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MINISTERIO DE SALUD
LIMA-PERU
INDICE
INTRODUCCION................................................................................3
SECCION 1
Generalidades.....................................................................................4
SECCION 2
Bioseguridad.......................................................................................6
SECCION 3
Recolección de muestras de sangre...................................................11
SECCION 4
Acondicionamiento, Preservación y Transporte de Muestras............18
SECCION 5
Metodología e Instrumentación..........................................................21
SECCION 6
Procedimientos ..................................................................................33
SECCION 7
BIBLIOGRAFIA................................................................................. 107
ANEXOS.......................................................................................... .109
2
INTRODUCCION
La Bioquímica como espejo molecular de la vida. Con esta cita queremos atraer su
atención hacia el concepto de esta enorme disciplina, centro importante del
conocimiento actual y arma fundamental para desentrañar los misterios metabólicos
celulares. El Laboratorio, como institución de apoyo diagnóstico e investigación,
mantiene un enorme nexo con esta actividad, desarrollando en el quehacer diario
numerosas pruebas relacionadas a componentes derivados de las diversas rutas
metabólicas con significado clínico. De las buenas prácticas laboratoriales, surgiran
reportes adecuados que ayudaran al personal médico y de salud en la toma de
decisiones.
3
SECCION 1: GENERALIDADES
1.1 FINALIDAD
1.2 ALCANCE
Para aplicación y modelo en los centros dependientes del Instituto Nacional de Salud y
en la Red Nacional de Laboratorios de Salud Pública .
4
1.4.9 Corrida. Término utilizado en la práctica laboratorial, la cual denota el proceso
poe el cual se determinan concentraciones de un analito enun mismo tiempo o en serie.
1.4.10 Cromógeno. Sustancia o componente químico capaz de virar hacia una tonalidad
de color dentro de una reacción química.
1.4.11 Enzima. Proteína que cataliza una reacción química.
1.4.12 Extinción. Aumento en la velocidad de desapariciónde un sustrato o producto.
1.4.13 Filtro. Dispositivo que al paso de todo el espectro de la luz, permite separar sólo
una banda de longitudes de onda de la misma.
1.4.14 Kit. Denominación de un set ó contenedor de diversos productos reactivos y
materiales necesarios para un análisis.
1.4.15 Linealidad. Capacidad de un análisi de permitir crecimientos progresivos y
lineales a medida que aumenta la concentración del analito.
1.4.16 Macromolécula. Se dice de las moléculas de alto peso molecular, compuestos
por distintos grupos químicos, formando una unidad. Dichos grupos químicos
pueden ser similares entre sí o distintos.
1.4.17 Método. Proceso o conjunto de procesos que permiten realizar una actividad, en
este caso un análisis. Las técnicas son variaciones para poner en la práctica un
método.
1.4.18 Monocromador. Dispositivo que permite seleccionar una determinada longitud
de onda con menos amplitud de banda que un filtro convencional.
1.4.19 Preservación. Resguardo de las condiciones originales de los componentes
químicos en una solución.
1.4.20 Prisma. Vidrio o cuarzo con caras laterales que al girar permite reflejar una
longitud de onda (luz) específico.Se usa en espectrofotómetros.
1.4.21 Reproducibilidad. Capacidad de verificar una misma concentración bajo el
mismo método de análisis, pero con anlista distinto y en un momento diferente
de la determinación original.
1.4.22 Repetitibilidad : Capacidad de mantener la determinación de una concentración
anlítica bajo las mismas condicones de analista, equipo y momento.
1.4.23 Standard. Solución o sustancia pura de concentración conocida.
1.4.24 Suero control. Solución de analitos que se utiliza en el control de precisión. La
concentración obedece a una media y a un rango de valores calificados a ambos
lados de esta media.
1.4.25 Transmitancia. Pasaje de luz o de longitudes de onda no retenidas al atravesar
un cuerpo o compuesto molecular.
1.4.26 Trasvase. Acción de transportar una porción de un líquido o un sólido de un
contenedor a otro distinto.
5
SECCION 2 : BIOSEGURIDAD
2.2 RESPONSABILIDADES
6
• Se aconseja el uso de tomas de corriente de un solo enchufe, evitando las
conexiones múltiples.
2.4.1 Lavado de manos del personal después de haber manipulado material infeccioso.
2.4.2 No permitir pipetear con la boca
2.4.3 Prohibir al personal comer, beber o fumar en zonas de trabajo.
2.4.4 Evitar el uso de cosméticos en áreas de trabajo.
2.4.5 No guardar alimentos o bebidas en los refrigeradores de trabajo.
2.4.6 Mantener el laboratorio limpio y aseado. Descontaminar superficies de trabajo
una vez al día.
2.4.7 Usar batas, uniformes, mandiles en el ambiente de labores. No trasladar dicha
indumentaria fuera del mismo.
2.4.8 Autorizar el paso a la zona de trabajo al personal del mismo y a todo aquel que
sea informado de los requisitos para su permanencia en el lugar. Mantener las
puertas cerradas.
2.4.9 No permitir niños en zonas de trabajo.
2.4.10 Prohibido absolutamente el ingreso de animales, con excepción de alguna
finalidad dentro de las funciones del laboratorio.
2.4.11 Utilizar guantes en todos los trabajos que impliquen relación directa con
material sanguíneo.
2.4.12 Esterilizar en autoclave el material de desecho permisible de dicha acción, antes
de su eliminación.
2.5 DESINFECCION
7
contengan 0.075 g/L (75 ppm) de yodo libre. Los yodoformos pueden diluirse en
alcohol etílicos para el lavado de manos o como esporicida.
2.6.2 Los objetos agudos y cortantes, como las agujas hipodérmicas y jeringas,
deben colocarse en recipientes rojos con paredes que no puedan traspasarse
fácilmente. Cuando estos estén llenos, se colocan en bolsas anaranjadas para
desechos contaminados y se incineran.
2.6.4 Los materiales contaminados para eliminación como todos los cultivos, sangre
y sueros suelen esterilizarse en autoclaves. La eliminación de las muestras de suero
es muy importante. Cada área debe tener recipientes de basura para descartar las
muestras. Es importante tener presente que al descartar los desechos no producir
aerosoles.
8
O Comburente Según los resultados de los ensayos Evitar cualquier contacto con
considerando la inflamabilidad y sustancias combustibles.
el peligro de explosión. ¡Peligro de inflamación! Los
incendios pueden ser
favorecidos y dificultado su
extinción.
T+ Muy tóxico Tras resultados de ensayos de toxi- Evitar cualquier contacto con el
T Tóxico dad aguda oral, dermal, inhalativa, cuerpo humano, ya que no se
así como por indicios considerables pueden descartar graves daños
de daños graves para la salud, posi- para la salud, posiblemente de
blemente irreversibles, por absorción consecuencias mortales. Se ha-
única, repetida o de larga duración. ce referencia especial a la acción
cancerígena o al riesgo de altera-
ciones genéticas o de acción
teratógena de diversas
sustancias.
9
C Corrosivo Según intensidad de la destrucción Evitar el contacto con los ojos, la
de piel intacta sana durante tiempos piel y la ropa mediante medidas
de acción definidos. protectoras especiales. No
inhalar
los vapores.
Xi Irritante Claros daños de los ojos o irritación Evitar el contacto con los ojos y
de la piel, que se mantienen como la piel. No inhalar los vapores.
mínimo 24 horas posteriores al tiem- Si clasificado R43
sensibilización
po de acción, o una irritación clara posible.
de las vías respiratorias. Se hace
referencia especial a una posible
sensibilización por contacto con la
piel.
10
SECCION 3: RECOLECCION DE MUESTRAS DE SANGRE
11
Material para Toma de
Muestras :
• Guantes
• Jeringa, aguja
• Tubo recolector
• Algodón 70°
• Alcohol
• Ligadura
• Lancetas
• Capilares
• Venditas
• Contenedor de
desechos
3.3.1 Utilizar siempre guantes y mandil o bata para la obtención de muestras. Los
guantes deben desecharse y ser cambiados por un nuevo par después de atender
a cada paciente.
3.3.2 Lavarse prolijamente las manos antes y después de la atención de un paciente.
3.3.3 Todas las agujas, jeringas y de preferencia tubos de recolección deben ser
estériles.
3.3.4 Al utilizar una aguja, esta no debe haber tocado ningún elemento antes de la
punción de la piel. Si esto llega a ocurrir, utilice una nueva aguja.
3.3.5 Desinfectar adecuadamente el área de punción con alcohol 70°. Pueden
utilizarse otras soluciones antisépticas como el yodo, pero en condiciones
ideales use la primera.
3.3.6 Jamás toque el sitio de punción luego de la desinfección.
12
• Las condiciones de preparación del paciente deben ser escrupulosamente
respetadas.
• Preguntar por la ingesta de medicamentos; algunos de ellos interfieren en las
pruebas.
• En toma de muestras de tiempo múltiple, dar las recomendaciones pertinentes al
paciente mientras espera la siguiente punción (ej. : evitar ingerir alimentos o
limitar la actividad física).
• Se sugiere que en tomas de tiempo múltiple, la persona que inicialmente dio las
indicaciones al paciente y recolectó la primera muestra, sea la responsable de
respetar los horarios indicados.
3.7.3 Elija una extremidad en la que no exista ninguna venoclisis, herida o lesión
reciente, comunicaciones arteriovenosas, heridas o procedimientos quirúrgicos y
cualquier eventualidad que le haga dudar de la necesidad de punzar dicha zona.
3.7.4 Elija una vena que tenga dos características : visible y palpable. Puede ubicarla
en la fosa antecubital del antebrazo, por donde surcan las venas cefálica y
braquial. Si la vena no es muy visible, intente realizar masajes desde la muñeca
hasta el codo. Si no hay contraindicación, observe siempre ambas extremidades
para elegir el mejor sitio de punción
3.7.5 Ajuste una ligadura unos 2- 4 dedos por encima del sitio elegido. La presión
debe ser media, lo suficiente para evitar presiones mayores que causarían
hemólisis, colapso venoso o dolor.
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3.7.6 Previa a la punción limpie la zona indicada con movimientos circulares y del
centro hacia fuera.
3.7.7 Dirija la aguja en un ángulo de 15-30 ° con respecto a la superficie del brazo.
Punze en forma directa a través de la piel y hasta el lumen de la vena.
3.7.8 Terminada la colección , retire suavemente la aguja del brazo del paciente,
aplicando una gasa compresiva o torunda de algodón en el sitio de punción.
14
3.7.10 Si el sangrado no se detiene, aplique presión sobre la zona durante 10 minutos
adicionales. Si el problema persiste, consulte con el superior inmediato o médico
tratante.
3.7.11 Deposite y destruya todo el material desechable en los recipientes diseñados
para tal propósito. Este acto de destruir el material frente al paciente, aumenta su
confianza en las bondades y buenas prácticas de laboratorio.
3.7.12 Finalmente, y muy importante, termine su trabajo etiquetando e identificando los
tubos recolectados antes de atender una nueva tarea.
15
3.10.2 Precaliente el talón del bebé utilizando toallas calientes o alguna manta térmica
que permita una temperatura de 42°C por 3 a 5 minutos. Esto permitirá la
capilarización de la sangre y el flujo de la misma a la zona de punción.
Mantenga la precaución de no lastimar al niño con este proceder.
3.10.3 Limpie la zona y mantenga firme el pie del infante para evitar sacudidas bruscas.
3.10.4 Use una lanceta estéril y punze en las porciones laterales del talón (no en el
centro), en sentido contrario a los pliegues del talón, evitando que la gota de
sangre resbale hacia abajo, usando estos pliegues como camino.
3.10.5 Limpie la primera gota de sangre y permita la salida de las posteriores con
suaves masajes, evitando la dilución con líquidos tisulares. Llene el capilar o
contenedores con la cantidad necesaria.
3.10.6 Al finalizar, eleve el talón, coloque algodón en la zona y presione ejerciendo la
respectiva hemostasia.
3.10.7 Descarte el material desechable y etiquete apropiadamente los contenedores.
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• Aplicación prolongada de la ligadura.
• Excesivo masaje o presión al probar el sitio de punción.
• Venas esclerosadas u obstruidas.
• Uso de terapias endovenosas de largo plazo.
• Hemoconcentración .
• Incrementos significativos en proteínas totales, transaminasas, lípidos totales,
colesterol, hierro.
• Afecta al paquete celular sanguíneo.
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SECCION 4 : ACONDICIONAMIENTO, PRESERVACION Y TRANSPORTE
DE MUESTRAS
4.1.1 Definición
Son los procedimientos que aseguran la calidad de la muestra desde su recolección hasta
el análisis real.
18
4.2 PRESERVACION DE LAS MUESTRAS
4.2.1 Definición
4.2.2.1 Mantener como práctica ideal la centrifugación de una muestra, tan pronto como
se formó el coágulo.
4.2.2.2 El tiempo máximo de espera de una muestra de sangre total para su separación
es de una hora. Pasado este tiempo, sufren variaciones significativas la glucosa,
el potasio, fósforo, creatinina y transaminasas.
4.2.2.3 Si se requiriera una conservación superior a 1 hora, se recomienda almacenar la
muestra a temperatura ambiente,antes que a 4°C. Esto retardará discretamente la
hemólisis.
4.2.2.4 En el caso de suero o plasma separado, las muestras que no puedan analizarse
dentro de las primeras 4 horas deben ser almacenadas a temperatura de
refrigeración ( 2-8 °C) hasta su proceso, con un límite de 48 horas. Si el tiempo
de proceso se prolonga, es aconsejable almacenar las muestras a –20 °C.
4.3.1 Definición
4.3.2.1 El tiempo ideal de traslado de un laboratorio hacia otro centro debiera oscilar
entre 45 a 60 minutos.
4.3.2.2 Utilizar recipientes de material plástico (polietileno o polipropileno) como
contenedores de las muestras transportadas.
4.3.2.3 Identificar correctamente las muestras trasladadas, enviando en formato externo
cualquier dato adicional que no pudiera escribirse en el tubo o contenedor.
19
4.3.2.4 Depositar estas muestras en sobres o cajas que puedan permitir el uso de
unidades o bolsas refrigerantes (los envases de polietileno son adecuados para
este fin).
4.3.2.5 Asegurarse que los tubos se encuentren perfectamente sellados , evitando
derrames o contaminaciones con las soluciones refrigerantes.
4.3.2.6 En caso de recurrir a envíos por correo o courier, asegurarse de las condiciones
de entrega y emabalaje del material enviando, respetando la cadena de frío si es
esencial. Actualmente existen compañías que mantienen experiencia en traslados
de material biológico.
4.3.2.7 Verifique con el centro referencial las condiciones de envío de las muestras, así
como su recepción exitosa.
20
SECCION 5: METODOLOGIA E INSTRUMENTACIÓN
5.1 FOTOMETRIA
5.1.1 Definición
El color de una
El término equivale a “ medición de luz”, lo que se traduce sustancia se produce
en la práctica laboratorial como el proceso de determinar la porque al incidir la luz
intensidad de luz absorbida o emitida por una sustancia sobre ella, sus
coloreada. Dicha sustancia coloreada puede ser el resultado moléculas absorben
del proceso para determinar un analito y, por lo tanto, la ciertas longitudes de
medición de ese color final tendrá una relación directa con la onda y dejan pasar las
concentración de la sustancia. Para transformar la intensidad correspondientes al
del color de una solución en unidades de concentración de color que
una sustancia o analito, es necesario conocer la Ley de interpretaremos con
Lambert-Beer o simplemente Ley de Beer. nuestros ojos y cerebro.
La Ley de Beer explica mediante una fórmula matemática que la concentración de una
sustancia está en relación directa a la cantidad de luz absorbida o en relación inversa al
logaritmo de la luz transmitida. L a relación establecida entre Absorbancia (A) y
Transmitancia (T) se expresa de la siguiente manera :
En el terreno de la fotocolorimetría, sin embargo, usamos una fórmula práctica que nos
permite relacionar la concentración frente a la absorbancia de una solución :
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Si quisiéramos producir una gráfica en papel milimetrado, enfrentando la absorbancia
obtenida al medir distintas concentraciones de una misma sustancia, obtendríamos un
trazado parecido al de la figura A. Por otro lado, si realizamos lo mismo con la
transmitancia, el gráfico sería similar al de la figura B.
A mayor
concentración, No hay relación
mayor directa y lineal entre
A absorbancia T concentración y
transmitancia.
0 0
Concentración Concentración
Fig. A Fig. B
Dichas figuras permiten explicar el por qué resulta práctico medir la absorbancia cuando
intentamos realizar una curva de calibración en papel milimetrado. De esa forma
podremos obtener una curva lineal, que permite visualizar en forma directa que, a
mayor concentración, mayor cifra de absorbancia. Si quisiéramos lograr una curva
lineal aunque inversa, utilizando la transmitancia, necesitaríamos utilizar papel
semilogarítmico.
22
mediciones con luz visible se usan lámparas de wolframio o tungsteno y para las
del rango ultravioleta, son apropiadas las de hidrógeno o deuterio.
• Selector de longitud de onda : Se usan filtros o monocromadores (prismas,
rejillas de difracción). La selección de una determinada longitud de onda
dependerá del color de la solución a ser medida.
23
• Cubetas : Son los recipientes donde se colocará la solución a ser medida. Los
hay de diverso tamaño y material de construcción.
• Detectores de Energía Radiante o Luminosa : Se encargan de transformar la
energía luminosa en energía eléctrica.
• Dispositivos de Lectura: Para transformar la energía eléctrica en un valor de
absorbancia o transmitancia.
Regist
5.1.4.1 Los siguientes pasos son instrucciones generales. Cada instrumento tendrá
particularidades descritas en el manual del proveedor, así como
recomendaciones en relación al mantenimiento. He aquí algunos consejos útiles:
• Revisar las condiciones de conexión del aparato a la red eléctrica. Tome mucha
atención en el selector de voltaje. Conecte el instrumento a la energía cuando
esté seguro del mismo.
• Encienda el fotómetro o espectrofotómetro . Algunos instrumentos requieren
más tiempo que otros para estabilizar su sistema de medición, incluida la
lámpara.
• Basado en los procedimientos de cada análisis, seleccione una longitud de onda
determinada.
• Lleve a cero la absorbancia. Convencionalmente se logra Recuerde
esto utilizando agua destilada como solución de ajuste. En trasladar por
aparatos automatizados, la máquina realiza este escrito las
procedimiento internamente. instrucciones de
• Cerciórese si su procedimiento requiere blanco de muestra o operación de su
reactivo. Coloque lo indicado en la cubeta y ajuste a cero la equipo a un
absorbancia. archivo del
• Mida la absorbancia de estándares y muestras. laboratorio,
• Finalizado el trabajo, apague el instrumento. disponible a todos
• Limpie cualquier derrame en el instrumento o en su área de
trabajo.
24
5.1.4.2 Control del Instrumento
25
Sencillamente mida la absorbancia de este blanco de muestra y proceda a la
sustracción con la absorbancia de la muestra.
• Finalmente, Ud. puede realizar el cálculo de la concentración de una sustancia o
analito, construyendo una curva a partir de diluciones del patrón o Standard o
con concentraciones ya conocidas del mismo componente. Coloque en una hoja
milimetrada un gráfico de dos ejes. En el eje horizontal sitúe las concentraciones
utilizadas y en el eje vertical las absorbancias obtenidas para cada una. Luego
una las intersecciones logradas entre absorbancias y concentraciones y obtenga
una línea recta. Para lograr conocer la concentración de una muestra
desconocida, extrapole sus valores de absorbancia en la curva.
Proceda a las
respectivas
intersecciones
Eje vertical :
Absorbancias
10 20 30 40
Trace una
recta
uniendo los
puntos Eje horizontal:
Concentración
26
selección de la longitud de onda necesaria para la medición y un control preciso de la
temperatura de reacción.
DHL
Piruvato + NADH2 NAD + Lactato
5.2.1 Definición
Instrumental destinado al proceso de centrifugación, técnica de separación por la cual
las partículas de una solución son separadas lejos de un centro de rotación, gracias al
movimiento originado por la fuerza centrífuga. Dicha separación dependerá de la masa
y la forma de las partículas.
5.2.2 Tipos de Centrífugas
Existen dos tipos fundamentales de centrífuga en el
trabajo de un laboratorio de Bioquímica. Estos tipos
dependen del cabezal o rotor que soporta los envases
donde se colocan los tubos. Dichos cabezales pueden
ser horizontales o angulares. En los primeros, los
tubos se centrifugan
en forma horizontal,
en forma paralela al
eje de rotación. En
27
Centrífuga Angular
los llamados angulares, la disposición de los tubos en ángulo con respecto al eje,
permite una centrifugación que empuja las partículas hacia el fondo y hacia una pared
lateral del tubo (ver fotografías).
-5 2
FCR = 1.12 x 10 (rpm) x r
5.3.1 Clasificación
28
• Automatización completa : Son equipos que partiendo de suero u otro líquido
susceptible de análisis, son capaces de realizar todos los pasos técnicos hasta la
entrega de resultados en forma de concentraciones.
• Automatización parcial o Semiautomatización : Son aquellos que requieren de
algún manipuleo previo del suero o líquido a analizar, antes de suministrarlo a la
máquina para que lo siga procesando.
29
5.3.2.3 Delegue a una persona la responsabilidad del mantenimiento . Si el laboratori o
cuenta con personal suficiente, puede dividirse este trabajo entre varias personas.
5.3.2.4 Mantenga el contacto y los datos precisos acerca del distribuidor local de su
instrumento, con el objeto de coordinar mantenimientos preventivos y
necesidades de reparación.
5.3.2.5 En relación a calibraciones, los equipos citados en este acápite no requieren
estos procedimientos. Sustituya esta acción mediante verificaciones mensuales
del rendimiento del equipo, basado en la performance buena o no del control de
calidad interno. Es buena práctica pegar un sticker en alguna zona visible del
aparato y realizar un check por cada mes en que se verifica el instrumento.
Unido al mantenimiento arriba citado, Ud. habrá cumplido con el cuidado de
este útil equipo.
5.4 PIPETAS
5.4.1 Definición
5.4.2 Clasificación
30
presente iniciarlo por encima del nivel de líquido en el que la punta penetró y no
tocar el líquido, ya que de esta forma se extraería parte del mismo.
• Finalmente, depositar la muestra o líquido en el contenedor o tubo que recibirá
el primer volumen. Puede introducirse la punta hasta cierta profundidad y
expeler la totalidad de lo aspirado con suavidad. Dado que las puntas utilizadas
para estas micropipetas son no humedecibles, no existe el peligro de arrastre de
solvente fuera del tubo o receptáculo que lo contiene. Incluso , pueden realizarse
lavados finales con el solvente o reactivo final, desechando la punta al final de
este acto.
5.5.1 Definición
• Controlar el nivel de agua, de modo que se mantenga por encima del nivel de la
solución que se ha de incubar.
• Mantener la tapa del baño maría abierta cuando se proceda a la incubación de
recipientes o tubos , evitando contaminaciones y la dilución del material por el
agua condensada.
• Cambiar el agua con regularidad para evitar la proliferación de algas, bacterias u
hongos.
31
5.5.3 Mantenimiento del Equipo
5.5.3.1 Desmontar los sistemas de circulación de agua para eliminar algas e impurezas.
5.5.3.2 Los termómetros de uso en el equipo deben verificarse al recibirlos de los
proveedores y después cada 3 meses, frente a un patrón : hielo o agua hirviendo.
5.5.3.3 Mantener una ficha ó formato individual para mantenimiento, siguiendo las
recomendaciones arriba citadas, así como las sugeridas por el fabricante.
32
SECCION 6: PROCEDIMIENTOS
6.1.1 Presentación
Ante la presencia de glucosa en el suero o plasma analizado , ésta es oxidada por acción
de la Glucosa Oxidasa, produciendo Acido Glucónico con liberación de Peróxido de
hidrógeno. Luego, gracias a la acción de la Peroxidasa, este Peróxido libera agua y
Oxígeno. La molécula de Oxígeno es capatada por la 4 Aminofenazona, el cual junto al
fenol(en algunos casos podría ser el hidroxibenzoato u otro aceptor de oxígeno), forma
un compuesto cromógeno de color rosado-grossella, el cual se mide fotométricamente
(entre 490 a 530 nm). Dicha medición del cromógeno guarda una relación directa con la
concentración previa de glucosa.
Recuerde separar dentro de los primeros 60 minutos el suero o plasma del paquete de
glóbulos rojos. Sin la utilización de aditivos, la glucosa en muestras de sangre completa
se metaboliza a razón de 7 mg/dl/hora a temperatura ambiente y a 2 mg/dl/hora a 4°C.
Sin embargo, separando a tiempo el suero o plasma, la glucosa es estable por 48 horas a
temperaturas de refrigeración y aproximadamente 6 horas a temperatura ambiente.
En caso contrario, al no existir condiciones para una separación oportuna de la muestra
de sangre completa, utilice como aditivo el fluoruro de sodio: 2 mg del mismo por cada
mililitro de sangre obtenida. Esto preserva la muestra en refrigeración por unas 48
horas.
34
6.1.5 Equipos y Materiales
Se requieren tubos de ensayo( 13 x 100 mm) adecuados para las separaciones de sueros
o plasmas y las correspondientes reacciones e incubaciones durante el ensayo.
Adicionalmente se requieren pipetas con capacidad suficiente para dispensar reactivo.
Mantener las normas de bioseguridad en relación al uso de este material.
6.1.6 Reactivos
35
a)Buffer Fosfato : Verificar al final un pH de 7.0 +/- 0.05
b)Reactivo de Color
c)Acido Benzoico
Disuelva 1 g de glucosa en ácido benzoico hasta lograr 100 ml de solución. Estable por
6 meses a temperatura ambiente .
Para obtener un Standard con 100 mg/dl de glucosa, disuelva 10 ml de la solución stock
en ácido benzoico hasta completar 100 ml de solución. Estable por 6 meses a
temperatura ambiente.
36
6.1.7 Procedimientos
S1 S2 S3 S4 S5 Muestra Control
Mezcle bien.
• Desarrollo de Color
Agua
Destilada 0.1 --- --- --- --- --- --- ---
Standard
Diluido --- 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 --- ---
Muestra/
Control --- --- --- --- --- --- 0.1 0.1
Diluido
37
Mezcle todos los tubos. Incube a 37°C en baño maría por 15 minutos.
Remueva del baño y deje atemperarse a temperatura ambiente. Lea en fotómetro o
espectrofotómetro a 505 nm ó filtro verde los Standards, muestras y Control. Blanquee
previamente a 0 con el Blanco preparado.
Una vez que la linealidad está asegurada, no es necesario preparar gráficos de standards
cada vez que se analizan muestras de pacientes. Utilice el Standard S2 (200 mg/dl de
glucosa) en cada corrida y calcule la concentración de cada muestra utilizando la
siguiente fórmula :
Absorbancia de la muestra
Concentración de la muestra = -------------------------------- x 200 mg/dl
Absorbancia del Standard S2
38
6.1.9 Procedimientos de Control de Calidad.
6.1.10 Interferencias
Interfieren : hemoglobina ( > 0.5 g/dl), triglicéridos ( > 1,250 mg/dl) y bilirrubina (> 10
mg/dl), provocando todos ellos falsos aumentos de concentración.
Niveles altos de acido ascórbico y ácido úrico pueden interferir disminuyendo los
niveles de glucosa al interferir con el desarrollo de la reacción de color.
39
lesiones anatómicas que derivan en insulinomas, insuficiencia
corticosuprarrenal, hipopituitarismo, neoplasias extrapancreáticas y enfermedad
hepática masiva, pueden condicionar valores hipoglicémicos transitorios o
continuos.
6.1.14 Especificaciones de desempeño
6.1.16.1 Controlar la temperatura exacta del baño maría. La variación no puede ser
mayor a +/- 0.1°C.
6.1.16.2 Observar que el nivel de agua del baño cubra el nivel superior de los tubos en
incubación.
6.1.16.3 Verificar la limpieza de los tubos . Las impurezas o restos de detergente son
causa de variaciones en las reacciones.
6.1.16.4 Mantener la unidad de los componentes del kit comercial, evitando la mezcla
de reactivos de marcas distintas o lotes diferentes.
40
6.2 PRUEBA DE TOLERANCIA A LA GLUCOSA
6.2.1 Presentación
Esta prueba se solicita en pacientes cuyo nivel de glucemia es dudoso frente aun
diagnótico de diabetes mellitus, durante el embarazo o por razones epidemiológicas para
detectar diabetes y disminución de la tolerancia a la glucosa.
Luego de tomar una glucosa basal, el paciente ingiere una cierta cantidad de glucosa,
permitiendo luego de dos horas la recolección de una nueva muestra de sangre. Las
muestras de sangre se colectan bajo normas convencionales y se procesan según el
procedimiento explicado en el acápite 6.1, siguiendo la metodología de determinación
enzimática de glucosa .
6.2.6 Reactivos
41
6.2.7 Procedimientos
6.2.10 Interferencias
6.2.11.1 Tolerancia normal a la glucosa : Cuando a las dos horas posteriores a la carga,
presenta glucemia menor de 140 mg/dl.
No aplica.
6.2.13 Interpretación de Laboratorio
6.2.13.1 Tolerancia normal: Valores a las dos horas menores a 140 mg/dl.
42
6.2.13.2Intolerancia a la glucosa : Valores a las 2 horas mayor o igual a 140 mg/dl y
menor a 200 mg/dl.
6.2.13.3Diagnóstico de diabetes : Valores a las 2 horas mayores de 200 mg/dl.
43
6.3 COLESTEROL TOTAL : METODO ENZIMATICO CON
COLESTEROL OXIDASA
6.3.1 Presentación
Colest. esterasa
Ester de Colesterol + H2O Colesterol + Acido Graso
Colest. Oxidasa
Colesterol + ½ O2 + H2O Colestenona + H2O2 (Peróxido de
Hidrógeno)
Peroxidasa
2 H2O2 + 4-Aminofenazona + Fenol Quinoneimina + 4H2O
44
6.3.4 Tipo de muestra Primaria
Recuerde separar dentro de los primeros 60 minutos el suero o plasma del paquete de
glóbulos rojos.
La muestra es estable 7 días a 2-8°C y 3 meses a –20°C.
Se requieren tubos de ensayo(13 x 100 mm) adecuados para las separaciones de sueros
o plasmas y las correspondientes reacciones e incubaciones durante el ensayo.
Adicionalmente se requieren pipetas con capacidad suficiente para dispensar reactivo.
Mantener las normas de bioseguridad en relación al uso de este material.
45
Los sistemas automatizados y algunos semiautomatizados no requieren este
equipamiento.
c) Matraces, vasos de reacción, probetas, en el caso de preparación de reactivos.
d) Cubetas y accesorios propios de cada fotómetro o espectrofotómetro.
e) Reloj o timer.
6.3.6 Reactivos
Definido el kit
6.3.6.2 Reactivo Comercial
que usará,
recuerde
Recomendamos utilizar material comercial para la metodología
trasladar por
empleada en la determinación de este componente. Estos
escrito el
elementos aseguran precisión y facilitan el trabajo de
procedimiento
un laboratorio de cualquier nivel. Las
específico.
características y procedimientos anotados
posteriormente se ciñen a la metodología ya reseñada.
6.3.7 Procedimientos
Standard -- 0.02 --
Mezclar bien e incubar a 37°C en baño maría por 5 minutos. Retirar del baño de agua y
Muestra ó Control -- -- 0.02
preparar el espectrofotómetro ó fotómetro para la lectura respectiva.
46
• Leer la absorbancia del blanco, standard y muestra a 500-505 nm ó filtro
verde (490-530 nm) en fotómetro con filtros. Blanquee a cero
previamente con agua destilada.
• Las proporciones arriba indicadas pueden disminuirse ó aumentarse
proporcionalmente de acuerdo a las necesidades de cada laboratorio y su
infraestructura.
La linealidad para los gráficos de calibración ha sido bien documentada por diversos
fabricantes de kits comerciales. Se ha obtenido un nível mínimo de linealidad de 500
mg/dl, razón por la cual basta utilizar un solo standard para la calibración de la prueba y
para los cálculos respectivos de la concentración mediante la fórmula :
Absorbancia de la muestra
Concentración (mg/dl) = x 200
Absorbancia de Standard
6.3.10 Interferencias
Interfieren : hemoglobina ( > 0.5 g/dl), triglicéridos ( > 1,000 mg/dl), bilirrubina (> 10
mg/dl) y ácido ascórbico (> 10 mg/dl), provocando todos ellos falsos aumentos.
Citando como fuente al National Colesterol Education Program de los Estados Unidos
(2001) y, al último reporte del Adult Treatment Panel (2002), se refiere a la fecha los
siguientes valores de referencia en adultos :
47
• Deseable ó Aceptable : Menor de 200 mg/dl
• Moderadamente alto : 200-239 mg/dl
• Alto ó elevado : Mayor o igual a 240 mg/dl.
6.3.14.1 Linealidad : Varía según los fabricantes. Se sitúa entre 500 a 1000 mg/dl.
6.3.14.2Límite de detección : Igualmente, los diferentes productos citan cifras entre 0.3
mg/dl y 0.7 mg/dl.
6.3.14.3 Reproducibilidad: Procesando replicados de muestras en varios días, esta
metodología arroja coeficientes de variación entre 1.0% y 3.49 %, siendo
menores las variaciones a mayor concentración de las muestras.
6.3.14.4 Repetitibilidad : Los coeficientes de variación se sitúan entre 0.9 y 1.1 % para
la metodología.
6.3.16.1 Controlar la temperatura exacta del baño maría. La variación no puede ser
mayor a +/- 0.1°C.
6.3.16.2 Observar que el nivel de agua del baño cubra el nivel superior de los tubos en
incubación.
6.3.16.3 Verificar la limpieza de los tubos . Las impurezas o restos de detergente son
causa de variaciones en las reacciones.
6.3.16.4 Mantener la unidad de los componentes del kit comercial, evitando la mezcla
de reactivos de marcas distintas o lotes diferentes.
48
6.4 TRIGLICERIDOS: METODO ENZIMATICO CON GLICEROL
FOSFATO OXIDASA
6.4.1 Presentación
Los triglicéridos son ésteres formados gracias a la unión de glicerol y ácidos grasos
provenientes de dos fuentes: exógena (dieta) y endógena, por síntesis interna a partir de
carbohidratos y principalmente en el hígado. Son transportados al igual que otros lípidos
en complejos moleculares denominados lipoproteínas hacia el tejido adiposo, músculo y
otros, teniendo como función principal el aportar energía a nivel celular. Sus
elevaciones se han reportado en diversas hiperlipidemias primarias, de origen genético,
así como secundariamente a patologías de fondo como la diabetes mellitus. Hoy en día
se considera la hipertrigliceridemia como un factor de riesgo de enfermedad coronaria
arterial en forma independiente.
Se describe el método enzimático con el uso de Glicerol Fosfato oxidasa como enzima
que cataliza la formación de peróxido de hidrógeno y Peroxidasa como responsable de
la separación de Oxígeno del peróxido. Esta metodología es ampliamente utilizada hoy
en día y aplicable a cualquier analizador.El mercado provee de kits comerciales para su
uso . Los laboratorios que no empleen esta metodología seguiran sus instructivos de
acuerdo a las normas del fabricante del kit comercial o de la referencia bibliográfica
utilizada para el desarrollo de la prueba. Se sugiere en todo caso, mantener dichas
instrucciones al alcance del personal que labora en el área y para efectos de auditorías
y/o supervisiones.
Los triglicéridos presentes en la muestra, sufren una escisión inicial, dando lugar a la
separación del glicerol y los ácidos grasos. Luego, el glicerol es unido a adenosina
trifosfato (ATP) que, en presencia de glicerolquinasa, cede un fósforo al glicerol,
convirtiéndolo en glicerol 3-P. Este, unido al oxígeno y bajo la acción de la Glicerol
Fosfato oxidasa forma una cetona y peróxido de hidrógeno. Finalmente, el Peróxido de
hidrógeno, ante la presencia de la Peroxidasa, cede oxígeno, el cual es capturado por la
4-aminofenazona en presencia de clorofenol, terminando en un compuesto coloreado o
quinonimina roja. Este último componente es medido fotométricamente , estando en
relación direca a las concentraciones previas de triglicérido. El rango de medición se
establece en 500-505 nm o bien con filtro verde (490-530 nm) en fotómetros que lo
utilicen.
Lipasa
Triglicéridos + H2O Glicerol + Acidos grasos
Gliceroquinasa
Glicerol + ATP Glicerol 3-P + ADP
Glicerol Fosfato Oxidasa
Glicerol 3-P + O2 Dihidroxiacetona-P + H2O2
2 H2O2 + 4-Aminofenazona + Clorofenol Quinonimina
49
6.4.4 Tipo de Muestra Primaria
Recuerde separar dentro de los primeros 60 minutos el suero o plasma del paquete de
glóbulos rojos.
Los triglicéridos son estables en estas muestras durante 3 a 5 días a temperatura de
refrigeración (2-8 °C). No congelar.
Se requieren tubos de ensayo( 13 x 100 mm) adecuados para las separaciones de sueros
o plasmas y las correspondientes reacciones e incubaciones durante el ensayo.
Adicionalmente se requieren pipetas con capacidad suficiente para dispensar reactivo.
Mantener las normas de bioseguridad en relación al uso de este material.
50
6.4.5.3 Otros implementos
6.4.6 Reactivos
51
6.4.7 Procedimientos
Standard -- 0.01 --
• Mezclar bien e incubar a 37°C en baño maría por 5 minutos. Retirar del
baño de agua y preparar el espectrofotómetro ó fotómetro para la lectura
respectiva.
• Leer la absorbancia del blanco, standard y muestra a 500-505 nm ó filtro
verde (490-530 nm) en fotómetro con filtros. Blanquee a cero
previamente con agua destilada.
• Las proporciones arriba indicadas pueden aumentarse
proporcionalmente de acuerdo a las necesidades de cada laboratorio y su
infraestructura.
La linealidad para los gráficos de calibración ha sido bien documentada por diversos
fabricantes de kits comerciales. Se ha obtenido un nível mínimo de linealidad de 600
mg/dl, razón por la cual basta utilizar un solo standard para la calibración de la prueba y
para los cálculos respectivos de la concentración mediante la fórmula :
Absorbancia de la muestra
Concentración (mg/dl) = x 200
Absorbancia de Standard
52
Se aconseja mantener la buena práctica de incluir dentro de cada corrida de muestras
(sin importar el número de ellas) , la participación de al menos un suero control.
Dependerá de las posibilidades de cada laboratorio mantener controles de calidad
comerciales o preparados en el laboratorio.
6.4.10 Interferencias
Interfieren : hemoglobina ( > 1.0 g/dl), bilirrubina (> 2.5 mg/dl) mg/dl), provocando
todos ellos falsos aumentos.
Citando como fuente al National Colesterol Education Program de los Estados Unidos
(2001) y, al último reporte del Adult Treatment Panel (2002), se refiere a la fecha los
siguientes valores de referencia en adultos :
6.4.14.1 Linealidad : Varía según los fabricantes. Se sitúa entre 600 a 1000 mg/dl.
6.4.14.2 Límite de detección : Igualmente, los diferentes productos citan cifras entre 0.8
mg/dl y 1.6 mg/dl.
6.4.14.3 Reproducibilidad: Procesando replicados de muestras en varios días, esta
metodología arroja coeficientes de variación entre 1.7% y 2.6 %.
6.4.14.4 Repetitibilidad : Los coeficientes de variación se sitúan entre 0.7 y 1.7 % para
la metodología.
53
6.4.15 Precauciones de Seguridad
6.4.16.1 Controlar la temperatura exacta del baño maría. La variación no puede ser
mayor a +/- 0.1°C.
6.4.16.2 Observar que el nivel de agua del baño cubra el nivel superior de los tubos en
incubación.
6.4.16.3 Verificar la limpieza de los tubos . Las impurezas o restos de detergente son
causa de variaciones en las reacciones.
6.4.16.4 Mantener la unidad de los componentes del kit comercial, evitando la mezcla
de reactivos de marcas distintas o lotes diferentes.
54
6.5 HDL-COLESTEROL : METODOS : A) PRECIPITACIÓN B) DIRECTO
6.5.1 Presentación
Las lipoproteínas constituyen macromoléculas de forma esférica con una capa externa
de proteínas, fosfolípidos y colesterol libre en diversa proporción. La parte central de la
esfera contiene básicamente colesterol esterificado y triglicéridos, cuya concentración
difiere según el tipo de lipoproteína. La función principal de estas moléculas es
transportar adecuadamente los lípidos dentro de un medio acuoso como es el torrente
sanguíneo. Las HDL cumplen importante función vía el mecanismo reverso, retornando
colesterol periférico desde los tejidos hacia el hígado. Esto permite afirmar que su
actividad es cardioprotectiva, razón por la cual son sus disminuciones las que tienen un
efecto contrario en la enfermedad cardiovascular.
Las lipoproteínas HDL se separan precipitando las VLDL y LDL gracias al agregado de
Acido Fosfotúngstico y iones magnesio en forma de cloruro de magnesio. Luego de un
determinado tiempo de reposo entre reactivo y muestra, se procede a un centrifugado de
esta reacción capturando una porción del sobrenadante. Esta muestra se procesa con el
reactivo de determinación de colesterol, generalmente suplido con el kit comercial. De
no ser así, puede emplearse el reactivo utilizado normalmente para el análisis de
colesterol, siempre y cuando se respeten las diluciones propuestas por el fabricante.
Para esta determinación se usan polímeros o polianiones que logran mantener como
complejos estables a las VLDL, LDL y Quilomicrones, no logrando su solubilización en
la reacción. Al contrario, la acción de un detergente específico permite a las HDL su
fragmentación y solubilización, con lo que su aporte de colesterol será cuantificado
posteriormente sin la necesidad del paso de centrifugación.
55
Polianión
Lipoproteínas de bajo peso molecular Estabilización de complejos
Detergente
HDL-colesterol Fragmentación de HDL
Recuerde separar dentro de los primeros 60 minutos el suero o plasma del paquete de
glóbulos rojos.
Las partículas de HDL son estables en estas muestras durante 7 días a temperatura de
refrigeración (2-8 °C). Sin embargo, algunos autores prefieren procesos mucho más
rápidos, con un máximo de almacenamiento de 3 días.
56
6.5.5 Equipos y Materiales
Se requieren tubos de ensayo( 13 x 100 mm) adecuados para las separaciones de sueros
o plasmas y las correspondientes reacciones e incubaciones durante el ensayo.
Adicionalmente se requieren pipetas con capacidad suficiente para dispensar reactivo.
Mantener las normas de bioseguridad en relación al uso de este material.
6.5.6 Reactivos
57
6.5.6.2Reactivos Provistos en Kits Comerciales
6.5.7 Procedimientos
Muestra 0.2 ml
58
b. Mezclar bien y dejar en reposo por 10 minutos a temperatura ambiente .
c. Centrifugar 10 minutos a 4,000 rpm. Esta información debe ser confrontada con el
reactivo comercial . Existen diversas alternativas de variar el tiempo y rpm.
d. Extraer el sobrenadante.
e.Proceder al segundo tiempo de reacciones (Determinación del Colesterol HDL):
Sobrenadante -- -- 0.05 ml
Las cantidades arriba citadas varían en cada kit. El anterior ejemplo sólo
presente ser demostrativo de una variante. Consulte su instructivo y no
olvide trasladarlo por escrito a su documento de procedimientos.
f. Mezclar bien e incubar a 37°C en baño maría por 10 minutos. Retirar del
baño de agua y preparar el espectrofotómetro ó fotómetro para la lectura
respectiva.
g. Leer la absorbancia del blanco, standard y muestra a 500-505 nm ó filtro
verde (490-530 nm) en fotómetro con filtros. Blanquee a cero
previamente con agua destilada.
59
6.5.7.2 Procedimiento con Metodología sin precipitación o Directa
Al ser una técnica que llega a 2 pasos, existen dos lecturas de absorbancia, la primera de
ellas luego de la primera incubación (A1) y la segunda al final de la reacción completa
(A2). Se realiza el mismo procedimiento con el calibrador. El cálculo general será el
siguiente :
60
6.5.9 Procedimientos de Control de Calidad.
6.5.10 Interferencias
Interfieren : hemoglobina ( > 0.5 g/dl), bilirrubina (> 10 mg/dl) mg/dl), provocando
todos ellos falsos aumentos. Es discutible la interferencia de los triglicéridos en cuanto a
cifras, pero es aconsejable considerar esta acción a cifras superiores a 1000 mg/dl.
Citando como fuente al National Colesterol Education Program de los Estados Unidos
(2001) y, al último reporte del Adult Treatment Panel (2002), se refiere a la fecha los
siguientes valores de referencia en adultos :
6.5.14.1 Linealidad : Varía según los fabricantes. Se sitúa entre 150 a 500 mg/dl para
ambas metodologías.
6.5.14.2 Límite de detección : Igualmente, los diferentes productos citan cifras entre 3.0
mg/dl para la metodología precipitante y 6.0 mg/dl en el método directo.
6.5.14.3 Reproducibilidad: Procesando replicados de muestras en varios días, estas
metodologías arrojan coeficientes de variación entre 3.1 % y 4.2 %.
61
6.5.14.3 Repetitibilidad : Los coeficientes de variación se sitúan entre 2.0 % y 3.3 %
para las metodologías.
6.4.16.1 Controlar la temperatura exacta del baño maría. La variación no puede ser
mayor a +/- 0.1°C.
6.4.16.2 Observar que el nivel de agua del baño cubra el nivel superior de los tubos en
incubación.
6.4.16.3 Verificar la limpieza de los tubos . Las impurezas o restos de detergente son
causa de variaciones en las reacciones.
6.4.16.4 Mantener la unidad de los componentes del kit comercial, evitando la mezcla
de reactivos de marcas distintas o lotes diferentes.
62
6.6 LDL-COLESTEROL :METODOS: A) PRECIPITACIÓN B)DIRECTO
6.6.1 Presentación
En ese método, se emplea un primer paso para solubilizar el colesterol de HDL, VLDL
y Quilomicrones, logrando consumir este compuesto vía enzimas, sin desarrollo de
color. Esto se logra vía un primer agente tensioactivo. Aplicando otra concentración de
agente tensioactivo, se logra en un segundo paso solubilizar la LDL restante y, esta vez,
someter su colesterol a una cuantificación directa.
Polímero-Detergente-Enzimas Liberación de
HDL + VLDL +Quilomicrones colesterol y
Consumo por
Enzimas.
Agente tensioactivo
LDL-colesterol Colesterol para
Ser medido.
63
6.6.4 Tipo de Muestra Primaria
Se debe usar suero. Sólo en algunos kits se condiciona el uso de plasma bajo
recolección con EDTA ó heparina y con metodología directa. Condición importante:
Ayuno de 12 horas.
Recuerde separar dentro de los primeros 60 minutos el suero o plasma del paquete de
glóbulos rojos.
Las partículas de LDL son estables en estas muestras durante 24 horas a temperatura de
refrigeración (2-8 °C) cuando se practica la metodología con reactivo precipitante y
entre 4-5 días en refrigeración para el método directo.
Se requieren tubos de ensayo( 13 x 100 mm) adecuados para las separaciones de sueros
o plasmas y las correspondientes reacciones e incubaciones durante el ensayo.
Adicionalmente se requieren pipetas con capacidad suficiente para dispensar reactivo.
Mantener las normas de bioseguridad en relación al uso de este material.
64
6.6.5.3 Otros implementos
6.6.6 Reactivos
65
6.6.6.2.2 Reactivos del Método sin Precipitación ó Directo
6.6.7 Procedimientos
Muestra 0.4 ml
Sobrenadante -- -- 0.02 ml
67
Concentración de Muestra = Absorbancia de Muestra x Concent. Standard x F
Absorbancia Standard
Con esto se obtiene la concentración del colesterol del sobrenadante. Para calcular el
colesterol de LDL, debe lograrse una diferencia entre el colesterol total del paciente y la
concentración obtenida con el cálculo anterior :
Al ser una técnica que llega a 2 pasos, existen dos lecturas de absorbancia, la primera de
ellas luego de la primera incubación (A1) y la segunda al final de la reacción completa
(A2). Se realiza el mismo procedimiento con el calibrador. El cálculo general será el
siguiente :
6.6.10 Interferencias
Interfieren : hemoglobina ( > 0.5 g/dl), bilirrubina (> 10 mg/dl) mg/dl), provocando
todos ellos falsos aumentos. Es discutible la interferencia de los triglicéridos en cuanto a
cifras, pero es aconsejable considerar esta acción a cifras superiores a 1000 mg/dl.
68
6.6.11 Intervalos de Referencia Biológica
Citando como fuente al National Colesterol Education Program de los Estados Unidos
(2001) y, al último reporte del Adult Treatment Panel (2002), se refiere a la fecha los
siguientes valores de referencia en adultos :
6.6.14.1 Linealidad : Varía según los fabricantes. Se sitúa entre 450 a 1000 mg/dl (más
alta con el método precipitane)para ambas metodologías.
6.6.14.2 Límite de detección : Igualmente, los diferentes productos citan cifras entre
0.45 mg/dl para la metodología precipitante y 3.5 mg/dl en el método directo.
6.6.14.3 Reproducibilidad: Procesando replicados de muestras en varios días, estas
metodologías arrojan coeficientes de variación entre 1.5 a 4.8 %.
6.6.14.4 Repetitibilidad : Los coeficientes de variación se sitúan entre 1.4 % y 2.7 %
para las metodologías.
6.6.16.1 Controlar la temperatura exacta del baño maría. La variación no puede ser
mayor a +/- 0.1°C.
6.6.16.2 Observar que el nivel de agua del baño cubra el nivel superior de los tubos en
incubación.
69
6.6.16.3 Verificar la limpieza de los tubos . Las impurezas o restos de detergente son
causa de variaciones en las reacciones.
6.6.16.4Mantener la unidad de los componentes del kit comercial, evitando la mezcla de
reactivos de marcas distintas o lotes diferentes.
6.6.16.5 Observar un sobrenadante claro. La aparición de turbidez puede implicar la
necesidad de adicionar otra cantidad de precipitane. Verificar los instructivos
comerciales para las correcciones respectivas.
6.6.16.6 En la metodología con precipitane, procurar no dejar el precipitado en contacto
con el sobrenadante, debido a que puede haber redisolución del colesterol de las
otras lipoproteínas, disminuyendo en el cálculo final el tenor de LDL-colesterol.
70
6.7 UREA : METODO ENZIMATICO CON UREASA
6.7.1 Presentación
Ureasa
Urea + H2O 2 NH4+ + CO2
Nitroprusiato
NH4+ + Salicilato +Hipoclorito de sodio Indofenol
6.7.4.1 Puede usarse suero, plasma u orina. Utilizar la orina diluida 1/50 con agua
destilada y multiplicar el resultado por esta dilución. Para el uso de plasma, obtenerla a
partir de heparina como anticoagulante. Ceñirse a otras instrucciones impartidas en la
sección de venopunción en Toma de Muestras.
6.7.4.2 La úrea en suero es estable por 7 días a 2-8°C. En muestras de orina es estable
por 3 días en refrigeración , salvo excesivo crecimiento bacteriano. Para aumentar a 6
meses la conservación deben usarse temperaturas de – 20°C o más bajas.
71
6.7.5 Equipos y Materiales
Se requieren tubos de ensayo( 13 x 100 mm) adecuados para las separaciones de sueros
o plasmas y las correspondientes reacciones e incubaciones durante el ensayo.
Adicionalmente se requieren pipetas con capacidad de 1 a 10 ml para dispensar reactivo.
Mantener las normas de bioseguridad en relación al uso de este material.
6.7.6 Reactivos
72
6.7.6.2Reactivos Provistos en Kits Comerciales
6.7.7 Procedimientos
Standard -- 0.01 ml --
Muestra -- -- 0.01 ml
Reactivo de Traba-
Jo ( 1 + 3) 1.0 ml 1.0 ml 1.0 ml
73
6.7.8 Cálculo de resultados
6.7.10 Interferencias
Interfieren : hemoglobina ( > 0.2 g/dl), bilirrubina (> 20 mg/dl) mg/dl), triglicéridos ( >
1000 mg/dl), provocando todos ellos falsos aumentos.
74
como único indicador de enfermedad renal, debido a su amplia variación por causas
extrarrenales.
6.7.14.1 Linealidad : Varía según los fabricantes. Se sitúa entre 250 a 300 mg/dl .
6.7.14.2 Límite de detección : Igualmente, los diferentes productos citan cifras
alrededor de 1.3 mg/dl.
6.7.14.3 Reproducibilidad: Procesando replicados de muestras en varios días, estas
metodologías arrojan coeficientes de variación entre 1.32 % a 2.4 %.
6.7.14.4 Repetitibilidad : Los coeficientes de variación se sitúan entre 0.8 y 1.6 %.
6.7.16.1 Controlar la temperatura exacta del baño maría. La variación no puede ser
mayor a +/- 0.1°C.
6.7.16.2 Observar que el nivel de agua del baño cubra el nivel superior de los tubos en
incubación.
6.7.16.3 Verificar la limpieza de los tubos . Las impurezas o restos de detergente son
causa de variaciones en las reacciones.
6.7.16.4 Mantener la unidad de los componentes del kit comercial, evitando la mezcla
de reactivos de marcas distintas o lotes diferentes.
6.7.16.5 Conservar estrictamente la reacción de trabajo con ureasa a 2-8 °C. Debido a
sus propiedades enzimáticas es muy sensibles a cambios de temperatura. Periodos
prolongados a temperatura ambiente reducen su estabilidad.
6.7.16.6 En relación a los rangos referenciales,tomar en cuenta el sexo como fuente de
variabilidad (mayor cantidad en hombres) y la edad ( cifras menores en neonatos y
mayores en ancianos).
75
6.8 CREATININA : METODO DE JAFFE/PICRATO ALCALINO
6.8.1 Presentación
76
6.8.4.3 Separación de la Muestra y Preservación
Recuerde separar dentro de los primeros 60 minutos el suero del paquete de glóbulos
rojos. La creatinina en suero es estable 24 horas en refrigeración de 2-8°C. La orina
mantiene creatinina estable por 4 días.
Se requieren tubos de ensayo( 13 x 100 mm) adecuados para las separaciones de sueros
o plasmas y las correspondientes reacciones e incubaciones durante el ensayo.
Adicionalmente se requieren pipetas con capacidad suficiente para dispensar reactivo.
Mantener las normas de bioseguridad en relación al uso de este material.
6.8.6 Reactivos
77
mismos. Los procedimientos del ensayo deberan ser trasladados por escrito a manera de
hojas individuales, constituyendo parte del manual de procedimientos. En el presente
acápite, se describirá el procedimiento estándar utilizado por la mayoría de proveedores.
6.8.7 Procedimientos
Standard Muestra
Reactivo Trabajo 1 ml 1 ml
Standard 0.2 ml --
Muestra -- 0.2 ml
78
• Leer las absorbancias citadas del Standard y muestra a 500-505 nm ó
filtro verde (490-530 nm) en fotómetro con filtros.
Para cálculos en orina, multiplicar por el factor de dilución y luego calcular de acuerdo
al volumen en 24 horas.
6.8.10 Interferencias
Interfieren : hemoglobina ( > 0.7 g/dl), bilirrubina (> 20 mg/dl), triglicéridos (>
1000mg/dl), glucosa (> 500 mg/dl), provocando todos ellos falsos aumentos.
79
6.8.12 Valores de Alerta/Críticos
6.8.16.1 Controlar la temperatura exacta del baño maría. La variación no puede ser
mayor a +/- 0.1°C.
6.8.16.2 Observar que el nivel de agua del baño cubra el nivel superior de los tubos en
incubación.
6.8.16.3 Verificar la limpieza de los tubos . Las impurezas o restos de detergente son
causa de variaciones en las reacciones.
6.8.16.4 Mantener la unidad de los componentes del kit comercial, evitando la mezcla
de reactivos de marcas distintas o lotes diferentes.
6.8.16.5 Mantener la temperatura controlada. Una diferencia entre la temperatura de
incubación del Standard y Muestras puede disminuir la precisión de la prueba.
6.8.16.6 Respetar los tiempos de lectura . Deben haber mediciones exactas a los 30
segundos y 5 minutos de iniciada la reacción. Esto puede afectar la exactitud de la
prueba.
6.8.16.7 Aunque no ha sido recomendado, el uso de plasma proporciona resultados
disminuidos.
80
6.9 PROTEINAS TOTALES : METODO COLORIMETRICO DE BIURET
6.9.1 Presentación
Las proteínas son un gran grupo de macromoléculas formadas por aminoácidos, cuya
función es primordial en la vida, siendo parte de estructuras celulares, medios de
transporte, mecanismos de defensa, catalizadores y en combinación con otras
moléculas. Su presencia se advierte al estudio de enzimas, anticuerpos, hormonas,
factores de coagulación, hemoglobina y transportadores como en el caso de
lipoproteínas, haptoglobina, transferrina y una serie de elementos que requieren de su
presencia al no ser solubles en sangre. Entre los componentes de mayor presencia, la
albúmina producida en el hígado reviste una importancia especial por las diversas
funciones asignadas, así como por las patología asociada a su descenso.
Los enlaces peptídicos, formados por los aminoácidos presentes en las proteína se unen
al ión cúprico y, en medio alcalino, dan lugar a la formación de un compuesto coloreado
de tonalidad violeta. La medición de este complejo a 540 nm es proporcional a la
concentración de proteínas totales.
Esta reacción coloreada la dan sustancias que contengan 2 moléculas CH2 NH2
unidos entre sí o a través de un átomo de Carbono o Nitrógeno y también estructuras
peptídicas que contengan como mínimo 2 enlaces peptídicos, característica de cualquier
proteína.
Se han propuesto muchas variantes de la reacción de Biuret con el objeto de estudiar las
concentraciones óptimas de cada uno de los componentes y establecer una estabilidad a
temperatura ambiente por tiempo prolongado, previniendo la autorreducción y
formación de óxido cuproso.
81
6.9.4 Tipo de Muestra Primaria
Se utiliza suero.
Recuerde separar dentro de los primeros 60 minutos el suero del paquete de glóbulos
rojos. La muestra puede conservarse hasta 3 días en refrigeración de 2-8°C o en
congelador a –20 °C por una semana.
Se requieren tubos de ensayo( 13 x 100 mm) adecuados para las separaciones de sueros
o plasmas y las correspondientes reacciones e incubaciones durante el ensayo.
Adicionalmente se requieren pipetas con capacidad suficiente para dispensar reactivo.
Mantener las normas de bioseguridad en relación al uso de este material.
82
6.9.6 Reactivos
6.9.7 Procedimientos
Standard -- -- 0.1 ml
Suero -- 0.1 ml --
6.9.10 Interferencias
84
6.9.12 Valores de Alerta/Críticos
6.9.16.1 Verificar la limpieza de los tubos . Las impurezas o restos de detergente son
causa de variaciones en las reacciones.
6.9.16.2 Mantener la temperatura controlada.
6.9.16.3 Considerar variaciones en los tenores de proteínas de acuerdo a los estados de
hidratación del individuo.
6.9.16.4 El efecto postural permite una variación de casi el 20 % entre la posición erecta
a la acostada, siendo mayor para la primera.
6.9.16.5 En relación a edad, el neonato mantiene cifras algo superiores que el infante y
éste a su vez tasas menores frente al adulto en 1-1.5 g/dl.
85
6.10 ALBUMINA : COLORIMETRIA CON VERDE DE BROMOCRESOL
6.10.1 Presentación
Se utiliza suero.
Recuerde separar dentro de los primeros 60 minutos el suero del paquete de glóbulos
rojos. La muestra puede conservarse hasta 3 días en refrigeración de 2-8°C o en
congelador a –20 °C por una semana.
86
6.10.5 Equipos y Materiales
Se requieren tubos de ensayo( 13 x 100 mm) adecuados para las separaciones de sueros
y las correspondientes reacciones e incubaciones durante el ensayo.
Adicionalmente se requieren pipetas con capacidad suficiente para dispensar reactivo.
Mantener las normas de bioseguridad en relación al uso de este material.
6.10.6 Reactivos
6.10.6.1Reactivo Comercial
6.10.7 Procedimientos
Standard -- 0.015 ml --
Suero -- -- 0.015 ml
Reactivo 1 ml 1 ml 1 ml 87
Mezclar y dejar 1 minuto a temperatura ambiente. Leer a 630 nm o en filtro rojo 630 +/-
20 nm, blanqueando a cero con el blanco de reactivo.
6.10.10 Interferencias
Interfieren : triglicéridos ( > 1250 mg/dl), hemoglobina (> 0.125 g/dl). La bilirrubina no
interfiere.
88
6.10.13 Interpretación de Laboratorio
6.10.16.1 Verificar la limpieza de los tubos . Las impurezas o restos de detergente son
causa de variaciones en las reacciones.
6.10.16.2 Mantener la temperatura controlada.
6.10.16.3 Considerar variaciones en los tenores de proteínas de acuerdo a los estados de
hidratación del individuo.
6.10.16.4 La reacción de la albúmina con el verde de bromocresol es inmediata. No
demore las lecturas; otras proteínas podrían reacionar lentamente.
89
6.11 BILIRRUBINA TOTAL Y DIRECTA: COLORIMETRIA CON
REACTIVO SULFANILICO-DIAZOADO.
6.11.1 Presentación
BILIRRUBINA TOTAL
90
6.11.4 Tipo de Muestra Primaria
Se requieren tubos de ensayo( 13 x 100 mm) adecuados para las separaciones de sueros
y plasma y las correspondientes reacciones e incubaciones durante el ensayo.
Adicionalmente se requieren pipetas con capacidad suficiente para dispensar reactivo.
Mantener las normas de bioseguridad en relación al uso de este material.
91
6.11.6 Reactivos
6.11.7 Procedimientos
Desarrollador -- -- 2.5 ml
92
ml y luego multiplicar el resultado por 3.79. Para el caso de ictericias severas puede
utilizarse 0.02 ml, multiplicando el resultado por 9.38.
6.11.10 Interferencias
93
6.11.13 Interpretación de Laboratorio
6.11.16.1 Verificar la limpieza de los tubos . Las impurezas o restos de detergente son
causa de variaciones en las reacciones.
6.11.16.2 La lectura de las reacciones en el caso de bilirrubina directa es de capital
importancia. Lecturas antes de los 5 minutos dan valores por debajo de lo esperado,
ocurriendo lo contrario con tiempos de lectura posteriores.
6.11.16.3 Se reitera la importancia de la protección de las muestras de la luz, sea
artificial o natural.Utilizar papel negro para proteger las muestras que no seran
analizadas de inmediato. La prolongación del análisis en una hora, puede permitir la
pérdida de hasta el 50 % de la concentración de la muestra.
6.11.16.4 Los niveles de bilirrubina en los neonatos a término alcanzan las cifras de
adulto hacia el primer mes de vida. Considerar que en el caso de pretérminos se retarda
esta nivelación, debido a una inmadurez hepática.
94
6.12 TRANSAMINASAS : METODO CINÉTICO UV OPTIMIZADO (IFCC)
6.12.1 Presentación
ALT/TGP
ALANINA + 2-OXOGLUTARATO PIRUVATO + GLUTAMATO
SE ACOPLA AL PIRUVATO :
Desshidrogenasa Láctica
PIRUVATO + NADH + H+ LACTATO + NAD+
95
6.12.3.2 Reacción de determinación de actividad AST/TGO:
AST/TGO
ASPARTATO + 2- OXOGLUTARATO Oxalacetato + Glutamato
SE ACOPLA AL OXALACETATO:
Malato Deshidrogenasa
OXALACETATO + NADH + H+ MALATO + NAD+
6.12.4.1 Puede usarse suero y plasma . Para el uso de plasma, obtenerla a partir de
heparina como anticoagulante. Ceñirse a otras instrucciones impartidas en la sección de
venopunción en Recolección de muestras.
6.12.4.2 Las transaminasas son estables en suero por 3 días a 2-8°C. No congelar.
Se requieren tubos de ensayo( 13 x 100 mm) adecuados para las separaciones de sueros
o plasmas y las correspondientes reacciones e incubaciones durante el ensayo.
Adicionalmente se requieren pipetas con capacidad suficiente para dispensar reactivo.
Mantener las normas de bioseguridad en relación al uso de este material.
96
a) Pipetas para recolección de 10 a 100 ul.Se utilizaran en la recolección del
volumen necesario de suero o plasma. Se aconsejan las pipetas con puntas
desechables.
b) Baño María : Para la respectiva incubación durante el ensayo de los tubos de
ensayo con la mezcla de suero o plasma y reactivo. Mantener controlado a 37°C.
Los sistemas automatizados y algunos semiautomatizados no requieren este
equipamiento.
c) Matraces, vasos de reacción, en el caso de preparación de reactivos.
d) Cubetas y accesorios propios de cada fotómetro o espectrofotómetro.
e) Reloj o timer.
6.12.6 Reactivos
6.12.7 Procedimientos
97
b) Mezclar de inmediato y disparar en simultáneo el reloj ó timer. Luego de 1
minuto, registrar la absorbancia inicial. Posteriormente, registrar la absorbancia
a los 1, 2, 3 minutos de la primera lectura.
c) Determinar la diferencia promedio, restando cada lectura de la anterior y luego
promediando dichas diferencias ( A/min).
6.12.10 Interferencias
98
ALT/TGP: Hombres ( hasta 41 U/l) Mujeres ( hasta 31 U/l)
AST/TGO: Hombres (hasta 38 U/l) Mujeres ( hasta 32 U/l)
6.12.16.1 Controlar la temperatura exacta del baño maría. La variación no puede ser
mayor a +/- 0.1°C.
6.12.16.2 Observar que el nivel de agua del baño cubra el nivel superior de los tubos en
incubación.
6.12.16.3 Verificar la limpieza de los tubos . Las impurezas o restos de detergente son
causa de variaciones en las reacciones.
6.12.16.4Mantener la unidad de los componentes del kit comercial, evitando la mezcla
de reactivos de marcas distintas o lotes diferentes.
6.12.16.5Controlar exactamente los tiempos de lectura de absorbancias para el cálculo
de A/min.
99
6.13 FOSFATASA ALCALINA : CINÉTICA OPTIMIZADA-
DIETANOLAMINA
6.13.1 Presentación
La fosfatasa alcalina cataliza en medio alcalino la transferencia del grupo fosfato del 4-
nitrofenilfosfato a la dietanolamina, liberando 4-nitofenol. A partir de la velocidad de
formación del 4-nitrofenol se relaciona la actividad de la enzima.
6.13.4.1 Puede usarse suero y plasma . Para el uso de plasma, obtenerla a partir de
heparina como anticoagulante. Ceñirse a otras instrucciones impartidas en la sección de
venopunción en Recolección de muestras.
6.13.4.2 La fosfatasa alcalina es estable en suero por 7 días a 2-8°C.
Se requieren tubos de ensayo( 13 x 100 mm) adecuados para las separaciones de sueros
o plasmas y las correspondientes reacciones e incubaciones durante el ensayo.
Adicionalmente se requieren pipetas con capacidad suficiente para dispensar reactivo.
Mantener las normas de bioseguridad en relación al uso de este material.
100
6.13.5.3 Otros implementos
6.13.6 Reactivos
6.13.7 Procedimientos
Sustrato reconstituido.......... 1 ml
Muestra .......................... 0.02 ml
Estas cantidades son a modo de ejemplo. Varían según el kit comercial.
101
b) Mezclar de inmediato y disparar en simultáneo el reloj ó timer. Luego de 1
minuto, registrar la absorbancia inicial. Posteriormente, registrar la absorbancia
a los 1, 2, 3 minutos de la primera lectura.
c) Determinar la diferencia promedio, restando cada lectura de la anterior y luego
promediando dichas diferencias ( A/min).
6.13.10 Interferencias
Interfieren : bilirrubina (>20 mg/dl), triglicéridos (>1000 mg/dl), hemoglobina (> 0.5
g/dl) dan valores falsamente aumentados.
102
6.13.14 Especificaciones de desempeño
6.13.15Precauciones de Seguridad
6.13.16.1 Controlar la temperatura exacta del baño maría. La variación no puede ser
mayor a +/- 0.1°C.
6.13.16.2 Observar que el nivel de agua del baño cubra el nivel superior de los tubos en
incubación.
6.13.16.3 Verificar la limpieza de los tubos . Las impurezas o restos de detergente son
causa de variaciones en las reacciones.
6.13.16.4Mantener la unidad de los componentes del kit comercial, evitando la mezcla
de reactivos de marcas distintas o lotes diferentes.
6.13.16.5Controlar exactamente los tiempos de lectura de absorbancias para el cálculo
de A/min.
103
6.14 HEMOGLOBINA GLICOSILADA: CROMATOGRAFÍA DE
INTERCAMBIO IONICO
6.14.1 Presentación
Est prueba muestra variabilidad entre las diversas metodologías e incluso entre
fabricantes . Para garantizar que la información obtenida es confiable, resulta
indispensable que los laboratorios utilicen métodos cromatográficos certificados por el
National Glycohemoglobin Standardization Program (NGSP). En la actualidad es
recomendable en laboratorios de referencia, la utilización de cromatografía de
intercambio iónico a baja presión.
104
en el mercado alternativas de acuerdo al volumen de pruebas de los distintos
laboratorios. Se entiende que este es un procedimiento que debería centralizarse en
Laboratorios de referencia, dado el costo y complejidad de su performance.
6.14.5.2 Material requerido
• Dispositivos para pruebas
• Reactivos diversos para la preparación del hemolizado.
• Software
• Dispensadores, viales muestra.
• Pipetas para volúmenes de muestra y reactivo según los protocolos de
cada fabricante.
• Impresora y papel de impresión.
6.14.6 Reactivos
Los fabricantes proveen reactivos con buffer y reactivos de hemólisis, específico para
cada marca. Además, debe obtenerse controles.
6.14.7 Procedimientos
Los procedimientos varían según el proveedor, pero existen pasos generales en todos
ellos :
6.14.7.1 Iniciar la corrida con un control de Calidad. Utilizar los niveles exigidos.
6.14.7.2 Calibración : Este paso no suele ser necesario, gracias al apoyo de un software
que guarda la información de curvas de calibración leyendolas de cada lote de reactivos.
6.14.7.3 Preparación de los hemolizados a partir de las muestras de pacientes.
6.14.7.4 Inicio de corrida.
6.14.7.5 Aspiración de muestra y análisis.
6.14.7.6 Reporte e impresión de resultados.
6.14.10 Interferencias
105
6.14.12Valores de Alerta/Críticos
No se reportan.
6.14.13Interpretación de Laboratorio
<7% Objetivo
< 6% NO diabético
6.14.14Especificaciones de desempeño
106
SECCION 7 : BIBLIOGRAFIA
7.1 American Diabetes Association : Standards of Medical Care for Patients with
Diabetes Mellitus. Diabetes Care, 1996: S8-S9.
7.9 Henry R.J., Cannon Dc, Winkelman JW. Química Clínica. Bases y Técnicas, 2ª
ed., Editorial Jims, Barcelona , 1980.
7.11 Instituto Nacional de Salud. Manual de Bioseguridad para los Laboratorios. Serie
de Normas Técnicas N0. 18.Lima, 2002.
107
7.17 Terrés-Speziale. Confiabilidad y Aplicabilidad de los Nuevos Criterios
internacionales para el diagnóstico de Diabetes Mellitus. Revista Mexicana de Patología
Clínica, Vol. 49, N0. 4, Octubre-Diciembre 2002.
7.20 World Health Organization. Regional Office for South East Asia. Guidelines
on Standard Operating Procedures for Clinical Chemistry. 2001.
108
ANEXO A
LABORATORIO CLINICO
HOJA DE PROCEDIMIENTOS
1.NOMBRE DE LA PRUEBA
2. METODOLOGIA
4. INSTRUMENTO UTILIZADO
LECTURA A : nm
5. PROCEDIMIENTO :
a. Muestra:
b. Preparación de Reactivos:
c. Procedimiento técnico:
6. CALCULO DE RESULTADOS
109
7. RANGO DE REFERENCIA
8. PERFORMANCE Linealidad :
Límite de detección;
Reproducibilidad :
Repetitibilidad:
Otros :
9. SUSTANCIAS INTERFERENTES
Frecuencia de uso :
Elaborado
Revisado
Aprobado
110
ANEXO B
111