Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
MELISSA VANEGAS
MELISSA VANEGAS
“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus
trabajos de tesis. Solo velará por que no se publique nada contrario al dogma y a la moral
católica y por que las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien
se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”.
AISLAMIENTO DE LEVADURAS CAPACES DE PRODUCIR ALCOHOL A PARTIR DE
MACROFITAS ACUATICAS EXTRAIDAS MECANICAMENTE DE LA LAGUNA DE
FÚQUENE
MELISSA VANEGAS
MONICA ZAPATA PINEDA
APROBADO
MELISSA VANEGAS
MONICA ZAPATA PINEDA
APROBADO
A nuestra directora Patricia Martínez y codirector Jorge Robles por la colaboración durante la
realización de esta investigación.
Y a todas las personas que de una u otra forma hicieron parte de este proyecto y lograron su
realización.
TABLA DE CONTENIDO
Pág.
1. Introducción 1
2. Justificación y planteamiento del problema 2
3. Marco teórico 3
3.1. Laguna de Fúquene 3
3.2. Problema ambiental 3
3.3. Macrófitas contaminantes de la Laguna de Fúquene 3
3.3.1 Elodea (Egeria Densa) 3
3.3.2 Buchón de Agua (Eichhornia Crassipes) 4
3.3.3 Alternativas de disposición de las macrófitas 4
3.4 .Bioetanol 5
2.4.1. Producción de bioetanol 5
3.5. Hidrólisis 5
3.5.1. Hidrólisis química 6
3.5.1.1. Hidrólisis con ácidos concentrados 6
3.5.1.2. Hidrolisis con ácidos diluidos 6
3.6.1.3. Hidrólisis enzimática 6
3.6. Fermentación de los azúcares 7
3.7. Cuantificación de etanol 7
4. Objetivos 8
4.1. Objetivo general 8
4.2. Objetivos específicos 8
5. Metodología 9
5.1. Muestreo 9
5.2 Aislamiento de levaduras 9
5.3 Hidrólisis 9
5.3.1 Hidrólisis acida con ácido sulfúrico o peracético 9
5.3.2 Hidrólisis mixta 9
5.3.3 Hidrólisis alcalina con hidróxido de sodio 10
5.3.4. Hidrólisis biológica con Pleurotus ostreatus 10
5.3.5. Azucares reductores 10
5.3.6. Análisis de datos 10
5.4. Determinación de la producción de etanol 10
5.4.1. Prueba de yodoformo 10
5.4.2. Determinación semi-cuantitativa de etanol por la 11
técnica del dicromato de potasio
5.4.3. Cromatografía de gases acoplada a masas 11
5.5. Caracterización taxonómica preliminar de las levaduras 11
6. Resultados y discusión 12
6.1. Muestreo y aislamiento 12
6.2. Hidrólisis 12
6.2.1. Hidrólisis acida con ácido sulfúrico o peracético 12
6.2.2. Hidrólisis mixta 14
6.2.3. Hidrólisis alcalina con hidróxido de sodio 14
6.2.4. Hidrólisis biológica con Pleurotus ostreatus 16
6.3. Determinación de la producción de etanol 19
6.3.1. Prueba de yodoformo 19
6.3.2. Determinación semi-cuantitativa de la producción
de etanol por la técnica del dicromato de potasio 19
6.3.3. Cromatografía de gases acoplada a masas 22
6.4. Caracterización taxonómica preliminar de las levaduras 24
7. Conclusiones 26
8. Recomendaciones 27
9. Bibliografía 28
10. Anexos 37
LISTA DE FIGURAS
Pág.
Pág.
Pág.
Cuarenta y nueve levaduras fueron aisladas y se identificaron las 13 cepas que presentaron un
sobrenadante amarillo laminado característico de etanol en la prueba de yodoformo. Estas
cepas se acercaron bioquímicamente a los géneros Candida sp, Brettanomyces sp͘ y
Hansenula sp. Adicionalmente, se realizaron 3 pre-tratamientos hidrolíticos (ácido, alcalino y
biológico) a los sustratos vegetales estudiados (determinando la cantidad de azucares
reductores por el método de DNS), encontrando una mayor cantidad de azucares liberados en
g/L con el tratamiento biológico (Pleurotus ostreatus) a un nivel de significancia de 0.01. Lo
anterior permitió escoger este método hidrolíticos para adecuar los sustratos para la producción
de etanol
A partir de esto se realizó un diseño al azar inoculando las mejores levaduras productoras de
etanol (escogidas mediante una prueba cualitativa de yodoformo) en los medios específicos de
buchón y elodea con el pretratamiento biológico y sin pretratamiento. La concentración de
etanol fue determinada a las 24 y 48 horas de cultivo por la prueba del dicromato de potasio; al
igual que las concentraciones de azucares y la cantidad de células/ml. Al final de la
fermentación se determinó que las levaduras que mayores concentraciones de etanol
produjeron con este método fueron C. albicans en medio hidrolizado de buchón (54.97 g/L) y C.
lusitaniae en medio hidrolizado de elodea (37.80 g/LͿ. A partir de esto se realizó una
cromatografía de gases acoplada a espectrómetro de masas de estas levaduras, donde se
comprobó la producción de etanol en los medios hidrolizados y no hidrolizados con un tiempo
de retención del catión molecular de 1.48 minutos.
1. INTRODUCCION
La laguna de Fúquene es una importante fuente hídrica para los departamentos de Boyacá y
Cundinamarca; lamentablemente está desapareciendo, debido a la eutroficación producida por
la contaminación proveniente de desechos agrícolas, ganaderos y de aguas residuales. Estos
desechos contienen alta concentración de nitrógeno (N), fósforo (P) y materia orgánica,
promoviendo el crecimiento de plantas acuáticas como buchón de agua y elodea brasilera, que
están deteriorando conjuntamente con otros factores el ecosistema y reduciendo el espejo de
agua.
A partir de este problema, los pescadores de la Asociación “Los Fundadores” con el apoyo de
La Fundación Humedales, el Instituto de Desarrollo Rural -ICONDER- y la Corporación Andina
de Fomento –CAF-,empezaron a utilizar como materia prima los desechos de las malezas
acuáticas en la producción de abono orgánico. Pero, a pesar de ser efectivo, controla solo
parcialmente la problemática de la disposición final de estos desechos, ya que la cantidad de
buchón de agua destinada para la producción de bioabono es solo una pequeña proporción
comparado con la cantidad extraída mensualmente de material vegetal.
ϭ
La laguna de Fúquene constituye una fuente de sustento y seguridad alimentaria para más de
200 familias, muchas de ellas dedicadas a la pesca artesanal; que junto con la agricultura se
constituyen en dos campos de donde proceden los ingresos de las mismas.
Desafortunadamente en la laguna por causa de la contaminación se acumulan grandes
cantidades de nutrientes que permiten el crecimiento de maleza acuática como buchón de
agua y elodea. Estas plantas generan eutroficación en la laguna y crea no solo un gran impacto
medioambiental, sino también un problema socio económico ya que muchas familias de
pescadores dependen de ella (Fundación Humedales, 2001; Cruz, 2004; Estrada et al., 2004)
Estudios recientes han demostrado que el buchón de agua puede ser una opción viable como
sustrato para la producción de biocombustible y aunque hasta el momento no se han
encontrado estudios reportados para la macrófita elodea, dado el rápido crecimiento y fácil
obtención de la laguna, podría ser una alternativa económicamente sustentable y amigable con
el medio. Lo anterior debido a que no solo se disminuye la biomasa extraída de la laguna, sino
también se contribuye a control de las emisiones de gases tóxicos a la atmosfera por parte de
los combustibles provenientes del petróleo (García, et al., 2006; Isarankura-Na-Ayudhya, et al
2007).
Ϯ
3. MARCO TEORICO
Esta importante red hídrica soporta una población de más de 200 mil habitantes que viven de la
ganadería, la agricultura, la minería, el desarrollo agroindustrial y la pesca; siendo esta ultima
una fuente de seguridad alimentaria (Instituto Colombiano para el Desarrollo Rural-INCODER-,
2009). Otro importante servicio ambiental radica en que el complejo de humedales es fuente de
agua para el consumo de más de 70,000 personas y como proveedor para el sistema de riego,
sobre el cual se basa una de las industrias lecheras más prósperas del país (Maya y Castillo,
2005; Fundación Humedales, 2008).
Ademas lo anterior, la explotación minera de carbón que saca más de 763.000 toneladas del
mineral al año y el desarrollo urbano, le descarga a la laguna las aguas residuales domésticas
e industriales de los habitantes de 14 municipios (CAR, 2000 y 2009).
El alto deterioro de este cuerpo de agua esta representado en los excesivos niveles de fosfatos
y nitratos agregados por el sector ganadero y agricultor, así como la proliferación de plantas
acuáticas como buchón de agua y la elodea, que han acelerado procesos de eutroficación y
por consiguiente de desecación de la laguna. El espejo de agua se ha reducido
considerablemente haciendo imposible la navegación (Fundación Humedales, 2008).
Esta planta afecta el movimiento del agua, su calidad y el uso para la pesca, navegación y
recreación. (Dirección General de Aguas-DGA- et al., 2005). Al igual que otros hidrófitos de
crecimiento laminar-tapizante, la explosión demográfica de esta especie produce desajustes
ecosistemáticos, como condiciones de anoxia, eutroficación, alteración del ciclo de los
nutrientes, reducción de la penetración lumínica y desplazamiento de especies nativas (Dillon
ϯ
En nuestro país se encuentran varios cuerpos de agua con invasión de macrófitas acuáticas
en Cundinamarca y Boyacá como la laguna de Fúquene, Tota. Sochagota y Palagua (Ramsar,
2008).
El Buchón de agua es una planta de crecimiento rápido que flota sobre la superficie del agua
ofreciendo un excelente refugio para los peces y protegiéndolos del sol excesivo y las heladas;
sus extensas raíces cuelgan por debajo, donde pueden alcanzar la altura de un metro o más;
en estas condiciones su crecimiento se caracteriza por formar masas compactas que son
arrastradas por el viento (Aweke, 1993). Estas grandes masas pueden ocasionar problemas en
los cuerpos de agua como: Reducción de la biodiversidad, obstrucción de los ríos y
alcantarillado interfiriendo físicamente con la navegación, el flujo del agua y las actividades de
pesca. Estos bloques compactos toman la luz del sol, impidiendo el desarrollo del fitoplancton,
que son básicos en las cadenas alimenticias acuáticas, disminuyen el oxigeno disuelto
producido normalmente por las plantas acuáticas sumergidas. Así como alteración en la
química del agua (Ozimek et al.1993; Schouben, 2005).
Son consideradas entre las 100 especies más invasoras del mundo por la Unión Internacional
para la Conservación de la Naturaleza (UICN) ya que pueden obstruir en poco tiempo una vía
fluvial o lacustre (Sáenz, 2003). Tiene la capacidad de absorber nutrientes (N, P, Ca, K, entre
otros) de los cuerpos de agua, los cuales normalmente se pierden. Como consecuencia de su
proliferación en ríos y lagos importantes, están causando problemas en canales de riego
agrícolas y afecciones a los ecosistemas ribereños; ya que cubre como una manta toda la
superficie del río, por su fácil reproducción vegetativa y sexual (Gunnarsson y Petersen, 2007).
Además es una especie sin predadores, ni competidores en muchos sitios (Schouben, 2005;
Valderrama, 2007)
Se ha buscado otras disposiciones finales para el buchón de agua dentro de los cuales esta la
utilización de estos residuos como materia prima para la industria papelera, por el manejo
ecológico de los procesos bajo el esquema de producción más limpia compatible con los
ecosistemas. Además está la utilización de este como filtro biológico para la remoción de
contaminantes orgánicos e inorgánicos y otras sustancias tóxicas, y la producción de
biocombustible como el etanol (Gajalakshmi et al., 2001; Isarankura-Na-Ayudhya, 2007; Lara et
al., 2007).
ϰ
3.4. Bioetanol
El alcohol etílico o etanol es un producto químico obtenido a partir de la fermentación de los
azúcares que se encuentran en los productos vegetales, tales como cereales, remolacha, caña
de azúcar, sorgo o biomasa. Cuando se produce por la fermentación de los azúcares
contenidos en la materia orgánica de las plantas, se denomina bioetanol o etanol de biomasa
(Hernández, 2001; National Renewable Energy Laboratory-NREL-, 2007 y Corporación
Colombiana Agropecuaria -CORPOICA, 2009). Para la fabricación de este, se puede utilizar
una gran cantidad de materias primas como almidón de maíz, cereales, remolacha o residuos
forestales (Gray et al., 2006). El buchón de agua se ha considerado como posible substrato
para la producción de etanol ya que tienen una ventaja por su rápido crecimiento y obtención a
bajo costo (García et al., 2006; Masami et al., 2008; Mishima et al., 2008).
Los residuos vegetales contienen una mezcla compleja de carbohidratos como celulosa,
hemicelulosa y lignina que son llevados hasta etanol por acción enzimática (Nigam, 2002; Bon
et al, 2007; Masami et al., 2008). Las celulosas no pueden ser fermentadas directamente, es
necesario degradarlas a azucares más sencillos (García et al., 2006; Isarankura-Na-Ayudhya et
al; 2007). Para esto se utilizan pre tratamientos de hidrólisis con ácidos concentrados, diluidos
y la hidrólisis enzimática (Miliarium Aureum, 2004; Kovacs, 2009).
Los materiales para producir etanol que se encuentran disponibles en gran cantidad y bajo
costo son los lignocelulósicos, su empleo podría reducir costes de producción (Angenent,
2007; National Renewable Energy Laboratory-NREL-, 2007). Una fuente lignocelulolìtica es el
buchón de agua, considerada maleza acuática, que puede ser empleada en la producción de
biocombustible, ya que puede proporcionar los azucares necesarios para la bioconversión a
etanol (Abraham y Kurup, 1996; Nigam, 2007; Misami et al., 2008).
3.5. Hidrólisis
La biomasa lignocelulósica presenta una estructura compleja compuesta de tres fracciones
(celulosa, hemicelulosa y lignina) que deben ser procesadas. La fracción mayoritaria de esta
biomasa es la celulosa cristalina, que debido a su estructura química se dificulta su hidrólisis y
conversión a azúcares fermentables (Reese, 1955; Angenent, 2007; Kovacs, 2009). Por el
contrario la hemicelulosa es fácilmente hidrolizable, pero su carbohidrato principal, la xilosa, es
ϱ
difícil de fermentar a alcohol. Por último la lignina, no puede convertirse en etanol, porque no es
un carbohidrato, sino un polímero rígido aromático.
Mediante un proceso químico (hidrólisis) que divide la celulosa y la hemicelulosa por acción de
la molécula de agua en medio ácido, en moléculas más pequeñas, se logra una solución
azucarada. La hidrólisis permite también eliminar productos de la descomposición que puede
tener efectos desfavorables durante la fermentación como el furfural e hidroximetilfurfural (Bon
y Ferrara 1996; Miliarium Aureum, 2004; Campo, 2006; García, et al., 2006).
La mayor ventaja de los procesos que utilizan el ácido diluido es su rápida tasa de reacción,
que facilita la continua transformación. Su mayor desventaja es su bajo rendimiento en azúcar.
Para procesos rápidos y continuos, a fin de permitir la penetración del ácido, las materias
primas deberán reducirse en tamaño, de manera que la dimensión máxima de las partículas
está en el rango de unos pocos milímetros (Badger, 2002).
Las celulasas son producidas por una variedad de bacterias y hongos aeróbicos o anaeróbicos,
mesófilos o termófilos. Sin embargo, sólo algunos de ellos producen enzima celulasa
extracelular capaz de hidrolizar la celulosa (Chacón y Waliszewski, 2005).
A partir de los hongos aeróbicos se han obtenido los complejos celulolíticos utilizados en la
mayoría de los estudios (Eriksson y Wood 1985), debido a que son capaces de degradar la
celulosa, la hemicelulosa y la lignina por un complejo de enzimas hidrolíticas y oxidativas (Gosh
y Gosh, 1992). Entre los otros microorganismos productores del complejo enzimático, los
ϲ
termofílicos son de interés por su capacidad para producir enzimas celulolíticas termoestables,
las cuales son en general estables bajo condiciones severas, incluso en niveles de pH
altamente ácidos o alcalinos así como temperaturas de hasta 90 °C (Lamed y Bayer 1988;
Nigam, 2002).
La hidrólisis enzimática es un proceso que presenta ventajas frente a la hidrólisis química,
como bajos costos, mayor rendimiento y la no utilización de agentes químicos (García et al.,
2006; Mishima et al., 2006; Bon et al., 2007;). Además la producción de subproductos puede
ser controlada y las necesidades de energía son relativamente bajas (Badger, 2002; Bell y
Attfield, 2007).
ϳ
4. OBJETIVOS
ϴ
5. METODOLOGIA
5.1. Muestreo
Se escogieron 5 puntos dentro de la extensión de la laguna de Fúquene y se tomaron 3
muestras de agua en cada uno, para un total de 15 muestras. En cada punto se midieron las
características fisicoquímicas con sonda multiparámetro, en cuanto a temperatura, pH,
conductividad y sólidos disueltos; al igual se midieron parámetros como la profundidad, olor y
color. Los puntos fueron georeferenciados con un sistema de Global Position System (GPS),
marca GARMIN NUVI 200w suministrado por la Fundación Humedales y a la Asociación de
pescadores de Fúquene “Los Fundadores”.
En dos de los sitios muestreados, además se recolectaron muestras por triplicado de las
plantas acuáticas buchón y elodea y adicionalmente se tomaron muestras de suelo y compost
a un Km en inmediaciones a la laguna de Fuquene del embarcadero en la vereda Guatancuy
del municipio de Fúquene.
5.3. Hidrólisis
Este procedimiento se realizo como pretratamiento de las macrófitas Jacinto de agua y Elodea
brasilera para liberar los azucares contenidos en la pared celular de buchón de agua y elodea
mediante los tipos de hidrolisis acida, alcalina y biológica.
El otro método de hidrólisis acida se llevó a cabo hirviendo 10 g del buchón o la elodea lavados
y cortados con 100mL de ácido peracético a 100ºC durante 30 minutos. Posteriormente se
realizaron lavados con agua destilada hasta que el agua estuviera neutra y el buchón se llevo a
80º C durante toda la noche (Abraham y Kurup, 1996., Masami et al, 2007).
ϵ
Se preparó un medio liquido con extracto de malta, aserrín, buchón o elodea, y se distribuyo
un volumen de 45mL en frascos de vidrio, los cuales fueron inoculados con 0.9g, 2.7g y 4.5g
del hongo Pleurotus ostreatus. Este procedimiento se realizó por triplicado para cada
tratamiento con distribución completamente al azar y la incubación se hizo a temperatura
ambiente.
ϭϬ
ϭϭ
6. RESULTADOS Y DISCUSION
6.2 Hidrólisis
6.2.1. Hidrólisis acida con ácido sulfúrico o peracético
Los resultados obtenidos en la hidrólisis con ácido sulfúrico mostraron diferencias en la
cantidad de azucares reductores liberados de las dos macrófitas (Figura 1 y 2). El análisis de
varianza con arreglo factorial encontró diferencias altamente significativas entre los
tratamientos utilizando como sustrato buchón (Anexo 6). La suspensión de buchón con una
concentración de ácido sulfúrico del 0.5%, en proporción 1:1 y sesenta minutos de
esterilización (0.669g/L), mostro diferencias con los otros tratamientos evaluados, siendo el
mejor resultado para la prueba de rango múltiple de Duncan (Anexo 6); mientras que, para
elodea se encontró que el mejor tratamiento fue en la suspensión, con una concentración de
ácido del 1%, en proporción 1:1 y sesenta minutos de esterilización (1,081g/L), mostrando
diferencias altamente significativas con los otros tratamientos (Anexo 6).
ϭϮ
Figura 2. Concentación de azúcares reductores en la hidrólisis con diferentes mezclas de ácido
sulfurico y tratamientos de elodea (suspension y filtrada) esterilizadas a 30 y 60 minutos.
En los resultado para buchón, los picos más altos de azúcares se obtuvieron en las
proporciones de 1:1 y 1:19 en la concentración de 0.5% de ácido con sesenta minutos de
esterilización; como también, en la proporción 1:1 con una concentración de 1% en sesenta
ϭϯ
Los tratamientos con ácido sulfúrico en Concentraciones generalmente por debajo del 4% en
peso, han sido de mayor interés en los estudios al ser económicos y eficaces (Breijo y Yufera,
1989). Sin embargo se ha demostrado que los materiales que han sido sometidos a la hidrólisis
ácida pueden ser más difíciles de fermentar, por la presencia de sustancias tóxicas que puede
inhibir a las células y afectar a la tasa de crecimiento específico de células y rendimiento de
masa por ATP (Palmqvist, 2000; Mussatto et al., 2004; Galbe y Zacchi, 2007).
Para muchos autores la hidrólisis acida presenta bajos rendimientos y una elevado formación
de subproductos tóxicos (furfural y hidroximetilfurfural) con un alto consumo de energía; por
eso investigadores como Mussatto et al., (2006) recomiendan la mezcla de hidrólisis ácida y
alcalina para mejora los resultados que pueden obtenerse solamente usando ácidos. También
otros investigadores como Lazaro y Arauzo (1994) recomiendan la hidrólisis enzimática que
usa menos energía y da productos puros con rendimientos cuantitativos.
ϭϰ
y comparada con la hidrólisis con ácido sulfúrico es inferior en las dos macrófitas (Anexo 6).
Las Concentraciones de azúcares reductores deberían haber sido mayores que en los
tratamientos con ácido sulfúrico; ya que la adición de sustancias alcalinas se usan como una
forma eficaz de acondicionamiento para reducir la toxicidad de los hidrolizados generados a
partir de pre-tratamiento de la biomasa lignicelulolitica para la producción de etanol (Ranatunga
et al., 2000; Horváth et al., 2005). Sin embargo, en este estudio la liberación de azúcares
reductores fue menor a otras hidrólisis; pero hay que tener en cuenta que el ajuste de pH con
hidróxido de calcio si no se hace en un tiempo corto hay perdida del 10 % de la glucosa (Kumar
et al.,2009).
Figura 3.Concentración de azúcares reductores obtenidos en la hidrólisis alcalina con hidróxido de
sodio al 5% en buchón con diferentes mezclas de sustrato y esterilizadas 30 y 60 minutos.
ϭϱ
Figura 4. Concentración de azúcares reductores obtenidos en la hidrólisis alcalina con hidróxido
de sodio al 5% en elodea con diferentes mezclas de sustrato y esterilizadas 30 y 60 minutos.
Comparando los azúcares obtenidos en este tratamiento con respecto a la mejor concentración
obtenida en la hidrólisis con ácido sulfúrico, son mucho menores; debido posiblemente, a que
la hidrólisis alcalina provoca un hinchamiento de la celulosa que no necesariamente conlleva a
una hidrólisis, ni modifica su composición química (Fuentes et al., 2008). La concentración en
los procesos industriales en los que se utiliza el hidróxido de sodio está entre el 1 y el 5% como
la utilizada en este estudio, e implica un aumento en volumen de 30 a 60% respectivamente de
la celulosa, sin llegar a hidrolizarla (Fuentes et al., 2008; Núñez, 2008), razón por la cual estos
resultados no mostraron un incremento significativo en la concentración de azúcares
reductores.
En los resultados obtenidos con NaOH al 5% con los del 10% se observa en buchón una
concentración de 0.12g/L de azúcares reductores que es menor que la encontrada al 5%, y en
elodea se obtuvo la misma cantidad de azúcares 0.09 g/L en las dos Concentraciones;
demostrándose así, que Concentraciones un poco mayores de hidróxido de sodio no ejerce
resultados significativos en los rendimientos de azúcares reductores.
ϭϲ
ϭϳ
Después de los diez días de incubación se observó la disminución de los azúcares reductores
en las dos macrófitas desde el día once hasta el trece, día en el cual se realizó la última lectura
de azúcares reductores debido a su tendencia a disminuir (Anexo 8). La reducción de la
actividad enzimática podría atribuirse a la acumulación de subproductos que la inhiben; los
cuales son producidos durante el metabolismo del hongo, como resultado de la hidrólisis de los
diferentes componentes de los ácidos orgánicos esterificados de la hemicelulosa, y de los
derivados fenólicos solubilizados de la lignina (Palmqvist, 2000; Rodríguez et al., 2003;
Sánchez y Carlos, 2005).
Al comparar los azúcares obtenidos con las demás hidrólisis realizadas se observo como la
actividad enzimática es mucho más eficiente que cualquier sustancia química utilizada. Al
comparar estadísticamente los mejores tratamientos de cada tipo de hidrólisis, el análisis de
varianza muestra diferencias significativas a un nivel de 0.01 entre tratamientos y de acuerdo
con la prueba de Duncan, los tratamientos con el hongo P. ostreatus a una concentración del
10 % a los 10 y 7 días de incubación fueron los de mayor liberación de azúcares (Tabla 2). En
elodea la mayor cantidad de azúcares se presentó con una concentración del hongo de 10% a
los 10 y 11 días de incubación (Tabla 2).
Tabla 1. Comparación estadística de los mejores tratamientos de hidrólisis acida, alcalina con
NaOH 5% con las otras hidrólisis químicas y con la biológica en buchón.
Tratamiento Azúcares
reductores (g/L)
Suspensión buchón -0.5 % Ácido Sulfúrico 1:1- Esterilización 60min 0,67 b
Ácido Peracético -Neutralización lavados 0,083 c
NaOH 5 % 1:1- Esterilización 30 minutos 0,16 c
NaOH 10 % - Neutralización lavados 0,12 c
H2SO4+ Hidróxido de calcio +sulfito sodio -Neutralización Ácido 0,090 c
Hongo concentración 10 % a los 10 días de incubación 4,375 a
Hongo concentración 10 % a los 7 días de incubación 4,256 a
Tabla 2. Comparación estadística de los mejores tratamientos de hidrólisis acida, alcalina con
NaOH 5% con las otras hidrólisis químicas y con la biológica en elodea.
Tratamiento Azúcares
reductores (g/L)
Suspensión elodea -1 % Ácido Sulfúrico 1:1- Esterilización 60min 1,08 d
Ácido Peracético -Neutralización lavados 0,08 e
NaOH 5 % 1:1- Esterilización 30 minutos 0,09 e
NaOH 10 %-Neutralización lavados 0,09 e
H2SO4-Hidroxido de calcio +sulfito sodio - Neutralización Ácido 0,09 e
Hongo concentración 10 % a los 10 días de incubación 3,48 a
Hongo concentración 10 % a los 11dias de incubación 3,48 ab
Hongo concentración 10 % a los 7dias de incubación 3,37 bc
Hongo concentración 3 % a los 10dias de incubación 3,27 c
Hongo concentración 3 % a los 11dias de incubación 3,21 c
ϭϴ
Una de las ventajas del uso de la hidrólisis biológica como tratamiento del material
lignocelulolitico, es que las enzimas pueden actuar sobre los compuestos tóxicos presentes en
los hidrolizados y cambiar su composición. Se ha encontrado que el uso de la lacasa y de las
enzimas de la peroxidasa de los hongos de podredumbre blanca, ha promovido el aumento en
el consumo de glucosa y la productividad de etanol, debido a la acción de estas en ácidos y
compuestos fenólicos (Mussatto y Roberto, 2004). La selectividad de las enzimas no permite la
conversión a otro tipo de compuestos diferentes a azúcares evitando así la formación de
compuestos tóxicos para los microorganismos (Mejía et al., 2007). Lo que se ve reflejado en los
resultados, con un rendimiento mayor de azúcares reductores en la hidrólisis biológica en
comparación con los otros tratamientos probados (Tabla 1 y 2). Otros autores han encontrado
altos rendimientos con este tipo de hidrólisis como Bon, y Ferrara (1996), Nigam (2002),
Campo et al., (2006), Galbey y Zacchi (2007), Isarankura-Na-Ayudhya et al., (2007) y Kumar et
al., (2009).
Algunos autores como Hatakka (1984), Lazaro y Arauzo (1994), utilizaron este tipo de hongo
para hidrolizar materiales lignocelulosicos, ya que se alcanzan rendimientos superiores a los de
cualquier hidrólisis; encontrando en este estudio resultados similares, donde la cantidad de
azúcar hidrolizada a partir de la biomasa vegetal de las plantas acuáticas, buchón y elodea, fue
mayor al de los tratamientos químicos.
La prueba del yodoformo (CHI3) se basa en la formación de este compuesto que se observa
como un precipitado de color amarillo a partir de una reacción de halogenación en medio
básico (Griffin, 1981.; Primo, 1996; Morrison et al, 1998). Al realizar la prueba a los tubos con
diferentes proporciones de etanol en medio estéril, se presentó un precipitado color amarillo
laminado (Anexo 9).
Algunos de los otros compuestos utilizados como controles presentaban color y apariencia
similar a los tubos con las diferentes proporciones de etanol, como el alcohol isopropílico y el
acetaldehído (Anexo 9). En literatura se ha reportado que el acetaldehído es el único aldehído
sencillo que da positivo para la prueba de yodoformo y alcohol isopropílico es un alcohol
secundario que puede oxidarse formando una cetona, la cual reacciona positivamente
formando el haloformo amarillo llamado yodoformo (Grifiin, 1981., Primo, 1996, Morrison et al,
1998) Sin embargo se visualiza (Anexo 9) que los colores de los tubos de estos compuestos
suelen ser más oscuros que el etanol, al finalizar la reacción.
Por otro lado, la cetona presenta dos fases en el tubo de proporción 1:1, se alcanza a observar
un amarillo en el fondo del tubo (Anexo 9); el cual posiblemente sea producto de la formación
de yodoformo, ya que se ha reportado como un compuesto yodoformo positivo (Grifiin, 1981,
Morrison et al, 1998). En el anexo 9 se observan las diferencias entre los precipitados formados
por los compuestos empleados como controles en esta prueba.
ϭϵ
Figura 7. Concentración de etanol producida por las levaduras escogidas en el diseño in vitro con
buchón durante 48 horas de incubación de forma semi-cualitativa por el ensayo del dicromato
ϮϬ
Figura 8. Concentración de etanol producida por las levaduras escogidas en el diseño in vitro con
elodea durante 48 horas de incubación de forma semi-cualitativa por el ensayo del dicromato
Ϯϭ
En el ensayo con buchón, la Figura 7 muestra que la más baja producción de etanol en el
medio sin hidrólisis se obtuvo con la levadura 1 y la más alta en la 16. En el medio hidrolizado
en este mismo diseño la menor concentración producida fue en la cepa 16 y R y la mayor con
la levadura 30. En elodea la menor concentración de etanol en el medio no hidrolizado se
observó en la levadura 1 y T a las 48 horas y la mayor en la 23a. En los medios hidrolizados la
menor concentración se dio en la 30 y la mayor en la 23a (Figura 8).
La levadura 30 en el diseño con buchón hidrolizado a las 24 horas presentó una concentración
de etanol de 38,40g/l y a las 48 de 55,303g/l, mostrándose un aumento significativo en la
producción, al igual que la levadura 23a en elodea con una producción de etanol de 18,511g/l a
las 24 horas y a las 48 horas de 30,867g/l (Figura 7 y 8). El análisis de varianza mostró
diferencias significativas en los dos diseños (Į 0.05) y en el caso de buchón, la levadura 30 en
el medio hidrolizado con P. ostreatus, no presentó diferencias significativas con la levadura T y
1 en el mismo medio a las 48 h, siendo los mejores tratamientos.
En la prueba de rango múltiple de Duncan al evaluar el diseño in vitro con elodea muestra que
la levadura 23a en medio hidrolizado biológicamente fue el mejor tratamiento y no evidenció
diferencias significativas con las levaduras 17, T y 23 en el mismo medio a las 48 horas, como
tampoco con las levaduras T y 23 a las 24 horas (Anexo 11).
En los medios sin hidrólisis se observó una producción de etanol en bajas Concentraciones de
las 24 a las 48 horas al compararlos con los medios hidrolizados (Figura 7 y 8); esto se puede
deber a que las levaduras no tienen los mecanismos necesarios para degradar los compuestos
de las macrófitas como la celulosa y la lignina; mientras que con relación a la hemicelulosa se
han aislado algunas levaduras degradadoras de este compuesto como Candida sp y
Trichosporon sp (Fernández y Novo, 1988; Palmqvist y Hahn-Hagerdal, 2000; Srinorakutara et
al., 2006; Battan et al., 2007: Cervantes y Pedroza, 2007). No obstante lo que pudo haber
permitido a los microorganismos acceder a estos sustratos fue el proceso de esterilización al
que fueron sometidos los medios antes de ser inoculados, además del pre-secado de las
muestras en la planta de producción de bioabono ubicada en el Municipio de Fúquene, antes
de su uso en el laboratorio.
Las levaduras que produjeron la mayor concentración de etanol por el método dicromato de
potasio se escogieron para la realización de la cromatografía de gases. (Las levadura 30 en el
medio hidrolizado de buchón y la 23a en el medio sin hidrólisis de elodea).
ϮϮ
Ϯϯ
Figura 10. Cromatograma de la producción de etanol con la levadura 23a en el medio sin hidrólisis,
con un tiempo de retención 1.48 minutos
Por medio de este método se pudo comprobar la producción de etanol de las levaduras
escogidas en el medio hidrolizado como sin hidrólisis. Es un método de elección para la
determinación de etanol que ofrece alta selectividad y resultados precisos, utilizado en varios
estudios (Corrales y Rangel, 1999; Monsalve et al., 2006; Sarmiento y Silva, 2007; Oviedo et
al., 2009 y Peña y Arango, 2009).
Ϯϰ
Código Identificación
1 Brettanomyces sp.
16 Hansenula sp
17 Hansenula sp
23 Candida parasilopsis
23 a C. lusitaniae
30 C. albicans
45 H. polymorpha
R C. parasilopsis
T C. lusitaniae
Los resultados encontrados tienen relación con lo reportados por varios estudios de aislamiento
de levaduras acuáticas, los cuales mencionan que algunas especies del género Cándida
pueden encontrase en dichos ambientes (Ochoa y Vázquez, 2004). Adicionalmente especies
del género Candida sp. se han reportado como productoras de etanol y algunas a partir de
compuestos vegetales prehidrolizados como el buchón de agua (Isarankura et al, 2007.,
Mishima el al, 2008., Masami et al, 2008., Nigam, 2002;). El género Hansenula sp. también ha
sido reportado por algunos autores como productor de etanol (Olena et al, 2008., Voronovsky
et al, 2009., Dejelal et al, 2006). Dichas investigaciones dan soporte a los resultados
encontrados en este estudio, ya que se determinó que las levaduras identificadas como
mejores productoras de etanol, en su mayoría fueron aisladas de las muestras de agua de la
Laguna, (1, 16, 23, 23a, 30, R, T) y se determinó que producían etanol a partir de las
macrófitas acuáticas hidrolizados y sin hidrólisis.
Ϯϱ
7. CONCLUSIONES
El mejor pretratamiento para buchón y elodea fue el biológico con Pleurotus ostreatus a los
diez días de incubación que presentó la mayor liberación de azúcares fermentables con un
promedio de 55,303g/l y 30,867g/l para buchón y elodea respectivamente.
Con los resultados obtenidos durante este trabajo se cumplió con el objetivo general de la
investigación, ya que se aislaron levaduras capaces de producir etanol a partir de las
macrófitas acuáticas buchón y elodea, siendo un punto de partida para una posible solución a
la disposición final de estos residuos vegetales una vez extraídos mecánicamente de la laguna
de Fúquene.
Ϯϲ
8. RECOMENDACIONES
Es necesario continuar con los estudios de estas macrófitas acuáticas para dar una alternativa
industrial a escalas mayores en la producción de etanol.
Continuar con la identificación molecular de las cepas aisladas de la laguna de Fuquene para
así conocer las mejores condiciones de fermentación inherentes a la cepa, para el
aprovechamiento de buchón y elodea en la producción de etanol.
Ϯϳ
9. BIBLIOGRAFIA
Abraham, M. y Kurup, G.M. 1996. Bioconversion of tapioca (Manihot esculenta) waste and
water hyacinth (Eichhornia crassipes)-Influence of various physicochemical factors. Journal of
Fermentation and Bioengineering. 82:259-63.
Aguilar, C. N. y Saucedo, S.E. 2008. Producción de etanol con Cándida kéfir. Reporte del
verano de la ciencia. Facultad de ciencias químicas departamento de investigación en
alimentos. Universidad Autónoma de Coahuila. 11p.
Aweke, G. 1993. The water hyacinth (Eichhornia crassipes) in Ethiopia. Bulletin des se´ances.
Acade´mie royale des Sciences d’outre-mer, Brussels. 39(3):399–404.
Badger, P.C. 2002. Ethanol from cellulose: A general review in J. Janick and A. Whipkey
(eds.). Trends in new crops and new uses, ASHS Press, Alexandria, VA. 17-21.
Bell, P. y Attfield, P. 2007. Breakthrough in yeasts for making bio-ethanol from lignocellulosics.
Microbiogen Pty Ltd, Macquaie University Campus, Sydney, NSW 2109, Australia. 3p.
Blasina y Tardáguila. 2006. Empresa de EEUU extraerá alcohol y biodiesel del maíz. Diario El
Observador- Agropecuario-.10p.
Calixto, M.P. y Basto, M.A. 2005. Análisis preliminar de inóculos microbianos como
biofertilizantes y aceleradores del compostaje de macrófitas acuáticas presentes en la Laguna
de Fúquene. Tesis de grado para obtener el título de Microbiólogo Industrial. Pontificia
Universidad Javeriana. Director Martínez, P. y Codirector Castillo, J. Bogotá, Colombia. 169p.
Campo, I.; Alegria, I.; Zazpe, M.; Echeverria, M. y Echeverria, I. 2006. Diluted acid hydrolysis
pretreatment of agri-food wastes for bioethanol production. Industrial Crops and Products. 24:
214–221.
Ϯϴ
Corrales, J. y Rangel, C.C.1999. daños por frío y producción de etanol en aguacate (Persea
americana Mill.) CV. HASS. Revista Chapingo Serie Horticultura 5:345-351.
Cruz, F. 2004. Compostaje del buchón de agua como alternativa de gestión. Primeros
resultados. Universidad de Los Andes, Bogotá, Colombia. 2p.
Dillon, C.R., Maurice, D.V. y Jones, J.E.1988. Composition of Egeria densa. J.Aquat. Plant
Manage. 26:44-45.
Estrada, R.D., Rubiano, J., Quintero, M., Giron, E. y Pernett, X. 2004. Pago por servicios
ambientales en la laguna de Fúquene -Colombia-. Consorcio para el Desarrollo Sostenible de
la Ecorregión Andina-CONDESAN-. 17p.
Feijo, C.S., Momol, F.R., Bonetto, C.A. y Tur, N.M. 1993. Factors influencing biomass and
nutrient content of the submersed macrophyte Egeria densa planch in a pampasic stream.
Hydrobiologia. 341: 21-26.
Feijoó, C., García M. E., Momo, F. y Toja, J. 2002. Nutrient absorption by the submerged
macrophyte egeria densa planch: Effect of Ammonium and Phosphorus Availability in the Water
Column on Growth and Nutrient Uptake. Lirnnetica. 21(1-2): 03-104.
Fernández, C. y Novo, R. 1988. Vida Microbiana en el Suelo, II. Editorial Puebloy Educación,
La Habana, Cuba. 220p.
Fuentes, L., Rabelo, S., Maciel, R. y Costa, A. C. 2008. Alkaline and oxidative pretreatment of
sugarcane bagasse for bioethanol. Department of Chemical Process – School of Chemical
Engineering State University of Campinas-UNICAMP-.Brazil. 14p.
Fujita, Y., Takahashi, S., Ueda, M., Tanaka, A., Okada, H., Morikawa, Y., Kawaguchi, T., Arai,
M., Fukuda, H. y Kondo, A. 2002. Direct and efficient production of ethanol from cellulosic
material with a yeast strain displaying cellulolytic enzymes. Applied and Environmental
Microbiology. 68(10):5136–5141.
Ϯϵ
García, J.M. y García, J.A. 2006. Biocarburantes líquidos: biodiesel y bioetanol. Informe de
Vigilancia Tecnológica. Fundación para el conocimiento Madrid CEIM. La levadura y la
producción de CO2. Obtenido el 12 de agosto de 2008 en
<http://usuarios.lycos.es/nachodiscosweb/articulo/levadura.htm>. 125p.
González, A., Mata, Y., Hernández, G., Terrón, M.C., Carbajo, J.M., Santos, S., Eugenio, M.E. y
Villar, J.C. 2008. Procesos combinados de tratamiento de la biomasa vegetal para la
producción de materias primas para el sector energético y papelero. V congreso
iberoamericano de investigación en celulosa y papel. Guadalajara, Jalisco, México.12p.
Gregori, A.; Svagelj, M. y Pohleven, J. 2007. Cultivation techniques and medicinal propertiesof
Pleurotus spp. Food Technology and Biotechnology. 45(3):238–249.
Gunnarsson, C.C. y Petersen, C.M. 2007. Water hyacinths as a resource in agriculture and
energy production: A literature review Waste Management. 27(1):117-129.
Hadar, Y., Kerem, Z., Gorodecki, B. y Ardon, O. 1992. Utilization of lignocellulosic waste by the
edible mushroom, Pleurotus. Biodegradation. 3:189-205.
Hahn-Hägerdal, B., Galbe, M., Gorwa-Grauslund, M.F., Liden, G., Zacchi, G. 2006. Bio-
ethanol--the fuel of tomorrow from the residues of today. Trends Biotechnology. 24:549-556.
Horváth, I.S., Sjöde, A., Alriksson, B., Jönsson, L.J. y Nilvebran, N.O. 2005. Criritical conditions
for improved fermentability during overliming of acid hydrolysates from spruce Applied
Biochemistry and Biotechnology. 124(1-3):1031-1044.
Hronich, J,E., Martin, L., Plawsky, J. y Bungay, H. R. 2008. Potential of Eichhornia crassipes
for biomass refining Industrial. Microbiology and Biotechnology. 35:393–402.
ϯϬ
Inga, R.A. 2009. Producción de biotetanol. Monografía presentada para optar el Título de
Licenciado en Biología, en el XV Curso de Titulación realizado en la ciudad de Lambayeque,
Perú Facultad de Ciencias Biológicas-Universidad Nacional “Pedro Ruiz Gallo”-. 96p.
Japan Inernational Cooperation Agency- JICA-. 2000. Informe final proyecto Laguna de
Fúquene-Informe final CTI Engineering International, Co, Ltda. Bogotá D.C.28p.
Kovacs, K., Macrelli, S., Szakacs, G. y Zacchi, G. 2009. Enzymatic hydrolysis of steam-
pretreated lignocellulosic materials with Trichoderma atroviride enzymes produced in-house.
Biotechnology for Biofuels. 2:14.
Kumar, A., Singh, L.K. y Ghosh, S. 2009. Bioconversion of lignocellulosic fraction of water-
hyacinth (Eichhornia crassipes) hemicellulose acid hydrolysate to ethanol by Pichia stipitis.
Bioresource Technology.100:3293–3297.
Lara, G., Yeomas, J; Ulloa, O. y Kojima, K. 2007. Efecto del nuevo sistema de tratamiento de
residuos Sépticos en el funcionamiento del humedal artificial del relleno sanitario de la
universidad Earth. Tierra Tropical. 3(2):173-181.
Linde. M.; Galbe, M. y Zacchi, G. 2006 .Steam Pretreatment of Acid-Sprayed and Acid-Soaked
Barley Straw for Production of Ethanol. Applied Biochemistry and Biotechnology. 129-132:546-
562.
Manzano, A.M., León, T., Argüelles, J., Ramos, M., Chinea, R., Guerra, G, Casado, G.
Sánchez, M.I. y Gómez, B. 2004. Hongos de la podredumbre blanca con capacidad
ligninolítica y acción decolorante sobre el violeta cristal. Revista Biología. 18(2):123-127.
ϯϭ
Martin, C. Klinke, H. y Thomsen, A.B. 2007. Wet oxidation as a pretreatment method for
enhancing the enzymatic convertibility of sugarcane bagasse. Enzyme and Microbial
Technology. 40: 426–432.
Masami, G., Yukinari, I. y Urano, N. 2008. Ethanol production from the water hyacinth
Eichhornia crassipes by yeast isolated from various hydrospheres. Africa Journal of
Microbiology Research. 2:110-113.
Ministerio del Medio Ambiente. 2002. Política nacional para humedales interiores de Colombia,
Estrategias para su conservación y uso sostenible. Bogotá D.C. 67p.
Miller, G. 1959. Use of Dinitrosalicylic Acid Reagent for Determination of Reducing Sugar.
Analytical Chemistry, ISSN 0003-2700. 31(3):426-428.
Mishima, D.; Kuniki, M.; Sei, K.; Soda, S.; Ike, M. y Fijita, M. 2008. Ethanol production from
candidate energy crops: Water hyacinth (Eichhornia crassipes) and water lettuce (Pistia
stratiotes). Bioresource Technology. 99:2495-2500.
ϯϮ
Monsalve, J.F., Mediana, V.I. y Ruiz, A.A. 2006. Red De Revistas Científicas de América Latina
y el Caribe, España y Portugal. 73(150):21-27.
Morgan, V.H. 2009. Egeria densa. USGS Nonindigenous Aquatic Species Database,
Gainesville, FL.1p.
Morrison, R. y Boyd, R. 1998. Química orgánica. Quinta edición. New York University. Pearson
Education. 1450p.
Mussatto, S.I., Dragone, G., Fernandes, M., Rocha, G. y Roberto, I. 2006. Efecto de los
tratamientos de hidrólisis ácida e hidrólisis alcalina en la estructura del bagazo de malta para
liberación de fibras de celulosa. XXII Interamerican Confederation of Chemical Engineering
(CIIQ). 10p.
Mussatto, S.I. y Roberto, I.C. 2004. Alternatives for detoxification of diluted-acid lignocellulosic
hydrolyzates for use in fermentative processes: a review. Bioresource Technology. 93:1–10.
Neidleman, S. 1993. Advances in Applied Microbiology. Academic Press. San Diego, California.
Volumen 39. 352 p.
Núñez, C.E. 2008. Pulpa y papel I 7 - Química de la madera. 7.2– Celulosa. Consultado online
el 20 de noviembre de 2009 en <http://www.cenunez.com.ar >. 57-65.
Ozbay, H.; Üniversitesi, K y Fakultesi, F. 2001. Testing growth of elodea nuttallii (Palnch) H. St.
John with different culture media. Turk J Bot. 25:239-244.
Ozimek , T; Donk, E.V. y Gulati, R.D. 1993. Growth and nutrient uptake by two species of
Elodea in experimental conditions and their role in nutrient accumulation in a
macrophytedominated lake. Hydvobiologia. 251:13-18.
ϯϯ
Petrell, R.J. y Bagnall, L.O. 1991. Hydromechanical properties of water hyacinth mats.
Aquacultural Engineering. 10:133–147.
Piñeros, Y., Rodríguez, L y Montero, M. 2009. Desarrollo de una propuesta tecnológica para el
pretratamiento de los residuos lignucelulósicos de palma de aceita, previo a la hidrólisis
enzimática". Boletín UJTL. Noticias de la Universidad Jorge Tadeo Lozano. 1p.
Ramsar. 2008. Informe nacional sobre la aplicación de la convención de ramsar sobre los
humedales. Informes Nacionales que se presentarán a la 10ª Reunión de la Conferencia de las
Partes Contratantes, República de Corea.37p.
Ranatunga, T.D, Jervis, J., Helma, R.F, McMillan, J.D.y Wooley, R.J. 2000. The effect of
overliming on the toxicity of dilute acid pretreated lignocellulosics: the role of inorganics, uronic
acids and ether-soluble organics. Enzyme and Microbial Technology 27:240–247.
Reese, E.T. 1955. A Microbiological Process Report Enzymatic Hydrolysis of Cellulose. Applied
Microbiology. 4(1):39–45.
Rodríguez, C. 2003. Los peligros de eutrofización de los cuerpos de agua por el vertimiento de
las aguas residuales. Ingeniería hidráulica y Ambiental. XXIV (2):8-11.
Rodríguez, K.J. 2005. Eficacia del hongo Pleurotus ostreatus como biorremediador de suelos
contaminados con metales pesados. Tesis sometida en cumplimiento parcial de los requisitos
para el grado de maestro en ciencias en biología. Universidad de Puerto Rico Recinto
Universitario de Mayagüez. 83p.
Rodríguez, S., Fernández, M., Bermúdez, R.C. y Morris, H. 2003. Tratamiento de efluentes
industriales coloreados con Pleurotus ostreatus. Revista Iberoamericana de Micologia, 20:164-
168.
Rovida, E., Luzzana, M., Ripamonti, M.; Mosca, A., Gambaro, V., Marozzi, E., Lodi, F. y
Rossi-bernardi, L. 1984. The determination of ethanol in whole blood by differential pH
measurements. Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigation.Oslo. 44:617-621.
Sáenz, E.C. 2003. Plantas invasoras en Colombia: una visión preliminar. Instituto Alexander-
Von-Humboldt. Programa de Biología de la Conservación, Línea ‘Especies Focales’.7p.
Sarrouh, B.F., Jover. J. y González, E. 2005. Estudio de la hidrólisis del bagazo con ácido
sulfúrico concentrado utilizando dos variantes de una sola etapa y una sola etapa modificada
ϯϰ
Schouben, C.G. 2005. Aprovechamiento del buchón de agua Eichhornia crassipes como
enmienda orgánica en el ecoparque lago de las garzas. Tesis de postgrado en Ingeniería
Sanitaria y Ambiental. Universidad del Valle .Directora Piedad López. Universidad del Valle.
Cali, Colombia. 116p.
Scribailo, R.W. 2003. Technical Information about Egeria densa (Brazilian elodea). Washington
State Department of Ecology.3p.
Sharma, A.; Unni, B.G. y Singh, H.D.1999. A novel fed-batch digestion system for
biomethanation of plant biomasses. Journal of Bioscience and Bioengineering. 87:678-82.
Singhal, V. y Rai, J.P. 2003. Biogas production from water hyacinth and channel grass used for
phytoremediation of industrial effluents. Bioresource Technology. 86(3):221-225.
Taylor, G. F., Turrill, G. H. y Carter, N. G. 1984. Blood alcohol analysis: a comparison of the
gas-chromatography assay with an enzymatic assay, Pathology, Adelaide. 16(2):157-159.
Teixeira, L.C., Linden, J.C. y Schroeder, H.A. 2000. Simultaneous saccharification and
cofermentation of peracetic acid-pretreated biomass. Applied Biochemical and Biotechnology.
84-86:111-27.
The Nature Conservancy of Vermont. 2003. Vermont Invasive Exotic Plant Fact Sheet.
Vermont Agency of Natural Resources and The Nature Conservancy of Vermont. 2p.
Tognetti, S. 2006. Disponibilidad de jugar por los servicios de cuencas hidrológicas. Flows, -
News of payments for watershed services-. Supported by the International Institute for
Environment and Development (IIED) and the World Bank, Bank-Netherlands Watershed
Partnership Program. 4p.
Universidad Nacional de Colombia. 2007. La biomasa lignocelulósica como materia prima para
la producción de etanol. Engormix.1p.
Xiros, C. y Christakopoulos, P. 2009. Enhanced ethanol production from brewer's spent grain by
a Fusarium oxysporum consolidated system. Biotechnology for Biofuels. 2(4):1-12.
Xue-Bing, Z., Wang, L. y De-Hua, L. 2008. Peracetic acid pretreatment of sugarcane bagasse
for enzymatic hydrolysis. Journal of Chemical Technology And Biotechnology. 83(6):950-956.
ϯϱ
Zhaoa, X., Zhang, T., Zhou, Y. y Liu, D. 2007. Preparation of peracetic acid from hydrogen
peroxide. Part I: Kinetics for peracetic acid synthesis and hydrolysis. Journal of Molecular
Catalysis A: Chemical. 271:246–252.
ϯϲ
10. ANEXOS
Anexo 1. ŽŵƉŽƐŝĐŝſŶĚĞůŽƐŵĞĚŝŽƐĚĞĐƵůƚŝǀŽƵƚŝůŝnjĂĚŽƐĚƵƌĂŶƚĞůĂĨĂƐĞĞdžƉĞƌŝŵĞŶƚĂů
MEDIO COMPONENTES CANTIDAD (g, mL o UI)L
Melaza Melaza 100g
Sulfato de magnesio (MgSO4) 0.5g
Sulfato de amonio (NH4)2SO4) 5g
Fosfato de potasio (KPO4) 1g
Cloranfenicol 0,5g
Penicilina 20000 UI
Agar-agar 15g
Soya-Malta Malta 30g
Harina de soya 3g
Cloranfenicol 0,5g
Penicilina 20000 UI
Agar-agar 15g
Arroz Arroz 500g
Cloranfenicol 0,5g
Penicilina 20000 UI
Agar-agar 15g
Dextrosa Sabouraud Glucosa 40g
Peptona 10g
Agar-agar 15g
YGC Glucosa 20g
Extracto de levadura 5g
Cloranfenicol 0.1g
Agar-agar 15g
Medio de crecimiento de Aserrín 1600g
Pleurotus ostreatus Salvado de trigo 360g
Melaza 40g
Cal 1g
Malta Glucosa 50 % Glucosa 500g
Extracto de malta 10g
Extracto de levadura 2.5g
Agar-agar 15g
Malta Glucosa Extracto de malta 20 g
Glucosa 20 g
Peptona 1g
Agar-agar 15g
Tabaco Tabaco de cigarrillos 50g
Agar-Agar 15g
Malta Sal Glucosa Glucosa 128g
Extracto de malta 20g
Extracto de levadura 5g
Cloruro de sodio (NaCl) 100g
Agar-agar 15g
YGC con 10 % de Cloruro Glucosa 20g
de Sodio (NaCl) Extracto de levadura 5g
Cloruro de sodio (NaCl) 100g
Cloranfenicol 0.1g
Agar-agar 15g
YGC con 16 % de Cloruro Glucosa 20g
de Sodio (NaCl) Extracto de levadura 5g
Cloruro de sodio (NaCl) 160g
Cloranfenicol 0.1g
Agar-agar 15g
ϯϳ
Todos los medios deben ser llevados a esterilizar en autoclave a 121º C (15lb de presión)
durante 15. El medio malta sal glucosa y malta glucosa 50% son esterilizados en un baño de
agua hirviendo por 30 minutos.
ϯϴ
Anexo 2.
Curva patrón para al determinación de azucares reductores por el método del ácido 3,5-
dinitrosalicilico (DNS)
Se protegen los tubos de ensayo tapa rosca de 13*100mm con papel aluminio.
Se calientan los tubos de ensayo en un baño termostatado con agua hirviendo sin papel
aluminio por cinco minutos y posteriormente detenga la reacción por inmersión de los tubos en
hielo durante 5 minutos.
ϯϵ
ϰϬ
Anexo 3.
Curva patrón para la determinación de etanol por el método del dicromato de potasio
• Solución oxidante
Se mezclan 4.165 g de dicromato de potasio (97%) y 250 mL de ácido sulfúrico (96%) en un
vaso de precipitado de 600mL. Luego esta solución se para a un balón volumétrico aforado de
1000 mL y se completa hasta el aforo con agua destilada.
• Solución final.
Se toman 4 mL de la solución oxidante en un tubo de ensayo y luego se adiciona, gota a gota,
2 mL de solución de carbonato de potasio hasta finalizar el burbujeo.
ϰϭ
ϰϮ
ϰϯ
Anexo 4.
^KzͲ
Muestra Ubicación z' D> >K h,KE ZZK
D>d
Laguna de
Agua Fúquene sector н Ͳ н н Ͳ н
Ubate
Laguna de
Agua Fúquene sector н н н Ͳ н Ͳ
Tagua
Laguna de
Agua н н н Ͳ Ͳ н
Fúquene Monroy
Laguna Fúquene
Agua н н н н н н
sector la Isla
Laguna Fúquene
Buchón н н н н Ͳ н
sector la Isla
Laguna de
Agua Fúquene sector н н н н Ͳ н
Suarez
Laguna de
Elodea Fúquene sector н н н Ͳ н н
Suarez
Vereda
Guatancuy,
municipio de
Suelo н Ͳ Ͳ Ͳ Ͳ н
Fúquene. Predio
Fundación
Humedales
Vereda
Guatancuy,
municipio de
Compost Ͳ Ͳ Ͳ Ͳ Ͳ Ͳ
Fúquene. Predio
Fundación
Humedales
ϰϰ
Anexo 5.
ϰϱ
ϰϲ
Anexo 6.
ŶĄůŝƐŝƐĨĂĐƚŽƌŝĂůĚĞďƵĐŚſŶĞŶůĂŚŝĚƌſůŝƐŝƐĂĐŝĚĂ;,Ϯ^KϰͿ͕ĐŽŶƵŶŶŝǀĞůĚĞƐŝŐŶŝĨŝĐĂŶĐŝĂĚĞϬ͘ϬϭLJϬ͘Ϭϱ͘
ϰϳ
WƌƵĞďĂĚĞƌĂŶŐŽŵƷůƚŝƉůĞĚĞƵŶĐĂŶƉĂƌĂůĂŚŝĚƌſůŝƐŝƐĂĐŝĚĂĞŶďƵĐŚſŶ
dƌĂƚĂŵŝĞŶƚŽ,ŝĚƌſůŝƐŝƐYƵşŵŝĐĂ njƵĐĂƌĞƐZĞĚƵĐƚŽƌĞƐŐͬ>
ƐƚĞƌŝůŝnjĂĐŝſŶ;ŵŝŶͿ
WƌŽƉŽƌĐŝſŶ͕ ƵƚŽĐůĂǀĞ
ŽŵƉŽŶĞŶƚĞYƵşŵŝĐŽ
dŝƉŽ ^ƵƐƚƌĂƚŽ ,Ϯ^Kϰ
EŽŵďƌĞ ŽŶĐĞŶƚƌĂĐŝſŶ ϯϬ ϲϬ
,ŝĚƌſůŝƐŝƐ ƵĐŚſŶ ĐŝĚŽ Ϭ͘ϱй ϭ͗ϭ Ϭ͕ϰϯϴϲĐĚ Ϭ͕ϲϲϵϲĂ
ĄĐŝĚĂ ^ƵƐƉĞŶƐŝſŶ ^ƵůĨƷƌŝĐŽ
ϭ͗ϰ Ϭ͕ϯϬϳϮĞĨ Ϭ͕ϮϵϭϵĞĨŐ
ŶĞƵƚƌĂůŝnjĂŶĚŽ
ĐŽŶEĂK, ϭ͗ϵ Ϭ͕ϮϵϮϰĞĨŐ Ϭ͕ϱϲϮϵď
ϭϬE
ϭ͗ϭϵ Ϭ͕ϭϵϰϵŐŚ Ϭ͕ϭϯϰŚ
ϭ͗ϰϵ Ϭ͕ϬϵϴŚ Ϭ͕ϬϵϬϲŚ
ϭ͗ϵϵ Ϭ͕ϬϵϲŚ Ϭ͕ϬϴϳϳŚ
ϭй ϭ͗ϭ Ϭ͕ϰϮϬϲĐĚ Ϭ͕ϱϱϵϵď
ϭ͗ϰ Ϭ͕ϯϳϭϳĐĚ Ϭ͕ϭϵϳϰŐŚ
ϭ͗ϵ Ϭ͕ϭϬϲϮŚ Ϭ͕ϭϳϰŚ
ϭ͗ϭϵ Ϭ͕ϬϴϱϴŚ Ϭ͕ϭϰϯϴŚ
ϭ͗ϰϵ Ϭ͕ϬϴϱϯŚ Ϭ͕ϭϮϳϮŚ
ϭ͗ϵϵ Ϭ͕ϬϴϮϰŚ Ϭ͕ϭϭϭϭŚ
Ϯй ϭ͗ϭ Ϭ͕ϮϬϱϮĨŐŚ Ϭ͕ϬϵϴŚ
ϭ͗ϰ Ϭ͕ϭϭϮϲŚ Ϭ͕ϬϵϭϲŚ
ϭ͗ϵ Ϭ͕ϬϵϴϰŚ Ϭ͕ϬϴϳϳŚ
ϭ͗ϭϵ Ϭ͕ϬϵϳŚ Ϭ͕ϬϵϮϲŚ
ϭ͗ϰϵ Ϭ͕ϬϵϰϱŚ Ϭ͕ϬϴϴϳŚ
ϭ͗ϵϵ Ϭ͕ϬϵϱϱŚ Ϭ͕ϬϵϯϭŚ
ƵĐŚſŶ ĐŝĚŽ Ϭ͘ϱй ϭ͗ϭ Ϭ͕ϰϴϰϵďĐ Ϭ͕ϭϬϮϯŚ
&ŝůƚƌĂĚŽ ^ƵůĨƷƌŝĐŽ
ϭ͗ϰ Ϭ͕ϮϭϳϯĨŐŚ Ϭ͕ϬϵϬϮŚ
ϭ͗ϵ Ϭ͕ϭϬϱϯŚ Ϭ͕ϬϴϳϳŚ
ϭ͗ϭϵ Ϭ͕ϬϵϮϭŚ Ϭ͕ϬϴϰϴŚ
ϭ͗ϰϵ Ϭ͕ϬϴϭϵŚ Ϭ͕ϬϵϯϭŚ
ϭ͗ϵϵ Ϭ͕ϬϳϵϰŚ Ϭ͕ϬϴϰϴŚ
ϭй ϭ͗ϭ Ϭ͕ϮϯϱϵĨŐŚ Ϭ͕ϮϭϴϴĨŐŚ
ϭ͗ϰ Ϭ͕ϭϯϱŚ Ϭ͕ϬϵϮϲŚ
ϭ͗ϵ Ϭ͕ϬϵϲŚ Ϭ͕ϬϴϲϯŚ
ϭ͗ϭϵ Ϭ͕ϬϵϱŚ Ϭ͕ϬϳϮϲŚ
ϭ͗ϰϵ Ϭ͕ϬϴϴϳŚ Ϭ͕ϬϳϭϲŚ
ϭ͗ϵϵ Ϭ͕ϬϴϱϯŚ Ϭ͕ϬϱϵϱŚ
Ϯй ϭ͗ϭ Ϭ͕ϬϲϴϲŚ Ϭ͕ϭϱϲϵŚ
ϭ͗ϰ Ϭ͕ϬϵϯϲŚ Ϭ͕ϭϬϬϰŚ
ϭ͗ϵ Ϭ͕ϬϵϬϮŚ Ϭ͕ϬϵϴϰŚ
ϭ͗ϭϵ Ϭ͕ϬϴϴϮŚ Ϭ͕ϬϵϳŚ
ϭ͗ϰϵ Ϭ͕ϬϴϱϴŚ Ϭ͕ϬϵϵϰŚ
ϭ͗ϵϵ Ϭ͕ϬϴϴϳŚ Ϭ͕ϬϵϲϱŚ
ϰϴ
ŶĄůŝƐŝƐĨĂĐƚŽƌŝĂůĚĞĞůŽĚĞĂĞŶůĂŚŝĚƌſůŝƐŝƐĂĐŝĚĂ;,Ϯ^KϰͿ͕ĐŽŶƵŶŶŝǀĞůĚĞƐŝŐŶŝĨŝĐĂŶĐŝĂĚĞϬ͘ϬϭLJϬ͘Ϭϱ͘
ϰϵ
WƌƵĞďĂĚĞƌĂŶŐŽŵƷůƚŝƉůĞĚĞƵŶĐĂŶƉĂƌĂůĂŚŝĚƌſůŝƐŝƐĂĐŝĚĂĞŶĞůŽĚĞĂ͘
dƌĂƚĂŵŝĞŶƚŽ,ŝĚƌſůŝƐŝƐYƵşŵŝĐĂ njƵĐĂƌĞƐZĞĚƵĐƚŽƌĞƐŐͬ>
ƐƚĞƌŝůŝnjĂĐŝſŶ;ŵŝŶͿ
WƌŽƉŽƌĐŝſŶ͕ ƵƚŽĐůĂǀĞ
ŽŵƉŽŶĞŶƚĞYƵşŵŝĐŽ
dŝƉŽ ^ƵƐƚƌĂƚŽ ,Ϯ^Kϰ
EŽŵďƌĞ ŽŶĐĞŶƚƌĂĐŝſŶ ϯϬ ϲϬ
,ŝĚƌſůŝƐŝƐ ůŽĚĞĂ ĐŝĚŽ Ϭ͘ϱй ϭ͗ϭ
Ϭ͕ϮϵϮϰĚ Ϭ͕ϮϳϳϴĚ
ĄĐŝĚĂ ^ƵƐƉĞŶƐŝŽŶ ^ƵůĨƷƌŝĐŽ
ϭ͗ϰ
ŶĞƵƚƌĂůŝnjĂŶĚŽ Ϭ͕ϮϳϳϴĚ Ϭ͕ϭϲϵϲĨ
ĐŽŶEĂK, ϭ͗ϵ
Ϭ͕ϮϳϬϱĚ Ϭ͕ϭϭϱϬĨ
ϭϬE
ϭ͗ϭϵ
Ϭ͕ϭϴϱϮĞ Ϭ͕ϭϬϴϳĨ
ϭ͗ϰϵ
Ϭ͕ϬϴϳϳŐ Ϭ͕ϬϵϬϮŐ
ϭ͗ϵϵ
Ϭ͕ϬϴϰϴŐ Ϭ͕ϬϴϳϳŐ
ϭй ϭ͗ϭ
Ϭ͕ϰϭϰϳďĐ ϭ͕ϬϴϭϰĂ
ϭ͗ϰ
Ϭ͕ϮϭϬϬĚĞ Ϭ͕ϰϵϳϭď
ϭ͗ϵ
Ϭ͕ϭϴϵϭĞ Ϭ͕ϭϱϴϰĨ
ϭ͗ϭϵ
Ϭ͕ϬϴϲϳŐ Ϭ͕ϭϭϭϲĨ
ϭ͗ϰϵ
Ϭ͕ϬϴϭϰŐ Ϭ͕ϬϵϭϭŐ
ϭ͗ϵϵ
Ϭ͕ϬϳϵϵŐ Ϭ͕ϬϵϳϬŐ
Ϯй ϭ͗ϭ
Ϭ͕ϭϭϳϬĨ Ϭ͕ϬϵϲϬŐ
ϭ͗ϰ
Ϭ͕ϬϵϵϵŐ Ϭ͕ϬϵϰϭŐ
ϭ͗ϵ
Ϭ͕ϬϵϯϲŐ Ϭ͕ϬϴϳϳŐ
ϭ͗ϭϵ
Ϭ͕ϬϵϳϱŐ Ϭ͕ϬϮϵϮŐ
ϭ͗ϰϵ
Ϭ͕ϬϵϰϭŐ Ϭ͕ϬϬϬϬŐ
ϭ͗ϵϵ
Ϭ͕ϬϬϬϬŐ Ϭ͕ϬϬϬϬŐ
ůŽĚĞĂ ĐŝĚŽ Ϭ͘ϱй ϭ͗ϭ
Ϭ͕ϯϬϰϭĚ Ϭ͕ϭϬϰϯŐ
&ŝůƚƌĂĚŽ ^ƵůĨƷƌŝĐŽ
ϭ͗ϰ
Ϭ͕ϭϱϱϬĨ Ϭ͕ϬϵϬϲ
ϭ͗ϵ
Ϭ͕ϬϵϴϵŐ Ϭ͕ϬϵϬϮŐ
ϭ͗ϭϵ
Ϭ͕ϬϬϬϬŐ Ϭ͕ϭϬϰϯŐ
ϭ͗ϰϵ
Ϭ͕ϬϬϬϬŐ Ϭ͕ϬϴϳϮŐ
ϭ͗ϵϵ
Ϭ͕ϬϬϬϬŐ Ϭ͕Ϭϳϵϵ
ϭй ϭ͗ϭ
Ϭ͕ϭϵϵϯĞ Ϭ͕ϯϬϵϵĐĚ
ϭ͗ϰ
Ϭ͕ϭϭϰϱĨ Ϭ͕ϭϳϲϵĞĨ
ϭ͗ϵ
Ϭ͕ϭϬϵϲĨ Ϭ͕ϭϭϭϭĨ
ϭ͗ϭϵ
Ϭ͕ϬϴϲϳŐ Ϭ͕ϭϮϳϳĨ
ϭ͗ϰϵ
Ϭ͕ϬϴϱϯŐ Ϭ͕ϬϵϰϭŐ
ϭ͗ϵϵ
Ϭ͕ϬϴϰϴŐ Ϭ͕ϬϴϳϮŐ
Ϯй ϭ͗ϭ
Ϭ͕ϭϬϴϮĨŐ Ϭ͕ϭϭϭϮĨ
ϭ͗ϰ
Ϭ͕ϬϵϴϬŐ Ϭ͕ϭϰϵϭĨ
ϭ͗ϵ
Ϭ͕ϬϵϱϱŐ Ϭ͕ϬϵϵϵŐ
ϭ͗ϭϵ
Ϭ͕ϬϵϮϭŐ Ϭ͕ϬϵϲϬŐ
ϭ͗ϰϵ
Ϭ͕ϬϵϳϱŐ Ϭ͕ϭϬϭϵŐ
ϭ͗ϵϵ
Ϭ͕ϬϵϭϲŐ Ϭ͕ϬϬϬϬŐ
ϱϬ
Anexo 7.
ŶĄůŝƐŝƐ ĚĞ ǀĂƌŝĂŶnjĂ ĚĞ ďƵĐŚſŶ ĞŶ ůĂ ŚŝĚƌſůŝƐŝƐ ĂůĐĂůŝŶĂ ;EĂK, ϱйͿ͕ ĐŽŶ ƵŶ ŶŝǀĞů ĚĞ ƐŝŐŶŝĨŝĐĂŶĐŝĂ ĚĞ
Ϭ͘Ϭϱ͘
WƌƵĞďĂĚĞƌĂŶŐŽŵƷůƚŝƉůĞĚĞƵŶĐĂŶƉĂƌĂůĂŚŝĚƌſůŝƐŝƐĂůĐĂůŝŶĂ;EĂK,ϱйͿĞŶďƵĐŚſŶ͘
NaOH 5 %
Tiempo de
esterilización(min)
Proporción 30 60
1:1 0,159 a 0,085 bcd
1:4 0,108 b 0,075 cd
1:9 0,098 bc 0,074 cd
1:19 0,092 bcd 0,068 cd
1:49 0,088 bcd 0,068 cd
1:99 0,088 bcd 0,0670 d
ϱϭ
ŶĄůŝƐŝƐĚĞǀĂƌŝĂŶnjĂĚĞĞůŽĚĞĂĞŶůĂŚŝĚƌſůŝƐŝƐĂůĐĂůŝŶĂ;EĂK,ϱйͿ͕ĐŽŶƵŶŶŝǀĞůĚĞƐŝŐŶŝĨŝĐĂŶĐŝĂĚĞϬ͘Ϭϱ͘
WƌƵĞďĂĚĞƌĂŶŐŽŵƷůƚŝƉůĞĚĞƵŶĐĂŶƉĂƌĂůĂŚŝĚƌſůŝƐŝƐĂůĐĂůŝŶĂ;EĂK,ϱйͿĞŶĞůŽĚĞĂ͘
NaOH 5 %
Tiempo de esterilización(min)
Proporción 30 60
1:1 0,093 a 0,071 ab
1:4 0,078 ab 0,068 b
1:9 0,075 ab 0,067 b
1:19 0,074 ab 0,068 b
1:49 0,070 ab 0,067 b
1:99 0,073 ab 0,068 b
ϱϮ
Anexo 8.
Análisis de varianza de la hidrólisis biológica con Pleurotus ostreatus en buchón con un nivel de
significancia de 0.05.
Prueba de rango múltiple de Duncan para la hidrólisis biológica con Pleurotus ostreatus en
buchón.
Tiempo (días)
Concentración del
hongo Pleurotus
ostreatus Azucares reductores (g/L)
5 7 10 11 12 13
2% 2,05 h 2,17 gh 2,24 gh 2,22 gh 2,15 gh 2,10 h
ϱϯ
Análisis de varianza de la hidrólisis biológica con Pleurotus ostreatus en buchón con un nivel de
significancia de 0.05.
Prueba de rango múltiple de Duncan para la hidrólisis biológica con Pleurotus ostreatus en elodea.
Tiempo (días)
Concentración del
hongo Pleurotus Azucares reductores (g/L)
ostreatus
5 7 10 11 12 13
2% 1,93 d 2,38 c 2,44 c 2,38 c 2,22 c 2,17 d
3% 2,16 d 2,99 b 3,27 ab 3,21 ab 2,96 b 2,87 b
10% 2,41 c 3,367 ab 3,48 a 3,48 a 3,01 b 2,88 b
ϱϰ
Anexo 9.
ϭ Ϯ
ϭ Ϯ
ϭ Ϯ
ϱϱ
ϭ Ϯ
ϭ Ϯ
Prueba de yodoformo controles de etanol y algunos posibles interferentes. En la primera columna
de la izquierda se observan los resultados de la prueba de yodoformo para los controles con
proporciones de izquierda a derecha 1:1, 1:9 y 1:99 en medio buchón; en la columna de la derecha
para el medio elodea con las mismas proporciones. En las filas se encuentran los diferentes
compuestos. A. Etanol, B. Acetato de etilo, C. Acetona, D. Alcohol Isopropílico, E. Metanol.
ϱϲ
Anexo 10.
Crecimiento única
Prueba de Yodoformo Fuente de carbono
CEPA Caldo YGC Buchón Elodea Buchón Elodea
1 +++ +++ +++ ++ +++
2 - - - + ++
3 ++ + - ++ ++
4 ++ + + ++ ++
5 +++ + - + ++
6 ++ + + + ++
7 +++ - - +++ +++
8 - - - ++ ++
Y - - - ++ ++
9 - - - ++ ++
S + - - ++ +++
10 + - - +++ ++
11 - - - ++ ++
T ++ +++ ++ ++ ++
14 + - - +++ ++
16 +++ +++ + ++ +
16a - - - ++ ++
17 +++ + ++ + +
17a ++ + - + ++
17m ++ + + ++ +
18 + - - ++ +++
19 + - - ++ +++
21 - - - ++ +
22a ++ + + + +
23 +++ +++ ++ ++ ++
23a +++ ++ ++ +++ +++
25a +++ + - ++ ++
26 + - - ++++ ++++
R +++ +++ + ++++ ++++
29 - - - + +
30 ++ +++ +++ +++ ++++
35 + + - ++ ++
40 - - - ++ +
41 +++ - - ++ +++
ϱϳ
42 - - - + +
45 +++ +++ + +++ ++
50 - - - ++ ++++
52 - - - + +
59 - - - ++ +
U - - - +++ +++
54 + + - ++ ++
60 - - - +++ +++
63 + - - ++ +++
70 - - - + +++
74 - - - +++ ++++
76 - - - + +++
77 - - - +++ +++
79 - - - + +
81 + ++ - ++ +
ϱϴ
Anexo 11.
ŶĄůŝƐŝƐĚĞǀĂƌŝĂŶnjĂĐŽŶůĂƉƌƵĞďĂĚĞůĚŝĐƌŽŵĂƚŽĚĞƉŽƚĂƐŝŽĞŶďƵĐŚſŶ͘EŝǀĞůĚĞƐŝŐŶŝĨŝĐĂŶĐŝĂĚĞϬ͘Ϭϱ͘
WƌƵĞďĂĚĞƌĂŶŐŽŵƷůƚŝƉůĞĚĞƵŶĐĂŶĞŶďƵĐŚſŶƉĂƌĂůĂƉƌƵĞďĂĚĞůĚŝĐƌŽŵĂƚŽĚĞƉŽƚĂƐŝŽ͘
Determinación de etanol
Levadura Medio Etanol g/L
24 48
1 Hidrolizado 37,180 bcd 41,570 ab
Sin hidrolisis 6,935 f 9,462 f
T Hidrolizado 37,605 bcd 41,34 ab
Sin hidrolisis 10,151 f 13,413 f
16 Hidrolizado 23,655 cdef 34,679 bcd
Sin hidrolisis 10,656 f 22,277 def
23 Hidrolizado 31,245 bcde 37,665 bcd
Sin hidrolisis 8,084 f 12,310 f
R Hidrolizado 23,175 cdef 36,333 bcd
Sin hidrolisis 9,278 f 11,988 f
30 Hidrolizado 38,400 bc 54,9704 a
Sin hidrolisis 7,533 f 12,999 f
45 Hidrolizado 17,706 ef 35,598 bcd
Sin hidrolisis 12,034 f 14,004 f
Control Hidrolizado 16,490 ef 16,655 ef
Sin hidrolisis 6,476 f 6,495 f
ϱϵ
ŶĄůŝƐŝƐĚĞǀĂƌŝĂŶnjĂĐŽŶůĂƉƌƵĞďĂĚĞůĚŝĐƌŽŵĂƚŽĚĞƉŽƚĂƐŝŽĞŶďƵĐŚſŶ͘EŝǀĞůĚĞƐŝŐŶŝĨŝĐĂŶĐŝĂĚĞϬ͘Ϭϱ͘
WƌƵĞďĂĚĞƌĂŶŐŽŵƷůƚŝƉůĞĚĞƵŶĐĂŶĞŶĞůŽĚĞĂƉĂƌĂůĂƉƌƵĞďĂĚĞůĚŝĐƌŽŵĂƚŽĚĞƉŽƚĂƐŝŽ͘
Determinación de etanol
Levadura Medio Etanol g/L
24 48
1 Hidrolizado 17,546 fghi 32,474 abc
Sin hidrolisis
8,865 i 14,698 fghi
T Hidrolizado 33,393 ab 35,230 a
Sin hidrolisis 12,034 ghi 14,652 fghi
17 Hidrolizado 29,627 abcde 36,425 a
Sin hidrolisis 10,289 hi 17,684 fghi
23 Hidrolizado 30,775 abcd 33,577 ab
Sin hidrolisis 10,65 ghi 16,030 fghi
23 A Hidrolizado 21,664 defg 37,803 a
Sin hidrolisis 18,511 fgh 30,867 abcd
30 Hidrolizado 23,288 cdef 31,785 abc
Sin hidrolisis 11,132 ghi 16,030 fghi
Control Hidrolizado 20,336 efgh 24,724 bcdef
Sin hidrolisis 6,384 i 6,568 i
ϲϬ
Anexo 12.
Compuesto LEVADURAS
L23 LR L30 L23A LT L1 L16 L17 L45
Hidroxiprolina-b- Naftilamida + + + + + - - - -
L-isoleucina-b-naftilamida - - - D + - D + +
L-prolina-b-Naftilamida + + + + + - - - -
L-tirosina-b-Naftilamida + + + + + + + + +
Glicina-b-Naftilamida - - - - - - D + +
Glicilglicina-b-Naftilamida + - + + + - - - -
Glicil-L-arginina 4-metoxi-b-Naftilamida + - + - - - - - -
Glicil-L-prolina-4-metoxi-b-Naftilamida - - - - - - - - -
L-arginil-L-arginina-b-Naftilamida + + - - - - - - -
L-lisil-L-alanina 4-metoxi-b-Naftilamida - + - - - - - - -
L-alanina-4-metoxi-b-Naftilamida - - - - - - - - -
L-seril-L-tirosina-b-Naftilamida - - - - - - - - -
Urea - - - - - - - - -
3-Indoxil-fosfato + + + + + - + + +
L-histidina -b-Naftilamida D + D D D D D + +
Sacarosa - + - - - + - - -
Sacarosa + + + + + + + + +
Trehalosa + + + + + + + + +
p-nitrofenil-Į-D-glucopiranosido - - - - - - - - -
o-nitrofenil-ȕ-D-glucopiranosido - - - + + - - - -
o-nitrofenil-ȕ-D-Galactopiranosido - - - - - - - - -
p-nitrofenil-Į-D-glucopiranosido - - + + + + + + +
p-nitrofenil-ȕ-Fucopiranosido - - - + + + + + +
p-nitrofenil-Į-D-Galactopiranosido - - - - + + + + +
p-nitrofenil-N-acetil-B-D-Glucosamina - - - - - - - - -
p-nitrofenil-ȕ-D-celobiosa - - - - - - - - -
p-nitrofenil-N-acetil-B-D-Galactosaminida - - + - - - - - -
Identificación presuntiva
Brettanomyces
C. parapsilosis
H. polymorpha
Hansenula sp
Hansenula sp
C. lusitaniae
Candida sp.
Candida sp.
C. albicans
sp.
ϲϭ