de la méthode :
Ce test doit être effectue uniquement sur des échantillons de sérum ou de plasma
individuels.
Un résultat négatif par un test de détection de
l Ac n’exclut pas la possibilité d une infection.

L utilisation d échantillon fortement hémolyses, de sérum incomplètement coagules peut

provoquer des résultats erronés

DETECTION DES ANTICORPS ANTI HIV :

*But du test :
C est un test immun enzymatique sensible, rapide pour la détection des Acs spécifiques
des virus de l immunodéficience humaine de type 1 et 2 dans du sérum ou du plasma.
*Résume du test :
Deux types de virus de l immunodéficience humaine ont été décrits HIV-1 et HIV-2. les
deux types de virus montrent une réactivité croisée importante au niveau de leurs
protéines de coré, mais les glycoprotéines d’enveloppes sont moins cross- réactives.
Il est nécessaire, pour des fin de diagnostique, d’utiliser des epitopes issus des protéines d
enveloppe a la fois des deux virus en addition aux protéines majeurs du coré cross-
réactive, afin
de permettre la détection des anticorps spécifiques des deux types de virus a tous les
stades de l infection.
Ce test a été développe pour détecter les Ig M et Ig G dirige spécifiquement contre les
glycoprotéines S d enveloppe et contre les protéines du coré cross-créatif des HIV-1 et
HIV-2. Il peut donc permettre l identification des échantillons de sérum ou de plasma
potentiellement infectieux.
*Principe de la méthode :
Ce test est base sur un principe d’immuno-capture des anticorps. Il utilise des cupules
sensibilisées avec un mélange d’immunoglobulines monoclonales de souris et
ployclonales de lapin capable de fixer spécifiquement les immunoglobulines humaines de
type M et G respectivement. Lorsque des échantillons de sérum ou de plasma sont
incubes dans les cupules, une proportion représentative des Ig G et Ig M totales présente
dans l échantillon et capturée par la phase solide. Les anticorps non fixes sont élimines
par lavage.
La détection spécifique des Acs recherchée est réalisée lors de l étape d incubation du
conjugue, solution d’Ags marquées par l enzyme peroxydase. Les Acs captures non
spécifiques pour l Ag n entraineront pas la fixation du conjugue. Le conjugue non lie est
élimine par lavage. Une solution contenant du TMB et du peroxydase est ajoutée dans
chaque cupule. Les cupules avec du conjugue lie développe une coloration violette qui
vire a l orange quand la réaction est arrêtée par l acide sulfurique.
*Mode opératoire :
-Reconstituer et mélanger le conjugue, puis préparer la solution substrat. N utiliser que le
nombre de barrette nécessaires au test. Eviter de toucher le fond et les bords des cupules.

-Ajouter 50 ul de diluant échantillon dans chaque cupule.

-Ajouter 50 ul d’échantillon ou de contrôles. Il est recommande d utiliser trois cupules de
contrôle négatif deux cupules de contrôle positifs HIV-1 et une cupule de contrôle positif
HIV-2.
-Couvrir les cupules avec le couvercle et incuber a 37° C pendant 30 mn en
atmosphère humide.
-Faire 5 cycles de lavage avec une double aspiration afin d’éliminer tout liquide résiduel
fond des cupules. Ajouter immédiatement 50 ul de conjugue dans chaque cupule.
-Couvrir les cupules avec un couvercle et incuber a 37° C pendant 60 mn en
atmosphère humide.
-Laver la plaque, comme précédemment. Couvrir et incuber a 37° C pendant 30 mn
en atmosphère humide et garder a l abri de toute lumière directe. Une coloration violette
doit se développer dans les cupule contenant des échantillons réactifs.
-Ajouter 50 ul de solution d arret dans chaque cupules ( acide sulfurique ). Dans les 15
mn, lire l absorbance de la plaque a 450 nm en utilisant 690 a 620 nm comme longueur d
onde référence si possible.
*Résultats :
Contrôle négatif : calculer l absorbance moyenne du contrôle négatif. Exclure toute
valeur de contrôle négatif supérieure de 0,15 en dessus de la moyenne.
Valeur seuil : calculer la valeur seuil en ajoutant 0,2 a la moyenne des répliquâtes du
contrôle négatif.

Interprétation des résultats :

- Résultats négatifs : les échantillons donnant une absorbance inferieure a la valeur seuil
seront considérées conne négatifs.
-Résultats positifs : les échantillons donnant une absorbance supérieure ou égale a la
valeur seuil seront considérées comme initialement réactifs et devront être retestes.
Limites de la procédure :
Ce test est uniquement destine a l investigation d’échantillons sériques et plasmatiques,
non dilues, de sujet individualises.
NB :Le SIDA est un syndrome clinique et son diagnostique peut seulement être établi
cliniquement. Un test E. I. A seul ne peut pas établir un diagnostic de SIDA, même si l
investigation conseillée des échantillons réactifs suggère une forte probabilité de
présence d’Acs anti HIV.
Ce test n aura pas une bonne performance sur des échantillons dilues en serum ou plasma
humain.
Un résultat négatif avec un test de détection d’Acs ne peut pas exclure totalement la
possibilité d une infection par le HIV.

SYPHILIS TPHA :
*Principe du Test :
Test d’ hémagglutination indirecte pour la détection des Acs spécifiques de la syphilis
dans le sérum ou le plasma humain.
Le TPHA sert a détecter des Acs spécifiques anti-tréponème pallidum. Des hématies de
poulets stabilises, puis sensibilisées par un lysat de tréponème pallidum, sont agglutinées
en présence d Acs spécifiques. Des hématies témoins, non sensibilisées permettent de
détecter les hétéro-agglutinines.
*Mode Opératoire :
Echantillons :
Sérum non contamine ou hémolyse.
Possibilité de conserver les sérums a frais : ( +2 ° a +8 ° C ).
Matériel nécessaire :
Micro pipette.
Plaque de microfiltration a fond en U.
Procédure du test :
-Le test qualitatif ; chaque test nécessite trois puits.
-Laisser les réactif revenir a température ambiante.
-déposer 190 ul de diluant dans le puits 1.
-déposer 10 ul d’échantillons a tester dans le puits 1. utiliser les deux derniers puits pour
les contrôles positif et négatif.
-Mélanger le contenu du puits 1 et transférer 25 ul dans le puits 2 et 25 ul dans le puit 3.
-S assurer que le réactif antigène et le réactif contrôle soient bien en suspension. Ajouter
75 ul de réactif contrôle au puits 2 et 75 ul de réactif antigène au puits 3.
-Mélanger le contenu de chaque puits en tapotant la plaque.
-Couvrir la plaque et incuber pendant 1 heure a température ambiante. Eviter toute source
de vibration et conserver a l abri de la chaleur.
*Lecture des résultats :
L agglutination avec les hématies sensibilisées simultanée a la non-agglutination des
hématies de contrôle indique la présence d Acs spécifiques de T. Pallidum.
Un bouton homogène et dense au centre de la cupule absence d’Acs de T. Pallidum

Limites de la méthode :
les Acs spécifiques peuvent persister pendant une longue période même après un
traitement réussi de la maladie.
La technique TPHA peut donner des réactions croisées avec d autres formes d infections
a tréponèmes et de réactions faussement positives avec des échantillons de patients
atteins de la mononucléose infectieuse, de la lèpre ou des maladies auto-immunes.