Capítulo 5

Control del crecimiento

microbiano

Dr. Ricardo J. Anselmo

1
2019
 Esterilización
«en Microbiología»

Eliminación o muerte de todos los

microorganismos que contiene un objeto o
sustancia, incluso formas de reproducción y
latencia

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 Algunos conceptos básicos...
 Bactericida: agente que mata bacterias

 Bacteriostático: agente que inhibe el crecimiento bacteriano

 Fungicida: agente que mata hongos

 Fungistático: agente que inhibe el crecimiento fúngico

 Desinfección: agente que mata microorganismos de superficies vivas e

inertes

 Desinfectante: agente que mata microorganismos de superficies

inanimadas tales como mesadas de trabajo

 Antiséptico: agente que mata microorganismos (potencialmente

patógenos) en piel y/o mucosas 3
4
 Totales

Viables
5
Totales

Viables
6
Cinética de muerte de un microorganismo
La muerte de microorganismos como consecuencia de un
tratamiento a altas temperaturas sigue una cinética
exponencial.
Log ufc/ml

tiempo

dN
=-KN
dt
A temperatura constante 7
 VALOR D : Tiempo de reducción decimal
Se define el valor D como el tiempo necesario para que el número de supervivientes
caiga al 10% del valor inicial (o, lo que es lo mismo, para que el logaritmo del número de
supervivientes se reduzca en una unidad)

El tiempo (D) varía para cada temperatura (de ahí el subíndice t) de forma que a
mayores temperaturas el valor de D es menor, es diferente para distintos
microorganismos, distintos entornos y diferentes condiciones fisiológicas 8
 Por ejemplo:

Geobacillus stearothermophilus

D121 = 5 (calor húmedo, vapor a presión)

D160 = 10 (calor seco)

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 Efecto de la temperatura

log ufc/ml
Igual carga microbiana inicial y
microorganismo
100

10

70°C 50°C
1

60°C

tiempo

10
Efecto de la carga microbiana inicial (N°)

log ufc/ml
El mismo microorganismo y
distinta carga microbiana
inicial
100

10

tiempo

11
 ¿Cuál es el microorganismo más
resistente al calor?

log ufc/ml

100

10
B A

1
C

tiempo

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Ej.: Acondicionamiento previo del material
de vidrio. Higiene en la confección de
medios de cultivo e inmediata
esterilización.

13
MÉTODOS EMPLEADOS PARA
ESTERILIZACIÓN

• Físicos

• Químicos

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 Agentes físicos
Método Fuente Tipos
Acción directa Flameado (directo e indirecto)
Calor seco de la llama Incineración
Acción directa por Estufa de calor seco
generadores de calor
Baño de María hirviente
Calor húmedo Acción de agua caliente Calentamiento repetido
(Tyndalización)
Ebullición directa
Acción de vapor de Autoclave
agua
Ionizantes Rayos X

Rayos Gamma
Radiación
Ultravioleta UV 260 nm (ADN/ARN)
UV 280 nm – 230 nm (proteínas)
Filtración Filtros Filtros de diferente composición,
15
 Agentes químicos:
deben ser tóxicos y volátiles

• Óxido de etileno

• Glutaraldehído

• Cloroformo

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Antes de entrar en esterilización en
Microbiología hablaremos de:

• Pasteurización

• Esterilización

(en la industria alimentaria)

17
 Pasteurización

• Batch o discontinua: 30 min a 62,8°C

• Continua: HTST (high temperature short time)

15 seg a 71.6ºC. Ej.: leche, derivados, jugos de fruta

Solo destruye patógenos (Brucella abortus, Louis Pasteur

Mycobacterium tuberculosis, etc.) y reduce flora 1822-1895

de deterioro

No es un proceso de esterilización, sobreviven los

microorganismos termodúricos

18
Esterilización en la industria alimentaria

• UHT (Ultra High Temperature):

140-150°C, pocos seg, proceso continuo

Ej.: leche estéril

• Conservas: En autoclave

– 121°C, 1 atm (alimentos de escasa acidez)

– 115°C, ½ atm (alimentos ácidos o de escasa

acidez en medio acidificado

19
 Calor seco: Flameado

1. Directo 2. Indirecto

Ansa de siembra Espátula de Drigalsky

Boca de tubos, frascos, etc. Varilla de vidrio doblada en «L»
Pinzas
Tijeras
Cucharas
Bisturís, etc.
(Triple inmersión en alcohol de 96° y
flameado)

20
 Estufa de Calor Seco
Usos: Material de vidrio, sustancias no miscibles en agua (inyectables
oleosos, siliconas, vaselina líquida) y polvos

Condiciones: 160 – 180°C durante 120 minutos

Mecanismo de acción: Proceso oxidativo irreversible

Controles de esterilización:
• Físicos: Temperatura
• Químicos:
• Biológicos: esporas de Bacillus subtilis var. niger
D160= 0.3 a 1.8
Tamaño del inóculo:  105 esporas

21
 Estufa de Calor Seco
Ventajas:

─ No es corrosivo para metales e instrumentos

─ Permite la esterilización de sustancias en polvo y no
acuosas, así como, de sustancias viscosas no volátiles

Desventajas:

─ Requiere mayor tiempo de esterilización, respecto al calor

húmedo, debido a la baja penetración del calor

22
 Incineración

Destrucción de desechos biológicos en hospitales, 250ºC

45 minutos ó 180ºC 4 h, ó 650ºC 1 min

23
Calor húmedo: Tyndalización

 60 -100 ºC 30 min, 3 días sucesivos

 Proceso discontinuo con períodos de incubación

intercalados

 Usos: Esta técnica se puede emplear para esterilizar John Tyndall

1820-1893
medios de cultivo que no se pueden calentar a

temperaturas superiores a 100º sin alterar sus

propiedades. El principal inconveniente de esta técnica

es que lleva mucho tiempo. Actualmente tiene muy poco

uso

 Ej.: Vino, cerveza, leche 21

 Calor húmedo (vapor a presión)
Usos: medios de cultivo termoestables y soluciones que no formen
emulsiones con el agua y no se desnaturalicen a temperaturas mayores de
100°C

Condiciones :
• 121ºC durante 15-20 minutos, con cargas iniciales bajas
• 121ºC durante 30 minutos, con cargas iniciales altas

Mecanismo de acción: desnaturalización y coagulación de proteínas

Controles de esterilización:
• Físicos: Temperatura y/o presión
• Químicos: Ácido benzoico
• Biológicos: esporas de Geobacillus stearotermophilus
D121= 5
Tamaño del inóculo: >106 esporas

25
Autoclave Chamberland
• La esterilización comienza cuando se ha alcanzado la temperatura óptima
en el interior del aparato (autoclave o estufa)
• Según el contenido, un autoclave puede requerir tiempos más largos para
alcanzar la temperatura de esterilización.

26
 Calor húmedo (vapor a presión)
Ventajas:
• Rápido calentamiento y penetración
• Destrucción de formas vegetativas y esporas en corto
tiempo
• No deja residuos tóxicos
• Hay un bajo deterioro del material expuesto
• Es posible por este método esterilizar materiales que no
resisten el calor seco (material plástico)

Desventajas:
• No permite esterilizar soluciones que formen emulsiones con
el agua
• Es corrosivo sobre ciertos instrumentos metálicos
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 Resistencia a calor

RESISTENCIA
 Priones +
 Endosporas bacterianas
 Mycobacteria
 Virus sin envoltura lipídica
 Hongos
_
 Bacterias
 Virus con envoltura lipídica

28
 Esterilización por radiaciones

Baja energía

Actividad
microbicida
Alta energía

Radiación con longitudes de onda entre 100 y 400 nm. Las de mayor
actividad microbicida son las comprendidas entre 260-270 nm. Son
absorbidas por lo ácidos nucleicos y aminoácidos aromáticos
29
 Dos tipos:

Radiaciones ionizantes

Radiaciones no ionizantes

30
 Radiaciones Ionizantes
• Tienen mayor energía que las ultravioleta y por tanto mayor
poder de penetración. Producen iones y radicales libres que
alteran las bases de los ácidos nucléicos, proteínas y otros
componentes celulares

• Se utilizan para la esterilización de materiales

termosensibles como jeringas, sondas, suturas,
guantes, etc.

• No se utilizan para medios de cultivo o soluciones porque

producen alteraciones de los componentes

• Solo se utiliza a escala industrial por el alto costo

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 Radiaciones no Ionizantes
Características:
• Baja energía, sin poder ionizante
• Sin poder penetrante
• Máxima eficiencia biocida a 260nm

Mecanismos de acción:
• Sitio blanco ADN NO SE UTILIZAN
• Formación de dímeros de timina PARA
ESTERILIZAR
Usos: SINO PARA:
• Desinfección de superficies
• Desinfección de aire y agua

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 ESTERILIZACIÓN POR RADIACIÓN UV

Luz ultravioleta
Afectan a los ácidos nucleicos provocando errores en la duplicación y
pérdida de viabilidad. Tienen bajo poder de penetración: solo se utilizan
para la esterilización de superficies, (quirófanos, salas de envasado de
medicamentos). Producen daños en ojos y piel.

33
Dímeros de timina
 Esterilización por filtración
La esterilización por filtración se logra por el paso de un
líquido o un gas a través de un material capaz de retener
los microorganismos presentes (tanto vivos como muertos
es decir no mata sino los elimina).

La esterilización por filtración se emplea para materiales

termolábiles o termosensibles (sensibles al calor),
tales como ciertos medios de cultivo, azúcares, soluciones
de antibióticos y otros medicamentos, etc.

34
Esterilización
por filtración
Embudo

Filtro de membrana de 0.2 µm

Plataforma de vidrio

Base
Tapón de goma

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Esterilización Medio no estéril
por filtración

Grampa de sujeción

Vacío

Medio
Libre de microorganismos vivos y estéril
muertos
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 FILTRACIÓN DE AIRE

•Filtros HEPA (High Efficiency Particulate Air)

•Remoción de hasta el 99.97% de partículas mayores de 0.3 micrones de
diámetro
•Se usan en cabinas o habitaciones de flujo laminar

CONTROL
•Retención Mínima de un 99.97% de partículas generadas mediante ensayo
DOP(di-octil-nftalato) en caliente con un diámetro de 0.3 micrones.

SE USAN PARA Lograr ambientes con número de partículas controlado:

FLUJOS LAMINARES
ÁREAS DE TRABAJO

37
Cabinas de Flujo Laminar Vertical

Protege la
muestra, el
operador y el
medio ambiente

38
Esterilización mediante agentes químicos:

Método Usos

Óxido de etileno Material termosensible (descartable,

plástico), equipos electrónicos, bombas
cardiorrespiratorias, etc.
Glutaraldehído Ídem

Cloroformo Soluciones acuosas de sustancias

termolábiles inmiscibles en cloroformo

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 Oxido de Etileno
• Es un agente alquilante que se une a compuestos con
hidrógenos lábiles como los que tienen grupos carboxilos,
amino, sulfhidrilos, hidroxilos, etc.
• Es utilizado en la esterilización gaseosa, generalmente en la
industria farmacéutica. Sirve para esterilizar material
termosensible como el descartable y plástico, equipos
electrónicos, bombas cardiorrespiratorias, etc.
• Es cancerígeno y explosivo.

Punto de ebullición: 10,5°C

40
 Glutaraldehído:
• Es un agente alquilante que actúa sobre proteínas, lo que provoca
modificación irreversible de enzimas e inhibición de la actividad enzimática

• Es utilizado en la esterilización gaseosa, generalmente en la industria

farmacéutica. Sirve para esterilizar material termosensible como el
descartable y plástico, equipos electrónicos, bombas cardiorrespiratorias,
etc.

• Es un esterilizante efectivo en frío

• Destruye células vegetativas y esporas

Punto de ebullición: 101°C

41
 Cloroformo
• Disuelve los lípidos de las paredes celulares
• Es utilizado para esterilizar soluciones acuosas de sustancias
termolábiles inmiscibles en cloroformo
• Es un esterilizante efectivo en frío
• Destruye sólo células vegetativas no esporas

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 Condiciones que debe cumplir la
desinfección:
1. eliminar el mayor número de microorganismos
(al menos todos los patógenos)
2. ser económico
3. no debe ser corrosivo, tóxico o irritante para
los tejidos
4. al menos ser soluble en agua
 Desinfección
• Alcoholes:
– Etanol (50-70%) Desnaturaliza proteínas y solubiliza fosfolípidos de la
membrana. No destruye esporas y tiene una acción germicida lenta

– Isopropanol (50-70%) Desnaturaliza proteínas. Se utiliza para

desinfección en cabinas de flujo laminar

• Formaldehído (8%) Reacciona con grupos –NH2, -SH y –COOH. Destruye

endosporas. Tiene la desventaja de ser muy irritante y perder actividad en
ambientes refrigerados

• Cloro (Cl2) gas Forma ácido hipocloroso (HClO), un fuerte agente

oxidante. Desinfección en general (200 ppm)y en particular para agua
potable (0.2 ppm)

• Detergentes(ej. Amonios cuaternarios) Ruptura de membranas

celulares. Desinfectantes y antisépticos de piel.
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 Control de Esterilización

• Controles del proceso:

Mediante Indicadores:

Físicos
Químicos
Biológicos

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 Control de Esterilidad

• Post-proceso:

– De material de vidrio

– De medios de cultivo

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 Controles del proceso

Indicador físico Ej: Temperatura, presión

Indicador químico Cambio de color o fusión

del ácido benzoico

Indicador biológico Microorganismo resistente

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